DD264231B5

DD264231B5 - Method for cleaving resistant DNA with restriction endonucleases

Info

Publication number: DD264231B5
Application number: DD30703487A
Authority: DD
Inventors: Detlev H Krueger; Gerard J Barcak; Claus-Dieter Pein; Monika Reuter
Original assignee: Detlev H Krueger; Gerard J Barcak; Pein Claus Dieter; Monika Reuter
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1998-06-10
Also published as: DD264231A1

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro-Spaltung von refraktären DNA-Species. Es ist somit anwendbar auf dem Gebiet der Gentechnologie.The invention relates to a method for the in vitro cleavage of refractory DNA species. It is thus applicable in the field of genetic engineering.

Characteristic of the known state of the art

Die ortsspezifische Spaltung von DNA-Molekülen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen ist eine Basismethode der Gentechnik. Auf diese Weise lassen sich definierte DNA-Fragmente gewinnen, die weiter analysiert oder gentechnisch neu rekombiniert werden. Das normale Vorgehen besteht in der in vitro-lnkubation von gereinigter DNA mit der Restriktionsendonuklease bei 37⁰C (oder in einigen Fällen bei höheren Temperaturen) in Gegenwart von für jede Restriktionsendonuklease charakterischen Salz- und Kofaktorkonzentrationen bei entsprechendem pH-Wert (MANIATIS et al., Molecular Cloning — A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1982). Voraussetzung für die ortsspezifische Spaltung der DNA ist, daß die jeweiligen DNA-Moleküle die entsprechenen Erkennungsorte (spezifischen Basensequenzen) für die verwendete Restriktionsendonuklease besitzen. Es ist jedoch bekannt, daß DNA-Moleküle trotz des Besitzes solcher Erkennungsorte gegen die Restriktionsendonuklease resistent sein können (KRÜGER und BICKLE, Microbiol. Reviews 47,345-360 [1983]). Ein bekanntes Verfahren zur Spaltung solcher zunächst resistenten DNA mit Restriktionsendonukleasen existiert in den Fällen, wo die Resistenz der Erkennungsorte durch Methylierung oder anderweitige Abänderung der DNA-Basen (modifizierte oder sogenannte „seltene" Basen) in oder in der Nähe der Erkennungssequenz bedingt ist. In solchen Fällen läßt sich spaltbare DNA gewinnen, indem man diese vor der Isolierung und Restriktionsendonuklease-Behandlung in solchen Zellen vermehrt, in denen die Synthese von veränderten DNA-Basen nicht möglich ist. Die auf diese Weise vermehrte DNA, die nur die üblichen Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin enthält, läßt sich dann normal mit Restriktionsendonukleasen spalten (KRÜGER und BICKLE, siehe oben).The site-specific cleavage of DNA molecules using restriction endonucleases is a basic method of genetic engineering. In this way, defined DNA fragments can be obtained, which are further analyzed or recombined by genetic engineering. The normal procedure consists in the in vitro incubation of purified DNA with the restriction endonuclease at 37 ⁰ C (or in some cases at higher temperatures) in the presence of charakterischen for each restriction endonuclease salt and Kofaktorkonzentrationen with appropriate pH (Maniatis et al. , Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1982). The prerequisite for the site-specific cleavage of the DNA is that the respective DNA molecules have the corresponding recognition sites (specific base sequences) for the restriction endonuclease used. However, it is known that DNA molecules may be resistant to the restriction endonuclease despite the possession of such recognition sites (KRUGER and BICKLE, Microbiol. Reviews 47,345-360 [1983]). A known method for cleaving such initially resistant DNA with restriction endonucleases exists in cases where the resistance of the recognition sites is due to methylation or other modification of the DNA bases (modified or so-called "rare" bases) in or near the recognition sequence In such cases, cleavable DNA can be obtained by propagating them prior to isolation and restriction endonuclease treatment in those cells in which the synthesis of altered DNA bases is not possible. "" The DNA amplified in this way, containing only the usual bases of adenine, Guanine, cytosine and thymine can then be cleaved normally with restriction endonucleases (KRÜGER and BICKLE, supra).

