DD264336A3 - Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen - Google Patents
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Pilus-Impfstoffherstellung mit E. coli-Bakterien. Die so hergestellten Impfstoffe dienen der Prophylaxe von Infektionskrankheiten des Digestionstraktes, die durch E. coli-Staemme bedingt sind, deren pathogene Wirkung wesentlich auf Anheftungsmechanismen beruht. Ziel und Aufgabe der Erfindung ist ein oekonomisches Verfahren zur Herstellung von gut vertraeglichen und wirksamen Vakzinen, die von sonstigen Antigenstrukturen der Erreger unabhaengig wirken und beim Einsatz einer geringen Biomasse einen gleich guten oder besseren Antikoerpertiter bzw. Impfschutz bewirken als aufwendiger hergestellte Impfstoffe mit gleicher Indikation. Diese Aufgabe wird dadurch geloest, dass adeninauxotrophe E. coli-Mutanten - ZIMET-Nr. 11086, ZIMET-Nr. 11087 bzw. ZIMET-Nr. 11088 - als Traeger der Immunogene verwendet werden.
Description
Unbedingte Voraussetzung für den erfolgreichen Einsatz von Impfstoffen zur Immunprophylaxe gegen Erkrankungen des Digestionstraktes mit ausgeprägter lokaler Schadwirkung ist das Vorhandensein von Antigenstrukturen im Impfstoff, die in vivo eine Antikörperbildung bewirken und damit das Anhaften pathogener Stämme an der Oberfläche der Epithelzellen verhindern. Zur Immunprophylaxe gegen o.a. Infektionskrankheiten des Digestionstraktes, z.B. der Koliruhr bei verschiedenen Haussäugetierarten (Rind, Schaf, Schwein), wurden und werden bisher international inaktivierte polyvalente Vakzinen eingesetzt. Deren Prinzip beruht entweder
— auf dem Einsatz von Vollzellvakzinen mit den epidemiologisch relevanten OK-Strukturen (SCHOLL, 1973; MICHAEL u.a., 1977; WITTKOWSKI, 1980),
— auf dem Einsatz von polyvalenten Vollzellvakzinen, die durch Zugabe von Präparationen aus Zellen bezüglich der immunologisch relevanten Haftstrukturen angereichert sind (BRINTON u. Mitarb., 1983),
— auf dem Einsatz von Präparationen aus Zellen, die nur noch die Adhäsionsstrukturen unter Verzicht auf die kompletten Zellen enthalten (NAGY u.a., 1978; MORGAN u.a., 1978; LIEBERMANN u. LIEBSCHER, 1985).
Soweit es die Vollzellvakzinen ohne Anreicherung der Haftantigene anbelangt, weisen diese den Nachteil einer ausgeprägten serotypspezifischen Wirkung aus (WITTIG, 1965a, b, 1971,1980.1981; SENF, 1982; SCHOLL, 1973; SCHOLL u. Mitarb., 1980). Die im letzten Jahrzehnt auf Grund der erweiterten diagnostischen und pathogenetischen Kenntnisse (STIRM u. Mitarb., 1967; SMITH u. LINGGOOD, 1971; EVANS u. Mitarb., 1973; JONES u. RUTTER, 1974; ISAACSON, 1977; 0RSKOV u. Mitarb., 1977; NAGY u. Mitarb., 1978) bevorzugt produzierten Impfstoffe mit angereicherten oder gereinigten Haftantigenen und/oder Toxinen sind mit großem Herstellungsaufwand verbunden.
Ziel der Erfindung ist ein ökonomisches Verfahren zur Herstellung von gut verträglichen und wirksamen Vakzinen zur Prophylaxe von Infektionskrankheiten des Darmes bei Rindern und Schweinen, bei denen E. coli-Stämme mit Adhäsionsmechanismen (PiIi) eine Rolle spielen.
Durch die Erfindung soll ein Verfahren gefunden werden, bei dem mit geringem biotechnologischem Aufwand Pilusvakzinen hergestellt werden können, die
— von sonstigen Antigenstrukturen der Erreger unabhängig wirken,
— beim Einsatz einer geringen Biomasse einen gleich guten oder besseren Antikörpertiter bzw. Impfschutz bewirken, als aufwendiger hergestellte Impfstoffe mit vergleichbarer Indikation.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß
— die adeninauxotrophen E. coli-Mutanten ZIMET 11086, ZIMET11087 oder ZIMET11088 als Träger der Immunogene für die Herstellung von Pilusimpfstoffen eingesetzt werden,
— dem für die Züchtung dieser Mutanten verwendeten Nährmedium neben Hefeextrakt als Stickstoffquellen L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, L-Threonin, L-Methionin und Glycin zugesetzt werden.
