DD259046B1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von c-reaktivem protein (crp) - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung stellt ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein dar. Die Konzentration des CRP im Serum und anderen Körperflüssigkeiten erhöht sich bei bakteriellen Infektionen, Verletzungen, nach chirurgischen Eingriffen, Verbrennungen, Gewebsuntergängen.

Durch die Bestimmung der Konzentration des CRP erhält der Kliniker Hinweise auf den Zustand eines Patienten, da bei Gesundung Normalwerte erreicht werden. Hauptsächliche Anwendungen sind z.Z. Erkennen und Beurteilen von Heilungsverläufen nach chirurgischen Eingriffen und Verletzungen, Sepsis bei Neugeborenen, Nachweis von Infarkten und Neukrosen, Zustand bei chronischen Entzündungen, Verläufe und Differentialdiagnose bei akuten bakteriellen und viralen Infektionen.

Anwendungsgebiet ist daher die klinische Laboratoriumsdiagnostik. Da Wirbeltiere in ähnlicher Weise reagieren, ist das Verfahren auch für die Überwachung von Tierbeständen und die Beurteilung des Zustandes von Tieren geeignet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die quantitative Bestimmung von Eiweißen in Körperflüssigkeiten findet Anwendung in der klinischen Laboratoriumsdiagnostik. Empfindliche Methoden sind beider Analytik von Hormonen und einer Reihe von Plasmaproteinen notwendig. In den letzten Jahren haben sich hierfür Immunoassays durchgesetzt, die Antikörper einsetzen: Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Fluorimmunoassays, jetzt auch Lumineszenzimmunoassays. Bei diesen Immunoassays gibt es verschiedenen Konstruktionen: homogene und heterogene Assays, kompetetive Tests, direkte und indirekte Zweiseitenbindungsassays, Immunglobulin- und Antigenbindungsassays, Capture-techniken. Bei allen diesen Verfahren findet im entscheidenden Schritt eine Reaktion zwischen spezifischen Antikörpern und Antigenen bzw. Hapten statt. Die quantitative Auswertung der Reaktion wird durch Zählung radioaktiver Zerfallsprozesse, Substratreaktionen mit anschließender optischer Auswertung, Fluoreszenzuntersuchungen oder Messung der Chemilumineszenz erreicht. Die Empfindlichkeit der Methoden ist hoch, die Meßbereiche liegen in Konzentrationsbereichen von pg/l bzw. ng/l im Test. Diese Tests bieten in der praktischen Durchführung einige Schwierigkeiten: Die hohe Empfindlichkeit erfordert in der Regel, daß sehr verdünnte Lösungen der Proben eingesetzt werden, die exakt angefertigt werden müssen, was zu großem Aufwand bei hohen Probenzahlen führt. Weiterhin sind bei den üblichen Assays die Versuchszeiten relativ lang, d.h., die Tests dauern mehrere Stunden bzw. Tage. Antikörpertests führen bei niedrigem Titer und hoher Rheumafaktorkonzentration zu falsch erhöhten Werten. Am Beispiel des CRP in Gegenwart von Rheumafaktoren wurde dies beschrieben von J. Highton und P. Hessian, J. Immunol. Meth.68(1984) 185-192. Immunoassays sind relativ teuer, da die Herstellung, Aufarbeitung und Spezifitätsuntersuchung von Antiseren bzw. Antikörpern aufwendig ist. Es ist der Einsatz von Tiermaterial notwendig. Das gleiche trifft zu bei der Anwendung von monoklonalen Antikörpern. Von den Erfindern wurde 1986 ein Enzym-Immun-Zweiseitenbindungsassay für CRP publiziert, der (Bürger, v. Baehr u. a., Z. Klin. Med. 41,385-387) die Vorteile und Probleme der Antikörperassays beschreibt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, wobei gleichzeitig eine richtige Konzentrationsbestimmung bei Problemseren (hohe Konzentration an Rheumafaktoren) möglich ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, indem die Nachteile der bisherigen Verfahren vermieden werden durch die Anwendung neuer Bindungspartner unter Vermeidung von Antikörpern bzw. Antiseren. Das Verfahren hat weiterhin die Aufgabe, praktikabel zu sein und die Untersuchung großer Probenmengen mit vertretbarem Aufwand zuzulassen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem das CRP mit Liganden folgender chemischer Strukturen: Galaktene (galaktosehaltige Polysaccharide), Polykationen und Polyanionen, Bindung an Histone, Protamine, Nucleinsäuren, Aminoalkyl- bzw. mono-, di-, tri-Alkylaminoalkylphosphoryiverbindungen, Cu-haltige Proteine. Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz von ß-Aminoalkyl-phosphoryl-Trägerprotein-Konjugaten zur Bestimmung von C-reaktivem Protein erwiesen.

