DD261609A1

DD261609A1 - Verfahren zur herstellung eines polysaccharids

Info

Publication number: DD261609A1
Application number: DD30356587A
Authority: DD
Inventors: Udo Graefe; Guenther Reinhardt; Wolfgang Forberg; Dieter Ose
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-06-05
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1988-11-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Polysaccharids vom Typ des Pullulans auf fermentativem Wege unter Verwendung des Mikroorganismus Pullularia pullulans ZIMET 43826 und nachfolgenden Reinigung des so erhaltenen Rohproduktes unter Verwendung von Natriumhypochlorit und Aktivkohle in waessrig-alkoholischen Loesungen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Polysaccharids vom Typ der Pullulane in reiner Form, das in der Lebensmittelindustrie sowie als Biochemikalie von Nutzen ist.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Mikroorganismen sind in der Lage, eine breite Palette von Polysacchariden unterschiedlicher chemischer Struktur zu synthetisieren, die vielseitige Anwendung in der Lebensmittelindustrie und Technik gefunden haben bzw. potentiell für verschiedenste Zwecke einsetzbar sind (BAIRD et al., Biotechnology 1983, S. 778-783; CATLEY, Progr. Ind. Microbiol. Vol. 18, 130-200(1983]). Unter diesen Polysacchariden sind Glucane vom Typ des Pullulans von Interesse, da sie sowohl in der Lebensmittelindustrie (biologisch abbaubares Verpackungsmaterial für Süßwaren, Herstellung diätischer Zubereitungen) als auch als biochemisches Substrat für die Bestimmung von Aktivitäten amylolytischer Enzyme, z. B. der Pullulanase, eingesetzt werden können (siehe z.B. RENNEBERGj et al., Biotechnol.Lett.7, 809-812 [1985]). Chemisch besteht Pullulan aus linearen Polymeren (MG > 20000), in denen jeweils Maltotriose-Einheiten als grundlegendes Strukturelement miteinander in 1.6-Position verknüpft vorliegen (BENDER et al., Biochem.Biophys.Acta 36, 309-313 [1959]).

Bekannt ist, daß pilzliche Mikroorganismen der Gattung Pullularia, vorzugsweise der Art Pullularia pullulans (Aureobasidium pullulans) bei Kultivierung auf geeigneten Kohlenhydrat-haltigen Nährmedien extrazellulär Pullulan akkumulieren (UEDA et al., Appl.Mikrobiol.11, 211-215 [1963]). Von Nachteil ist, daß nur relativ geringe Mengen an Pullulan produziert werden, oder daß schleimbildende und farbige Nebenprodukte in das Medium abgegeben und zusammen mit dem Rohpullulan isoliert werden, die die Eignung des Produktes als Lebensmittelzusatzstoff bzw. als Substrat für enzymatische Reaktionen herabsetzen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines mikrobiellen Polysaccharids vom Typ des Pullulans, um die Palette der bekannten Verfahren zur Herstellung von Glucose-haltigen Polymeren durch einen neuen effektiven Prozeß zur Herstellung von reinem Endprodukt zu erweitern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe ein mikrobielles Polysaccharid (Glucan) vom Typ des Pullulans unter Verwendung billiger Einsatzstoffe in guten Ausbeuten auf fermentativem Wege produziert und in reiner Form erhalten werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus der Gattung Pullularia, vorzugsweise der Art P.pullulans und insbesondere der Stamm P.pullulans Gr 3-66, unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Medium mit an sich bekannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und mit den in der Fermentationsindustrie üblichen Mineralsalzzusätzen zum Medium unter submersen Bedingungen kultiviert wird.

Der Mikroorganismus P.pullulans Gr3-66 ist in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 43826 hinterlegt worden.

