DD264458A1 - Immunenzymometrisches bestimmungsverfahren fuer den quantitativen nachweis des humanen plasminogenaktivators urokinase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Medizin und die Biotechnologie. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Antikoerper gegen humane Urokinase an eine feste Phase adsorbiert wird, man die zu bestimmende urokinasehaltige Loesung zugibt un nach einer gewissen Inkubationszeit einen zweiten, mit einem Enzym markierten Antikoerper hinzufuegt und schliesslich die Enzymaktivitaet des an der festen Phase fixierten Immunkomplexes misst.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen Bestimmungen des humaner. Plasminogenaktivators Urokinase, das für die medizinische Diagnostik, die biomedizinische Grundlagenforschung und bei der biotechnologischon Urokinaseherstellung benötigt wird.
Humane Urokinase ist eine Serinprotoase, die von Körperzellen sezerniert wird. Urokinase wandelt das Zymogen Plasminogen, das im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten vorkommt, in aktives Plasmin um. Das System Urokinase/Plasmln ist an der Katalyse diverser extrazellulärer proteolytischer Prozesse beteiligt (E. rieich in: Biological Markers of Neoplasia: Basic and Applied Aspects [R. N. Ruciclon, ed.| Elsevier New York, 491-500 (1978)). Humane Urokinase wird als Therapeutikum für die Lyso thrombotischor Verschlüsse bei Herzinfarkt, Lungonombolio und anderen llirombotischen Erkrankungen eingesetzt
(M. Verstraeto et al., Blood 67,1529-1541,1986). Urokinase ist weiterhin als Markerenzym für den Nachweis einer Roihe von physiologischen und pathologischen Prozessen, u.a. Tumorwachstum und Motastasierung, geeignet.
Neben Urokinase existiert im humanen fibrinolytischen System noch ein zweiter, immunologisch und biochemisch verschiedener Typ von Plasminogenaktivator, nämlich der gowebsspezifische Plasminogenaktivator (t-PA).
Bisher erfolgt auch im internationalen Maßstab der quantitative Nachweis von Plasminogenaktivatoren über die Bestimmung ihrer katalytischen Aktivität, entweder direkt (Umsetzung eines chromogenen Substrates (Günzler, W. A. et al. Hoppe Seylor's
Z. Physiol. Chom.363 (1982) 133-141) oder indirekt über das von ihnen aktivierte Plasmin im Clot-Lysis-Test (Rijken, D. C. et al.,
J. Biol. Chem.257,2920-2925,1982) im Fibrinplattentest (Haverkate, F. et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, 4, ?5-31 (1979J) oder mittels eines chromogenen Substrates für Plasmin (Vorhoijon, J. H. et al., Thromb. Haemostas.48,266-269,
Diese Methoden sind störanfällig, abhängig von Modulatoren der Aktivität wie z. B. Detergenzien und werden durch die in biologischen Flüssigkeiten anwesondon Inhibitoren der Plasminogenaktivatoren und/oder des Plasmins beoinflußt. Die Proenzyme der Plasminogenaktivatoren mit geringer bzw. keiner enzymotischen Aktivität werden nicht erfaßt.
Eine Differenzierung zwischen Urokinase und t-PA allein über die Aktivität ist nur z. T. möglich. Seit der Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen Urokinase (ζ. B. Herion, P. et al., Bioscienco Reports 1,885-892,1981) wurden mehrore immunchemische Methoden beschrieben, um schneller, sicherer und genauer als über die katalytische Aktivität Urokinase-Konzentrationen in Lösungen bestimmen zu können. Solcho immunchemischon Verfahren auf der Grundlages des Einsatzes von monoklonalon Antikörpern können auf verschiedenen Testprinzipien beruhen:
a) Radioimmunoassay als kompetitiver Bindungstest
(Wojt, J, et al., Wiener klin.Wochenschr.97 (5), 244-248,1985)
b) Immunenzymometrische Assays
(Herion, P. ot al., Bioscienco Reports 3,381-388,1983; Darras, V. et al., Thromb. Haemostas.56 (3) 411-414,1986; Stump, D. C. et al., J.Biol.Chem.26113|, 1267-1273,1986; Nielsen, LS. et al., J.lmmunoassay 7 (3), 209-228,1986)
c) Enzymimmunoassay als kompetitiver Bindungstest
» (Nakamura, M. et al., Cell Struct. Funct.9,167-179,1984)
Die beschriebenen Verfahren nutzen mAk bzw. polygonale Antikörper (aus Antiseren) gegen Urokinase in unterschiedlichen Kombinationen und Testverfahren, wobei Festphasonsysteme und Verfahren in Lösung angewendet werden. Die erreichten Testparameter variieren hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Zeitdauer, los Arbeitsaufwandes und des Dotoktionssystoms (Radioaktivität, Enzymaktivität).
Bei den beschriebenen Festphasensystemen werden meist PVC bzw. Polystyroltostplatten als feste Phase eingesetzt. Die Beschichtung der festen Phase mit Antikörper erfolgt durch Benetzen der Oberfläche des Plastmaterials mit der iintikörperhaltigen Lösung für eine gewisse Zeit.
Die Nüchweisgronzen der veröffentlichten Vorfahren liegen zwischen 0,05 und 5ng/ml.
Die Nachteile der bisher bekannten immunchomischen Verfahren zum quantitativen Nachweis von Urokinase sind in der Art und
Weise der Beschichtung der Plastmaterial'en, der z.T. sehr langen Reaktionszeiten, der langen Meßzeiten und der komplizierten Technik zur Trennung von freien und gebundenen Radioaktivitäten (bei auf kompetitiver Bindung beruhendem Radioimmunoassay) begründet. Häufig fehlt der eindeutige Nachwels, daß Urokinase-Inhibitorkomplexe und das Proenzym ebenfalls quantitativ bestimmt werden.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein rationelles und sicheres immunenzymometrisches Bostimmungsverfahren zum quantitativen Nachweis des humanen Plasminogenaktivators Urokinase zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wird ein erster Antikörper an eine feste Phase, z. B. an die Oberfläche der Näpfe von Mikrntestplatten aus Polystyrol oder einem anderen Material,wie z. B. PVC als Trägermaterial für den Festphasen-Immunoassay adsorbiert, vorzugsweise durch Antrocknen. Solche Antikörper-beschichteten Platten uind bei 4'C in trockenem Zustand für mehrere Wochen haltbar. In die Reaktionsnäpfo der mit Antikörper beschichteten Platten werden erfindungsgemäß nacheinander zuerst die zu messende urokinasohaltige Lösung, und nach einer Inkubationszeit ein zweiter, enzymmarkierter Antikörper eingefüllt. Anschließend wird die Enzymaktivität des an der festen Phase fixierten Immunkomplexes gemessen. Als ersten Antikörper verwendet nan ainen polyklonalen Antikörper eines Vertebratonorganismus gegen Urokinase oder einen monoklonalen Antikörper, uör mit Urokinase reagiert, und als zweiten Antikörper einen mit einem Enzym markierte) polyklonalen oder monoklonalon Antikörper.
Ein bevorzugt eingesetzter mAk ist ZIM-UK-IH6 (DDR-0204), der mit Meerrettichperoxidase oder einem anderen aktiven Enzym markiert ist. Nach gründlichem Waschen der Reaktionsgefäße wird eine Substratlösung (Farbstoff) zugegeben, und nach angemessener Reaktionszeit die Reaktion durch Zugabe einer Säure gestoppt. Die entstandene Färbung in den einzelnen Näpfen der Mikrotestplatte wird schließlich durch photometrische Messung der Extinktion an einem entsprechend geeigneten Photometer quantifiziert.
Alle Arbeiten lassen sich bei Zimmertemperatur durchführen. Der Test läuft als „one-tube-assay" und ist damit sehr einfach und leicht handhabbar. Die Testanordnung gestattet die gleichzeitige Bestimmung von vielen Proben durch eine Person in weniger als 5 Stunden
Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel noch näher erläutert werden.
Immunenzymometrisches Bestimmungsverfahren für den quantitativen Nachweis des humanen Plasminogenaktivators Urokinase:
Als Reaktionsgefäße werden die Näpfe von 96er-Mikrotestplatten verwendet. In die einzelnen Näpfe werden je 10ΌμΙ der, ersten Antikörpers (polygonale spezifische anti-Urokinase-Antikörper vom Kaninchen; 2pg/ml Beschichtungspuffercler Zusammensetzung 0,015M Na2CO3 — 0,035M NaHCO3 — 0,02 NaN3 — pH 9,6) einpipettiert und über Nacht angetrocknet. Anschließend werden die Näpfe der Mikrotestplatton mit je 200μΙ TBS (Tris-gepufferte Salzlösung: 0,05M Tris-0,2 M NaCI, pH 7,4-0,1 % Tween 20) oder mit 200μΙ einer proteinhaltigen Lösung in TBS gefüllt und zwecks Blockierung der noch freien proteinbindenden Stellen für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und dann wieder ausgegossen. Danach werden 100μΙ einer Urokinase-Standard-Lösung bzw. der zu untersuchenden Probe verschiedenen Verdünnungsgrades eingefüllt und für 3 Stunden inkubiert (Schütteln in feuchter Kammer). Nach 3maligem Waschen mit H2O werden 50μΙ des mit Peroxydase markierten mAk ZIM-UK-IH6 eingefüllt und für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert (Schütteln in feuchter Kammer). Nach mindestens Bmaligem Waschen mit H2O werden in die einzelnen Näpfe jeweils 240μΙ einer Substratlösung i. B.
o-Phonylendiamin 0,4mg/ml
H2O2 0,015%ig
Phosphat-Zitrat-PufferpH 5,0
einpipettiert und für einige Minuten (z.B. 15 Minuten) inkubiert. Mit 60μΙ 2,5N H2SO4 wird die Farbreaktion in den Näpfen abgestoppt. Die Farbintensität in den einzelnen Näpfen wird schließlich photometrisch bei einer Wellenlänge von 492nm gemessen.
Aus der gemessenen Extinktion kann anhand der Standartkurve der Urokinase-Gehalt einer Lösung ermittelt werden.
Claims (4)
1. Immunenzymometrischos Bestimmungsverfahren für den quantitativen Nachweis des humanen Plasminogenaktivators Urokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ersten Antikörper an eine feste Phase adsorbiert, anschließend die zu messende urokinasehaltige Lösung, nach einer Inkubationszeit einen zweiten, enzymmarkierten Antikörper hinzufügt und die Enzymaktivität mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Antikörper einen polyklonalen oder einen monoklonalen Anti-Urokinase-Antikörper einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweiten Antikörper einen mit einem Enzym markierten monoklonalen oder polyklonalen Anti-Urokinase-Antikörper einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den monoklonalen Antikörper ZIM-UK-IH6 (DDR-0204), der mit Meerrettichperoxydase oder einem anderen Enzym markiert ist, einsetzt.
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