Bei der Züchtung darf die Zelloberfläche der Mutanten nicht verändert werden, so daß sich die Antigenität voll entfalten kann bzw. die genetische Potenz zur Ausbildung der Strukturen voll erhalten bleibt.
Diese genannten Stämme wurden im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena hinterlegt. Die erfindungsgemäß hergestellten Lebendimpfstoffe haben folgende Vorteile:
— Sie lassen sich mit vergleichsweise gegenüber anderen Plusvakzinen oder pilusangereicherten Vakzinen geringerem biotechnologischem Aufwand herstellen.11 Im Gegensatz zu diesen ist dabei die Ausbildung der PiIi an der Zelloberfläche nicht unbedingt erforderlich.
— Für eine Impfdosis ist nur eine vergleichsweise gegenüber anderen Pilusvakzinen oder pilusangereicherten Vakzinen geringere Biomasse erforderlich, was gleichzeitig Vorteile bezüglich der Verträglichkeit bietet.
1) Im Gegensatz zu diesen ist dabei die Ausbildung der PiIi an der Zelloberfläche nicht unbedingt erforderlich.
— Sie wirken unabhängig von anderen Antigenstrukturen der Erregerzellen.
— Sie bewirken bei Versuchstieren (Prüfverfahren) höhere Antikörpertiter gegn die Haftantigene als die entsprechenden inaktivierten Vakzinen.
— Sie haben eine bessere klinische Schutzwirkung als die entsprechenden inaktivierten Vakzinen.
Die Erfindung wird an Hand der angegebenen Versuchsparameter und Beispiele näher erläutert.
1. Gewinnung der Produktionsstämme
— Zur Herstellung der Bakterienmutanten wurde von folgenden E. coli-Wildstämmen ausgegangen:
| Stamm-Nr. | serologische | Haftantigen | Enterotoxin31 | LD50 11 |
| OK-Struktur | LT/ST | x± 1 σ | ||
| 212/111 | 0147:K89(B) | K 88 | + - | 5,4x106 |
| (2x106-1,4x 107) | ||||
| 213/055 | 0101 :K28(A) | K 99 | - + | 2,1 χ 10β |
| (8 x 105-5,6x 106) | ||||
| 212/160 | CS 201121 (A) | 987p | - + | 2,9x107 |
| (1,1 x107-7,4x107) |
1) Modell Maus (ICR Stamm, Lebendmasse 16-18g),
i. p. Applikation, Auswertung graphisch im Wahrscheinlichkeitsnetz (Schäfer's Feinpapier Nr. 485), Angabe als vermehrungsfähige Zellen/Maus, Verdünnungsmedium :5%igeMucin-Lösung
2) Nationale Nomenklatur der Colizentrale im Bezirksinstitut für Veterinärwesen Dresden
3) LT = hitzelabiles Enterotoxin; ST = hitzestabiles Enterotoxin
— Die Mutanten wurden mit einer Methode gemäß Patentschrift DD 199337 gewonnen und hatten folgende Eigenschaften:11
ZIMET-Nr. serologische Haftantigen Enterotoxin LD50
OK-Struktur LT/ST χ±1σ
11086 0147:K89(B) K88 + - 2,Tx
(7,2x107-5,6x 108)
11087 0101: K(A)" K99 - + 1x109
(6,2x108-2,2x109)
11088 CS 2011(K[A]-) 987p - + 9,6 x108
(5,8x108-1,6x109)
1) Zeichenerklärung der Tabelle s. Wildstämme
2. Nährmedien und Anzuchtverfahren zur Erhaltung der genetischen Potentiale der verwendeten Mutanten
— Als Nährmedium zur Kultivierung der Bakterienmutanten wird verwendet: E. c.-Medium 1998, bestehend aus:
Na2HPO4X 12H2O AB-DDR 27,0g
Mg SO4 χ 7 H2O AB-DDR 0,25 g
Supplement VS bzw. Bramschhefeextrakt 27,0 g
L-Asparaginsäure AB-DDR 0,32 g
L-Threonin AB-DDR 0,18 g
L-Glutaminsäure AB-DDR 0,055 g
L-Methionin AB-DDR 0,16g
Glycin AB-DDR 0,11g
Adenin AB-DDR 0,05 g
Thiamin AB-DDR 0,02 g
Glukose AB-DDR 5 g
Aqua dest. AB-DDR ad 1000 ml
pH 7,6-7,8
— Die Züchtung der Bakterienzellen erfolgt zunächst als Standkultur und anschließend unter Rührung und Lüftung im Fermentor. Während des Fermentationsprozesses bleiben die Adeninauxotrophie und die Fähigkeit zur Bildung der Haftantigene erhalten. Die Bebrütungstemperatur beträgt +370C. Die Bakterienzellen werden am Anfang der stationären Wachstumsphase geerntet.
3. Methoden zum Nachweis der genetischen Stabilität, der Unschädlichkeit und Antigenität
— Adeninauxotrophie und Attenuierung der Bakterienmutanten sind miteinander gekoppelt. Die genetische Stabilität der Lebendimpfstoffe wird
• während des Herstellungsprozesses durch quantitative Bestimmungen der Reversionsrate zur Adeninprotrophie und
• bei Abgrenzung von Wild-(Feld)Stämmen durch qualitative Bestimmung der Auxotrophiemarker geführt.
Dazu ist es erforderlich, die Zellen zweimal mit physiologischer NaCI-Lösung zu waschen und auf Minimalagarplatten DAVISu. MINGIOLI, 1959; FALKOWu. Mitarb., 1962) ohne Zusätze bzw. mit einer der Markersubstanzen zu plattieren.
Die Bestimmung der Lebendkeimzahl erfolgt auf vollergänztem Minimalmedium. Die Reversionsrate darf S 10/108 koloniebildende Einheiten (kbE) nicht überschreiten. Die Bakterienmutanten wachsen nicht aufteilergänztem Minimalmedium.
Zur Bestimmung der Antigenitat werden Kaninchen im Gewicht von 2,5—3 kg mit den verschiedenen Präparationen geimpft und die Immunantwort mittels Langsamagglutination (LA) durch Vergleich der Titer vor der Vakzination = O-Wert und des Titers nach der Vakzination ermittelt. Dabei ist das Testantigen so auszuwählen, daß die pilusspezifischen Titer erfaßt werden.
Folgende Ergebnisse wurden ermittelt:
• Κθθ-Αηίί^φβ^'νοη Kaninchen,geimpftmiti χ 109Zellen/Tier: K99-Trägerstamm (K99+a K99-Trägerstamm (K99~)3' a.vacc. p.vacc. a.vacc. p. vacc
23 128 8 128
• K88-Antikörpertiter1lvon Kaninchen, geimpft mit
K 88- inaktivierten polyvalenten mitK88-Trägerstamm
Test- Handelsimpfstoffen
antigen
Dosis: 7 χ 109Zellen/Tier Dosis: 2 χ 109Zellen/
a.vacc. p.vacc. a.vacc. p.vacc. Tier
I 5,7 16 10 256
II5,7 16 16 812
III 4 11,3 38 >1290
1) Titerangabe: reziproker Wert der Serumverdünnung als geometrisches Mittel von 2 Kaninchen
2) Die Züchtung wurde so gestaltet, daß die PiIi ausgebildet und in vitro nachzuweisen waren.
3) Die Züchtung wurde so gestaltet, daß die PiIi nicht ausgebildet waren, wohl aber die Fähigkeit der Zellen zur Ausbildung der Pilusstruktur erhalten blieb.
Antikorpertiter von Kaninchen, geimpft mit 11D1'
| Test | K 99 | K88-angerei- | p. vacc. | inaktivierter | p. vacc. | K 88-, K 99-, | p. vacc. |
| antigene | P 987 | cherten Hl21 | 25 | Hl (bisherig. | 32 | P987-Träger- | 128 |
| (internat. | 25 | DDR-Präparat) | 32 | stammgemisch | 256 | ||
| Vgl.-Präparat) | 25 | 23 | 102 | ||||
| a vacc. | — | a.vacc. | — | a.vacc. | 128 | ||
| K88I | 8 | 4 | __ | 6,3 | 1290 | ||
| Il | 6,3 | 2,8 | 13 | ||||
| III | 5 | 2,8 | 13 | ||||
| — | — | 11 | |||||
| __ | _ | 80 | |||||
Titerangaben s. o.
1) ID = vom Hersteller angegebene Impfdosis
2) Hl = Handelsimpfstoff polyvalent
Anwendung von Versuchsmustern eines Lebendimpfstoffes (Ll) auf der Basis von Stamm ZIMET11087 zur Muttertierimmunisierung von Primiparae im Vergleich zur inaktivierten Vakzine Colivacc „Dessau"""
| Versuchs | Gruppe unge- | Colivacc- | :K35 E. coli 0101 E. coli | Ll-Gruppe |
| kategorien | impfter Kon | Gruppe | ||
| trolltiere | ||||
| lebend geb. | 43 | 128 | 145 | |
| Kälber | ||||
| totgeb. | 1(2,3%) | 6(4,5%) | 5(3,3%) | |
| Durchfall | 3(6,98%) | 7(5,5%) | 3(2,07%) | |
| erkrankungen | ||||
| Durchfall | 1+ + | 5 + | 3 + | |
| intensität | 2++ + | 2+ + + | ||
| Verendungen | 4(9,3%) | 6(4,68%) | 2(1,38%) | |
| Sektions | 3 Kälber insgesamt: | |||
| ergebnisse | path.-anat.: Kolisepsis, Koliruhr, Koliinfektion | |||
| bakt.-serol.: E. coli 0 9 | 0101 :K30 |
Anwendung von Versuchsmustern eines Ll auf der Basis von Stamm ZIMET11087 zur Muttertierimmunisierung von Pluriparas im Vergleich zur inaktivierten Vakzine Colivacc „Dessau"(R)
Versuchskategorien
Gruppe ungeimpfter Kontrolltiere
Colivacc-Gruppe
Ll-Gruppe
lebend geb. Kälber totgeb. Kälber Durchfallerkrankungen Durchfallintensität
81
57 (70,3 %)
8+ + 49+ + +
212 5
160(75,47%)
11 +
51+ + 98+ + +
38(48,10%) 8 +
21 + +
Versuchskategorien Gruppe ungeimpfter Kontrolltiere
Colivacc-Gruppe
Ll-Gruppe
Verendungen Sektionsergebnisse
12(14,8%) 20(9,43%) 4(5,06%)
3 Kälber: 5 Kälber: 4 Kälber:
path.-anat.: path.-anat: path.-anat.
Salmonellose, Salmonellose, Salmonellose,
Salmonellose, Salmonellose, Enteritis,
Kolisepsis Enteritis u. Koliruhr
bakt.-serol.: Pneumonie, Kolisepsis
S. dublin, Kolisepsis, bakt.-serol.:
S. dublin, Kolisepsis, S. dublin,
E. coli 0101 bakt.-serol.: 0,E.coliO78,
K30 S.dublin, E.coli078
S. dublin,
0, E. coli
0101 K30,
E. coli 0 78
• Anwendung von Versuchsmustern eines trivalenten Lebendimpfstoffes auf der Basis der Stämme ZIMET11086, ZIMET11087 und ZIMET11088 zur Muttertierimpfung von Schweinen im Vergleich zur inaktivierten Vakzine Coliporc „Dessau"""
| Versuchs- | Coliporc-Gruppe | JS1' | Ll-Gruppe | JS11 |
| Kategorien | AS11 | 42 | AS11 | 14 |
| Würfe | 98 | 134 | 78 | 436 |
| aufzuchtfähige | 835 | 1020 | ||
| Ferkel | 14,0 | 13,4 | ||
| Ferkelverluste (%) | 13,7 | 71,6 | 9,1 | 61,7 |
| dav. Ferkelruhrtage | 59,1 | 16,1 | ||
1) AS = Altsausen; JS = Jungsauen
— Die Herstellung der lyophiiisierten Lebendimpfstoffe erfolgt nach bekannten Methoden. Der Bakterienkultur werden vor Lyophilisation Saccharose und inaktiviertes Normalserum vom Rind bzw. Schwein zugegeben. Die lyophiiisierten Impfstoffe werden in einer gepufferten NaCI-Lösung mitTrypton resuspendiert.
— Die resuspendierten Impfstoffe werden in festgelegter Dosis (KbE/lmmunisierung) hochträchtigen Muttertieren — in der Regel zweimal — parenteral (im., ggf. auch se.) appliziert, um auf diese Weise den Immunglobulingehalt der Eutersekrete spezifisch zu erhöhen und die mit diesen Sekreten getränkten bzw. gesäugten Kälber bzw. Ferkel passiv — allgemein und lokal — zu schützen.
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Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten des Digestionstraktes bei Rindern und Schweinen, die durch Escherichia coli-Bakterien hervorgerufen werden, durch Kultivierung entsprechend attenuierter Mutanten und nachfolgende Aufarbeitung der Kulturlösung zum Impfstoff, gekennzeichnet dadurch, daß die adeninauxotrophen E. coli-Mutanten ZIMET11086, ZIMET 11087 oder ZIMET11088 eingesetzt werden und daß dem Nährmedium Hefeextrakt und als Stickstoffquellen L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, L-Threonin, L-Methionin und Glycin zugesetzt werden.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen zur Prophylaxe von Infektionskrankheiten des Digestionstraktes (Rind und Schwein), die durch E. coli-Bakterien hervorgerufen werden, deren pathogene Wirkung wesentlich auf Anheftungsmechanismen beruht.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD27913585A DD264336A3 (de) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD27913585A DD264336A3 (de) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD264336A3 true DD264336A3 (de) | 1989-02-01 |
Family
ID=279462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD27913585A DD264336A3 (de) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Verfahren zur Herstellung von Pilus-Impfstoffen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD264336A3 (de) |
-
1985
- 1985-07-30 DD DD27913585A patent/DD264336A3/de not_active IP Right Cessation
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|---|---|---|---|
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