Die Kultivierung und der Erhaltung des eingesetzten Mikroorganismus der Gattung Pullularia, vorzugsweise der Art P.pullulans und insbesondere des neuen Stammes ZIMET 43826, wird wie folgt vorgenommen:

Lyophilisierte Myzelfragmente werden auf Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien eingeimpft, und das entstandene Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 20°C und 38⁰C, vorzugsweise 26°C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 5 Tagen, bei einer Azidizät kultiviert, die beständig über pH 4,0 liegt. In der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird ein Aziditätsverlauf gewählt, der zum Beginn der Fermentation zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt und während der Fermentation durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise von NaOH, im Bereich von pH 4,0 bis pH 6,0-gehalten wird. Als Kohlenstoff- und Stickstoffcfuellen sowie Mineralsalze können die in der Fermentationsindustrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden. Die Fermentation des eingesetzten Stammes kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentern bzw. V2A-Tanks durchgeführt werden. Der Nachweis der Bildung des Polysaccharide erfolgt durch Messung der zunehmenden Viskosität der Fermentationslösung sowie des Verbrauchs des eingesetzten Substrates.

Die Aufarbeitung wird am Ende der Fermentation durch Separation der Kulturlösung und Abtrennung der Biomasse (Filtration) eingeleitet.

Rohpolysaccharid wird durch Zusatz von hydrophilen organischen Lösungsmitteln zur Kulturlösung als tiefbraune amorphe Masse ausgefällt. Die weitere Reinigung erfolgt durch Lösung in heißem Wasser und nachfolgende alternierende Behandlung mit Aktivkohle und Hypochlorit-Lösung, vorzugsweise Natriumhypochlorit-Lösung, und erneutes Ausfällen aus der wäßrigen Lösung mithydrophilen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol oder Aceton, wobei diese Reinigungs- und Fällungsprozedur gegebenenfalls wiederholt wird. Es wird farbloses Polysaccharid enthalten, das durch folgende Eigenschaften charakterisiert ist:

Aussehen: weißes Pulver (nach Vermahlung)

Chemische Analyse: C40,03%H6,05%

Spezifische Drehung: [a]₅₄₆=+166,6° (Wasser)

[a]° =+118,9 Hydrolyse: 2NHCI,98°C,6Min.-60Min.

ergibt Gemische von Maltotriose und Glucose,

Totalhydrolyse in 2 N HCI (8 h, 98°C) ergibt Glucose

Die Vorteile der Erfindung werden wie folgt gesehen:

— Durch das Verfahren wird ein reines Polysacchararid hergestellt, das in seinen Eigenschaften dem Pullulan vergleichbar ist.

— Das mikrobiologische Verfahren unter Verwendung von P.pullulans ZIMET 43826 als Mikroorganismus führt zur Gewinnung von Rohprodukt in vergleichsweise sehr guten Ausbeuten.

— Das so erhaltene durch seine tiefbraune Farbe und begleitende Schleimstoffanteile nicht verwendungsfähige Rohprodukt kann effektiv durch Behandeln mit entfärbenden Mitteln wie Hypochlorit und Aktivkohle gereinigt und von Begleitstoffen befreit werden. Dadurch wird ein für biochemische Zwecke und Anwendungen in der Lebensmittelindustrie potentiell brauchbares Produkt erhalten.

Ausf ü hru ngsbeispiel

An einem Ausführungsbeispiel soll die Erfindung näher erläutert werden.

Lyophilisierte Myzelfragmente werden auf AL-53-Agarmedium ausgestrichen und 10 Tage lang bei 28°C angezogen. Zusammensetzung des AL-53-Mediums: 3,0g Saccharose 15,0g Dextrin 0,1 g Harnstoff 0,5g NaCI 0,5g KH₂PO₄ 1,0g Hefeextrakt 5,0 g Pepton

1,0ml FeSO₄(1%ige Salzlösung) 15,0g Fadenagar 1000ml Aqua dest pH 7,2

Inokulumkulturen werden durch Einsaat von Myzelstücken einer Agarkultur in ein Medium folgender Zusammensetzung erhalten (g/l):

Sojamehl 40, Glukose 40, NaCl 2.5, NaCO₃ 5, KH₂PO₄ 0.25, pH 6.3. Die zweite Vorkultur erfolgt auf gleichem Medium. Nach 48stündigerBebrütung der Vorkultur (500ml-Steilbrustflaschen,80ml Inhalt, 25 ⁰C, Rundschwingtisch, 180UpM) wird die stufenweise Maßstabvergrößerung durch Übertragung von Kulturproben in 51-Steilbrustflaschen (0.51) Medium und weitere 24 Stunden Bebrütung 27°C durchgeführt.

