DD266710A3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alkalischer Phosphatase mittels Bacillus licheniformis. Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines technischen Verfahrens zur Herstellung von alkalischer Phosphatase. Das Ziel der Erfindung wird durch die Verwendung des Stammes Bacillus licheniformis 41p - ZIMET 10 911 - erreicht. Die C-, N- und P-Quellen des Naehrmediums werden so kombiniert, dass durch die metabolische Wirkung der Kultur in der Phase der intensiven alkalische Phosphatase-Akkumulation der Glucosegehalt des Naehrmediums 0%, der Phosphatgehalt 7 mM und die NH4-Konzentration nicht mehr als 20 bis 30 mg/ml betraegt. Optimierungen des Verfahrens koennen durch Glucosefeeding in der Uebergangsphase der Kultur, durch intensive Durchmischung des Fermentationsmediums und Einhaltung einer bestimmten Fermentationstemperatur erzielt werden.
Description
-7-
Titel der Erfindung
Verfahren zur bioteohnisohen Herstellung von alkalischer Phosphat ase
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verführen zur bioteohniaohen Herstellung von alkalischer Phosphatasθ mit einem Bacillus lichen if or mis-Stamm. Das Enzym kenn in der klinischen Diagnostik sowie in der bioohemisohen und molokularbiologisohen Forschung eingesetzt werden.
Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen
Alkalische Fhosphatase wird von einer Vielzahl von Mikroorganismen synthetisiert. Unter den Bakterien eind zwar mehrere Spezies des Genus Baoillus dazu befähigt, so z. B. Bacillus subtilis, Bacillus oereus und Baoillus licheniformis (J.G. HANSA et al. 1981, Bioohim. Biophys. Aota £5£, 390 bis 401; O. HYDRKAN et al. 1977, J-. Biol. Chem. 2£2>, 6806; W.B. CHBSBHO & J.O. LAMPEN 1968, Baoteriol. 2£, 428 bis 437), aber die biotechnische Herstellung von alkalisoher Phosphatase mit Baoillen ist bisher nooh nicht bekannt.
Ss existieren Verfahren zur Herstellung von alkalischer Phosphatase mit Hilfe von Mikroorganismen anderer Gattungen, so u. a. Aotinomyoes ooelioolor A-66 (SU-UR 943 279)» Actinomyces streptomycin (SU-UR 178 337) sowie mit E. coli und Serratia maroesoens, die neukombinierte Plasmide mit Genen für alkalische Phosphatase enthalten (DB-OS 2 931 999).
*** C-, mm
Die bekannten Verfahren - bis auf die, bei denen klonierte Mikroorganismen verwendet werden - bringen nur geringe Enzymausbeuten, so daß zur Zeit noch vorrangig die alkalische Phosphatase aus Kalb er darm gewonnen wird.
Ziel der Erfindung
Zif>l der Erfindung ist es, ein Verfahren zur teohnisohen Gewinnung von alkalisoher Phosphatase mittels Baoillus lioheniformis zu entwickeln.
Darstellung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit einem besonderen Bacillus lioheniformis-Stamm eine alkalische Phoaphatase in hoher Ausbeute zu produzieren.
Erfindungsgemäß wird für die Herstellung der alkalischen Phosphatase Baoillus lioheniformis 41p - ZJMET 10 911 - verwendet, der sich vom Typstamm Bacillus lioheniformis ATCC 14 580 in mehreren Positionen unterscheidet (vgl. dazu nachfolgende Charakteristik mit BERGET's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. (1974)).
Charakteristik des Baoillus lioheniformis 41p - ZIMET 10
Morphologie
Form der Spore: oval
Lage der Spore: zentral
Sporulationsverhalten: 95 % (Gerstenschrotaßav 10 d/
37 0C)
Beweglichkeit: beweglioh
Gr amv er halten: grampositive Kurz stäbe heu
Koloniemorphologie auf unterschiedlichen Nährböden
Bluplatte: Kolonie hellbeige» milchig, matb-
nach 48 h/37 0C
Nähragar (NA):
NA + Glue + Cas.-Ao id:
Biochemische Merkmale Säurebildung aus:
Kolonie hellbeige, milohig, mattglänzend, gelappt Kolonie maude/roeö, mattglän· aend, Färbstoffbildung
-Xylose, Gluoose, d-Mannose, d-Fruotose, Maltose, Trehalose, Saccharose, Raffinose, Rhamnose, D-Mannit» d-Sorbit, D-Ribose, Aesoulin
L-Arabinose naoh 2^ h, d-Galactose
keine Säurebildung aus:
Indolnaohweiss
VPRs
C it r atv er w er imng:
Ureasenaohweis.t
Arginind.xhydr olase t
Waohstumsverhalten und bioohemisohe Merkmale
Wachstum in Nährbouillon:
Waohstum auf Gluoose-Nitrat-Agar:
Waohstum auf Gluoose-Asp ar ag in-Ag art
Waohstum in NaCl-Bouillons
Gasbildung aus Nitrat unter anaeroben Bedingungen: Nitratreduktion: Katalase: Stärkehydrolyse: Caseinhydrolyse: Gelatinohydrolyse: Lezithinase:
Hautbildung, Trübung, Bodensatz starkes Waohstum
sohlechtes Waohstum
3 - 7 % NaCl gutes Wachstum 10 % NaCl schwaches Wachstum
| HZ | 2 | mm |
| HZ | 1 | mm |
| HZ | mm |
HZ ss Hydrolysezone
Die Herstellung des Enzyms kann im Submersv erfahren in zwangsbelüfteten, sterilisierbaren Fermentationstanks unter üblichen bioteohnologisohen Bedingungen erfolgen. Es wurde Jedoch gefunden, daß den Eigenschaften des Stammes angepaßte Verfahrenobedingungen zu höheren Enzymausbeuten führen.