Oas Verfahren ist weiterhin gekennzeichnet durch einen Temperaturbereich von 0 bis 45°C, vorzugsweise 20⁰C, und einer Reaktionszeit von 5 bis 120 min, vorzugsweise 15 min. Die untere Nachweisungsgrenze beträgt 1 mg/l CRP bei einem Normbereich bis 8mg/l bei gesunden Erwachsenen. Der Meßbereich des Tests liegt zwischen 0,03 und 0,50mg/l. In diesem Bereich betragen die Variationskoeffizienten unter 15% in der Serie und rund 13-18% von Tag zu Tag bei dem im Anwendungsbeispiel beschriebenen Beispiel. Die Ligand-Träger-Konjugate können mit Hilfe von Kopplungsreaktanten bzw. durch unspezifische Bindung hergestellt werden, als praktikabel hat sich die Kopplung von Trägerprotein (z. B. Albumin, -Globulin, Ferritin) an ß-Aminoalkylphosphat mittels Glutaraldehyd und anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid erwiesen.

Ausführungsbeispiel 1

Kompetetiver Ligandassay zur Bestimmung von C-reaktivem Protein unter Verwendung von Ligand-Protein-Konjugat Aus ß-Aminoethylphosphat und Trägerprotein wird unter Verwendung von Glutaraldehyd ein Ligand-Protein-Konjugat hergestellt und mittels 0,1 m Karbonatlösung, pH = 9,5, auf eine Konzentration von 3,2 mg/l verdünnt. Diese Lösung wird zur Festphaseadsorption in geeignete Trägermaterialien überführt. Die Inkubation wird über nacht bei 4⁰C ausgeführt. Anschließend wird die Flüssigkeit entfernt und die Träger bei -20⁰C bis zum Gebrauch gelagert. Es werden Standard- und Probenverdünnungen in Calziumpuffer (0,02 m) pH = 7,3, im Verhältnis 1:50 angefertigt. Auf einer nichtbenetzten Mikrotiterplatte werden gleiche Mengen dieser Proben und einer Lösung von 0,32 mg/l Peroxidase-C-reaktives-Protein-Konjugat in Calziumpuffer gemischt. Stehen die Mischungen zur Verfügung, so werden sie in einheitlicher Menge innerhalb einer Minute in die entsprechenden benetzten und gewaschenen Trägermaterialien überführt und 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Lösung und dreimaligem Waschen wird die Substratreaktion mit o-Phenylendiamin/H₂O₂ durchgeführt und nach 5min mit Schwefelsäure (1 m/l) gestoppt, die Extinktion am Mehrkanalphotometer resp. Spektrophotometer gemessen, die Eichkurve auf halblogarithmischen Papier gezeichnet und die Konzentration der Proben ermittelt.

Ausführungsbeispiel 2

Kompetetiver Ligandassay zur Bestimmung von C-reaktivem Protein unter Verwendung von Ligand-Protein-Konjugat. Aus ß-Methylaminoethyl-phosphat und Trägerprotein wird durch Kopplung ein Ligand-Protein-Konjugat hergestellt, das gemäß Ausführungsbeispiel 1 an geeignete Trägermaterialien fixiert wird. Der Test verläuft ebenfalls wie beschrieben, jedoch ist es notwendig, die Inkubationszeit auf 20 min bei 20⁰C zu erhöhen, da eine etwas geringere Bindungsstärke zwischen der verwendeten Phosphorverbindung und dem CRP besteht. Auswertung des Tests wie beschrieben.

Claims (3)

1. Patentanspruch:

   1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein (CRP) mittels Festphasen-Liganden-Bindungs-Assay, dadurch gekennzeichnet, daß als Liganden-Trägerkonjugate Aminoalkyl- bzw. mono-, di-, tri-Alkylaminoalkyl-phosphorylverbindungen eingesetzt werden und die Reaktion bei 0 bis 45°C innerhalb von 5 bis 120min durchgeführt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ligand-Trägerkonjugate vorzugsweise ß-Aminoalkyl-phosphoryl-Konjugate verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise bei 20⁰C gearbeitet wird.