DD263081A1 - Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen - Google Patents
Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen Download PDFInfo
- Publication number
- DD263081A1 DD263081A1 DD30513687A DD30513687A DD263081A1 DD 263081 A1 DD263081 A1 DD 263081A1 DD 30513687 A DD30513687 A DD 30513687A DD 30513687 A DD30513687 A DD 30513687A DD 263081 A1 DD263081 A1 DD 263081A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- protein
- gene
- dna
- restriction site
- expression cassette
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 claims description 10
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 claims description 9
- 235000002096 Vicia faba var. equina Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005489 dwarf bean Nutrition 0.000 claims description 9
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 claims description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000010435 extracellular transport Effects 0.000 claims description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 claims description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101150000102 LEB4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Transformation von Fremdgenen in Pflanzen, vor allem zur Expression bestimmter, ernaehrungsphysiologisch wichtiger Proteine in Pflanzensamen, speziell von Leguminosen oder Getreiden. Dazu wird die Verwendung einer Expressionskassette vorgesehen, die mehrteilig aus einem Vektorplasmid und einer Deletionsmutante besteht und einen unikalen Restriktionsort zur Einligierung einer beliebigen, vor allem aber proteinogenen DNS-Sequenz aufweist, die nach der mit bekannten Mitteln durchgefuehrten Transformation exprimiert wird. Figur
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von beliebigen DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.
Es ist seit langem bekannt, speziell für diesen Zweck isolierte Gene in höhere Pflanzen einzuschleusen, um auf diese Weise bestimmte, vererbbare Veränderungen im Genom dieser Pflanzen herbeizuführen. Eine Voraussetzung für die Expression der übertragenen Gene ist dabei, daß sie über eine pflanzenspezifische Promotorsequenz verfügen. So ist es beispielsweise bereits gelungen, bestimmte Gene in höheren Pflanzen zu exprimieren, um deren Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide zu verbessern. Man verwendet dazu sogenannte konstitutive Promotoren wie den Promotor des Nopalinsynthase-Gens/1/, den TR-Doppelpromotor/4/ oder den Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohl-Mosaikvirus/5/.
Diese Promotoren sind in allen oder mindestens in vielen Geweben der manipulierten Pflanzen aktiv, und das ist nicht in jedem Fall erforderlich oder erwünscht. Es sind vielmehr häufig bessere Ergebnisse zu erwarten, wenn die Promotoren nur dort wirksam sind, wo das Pflanzengewebe tatsächlich verändert werden soll. Besonders vorteilhaft wäre es an sich auch, wenn der Vorgang in das günstigste Entwicklungsstadium der Pflanzen fiele. Die angegebenen bekannten Promotoren vermögen diesen Forderungen aber nicht gerecht zu werden. Aus diesem Grunde sind auch schon gewebe- und entwicklungsspezifische Promotoren isoliert worden, wobei man sich entweder sogenannter Promotorsuchplasmide oder des screening in Gen-Banken mit entsprechenden mRNS-Populationen als Hybridisierungsproben bedient; es konnten antheren-, ovarien-, bluten-, blätter-, laubblätter-, stengel-, wurzel- und samenspezifische Gene mit ihren zugehörigen Promotoren isoliert werden/2/. Davon sind vor allem die samenspezifischen Promotoren wegen der Bedeutung von Pflanzensamen für die Ernährung von großer Wichtigkeit. Als ergiebige Quelle für samenspezifische Regulationssequenzen stehen die Promotoren der von verschiedenen Pflanzenarten bereits Monierten und sequentiellen pflanzensamenproteinspezifischen Gene zur Verfügung/3; 6; 7/. Es fehlt jedoch bisher ein universell einsetzbares Übertragungsvehikel für Fremdgene zu deren pflanzensamenspezifischer Expression.