Die Resistenz von DNA-Erkennungsorten gegenüber Restriktionsendonukleasen ist aber nur in einem Teil der Fälle durch die Existenz von modifizierten bzw. seltenen Basen in der DNA bedingt. Aus der Literatur ist bekannt, daß auch Erkennungsorte, die die üblichen DNA-Basen enthalten, gegen Restriktionsendonukleasen resistent sein können. Die molekularen Ursachen dafür sowie praktische Möglichkeiten zu ihrer Überwindung waren bisher nicht bekannt (KRÜGER und BICKLE, s.o.). Die vorliegende Erfindung schafft eine solche praktikable Möglichkeit.The resistance of DNA recognition sites to restriction endonucleases, however, is only partly due to the existence of modified or rare bases in the DNA. It is known from the literature that recognition sites which contain the usual DNA bases can also be resistant to restriction endonucleases. The molecular causes and practical ways of overcoming them have not been previously known (KRÜGER and BICKLE, supra). The present invention provides such a viable option.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, um resistente DNA-Species auf einfache Weise ortsspezifisch durch Restriktionsendonukleasen zu schneiden.The aim of the invention is to develop a method for easily cleaving resistant DNA species site-specifically by restriction endonucleases.

Explanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Spaltung resistenter DNA mit Restriktionsendonukleasen zu entwickeln, die sich bisher nicht spezifisch durch Restriktionsendonukleasen spalten lassen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst, indem die Spaltung der resistenten DNA (DNA I) durch die Restriktionsendonuklease in Gegenwart einer zweiten, empfindlichen DNA-Species (DNA II) durchgeführt wird. Sowohl DNA I als auch DNA Il besitzen Erkennungsorte für die Restriktionsendonuklease, wobei unter den üblichen experimentellen Bedingungen (MANIATIS et al., siehe oben) bei Inkubation der Restriktionsendonuklease mit jeweils einer der beiden DNA-Species die DNA I resistent ist, die DNA Il aber normal ortsspezifisch spaltbar ist.The object of the invention is to develop a method for cleaving resistant DNA with restriction endonucleases which can not be cleaved specifically by restriction endonucleases. According to the invention, this object is achieved by carrying out the cleavage of the resistant DNA (DNA I) by the restriction endonuclease in the presence of a second, sensitive DNA species (DNA II). Both DNA I and DNA II have recognition sites for the restriction endonuclease, wherein under the usual experimental conditions (MANIATIS et al., Supra) upon incubation of the restriction endonuclease with one of the two DNA species, the DNA I is resistant, but the DNA II normal site-specific fissile is.

Das einfache und ökonomische Prinzip der Erfindung besteht darin, daß DNA I unter den üblichen, für die jeweilige Restriktionsendonuklease charakteristischen Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Puffer- und Kofaktorkonzentrationen, Zeitdauer der Inkubation) mit der Restriktionsendonuklease inkubiert wird (MANIATIS et al., s.o.), wobei entsprechend dem Wesen der Erfindung diese Inkubation in Gegenwart von DNA Il ausgeführt wird. Das mengenmäßige Verhältnis von DNA Il zu DNA I ist so zu gestalten, daß die Gesamtzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsorten, die in der DNA Il lokalisiert sind, mindestens so hoch oder höher ist als die Gesamtzahl der Erkennungsorte in der eingesetzten DNA I. Als DNA Il können sowohl biologisch replizierte DNA's als auch synthetisch hergestellte Oligonukleotid-Duplices eingesetzt werden. Nach Beendigung der Koinkubation beider DNA-Species und der Restriktionsendonuklease werden die entstandenen DNA-Fragmente durch Agarose- oder Polvacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Die DNA im Gel wird durch Äthidiumbromid angefärbt und mittels UV-Bestrahlung sichtbar gemacht.The simple and economical principle of the invention is that DNA I is incubated with the restriction endonuclease under the customary conditions (temperature, pH, buffer and cofactor concentrations, incubation time) typical for the particular restriction endonuclease (MANIATIS et al., US Pat. so), according to the essence of the invention, this incubation is carried out in the presence of DNA II. The quantitative ratio of DNA II to DNA I is to be designed so that the total number of restriction endonuclease recognition sites located in the DNA II is at least as high or higher than the total number of recognition sites in the DNA I used. As DNA II For example, both biologically replicated DNAs and synthetically produced oligonucleotide duplexes can be used. After completion of the co-incubation of both DNA species and the restriction endonuclease, the resulting DNA fragments are separated by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis. The DNA in the gel is stained by ethidium bromide and visualized by UV irradiation.

Als sehr vorteilhaft hat sich das Verfahren im Falle der Spaltung der DNA's der Bakteriophagen T3 und T7 durch die Restriktionsendonuklease EcoRII erwiesen. Beide DNA's sind normalerweise trotz Besitz von EcoRII-spezifrschen Erkennungsorten gegenüber dieser Restriktionsendonuklease resistent. In Gegenwart von sensibler DNA II, wie zum Beispiel der DNA des Plasmids pBR322 oder der Phagen lambda (die keine Cytosin-Methylierung tragen) bzw. von synthetischen, EcoRII-Erkennungsorte enthaltenden Oligonukleotid-Duplices, können auch T3- und T7-DNA sequenzspezifisch durch EcoRII geschnitten werden.In the case of cleavage of the DNAs of the bacteriophages T3 and T7 by the restriction endonuclease EcoRII, the method has proven to be very advantageous. Both DNAs are normally resistant to this restriction endonuclease despite the possession of EcoRII-specific recognition sites. In the presence of sensitive DNA II, such as the DNA of the plasmid pBR322 or the phage lambda (which do not carry cytosine methylation) or of synthetic oligonucleotide duplexes containing EcoRII recognition sites, T3 and T7 DNA can also be sequence-specific EcoRII be cut.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert.The invention will be explained below with reference to an embodiment.

example 1

Die DNA der Bakteriophagen T3 besitzt 3 Erkennungsorte für die Restriktionsendonuklease EcoRII, die zwar durch die isoschizomere Restriktionsendonuklease BstNI gespalten werden, nicht aber durch EcoRII. Die Resistenz der EcoRII-Erkennungsorte in der T3-DNA beruht nicht auf dem Vorliegen modifizierter DNA-Basen (KRÜGER et al., Eur. J. Biochem. 150/1985/ 323-330). Koinkubation der T3-DNA mit der DNA des Plasmids pBR 322 (das aus Escherichia coli dcm~ Zellen isoliert wurde und dessen 6 Erkennungsorte durch EcoRII normal gespalten werden) in Gegenwart von EcoRII führt auch zu spezifischen EcoRII-Spaltung der Erkennungsorte in der T3-DNA.The DNA of the bacteriophage T3 has 3 recognition sites for the restriction endonuclease EcoRII, which are cleaved by the isoschizomere restriction endonuclease BstNI, but not by EcoRII. The resistance of EcoRII recognition sites in T3 DNA is not due to the presence of modified DNA bases (KRÜGER et al., Eur. J. Biochem. 150/1985 / 323-330). Coincubation of the T3 DNA with the DNA of the plasmid pBR 322 (which was isolated from Escherichia coli dcm ~ cells and whose 6 recognition sites are normally cleaved by EcoRII) in the presence of EcoRII also leads to specific EcoRII cleavage of the recognition sites in the T3 DNA ,

In einem Reaktionsansatz werden 400 ng T3-DNA, 400 ng pBR322 DNA (aus dem" Zellen gewonnen) und 3 Einheiten EcoRII in 20 μΙ Reaktionspuffer mit den Endkonzentrationen 5OmM Tris-HCL (pH 7,4), 5OmM KCL, 5OmM NaCI, 6 mM MgCI₂,1 mM DTT bei einer Temperatur von 37°Cfür60min inkubiert.In a reaction mixture, 400 ng T3 DNA, 400 ng pBR322 DNA (from the "cells obtained) and 3 units EcoRII in 20 μΙ reaction buffer with the final concentrations 5OmM Tris-HCl (pH 7.4), 5OmM KCL, 5OmM NaCl, 6 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT at a temperature of 37 ° C for 60 min.

Nach Abstoppen der Reaktion (5min Inkubation bei 65°C) erfolgt die Auftrennung der DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Sichtbarmachung der Fragmente durch UV-Bestrahlung nach Äthidiumbromid-Behandlung des Gels.After stopping the reaction (5 min incubation at 65 ° C), the separation of the DNA fragments by agarose gel electrophoresis followed by visualization of the fragments by UV irradiation after Äthidiumbromid treatment of the gel.

Claims

1. A method for cleaving resistant DNA with restriction endonucleases, characterized in that a resistant DNA (DNAI) is incubated with a second sensitive DNA species (DNAII) in the presence of a restriction endonuclease the known reaction conditions.

2. The method according to claim 1, characterized in that the DNA ¹ S of the bacteriophages T3 and T7 are used as DNAI.

3. The method according to claim 1, characterized in that are used as DNAII biologically replicated DNA's.

4. The method according to claim 3, characterized in that the plasmid pBR 322 and phage lambda are used.

5. The method according to claim 1, characterized in that are used as DNAII synthetically prepared oligonucleotide duplexes.

6. The method according to claim 1, characterized in that is used as Restrictionendonuclease EcoRII.