In Nährmedien mit für bakterielle Verfahren häufig verwendeten C-Quellen, wie Glucose, Maltose, Mais- bzw. Kartoffelstärke und Getreideschroten, und übHohen N-Quellen, wie Sojaprotein, Casein, Mager milchpulver, Erbsen- und Bohnenmehl sowie Gelatine, bildet der erfindungsgemäße Stamm in ökonomisch interessanten Mengen a^alisohe Phosphatase.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur bloteohnisohen Herstellung von alkalischer Phosphatase mit Bacillus lioheniformis 41p - ZIMET 10 911 - werden die C- und N-Quellen des Nährmediums so kombiniert, daß durch die cietabolisohe Wirkung der Kultur in der Phase der Intensiven alkalische Phosphatase-Akkumulation dor Glucosegehalt des Nährmediums O %, der Phosphatgehalt < 7 mM und die NH^-Konzentration nicht mehr als 20 bis 3OyUgZmI beträgt. Die Akkumulation der alkalischen Phosphatase wird durch ein GIuoosefeeding in der Übergangsphase und durch intensives Durchmischen des Fermentationsmediums gesteigert. Die Permentationstemperatur beträgt 34 bis 40 0C, insbesondere 37 0C
Bacillus licheriformis 41p - ZIMET 10 911 - synthetisiert alkalische Phosphatase, die zu über 90 % an Partikel bzw. Membranbruchstücke assoziiert ist. Das Enzym kann in bekannter Welse, z. B. duroh MgCIg, von den Membranbruchstüoken gelöst und anschließend gereinigt werden (F.M* HULETT-COWLING 1971, Blechern, $&> 1364 bis 1371; G. SCHAFF1SL et al· 1978, Biochim. Biophys· Acta 52£, 457 bis 467).
Prozeßanalysen gaben wichtige wissenschaftliche Grundlagen für die oben angegebene Verfahrensführung:
- Die intensive Akkumulation an alkalischer Phosphatase er-
f-ro
folgt in der stationären Waohstumsphese der Kultur, und zwar dann, worin das Mbrmedium total an Glucose verarmt und dor Phosphatgehalt unter 7 mM abgesunken ist. Der Phosphatgehalt ist etwa 50fach höher als bei in dor Literatur (V. JEANNODA & G. BALASSA (1978) Moleo. gen. Genet. 163. 65 bis 73) erwähnten alkalische Phosphatase-Synthesen mit Baoillen.
- Eine um 50 % höhere Akkumulation an alle al lecher Phosphatase wird duroh ein Gluoosef eeding in der Ube.?gangsphaee der Kultur erreioht. Die Teobnologie des Gluoosefeedings erfolgt in der Weise, daß die Konzentration an freier Glucose in der KuItürlösung etwa 2 Stunden nach Beendigung der Zufütterung O % beträgt.
- Die Syntheeerate der alkalischen Phosphatase von Bacillus lioheniformis wird ganz entsoheidend duroh die Intensität der Durohmisohung der Kulturlösung beschleunigt. So wird allein duroh die Erhöhung der Hührgesohwindigkeit cieo Laboriermenters von 600 auf 800 rpm bei gleichbleibendem Lufteintrag zum gleichen Fermentationszeitpunkt eine um das lOfaohe höhere alkalische Phosphatsso-Aktivität gemessen *
- Die optimale Fermentationstemperatur liegt bei 37 0C Eine Abweichung um t 3 0C bewirkt bereits eine merkliohe Senkung der Enzymausbeute.