Die Erfindung hat das Ziel, Gene in Pflanzensamen zur Expression zu bringen, deren Expressionsprodukte Proteine sind, welche als solche aus den Pflanzensamen zu gewinnen sind oder ihre physiologische Wirkung bei der ernährungsmäßigen Nutzung der Pflanzensamen entfalten.
Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, für Gene der eingangs näher bezeichneten Art, deren proteinkodierende und regulative DNS-Abschnitte durch Sequenzanalyse ermittelt worden sind, ein geeignetes Transportmittel für die Einschleusung in das Genom der Empfängerpflanzen mit nachfolgender samenspezifischer Expression bereitzustellen, das einfach herstell- und universell anwendbar ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden, daß die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbereich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden, daß die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen-Transformationsvektor so einligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen-Transformationsvektor die Transformation der gesamten Expressionskassette in höhere Pflanzen übernimmt, daß in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS-Sequenz einligiert wird und daß die DNS-Sequenz in Pflanzensamen höherer Pflanzen exprimiert wird. Es ist zweckmäßig, daß die Expressionskassette auf der Basis eines Gens für ein Protein in Pflanzensamen, beispielsweise von Leguminosen oder Getreiden, konstruiert wird, welches aus einer Genbank selektiert wird, wobei das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Legumin/6/kodiert, aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird. Es ist auch möglich, daß das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Vicilin (Anlage 1) kodiert, aus einer
Genbank der Ackerbohne selektiert wird, genauso wie das Gen, welches für das in Pflanzensamen exprimierte Protein USP (Anlage 2) kodiert. Es ist erforderlich, daß aus einer cDNS-Bank der Ackerbohne Klone mit spezifischen Inserts von Legumin-, Vicilin- oder USP-DNS selektiert und durch Sequenzierung deren cDNS-Nukleotidsequenzen ermittelt werden, und daß die genomische Sequenz eines Proteins mit der zugehörigen cDNS-Nukleotidsequenz verglichen und daraus bestimmt wird, wo sich die proteinkodierenden, die regulativen DNS-Abschnitte und wo sich Intronsequenzen befinden. Im einzelnen ist es dann zweckmäßig, daß das in dem Vektorplasmid vorliegende Gen an einem im proteinkodierenden DNS-Abschnitt gelegenen, unikalen Restriktionsort geschnitten wird, daß die beidseitig vom Restriktionsort gelegenen beiden Teile des proteinkodierenden DNS-Abschnittes entfernt, die beiden so entstandenen Enden des Gens stumpf gemacht und über Linker unter Wiederherstellung eines unikalen Restriktionsortes rezirkularisiert werden. Es ist denkbar, daß die beidseitig vom unikalen Restriktionsort gesetzte Deletion den gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnittdes Gens erfaßt, aber günstiger, wenn dies ausschließlich der Signalpeptidsequenz und der durch die Signalpeptidase erkennbaren Proteinstruktur erfolgt, und wenn die Deletion die Signale zum intra- und extrazellulären Transport der Proteine nicht berührt. Es ist auch vorteilhaft, wenn die im Vektorplasmid vorliegende Deletionsmutante mittels Restriktasen gewonnen und in den durch kompatible Restriktasen . geöffneten Pflanzen-Transformationsvektor unter Erhalt der Expressionskassette so einligiert wird, daß der 3'seitig vom Promotor des Gens gelegene unikale Restriktionsort zur Einligierung der DNS-Sequenz erhalten bleibt. Es ist möglich, daß eine DNS-Sequenz, die für ein Protein mit physiologischer Wirkung im menschlichen Organismus kodiert, aus einer cDNS-Bank selektiert wird bzw. aus dieser cDNS-Bank ein Klon selektiert wird, der die vollständige doppelsträngige cDNS-Kopie der mRNS des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators enthält. Es ist schließlich möglich, daß die DNS-Sequenz des gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnittes mittels Restriktasen gewonnen wird und daß die proteinkodierende DNS-Sequenz des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators in den mittels Restriktasen geöffneten unikalen Restriktionsort der Expressionskassette einligiert wird und mit dieser Konstruktion höhere Pflanzen transformiert werden. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beliebige, vor allem proteinkodierende DNS-Sequenzen durch Überführung in eine Expressionskassette in den Zustand der direkten Transformierbarkeit in das Genom höherer Pflanzen versetzt. Ihre Expression erfolgt bevorzugt im Zellgewebe von Pflanzensamen. Die Vielfalt der verfahrensgemäß herstellbaren Expressionskassetten erlaubt eine Wahl nach dem Kriterium des gewünschten intra-oder extrazellulären Ortes der Lokalisation derexprimierten Proteine,
Die Erfindung wird nachstehend — zum Teil an Hand einer Zeichnung — an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Dabei werden drei Varianten der Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette dargestellt und auf der einzigen Figur der Zeichnung verdeutlicht.
a) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein USP
Das mit USP bezeichnete ,unbekannte' Samenprotein USP hat ein Molekulargewicht von 30 kD. Seine Funktion konnte noch nicht ermitteltwerden.USP-kodierendemRNS hat einen Anteil von 80%am poly-AtRNS-Gehalt in frühen Stadien sich entwickelnder Samen der Ackerbohne/8/. Durch Translation hybridselektierter mRNS werden USP-spezifische cDNS-Klone identifiziert. Einige dieser cDNS-Klone werden sequentiell und als spezifische Hybridisierungsprobe für die Isolierung entsprechender genomischer Klone aus einer Genbank benutzt/9/. Ein etwa 3,5kb großes Pst-I-Fragment eines genomischen Klones λ Vf 30.1 wird im Sequenzierungsvektor H13 mp 18 und mittels Sanger-Technik/10/ sequentiell. Durch Vergleich der cDNS-Nukleotidsequenzen mit der genomischen Sequenz können nun Promotorbereich, proteinkodierende und regulative DNS-Abschnitte sowie Intronsequenzen bestimmt werden (Anlage 2). Die Klonierung des 3,5 kb großen Pst-I-Fragmentes in einem Vektorplasmid pUC 18 ergibt das für die Konstruktion einer Expressionskassette verwendbare Plasmid pUC 18/Pst30.1 (Fig.). Die in diesem Plasmid jeweils unikalen Restriktionsorte Bstxl am Übergang vom proteinkodierenden zum regulativen DNS-Abschnitt und Hind IM (in der Zeichnung teilweise verkürzend mit H III bezeichnet) im Polylinker des Plasmids werden gespalten. Das restliche Plasmid wird nach Erzeugung glatter Enden mit Hilfe von T4-Polymerase und Einfügung von Bgl-Il-Linkern zirkularisiert/11/. Es entsteht ein mit pUC18/USPP bezeichnetes Plasmid (Fig.). Das USP-Promotorfragment liegt in diesem Plasmid als ein Bam-Hl-Bgl-Il-Fragment vor und wird in ein durch Bgl-Il-Spaltung geöffnetes Vektorplasmid pGA471/12/ kloniert. Dabei entsteht auf der einen Seite ein weder durch BgI Il noch durch BAM HI spaltbarer, mit BB bezeichneter Ort und auf der anderen Seite ein unikaler Bgl-Il-Ort. Das so konstruierte Plasmid wird mit 471/USPP bezeichnet und ist die Expressionskassette. Es handelt sich um einen für den Ti-Plasmid-vermittelten Gentransfer geeigneten Binärvektor, der in Agrobakterien-Stämme konjugiert und für die Transformation höherer Pflanzen benutzt wird. Der Einbau einer beliebigen DNS-Sequenz in den unikalen Bgl-Il-Ort der Expressionskassette stellt diese unter die Kontrolle des USP-Promotors. Es ist vorteilhaft, die einzubauende DNS-Sequenz mit GATC-Enden zu versehen, d.h., sie sollte als Bam-Hl-, BgI-II-, BcI-I-, San-3A-oder Mbo-I-Fragment vorliegen.
b) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein Legumin
Ein Gen LEB4/13; 14/des Samenproteins Legumin liegt in einem Plasmid pUC 18/BgI II4 (Fig.) als ein 4,7kb großes BgI-II-Fragment vor. Dieses Plasmid wird am unikalen BAM-HI-Ort geöffnet und partiell mit der Exonuklease BaI 31 und anschließend zur Entfernung der 3'seitig vom ursprünglichen BAM-HI-Ort gelegenen proteinkodierenden Sequenzen mit Sal I verdaut. Nach der Erzeugung von glatten Enden wird das Plasmid unter Einfügung von BAM-HI-Linkem zirkularisiert. Aus der so entstandenen Plasmid-Schar mit unterschiedlicher Lage des Delektionspunktes wird ein Klon ρΔ4/12 ausgewählt. Der BAM-HI-Linker liegt bei diesem Klon unmittelbar vor dem AUG-Startkodon/13/, so daß die gesamte 5'seitig nichttranslatierte Sequenz erhalten bleibt. Im so erhalten Plasmid wird zusätzlich der unikale Sst-I-Ort im Polylinker durch Einfügung eines Bgl-Il-Linkers in einen Bgl-Il-Ort umgewandelt, wodurch das Promotorfragment als Bgl-Il-Hind-Ill-Fragment isoliert werden kann. Es entsteht ein als ρΔ4/12ΒΒ bezeichnetes Plasmid (Fig.). Das Bgl-Il-Hind-Ill-Promotorfragment wird nun in den Bgl-II-Hind-lll-geöffneten Binärvektor pGA471 wie unter a) beschrieben kloniert. Es entsteht so eine samenspezifische Expressionskassette mit einem unikalen BAM-HI-Ort auf der Basis des Legumin-Promotors analog a).
Aus der Plasmid-Schar kann ferner ein Klon ρΔ4/4 ausgewählt werden, in dessen BAM-HI-Linker drei Nukieotide hinter dem die Signalsequenz kodierenden Bereich geschnitten wird. Durch Umwandlung des unikalen Sst-I-Ortes in einen Bgl-Il-Ort durch Einfügung entsprechender Linker wird der Abschnitt Promotor/Signalsequenz/kodierender Teil als Bgl-Il-Hind-Ill-Fragment isolierbar und kann in den Bgl-ll-Hind-lll-geöffneten Binärvektor pGA471 einkloniert werden. Das so erhaltene Plasmid 471 /leg P ist die Expressionskassette. In ihr stehen die in den Bam-Hl-Ort einklonierten DNS-Sequenzen nicht nur unter der Kontrolle des Legumin-Promotors, sondern darüber hinaus die Genprödukte unter der Kontrolle der Legumin-Signalsequenz,.die eine entsprechende Kanalisierung in vakuoläre Kompartimente gewährleistet
c) Konstruktion einer Expressionskassette für das Samenprotein Vicilin
Vicilin ist eines der beiden wichtigsten Reserveproteine inden Samen der Ackerbohne. Über isolierte poly A+-RNS aus frühen bis mittleren Reifestadien dieser Samen wird doppelsträngige DNS synthetisiert und eine cDNS-Bank eingerichtet, wobei vicilinspezifische Klone mittels Hybridisierungsselektion und in-vitro-Translation der mRNS identifiziert werden/13/. Diese Klone dienen wie oben als Hybridisierungsprobe für die Isolierung entsprechender genomischer Klone. Ein etwa 3,2kb großes Eco-Rl-Fragment wird in einem Sequenzierungs-Vektor M13 mp 18 kloniert und sequentiert/11/. Durch Vergleich mit cDNS-Sequenzen/9/ werden proteinkodierende von regulativen DNS-Abschnitten unterscheiden. Das in ein Plasmid pUC9 umklonierte, 3,2kb große genomische Eco-Rl-Fragment ergibt das Plasmid pUC9/Vid.1 (Fig.). Durch Verdauung mit Xba I wird der Teil des Genes entfernt, der 3'seitig von der Spaltungsstelle der Signalsequenz liegt. Durch Einligieren eines Bgl-Il-Linkers wird das Plasmid zirkularisiert zu dem Plasmid pUC9/VicP-S (Fig.). Der Promotorteil des Vicilin-Genes einschließlich des für die Signalsequenz kodierenden Bereiches wird durch Eco-Rl-Bgl-Il-Verdauung isoliert und in den Eco-RI-Bgl-ll-geöffneten Binärvektor pGA 471 einligiert: es entsteht als Expressionskassette das Plasmid 471/VicP-S (Fig.). Beim Einbau einer beliebigen DNS-Sequenz in den unikalen Bgl-Il-Ort dieses Plasmids steht diese in transgenischen Pflanzen unter der Kontrolle des Vicilin-Promotors und das Genprodukt unter Kanalisierungskontrolle der Vicilin-Signalsequenz.
Literatur
1 Herera-Estrella, L, A.Depicker, M. van Montagu, J. Schell, Nature (London) 303 (1983) 209-213.
2 Goldberg, R. B., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B314 (1986) 343-353.
3 Croy, R. R. D., J. A. Gatehouse (1985) Genetic Engineering of Seed Proteins: current and potential applications, in: Plant Genetic Engineering, ed. J. H. Dodds, Cambridge University Press.
4 Veiten, J., L.Veiten, R.Hani, J.Schull, EMBOJ.3 (1984) 2723-2730.
5 Koziel, M. G., T. L.Adams, M.A. Hazlet, D. Damm, J. Miller, D. Dahlbeck, S. Jayne, B. J.SIaskawicz, J. MoI. Appl. Genet. 2 (1984) 549-562.
6 Casey, R., C. Domoney, N. Ellis (1986) Legume storage proteins and their genes, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biol., im Druck.
7 Müntz, K., C. Horstmann, B.Schlesier, Biol. ZbI. 105 (1986) 107-120.
8 Bassüner, R., R. Mameuffel, K. Müntz, P. Püchel, P. Schmidt, und E.Weber, Biochem. Physiol. Pflanzen 178 (1983) 665-684.
9 Patentschrift DD 221756.
10 Sanger, F., S. Nicklen, A. R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74 (1977) 5463.
11 Maniatis, T, E. F. Fritsch und J. Sambrock, Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
12 An, G., B.D.Watson, S.Stachel, M.P.Gordon, E.W.Nester, EMBO J.4(1985) 277-284.
13 DD-Patentschrift240911.
14 Wobus, U.H.Bäumlein, R.Bassüner, U.Heim, R.Jung, K.Müntz, G.Saalbach und W.Wescheke, FEBS Lett. 201 (1986)74-80.
Claims (16)
1. Verfahren zum Einführen von beliebigen DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen, vorzugsweise von proteinogenen DNS-Sequenzuen für die Expression in Pflanzensamen, wobei
— zunächst ein vollständiges, beispielsweise pflanzensamenprotein-spezifisches Gen isoliert wird und
— danach die proteinkodierenden und regulativen DNS-Abschnitte durch Sequenzanalyse ermittelt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß
— die proteinkodierenden DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig aus dem in einem Vektorplasmid befindlichen Gen herausgeschnitten werden,
— die regulativen DNS-Abschnitte vollständig oder fast vollständig erhalten bleiben und unter Herbeiführung eines unikalen Restriktionsortes, der im Wirkungsbereich der regulativen DNS-Abschnitte liegt, zu einer Deletionsmutante vereinigt werden,
— die Deletionsmutante aus dem Vektorplasmid isoliert und in einen Pflanzen-Transformationsvektor so einligiert wird, daß der unikale Restriktionsort erhalten bleibt und eine Expressionskassette entsteht, in welcher der Pflanzen-Transformationsvektor die Transformation der gesamten Expressionskassette in höhere Pflanzen übernimmt,
— in den unikalen Restriktionsort der Expressionskassette eine beliebige DNS-Sequenz einligiert wird und
— die DNS-Sequenz in Pflanzensamen höherer Pflanzen exprimiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette auf der Basis eines Gens für ein Protein in Pflanzensamen, beispielsweise von Leguminosen oder Getreiden, konstruiert wird, welches aus einer Genbank selektiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Legumin kodiert, aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, welches für das in Pflanzensamen gespeicherte Protein Vicilin kodiert, aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, welches für das in Pflanzensamen exprimierte Protein USP kodiert, aus einer Genbank der Ackerbohne selektiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer cDNS-Bank der Ackerbohne Klone mit spezifischen Inserts von Legumin-, Vicilin- oder USP-DNS selektiert und durch Sequenzierung deren cDNS-Nukleotidsequenzen ermittelt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische Sequenz eines Proteins mit der zugehörigen cDNS-Nukleotidsequenz verglichen und daraus bestimmt wird, wo sich die proteinkodierenden, die regulativen DNS-Abschnitte und wo sich Intronsequenzen befinden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in dem Vektorplasmid vorliegende Gen an einem im proteinkodierenden DNS-Abschnitt gelegenen unikalen Restriktionsort geschnitten wird, daß die beidseitig vom Restriktionsort gelegenen beiden Teile des proteinkodierenden DNS-Abschnittes entfernt, die beiden so entstandenen Enden des Gens stumpf gemacht und über Linker unter Wiederherstellung eines unikalen Restriktionsortes rezirkularisiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die beidseitig vom unikalen Restriktionsort gesetzte Deletion den gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnitt des Gens erfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die beidseitig vom unikalen Restriktionsort gesetzte Deletion den proteinkodierenden DNS-Abschnitt ausschließlich der Signalpeptidsequenz und der durch die Signalpeptidase erkennbaren Proteinstruktur betrifft.
11. Verfahren nach Anspruch 1,8 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion die Signale zum intra- und extrazellulären Transport der Proteine nicht berührt.
12. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die im Vektorplasmid vorliegende Deletionsmutante mittels Restriktasen gewonnen und in den durch kompatible Restriktasen geöffneten Pflanzen-Transformationsvektor unter Erhalt der Expressionskassette so einligiert wird, daß der 3'seitig vom Promotor des Gens gelegene unikale Restriktionsort zur Einligierung der DNS-Sequenz erhalten bleibt.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNS-Sequenz, die für ein Protein mit physiologischer Wirkung im menschlichen Organismus kodiert, aus einer cDNS-Bank selektiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer cDNS-Bank ein Klon selektiert wird, der die vollständige doppelsträngige cDNS-Kopie der mRNS des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1,13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS-Sequenz des gesamten proteinkodierenden DNS-Abschnittes mittels Restriktasen gewonnen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1,8 und 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinkodierende DNS-Sequenz des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators in den mittels Restriktasen geöffneten unikalen Restriktionsort der Expressionskassette einligiert wird und mit dieser Konstruktion höhere Pflanzen transformiert werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30513687A DD263081A1 (de) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30513687A DD263081A1 (de) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD263081A1 true DD263081A1 (de) | 1988-12-21 |
Family
ID=5590891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD30513687A DD263081A1 (de) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD263081A1 (de) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3920034A1 (de) * | 1988-09-19 | 1990-05-31 | Pflanzenzuechtung Saatgut Veb | Verfahren zum einfuehren von dns - sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
| WO1997029200A1 (de) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Kassetten zur expression von lagerstabilen proteinen in pflanzen |
| DE19604588A1 (de) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Expressionskassette für die samenspezifische Expression |
| WO2000000624A1 (en) * | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Croptech Development Corporation | Production of urokinase in plant-based expression systems |
| DE3943825C2 (de) * | 1988-09-19 | 2003-12-11 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen |
-
1987