Für die Kultivierung in Fermentern wird ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet (g/l): Glucose 60, Pepton 5, (NH₄J₂SO₄ 5, MgSO₄ · 7H₂O 5, CaCO₃ 10, KH₂PO₄ 0.5. Die Belüftung erfolgt mit steriler Luft (1:1), die Fermentationszeit beträgt 120h, die Rührgeschwindigkeit 280 UpM. Die Schaumbildung kann in an sich bekannter Weise durch Zusatz kleiner Mengen an siliconhaltigen Antischaumitteln kontrolliert werden. pH 5.5-6.0 (NaOH).

Die Ausbeute an Roh-Polysaccharid (Trockenmasse nach Ethanolfällung) beträgt nach 120-stündiger Fermentation 20-24g/l. Nach Separation der Kulturlösung vom Myzel wird diese im Verhältnis 1:1 mit Ethanol (oder Methanol) versetzt, das Polysaccharid als braun-schwarze gallertartige Masse ausgefällt und durch Filtration gewonnen.

Anschließend wird das Rohprodukt im gleichen Volumen heißem Wasser (20I) gelöst und mit 500g Aktivkohle behandelt. Nach dem Abfiltrieren wird die Lösung (151) nochmals auf 90⁰C erhitzt und 30 Min. mit 1,51 Natriumhypochlorit-Lösung (3%ig) behandelt. Anschließend wird filtriert und aus dem Filtrat das Polysaccharid mit dem gleichen Volumen an Methanol oder Aceton ausgefällt. Die Endreinigung erfolgt durch Wiederauflösung des gefällten Produktes in heißem Wasser und Kochen mit 200g Aktivkohle (0,5 h, 95⁰C). Nach dem Abfiltrieren wird das Polysaccharid aus der erkalteten Lösung durch Zusatz von Methanol oder Aceton ausgefällt. Das erhaltene farblose Produkt wird bei 50⁰C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute: 65g reinweißes Polysaccharid.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids vom Typ des Pullulans durch aerobe Fermentation eines Pilzes der Gattung Pullularia in sterilen, flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, gekennzeichnet dadurch, daß

— der Mikroorganismus P.pullulans Gr3-66 (Stamm ZIMET43826) bei einer Azidität, die beständig über pH 4,0 liegt, kultiviert und

— das gebildete Polysaccharid nach Ausfällung aus der Kulturlösung durch alternierende Behandlung mit Aktivkohle und Hypochlorit-Lösung gereinigt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Stamm P.pullulans Gr3-66 für die Dauer von 2 Tagen bis 6 Tagen bei einer Temperatur zwischen 20°C und 38°C kultiviert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß Stamm P.pullulans Gr3-66 für die Dauervon 5 Tagen bei einerTemperaturvon 26⁰C und einer Azidizät kultiviert wird, die bei Fermentationsbeginn zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt sowie anschließend im Bereich von pH 4,0 und pH 6,0 gehalten wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Azidität durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise von NaOH, im Bereich zwischen pH 4,0 und pH 6,0 gehalten wird;

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß nach Separation und Filtration der Kulturlösung durch hydrophile organische Lösungsmittel, vorzugsweise durch Ethanol, Methanol oder Azeton, ein Rohpolysaccharid ausgefällt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Rohpolysaccharid durch Lösung in heißem Wasser sowie alternierende Behandlung mit Aktivkohle undNatriumhypochlorit-Lösung und erneutes Ausfällen mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln, gegebenenfalls unter Wiederholung dieses Reinigungs- und Fällungsschrittes, weiter zu einem Polysaccharid vom Typ des Pullulans gereinigt wird.