- Um eine ungestörte alkalische Phosphatase-Akkumulation zu erreichen, ist <?τ.β Nährmedium aus den aufgeführten C- und N-Quellen so zusammenzusetzen, daß duroh die metabolische Wirkung der Kultur in der Phase der intensiven Produktbildung die Konzentration des Phosphates < 7 mM ist und nioht mehr als 20 bis 30yug/ml Ammonium freigesetzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßea Verfahren können Enzymaktivitäten erreioht »ardan, die die Höhe der aus Kälberdarm gewinnbaren
Aktivitäten errelohen, so daß eine technische Produktion bakterieller alkalischer Phosphataso ökonomisch sinnvoll ist.
Gegenüber der bisher durchgeführten klolntechnlechon Produktion von alkalischer Phosphatase mit E. coli hat Bacillus lioheniformis 41p - ZIMBT 10 911 - den Vorteil, toxikologisch und pathologisch unbedenklich zu Bein.
Die Erfindung soll anhand von Aueführungsbeispielen näher . erläutert werden»
Ausführungtibolspiole
Der Bakterienrasen einer 48 h bei 37 0O bebrüteten Sohräg» agaikultuB Baoillus lioheniformis 11p - ZBiEZP 10 911 - auf Caseinagar wird mit sterilem Leitungswasser abgeschwemmt und in 50 ml einesVorkulturmediums in 500 ml-Rundstehkolben übertragen. Naoh einer .Inkubation von 7 h bei 37 0C auf einer Sohüttelmasohine mit 220 U/min werden ca. 4 bis 6 χ
10 Zellen/ml erreioht. Damit werden die Produktionsmedien so beimpft, daß etwa 3 x 1Cr Zellen/ml KuI tür lösung vorhanden sind.
Der Fermentationsprozeß mit dem nachfolgend aufgeführten Produktionsmedium erfolgte in einem Laborfermonter mit 1,5 1 Nettovolumen. Die Fermentationstemperatur lag bei 37 0C, der Lufteintrag betrug 1 vvm bei 800 U/min. Der Anfang s-pH-Wert lag bei 6,5, zum Zeitpunkt des Abbaus lag er bei pH 7,0. Unter diesen Bedingungen bildet der erfindungsgemäße Bacillus Hoheniformis 11p durchschnittlich 2,2 IE alkalische Phosphatase pro ml Kulturζentrifugat, das bei 6 000 U/min 10 Minuten zentrifugiert wurde.
Zusammensetzung der Nährböden für die Anzucht des Bakterienrasens und für die Vorkulturt
zu
Casoinogar:
Vor kulturmedium t P:jjoduktionsmedium:
— 7 —
Gluoose
Casein
Na2HPO^ . 2 H2O
Agar-Agar
Gluoose
Trookenhefe
Weizenfeinsohrot H . 2 H2O • / H9U
Stärkehydjffolyseprodukt
Sod&öohrot Casein
Na2HPO^ . 2 H2O . 7 H0O
0,5 0,5 0,6 0,1 2,5
2,0 0,5 0,5
0,1
1,6 0,8
Anzuoht und Fermentation erfolgen wie· im Beispiel 1, nur jiit dem Unterschied, daß die Rührung 700 U/min beträgt und von der 12. bis zur 20. Fermentatiousstunde insgesamt 9 8 Gluoose zugefüttert werden. Die Ausbeute konnte au£ 2,7 DS/ ml gesteigert werden.
Die quantitative Bestimmung der alkalisohen Phosphatase erfolgte untttP optimalen Bedingungen bei 37 0O in 1 M !Oiäthanolamin-HCl, ρΊ 9,5 (modifiziert naoh K. YAMANB und 5. MABKO (1978) J, Beoteriol. Ij^, 100). Als Substrat diente 5,5 mM p-Nitrophc>ny !phosphat.
Eine IE (internationale Einheit) ist definitionsgemäß die Menge alkalische Phosphatase, die die Freisetzung von 1yuMol p-Nitrophenol Je Minute unter den Bedingungen der Prüfmethode bewirkt.
Claims (5)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alkalischer Phosphataseι dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Bacillus lichenif ormie 41p - ZIMBT 10 911 - verwendet wird.
2» Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die C-, N- und P~Quellen des Nährmediums so kombiniert werden, daß durch die metabolisohe Wirkung der Kultur in der Phase der intensiven alkalische Pho ep hat aoe-Akkumulation der Gluoosegehalt des Nährmediums O %, der Phosphatgehalt C7 mM und die NH^-Konzentration nicht mehr als 20 bis 30/Ug/ml beträgt.
3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Übergangsphase ein Gluoosefeeding erfolgt.
4. Verfahren naoh den Punkten 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das FermentationsDiedium intensiv durchmischt wird.
5. Verfahren nach den Punkten 1 bis 4, dadurchgekennzeiohnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur von 34 bis 40 0C, insbesondere bei 37 0C, erfolgt.
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