- 1987-07-20 DD DD30513687A patent/DD263081A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3920034A1 (de) * | 1988-09-19 | 1990-05-31 | Pflanzenzuechtung Saatgut Veb | Verfahren zum einfuehren von dns - sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen |
| DE3920034C3 (de) * | 1988-09-19 | 1999-09-23 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Verfahren zum Einführen von DNS - Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen |
| DE3943825C2 (de) * | 1988-09-19 | 2003-12-11 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Verfahren zum Einführen von DNS-Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen |
| WO1997029200A1 (de) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Kassetten zur expression von lagerstabilen proteinen in pflanzen |
| DE19604588A1 (de) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Expressionskassette für die samenspezifische Expression |
| WO2000000624A1 (en) * | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Croptech Development Corporation | Production of urokinase in plant-based expression systems |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69424861T2 (de) | Geminivirus-basiertes-genexpressionsystem | |
| DE69332538T2 (de) | Cis elemente des ölkörperproteins als regulationische signale | |
| DE69231875T2 (de) | Pflanzen-promoter involviert in der kontrolle der lipid-biosynthese in samen | |
| EP0375092B1 (de) | Kartoffelknollenspezifische transkriptionale Regulation | |
| EP0765393B1 (de) | Dna-moleküle, die für einen plastidären 2-oxoglutarat/malat-translokator codieren | |
| DE19852195C2 (de) | Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen | |
| DE4004800C2 (de) | Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen | |
| DE3843628A1 (de) | Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation | |
| DE69533794T2 (de) | Für eine cinnamoyl-coa-reduktase kodierende dna-sequenzen, und ihre verwendung in regulation des lignin-gehalts von pflanzen | |
| DE69634361T2 (de) | Für eine cinnamoyl-coa-reduktase kodierende dna sequenzen, und ihre verwendung zur regulation des lignun-gehalts von pflanzen | |
| DD294040A5 (de) | Chimaeren-gen zur verleihung von herbizidresistenz an pflanzen, verfahren zum transformieren von pflanzenzellen und regenerierte transformierte pflanzen | |
| DE69132758T2 (de) | Plasmide zur Herstellung von transgenen Pflanzen welche in Habitus und Ertrag verändert sind | |
| DE69834637T2 (de) | Verbesserungen der spezifität der genexpression | |
| DE4100594A1 (de) | Neue plasmide zur zeitlichen und oertlichen kontrollierten expression eines heterologen produktes in pflanzen | |
| DE69636642T2 (de) | Pflanzliche glutathion-s-transferase-promotoren | |
| EP2379725B1 (de) | Verfahren zur steigerung des saccharoseertrages beim landwirtschaftlichen anbau von zuckerrüben und zuckerrohr | |
| DD263081A1 (de) | Verfahren zum einfuehren von dns-sequenzen in das genom von hoeheren pflanzen | |
| WO2002006320A2 (de) | Verfahren zur beeinflussung des sinapingehalts in transgenen pflanzenzellen und pflanzen | |
| DE60013123T2 (de) | Promotor, welcher die expression von transgenen in der ganzen pflanzen ausser dem samen erlaubt | |
| EP0789773A1 (de) | Verfahren zur veränderung des blühverhaltens bei pflanzen | |
| DE69226696T2 (de) | Bifunktionelle genetische marker | |
| DE19737870C2 (de) | Rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Steigerung des Ölgehaltes in Pflanzen | |
| DE3920034C3 (de) | Verfahren zum Einführen von DNS - Sequenzen in das Genom von höheren Pflanzen | |
| DE19857654A1 (de) | Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine | |
| EP1458230A1 (de) | Produktion von rekombinanten antikörpern mittels fusion mit elastin-ähnlichen peptiden |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |