DD261843A1 - Substratspezifische enzymelektrode - Google Patents
Substratspezifische enzymelektrode Download PDFInfo
- Publication number
- DD261843A1 DD261843A1 DD30372887A DD30372887A DD261843A1 DD 261843 A1 DD261843 A1 DD 261843A1 DD 30372887 A DD30372887 A DD 30372887A DD 30372887 A DD30372887 A DD 30372887A DD 261843 A1 DD261843 A1 DD 261843A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- enzyme
- electrode
- substrate
- enzymes
- specific enzyme
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010439 graphite Substances 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 claims 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010580 coupled enzyme reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft eine substratspezifische Enzymelektrode zur Bestimmung von Substanzen in Loesung und ist fuer den Einsatz in der analytischen Chemie, in der medizinischen Diagnostik und der Biotechnologie geeignet. Die bekannten Enzymelektroden bestehen aus einem Festkoerper (z. B. Kohle) mit einem kovalent oder adsorptiv gebundenen Enzym auf der Oberflaeche. Das Ziel der Erfindung besteht darin, in der katalytisch aktiven Schicht auf der Festkoerperoberflaeche in enger raeumlicher Nachbarschaft zwei Enzyme funktionell miteinander zu koppeln. Die Merkmale der Erfindung bestehen in der Koimmobilisation mehrerer Enzyme auf der Elektrodenoberflaeche, wobei ein Produkt oder ein Nebenprodukt der in einer Kettenreaktion oder in einem Zyklus arbeitenden Enzyme die amperometrische Messgroesse proportional dem zu messenden Stoff liefert. Erfindungsgemaess wird eine Verstaerkung und Einstellbarkeit des Messsignals durch geeignete Wahl der Enzymaktivitaeten und eine Rueckkopplung, sowie durch Variation der Konzentration der Kosubstrate oder Kofaktoren erreicht.
Description
Die Erfindung betrifft eine substratspezifische Enzymelektrode zur Bestimmung von Substanzen in Lösung mit Hilfe funktionell gekoppelter Enzyme und kann in der analytischen Chemie, der medizinischen Diagnostik und der Biotechnologie angewendet werden.
Zur Substratbestimmung sind Festkörperelektroden mit einem immobilisierten Enzym auf der Oberfläche bekannt. Das Enzym wird entweder kovalent gebunden (Anal. Chim. Acta 142 [1982] 277,158 [1984] 137; Anal. Chem. 48 [1976] 1 679, 52 [1980] 1198, 53 [1981] 2090, 54 [1982] 1 098, 56 [1984] 667) oder adsorbiert (Bioeiectrochem. Bioenerg. 12 [1984] 297,13 [1984] 163; Anal. Chim. Acta 169 [1985] 237; Agric. Biol. Chem. 48 [1984] 1 969; J. Electroanal. Chem. 48 [1984] 289). Diese Elektroden werden auf der Basis von Glucoseoxidase zur Glucosebestimmung genutzt. In einigen Ausführungen sind die zur enzymatischen Reaktion notwendigen Elektronendonatoren der Meßlösung zugesetzt oder in der katalytischen Schicht fixiert. Bei allen bekannten Lösungen ist nur ein Enzym an der Elektrode immobilisiert. Dadurch sind diese Elektroden auf die direkte, einstufige Umwandlung der zu messenden Substanzen bei gleichzeitiger Entstehung elektrodenaktiver Verbindungen beschränkt. Weiterhin besteht dadurch der Nachteil, daß für Enzymmembranen eingeführte Verfahren, wie Substratverstärkung, Kofaktorrecycling, Kompetition und Interferenz nicht angewendet werden können.
Ziel der Erfindung ist eine Multienzymelektrode, die durch Eliminierung von Transportvorgängen eine verbesserte und einstellbare Empfindlichkeit für Substanzen in Lösung erreicht.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine substratspezifische Enzymelektrode zu entwickeln, die die Vorteile optimaler Transportbedingungen für die Reaktionsprodukte in der oberflächennahen katalytischen Schicht und zur Elektrode zu nutzen gestattet.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß auf einer Elektrodenoberfläche zwei oder mehr Enzyme koimmobilisiert sind, wobei die Enzyme in einer Reaktionsfolge oder in einem Reaktionszyklus miteinander gekoppelt sind. Zur Langzeitstabilisierung der katalytischen Enzymschicht ist diese mit bekannten semipermeablen Membranen aus synthetischen oder natürlichen Materialien abgedeckt. Die festen Elektroden bestehen entweder aus nichtporöser Kohle oder anisotropem bzw. isotropem Graphit.
Mit der erfindungsgemäßen Elektrode wird diezu messenae Substanz von einem Enzym in bekannter Weise umgewandelt. Das entstehende Produkt oder ein Nebenprodukt dienen als Substrat für ein zweites Enzym. Dessen Produkte oder Koprodukte initiieren beliebige weitere Enzyme oder bewirken eine Rückkopplung mit dem ersten oder einem anderen Enzym z.B. in Form eines Recycling mit oder ohne Substratamplifizierung. Erfindungsgemäß schränkt die räumliche Anordnung mehrerer nahestehender oder sich berührender Enzym moleküle direkt auf der Elektrodenoberfläche die Transporti imitierungen zwischen den Enzymen weitgehend ein.
Erfindungsgemäß läßt sich die Menge der in der gekoppelten Enzym reaktion entstehenden und als Meßgröße dienenden elektrodenaktiven Moleküle mittels Konzentrationsvariation von reaktionsabhängigen Kosubstraten oder Hilfsstoffen beeinflussen. In Bezug auf gleiche Analytkonzentrationen werden so Meßsignale unterschiedlicher Intensität erzeugt. Nach bekannten elektrochemischen Prinzipien wird die Zu- oder die Abnahme der elektrodenaktiven Verbindungen als quantitatives Maß für den zu messenden Analyt genutzt, nachdem die erfindungsgemäße Elektrode in die Meßlösung mit den Hilfssubstanzen eingebracht und bei einem definierten Potential polarisiert wurde. Der Analyt wird in die Meßlösung injiziert und die Stromänderung mit Hilfe von Eichlösungen der gesuchten Konzentration zugeordnet.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Enzymelektrode bestehen darin, daß die Enzymkopplung direkt auf der Elektrodenoberfläche die Empfindlichkeit durch den Wegfall von Diffusionsprozessen erhöht und die Möglichkeit einer chemischen Beeinflussung der enzymatischen Reaktionsschritte in Bezug auf das Meßsignal bietet. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Elektrodenpräparation
Die polierte Fläche einer seitlich isolierten Elektrode aus nichtporöser Kohle oder Graphit wird 10 min bei 297 K in 0,5 ml einer Lösung von 10U Glucoseoxidase und 200 U Lactoperoxidase in Natriumacetatpuffer (pH 5,5,0,1 mol/l) getaucht und anschließend lOmin.in Pufferlösung gewaschen.
Die so hergestellte Enzymelektrode wird in eine elektrochemische Meßzelle mit Platingegenelektrode eingebaut.
Meßvorgang
In die Meßzelle werden 5 ml einer Lösung,bestehend aus Natriumacetatpuffer (pH 5,5,0,1 mol/l) und 20pmol/l Hydrochinon gegeben. Nach Polarisation der Arbeitselektrode auf +100 mV mit Hilfe eines rechnergestützten elektrochemischen Meßsystems ECM 700 werden 100 μΙ einer auf Glucose zu untersuchenden Lösung in die Meßzelle injiziert. Nach Eichung des Meßsignale mit Glucosestandardlösungen kann die Glucosekonzentration der Meßprobe aus der sich einstellenden Benzochinonkonzentration an der Enzymelektrode bestimmt werden. Durch Vorlage anderer Hydrochninonkonzentrationen (z. B. 5 μηιοΙ/Ι oder 300μιτιοΙ/Ι) kann das Meßsignal verkleinert bzw. vergrößert werden.
Eine polierte Elektrode aus anisotropem oder isotropem pyroiytischen Graphit wird 10 min in eine Lösung aus 2OU Glucoseoxidase und 180U Meerrettich-Peroxidase in Natriumacetatpuffer (pH 5,5,0,1 mol/l) getaucht danach 10min in Pufferlösung gewaschen und analog Beispiel 1 zur Glucosebestimmung verwendet. Zur Langzeitstabilisierung wird vor der ersten Verwendung eine semipermeable Celluloseacetatmembran straff über die Enzymelektrode gespannt.
Eine entsprechend dem Beispiel 1 hergestellte Enzymelektrode wird mit einem 20 μηη dicken Film wäßriger Alginatlösung versehen und nach 2h Härtung in 5%iger Calciumchloridlösung analog Beispiel 1 in die Meßlösung eingebracht. Nach Polarisation der Enzymelektrode auf+400 mV kann die Abnahme der aktuellen Hydrochinonlösung in der katalytisch aktiven Schicht nach Injektion der auf Glucose zu untersuchenden Lösung bestimmt und mit Hilfe von Glucosestandardlösungen geeicht werden. Die Variation der vorgelegten Hydrochinonkonzentrationen ist ebenso wie in Beispiel 1 möglich.
Claims (4)
1. Substratspezifische Enzymelektrode, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer festen Elektrode aus Kohlematerialien zwei oder mehr Enzyme koimmobilisiert sind und ggf. die Enzymschicht mit semipermeablen Membranen aus natürlichen oder künstlichen Materialien abgedeckt ist.
2. Substratspezifische Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die festen Elektroden aus nichtporöser Kohle oder isotropem Graphit bestehen.
3. Substratspezifische Enzymelektrode nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Enzyme in einer Reaktionsfolge oder in einem Reaktionszyklus miteinander gekoppelt sind.
4. Substratspezifische Enzymelektrode nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von reaktionsabhängigen Kosubstraten oder Hilfsstoffen zur Einstellung der Größe des elektrischen Meßsignals variiert wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30372887A DD261843A1 (de) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | Substratspezifische enzymelektrode |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30372887A DD261843A1 (de) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | Substratspezifische enzymelektrode |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD261843A1 true DD261843A1 (de) | 1988-11-09 |
Family
ID=5589756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD30372887A DD261843A1 (de) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | Substratspezifische enzymelektrode |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD261843A1 (de) |
-
1987
- 1987-06-12 DD DD30372887A patent/DD261843A1/de not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE68911299T3 (de) | Enzymelektrode und verfahren zur herstellung. | |
| DE69025470T2 (de) | Elektrische enzymfühlerelektrode sowie deren herstellungsverfahren | |
| Yao | A chemically-modified enzyme membrane electrode as an amperometric glucose sensor | |
| US4404066A (en) | Method for quantitatively determining a particular substrate catalyzed by a multisubstrate enzyme | |
| Florescu et al. | Development and evaluation of electrochemical glucose enzyme biosensors based on carbon film electrodes | |
| Mizutani et al. | Amperometric determination of pyruvate, phosphate and urea using enzyme electrodes based on pyruvate oxidase-containing poly (vinyl alcohol)/polyion complex-bilayer membrane | |
| AT408662B (de) | Creatinin-sensor | |
| Mascini et al. | Glucose electrochemical probe with extended linearity for whole blood | |
| Shkotova et al. | Thin-film amperometric multibiosensor for simultaneous determination of lactate and glucose in wine | |
| Pérez et al. | Amperometric bienzymatic biosensor for L-lactate analysis in wine and beer samples | |
| Sahin et al. | Polyvinylferrocenium based platinum electrodeposited amperometric biosensors for lysine detection | |
| Hnaien et al. | A rapid and sensitive alcohol oxidase/catalase conductometric biosensor for alcohol determination | |
| DE4310322A1 (de) | Assayvorrichtung und Assayverfahren | |
| DE69023440T2 (de) | Immobilisierte Alkoholoxydase, Methode zu deren Herstellung und Messgerät. | |
| Palleschi et al. | Amperometric probe for 3-hydroxybutyrate with immobilized 3-hydroxybutyrate dehydrogenase | |
| DD261843A1 (de) | Substratspezifische enzymelektrode | |
| EP1490503B1 (de) | Amperometrischer dickschicht-biosensor zur bestimmung der wasserstoffperoxid-konzentration in einer lösung und verfahren zur herstellung des sensors | |
| Kuntawong et al. | A Prussian Blue Modified Electrode Based Amperometric Sensor for Lactate Determination | |
| DE10212570B4 (de) | Amperometrischer Dickschicht-Biosensor zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration in einer Lösung und Verfahren zur Herstellung des Sensors | |
| DE19619056C2 (de) | Verfahren und Sensor zur enzymatisch-elektrochemischen Bestimmung von Substraten NAD·+·- und NAD(P)·+·-abhängiger Dehydrogenasen | |
| MACHOLÁN et al. | Assays of Urea and Arginase with a Biocatalytic Membrane Electrode | |
| DD280790A1 (de) | Biosensor und verfahren zur bestimmung von mediatoren | |
| Li et al. | Enhancement of the sensitivity and selectivity of oxidation of H2O2 on platinum wire at low working potential by platinization and covering of heteropolypyrrole film for amperometric micro-biosensor construction | |
| DE2659071A1 (de) | Verfahren zum elektro-chemischen nachweis eines enzymsubstrats und dafuer geeignete elektrode | |
| DD277759A1 (de) | Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen bestimmung von stoffwechselprodukten |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |