DD266964A5

DD266964A5 - Verfahren zur herstellung von insulinloesungen

Info

Publication number: DD266964A5
Application number: DD30807887A
Authority: DD
Inventors: Klavs H Joergensen
Original assignee: Novo Industri A/S,Dk
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1989-04-19
Also published as: ZA877825B; DK503386D0; JPS63179831A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Insulinloesungen. Erfindungsgemaess werden Insulinloesungen fuer die parenterale Verabreichung mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften, die mindestens 20 Insulineinheiten je ml enthalten und aus einer Loesung von Insulin oder einem Derivat davon und Magnesiumionen in einer im Bereich von etwa 0,005 bis 0,5 M liegenden Magnesiumkonzentration bestehen, wobei die Loesung einen p H-Wert im Bereich von 3 bis 8,5, vorzugsweise unter 8, aufweist und wahlweise ein verzoegernd wirkendes Praezipitat von Insulin oder einem Derivat davon enthaelt, in der Weise hergestellt, dass ein Magnesiumsalz, Insulin oder ein Insulinderivat und Wasser in angemessenen Mengen vermischt werden und, wenn erforderlich, der p H-Wert eingestellt wird.

Description

zu 9

Anwendungagablet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen für die Behandlung von Diabetes.

Charakteristik des bekannten Standes Jer Technik

Für die Behandlung von Diabetes eingesetzte Insulinpräparate enthalten Insulin sowohl in Lösungen als auch Suspensionen. Die Insulinsuspensionen, alle mit verzögerter Wirkung, besitzen um etwa 7 liegende pH-Werte. Die Insulinlösungen haben entweder bei etwa 3 (schnellwirkende sowie auch verzögert-wirkende Lösungen) oder bei etwa 7 (nur schnell-wirkende Lösungen) liegende pH-Werte.

Der Grund für die Differenz zwischen den beiden pH-Wert-Interval .en von Insulinlösungen liegt in der geringen Wasserlöslichkeit von Insulin irt ier Nähe seines isoelektrischen pH-Wertea (annähernd 5,3) sowohl beim Fehlen von Zinkionen (Tanford und Epstein: O. Am, Chem. Soc. 76, (1954), 2163 - 69, Fig. 1) ale auch beim Vorhandensein von Zinkionen (Fredericq und Neurathj 3. Am. Chem. Soc., 7,2 (1950), 2684 - 91_e Fig. 4).

Die sauren Insulinlösungen werden heute wegen de« Abbaues von Insulin durch Desamidierung nicht so umfassend angewandt wie zu Beginn der Insulinepoche·

Insulin-Präparate sind beispielsweise aus folgenden Veröffentlichungen bekannt ι

Die DK-PS Nr. 63 000 betrifft Präparate, die Suspensionen von Komplexen enthalten, die aus Insulin, Verzögerungsmitteln

-latz. B. Protamln) und Magnesiumionen bei pH-Werten von 6,5 bis 7 bestehen, wobei dio angeführten Magnesiumkonzentra» tionen unter 0,004 M liegen.

Die US-PS 4.196.196 befaßt eich mit einer Zusammensetzung zur Erhöhung der vaskulären Perfu9ion und Reperfusion bei Krankheitszuständen, wobei die Zusammensetzung aus Glucose, Insulin und Magnesiumdikaliummethylendiamintetraessigsäure besteht. Bei diesem Beispiel enthält das bekannte Präparat 0,02 Inöulineinheiten pro ml.

Die US-Pö 4.472.385 betrifft die Stabilisierung von Zink-Insulin-Lösungen bei pH-Wert©n von 7 bis 8, wobei die verbesserte Stabilität durch die Zugabe von etwa ü,0004 bis 0,01 M Calcium- oder Magnesiumionen erreicht wird. Die obere Grenze für die Magnesiumkonzentration liegt in den bekannten Beispielen bei 0,002 M.

Die Gegenstände der drei oben genannten Patente liegen außer· halb des Geltungsbereiches dieser Erfindung»

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von iBulinlösungen mit verbesserten therapeutischen Eigenschaf ten*

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Vorfahren zur Herstellung von Insulinlösungen mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften, insbesondere für die perenterale Anwendung zur Verfügung zu stellen.

Die Erfindung basiert auf den folgenden überraschenden Erkenntnieseni

1) Lösungen, die Insulin in therapeutisch relevanten Konzentrationen enthalten, können mit Konzentrationen von Maonesium· ionen von etwa 0,05 bis 0,5 Mol/Liter im pH-Wertbereich von etwa 4 bis 6,2, d. h_# annähernd dem isoelektriachen Punkt von Insulin, hergestellt werden.

2) In dem pH-Wertbereich von etwa 3 ble 4, der wegen der chemiechen Unbeständigkeit bei Insulin unangebracht ist, können brauchbare Lösungen von Insulinderivaten in Gegenwart von Magneslumionen in Konzentrationen von etwa 0,005 bis 0,5 M hergestellt werden, unter der Voraussetzung, daß Αθη durch einen keine Amidogruppe enthaltenden Aminosöurerest substituiert wird.

3) Auch im pH-Wertbereich von etwa 6,2 bis 8,5 können brauchbare Lösungen, die wahlweise ein Ineulinpräzipitat enthalten, unter Einbeziehung von Magnesiumionen in Konzentrationen von etwa 0,005 bis 0,5 M hergestellt werden*

Öle erfindungsgemäßen Präparate besitzen Eigenschafton, die denen der bisher üblichen Ineulinp'-Öparate überlegen sind.

Zu 1) ist zu sagen, daß jetzt überraschenderweise gebunden wurde, daß viele Magnesiumsalze, z. B* Magnesiumchlorid, bei pH-Werten von etwa 4 bis 6 eine Solubilisierungswlrkung auf Insulin ausüben, sowohl an sich als auch im Vergleich zu den entsprechenden Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalzen (siehe das unten angeführte Beispiel 1). Verschiedene Mischungen von Magnesiumsalzen ergeben die gleiche Wirkunp. Man zieht daher die Schlußfolgerung, daß das Vorhandensein von Magnesiumionen in bestimmten Konzentrationon einen kritischen Parameter für die Löslichkeit von Insulin bei pH-Werten von etwa 4 bis 6,2 darstellt.

Unter der Bezeichnung Magnesiumionen sollen sowohl freie als auch gebundene Magnesiumionen zu verstehen sein.

Weiter wurde überraschend ermittelt, daß Protamln in die erfindungsgemäßen Insulinlösungen mit pH-Werten von etwa 4 bis 6,2 einbezogen werden kann, ohne daß der Protamin-Insulln-Komplex

Precipitation aufweist. Nach dor Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7 fäj.lt ein derartiger Komplex aus·

Durch Calciumionen wird die Löslichkeit von Insulin im pH-Wertbereich v?n etwa 4 bis 6,2 gleichfalls erhöht. Allerdingo zeigen die Erg'jOnisse von in vitro Versuchen unter simulierten physiologischen Bedingungen, daß die Injektion einer Cnlciumionen enthaltenden Lösung in Gewebe zur Präzipitation von Calciumcarbonat und Calciumphosphat selbst bei weit unter 0,05 M liegenden CalciumKonzentrationen führt. Andere Versuche haben ergeben, daß die Präzipitation entsprechender Magnesiumverbindungen nach der Injektion von erfindungsgemäßen Lösungen nicht stattfindet. Da die Präzipitation von Calciumverbindungen in Goweben schädlich sein kann (wegon der Gefahr der künstlichen Calcifizierung), sollte der Gehalt an freien Calciumionen in den erfindungsgemäßen Präparaten nicht wesentlich über dem liegon, der dem Calciumgehalt in extrazellulären Flüssigkeiten entspricht. Die erfindungsgemkßen Präparate enthalten vorzugsweise weniger als etwa 10 mM Calciumionen, noch besser weniger als etwa 2 mM Calciumionen. So weit dem Erfinder bekannt ist, werden in den dem bisherigen Stand der Technik entsprechenden Veröffentlichungen, die 3ich auf Magnesiumionen enthaltende Insulinlösungen beziehen, der pH^Wertbereich von 4 bis 6,2 oder Magnesiumionenkonzentrationon von 0,005 bis 0,5 Mol/Liter nicht erv^nnt,

Erfindungsgemäß können Magnesiumionen in dem oben beschriebenen Konzentrationeberoich zu einer Lösung von Insulin oder einem Insu.llnderivat gegeben werden, wobei die Lösung, wenn verlangt» außerdem ausgefälltes Insulin oder ein ausgefälltes Insulinderivat mit verzögerter Wirkung enthält. Zum Zwecke der subkutanen Vorabroichung werden Magnesiumionen zugesetzt, um

- 5 - ZCC9C1

eine Lösung mit einem schnelleren Einsetzen der Wirkung oder, wenn die Lösung Protamin enthält, mit einer verzögerten Wirkung zu erhalten« Wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch ausgefällte« Insulin oder auegefälltes Insulindorivat enthält ι kann ein zweiphasigee Präparat gewonnen werden« Im Vergleich mit den bekannten zweiphaeigen Ineulinpröparaten bewirken die er^indmgsgemäßen zweiphasigen Präparate ein rascheres Einsetzen der den Blutzucker senkenden Wirkung. Beispiele für ausgefälltes Insulin sind Zirkinsulinkristalle und Protamin-Zinkinsulirikristalle.,

Die Erfindung betrifft daher Insulinlöaungon, die wahlweise ein Insulinprözipitat enthalten können, für die parenterale Verabreichung mit einem im Bereich von etwa 3 bis 8,5 liegenden pH-Wert und einem Gehalt an Magnesiumionen im Konzentrationsbereich von etwa 0,005 bis 0,5 Mol. Die Konzentration von gelöstem Insulin kann im Bereich von etwa 20 bis 500 Insulin*· einheiten pro ml liegen.

Im Fachgebiet bekannte Stabilisierung?»- und Konservierungsmittel können in dem Ineulinpräparat vorhanden saln.

Protamin kann vorhanden sein, möglichst von 8 bis 40 % (Masse/ Masse) in bezug auf die Masse von Insulin, wobei 10 bis 30 % (Masse/Masse) ein bevorzugter Bereich iet.

Wenn in den erfindungsgemäßen Insulinlösungen keine Verzögerungs· substanzen vorhanden waren, dann erfolgte die Absorption von Insulin überraschenderweise schneller als die des Bezugsinsulins (siehe die folgenden Beispiele 2 bis 9 und Xl), Diese Eigenschaft ist für ein rasch wirkendes Insulin von Vorteil, vor allem in Verbindung mit einer mehrmaligen Injektionsform,

boi der Insulin vor jeder Mahlzeit verabreicht wirdo Bei ochneller einaetzonder Wirkung kann dae Insulin entsprechend kürzer vor dem Essen als bei herkömmlicher» schnell-wirkenden Ineulinlösungen verabreicht werden« Außerdem wird durch dao schnellere Verschwinden von Insulin möglicherwelee die Gefahr von Hyperglycömie nach dem Essen verringert.

Erfindungsgemöße Insulinlösungen mit einem im Bereich von 3 bis 6,2 liegenden pH-Wert können eich auch ale besonders brauch* bar für Infusionszwecke mit Hilfe von Pumpen erweisen, weil die Möglichkeit einer durch Kohlondioxiddiffusion durch Kathoder verursachten Ineulinpräzipitotion ausgeschlossen wird. Eine derartige Präzipitation ist gelegentlich bei neutralen Infueicnslösungon beobachtet worden, und es wird angenommen, daß sie auf eino durch Kohlendioxid hervorgerufene Senkung des pH-Wertes zurückzuführen ist.

Erfindungegomöße Insulinlösungen, die über etwa 5 %, vorzugsweise über otwa 8 % und am besten über etwa IO % (Masse/Masse) Protamin ouf der Basis von Insulin enthalten, zeigen eine verzögerte Absorption von Insulin nach der subkutanen Injektion bei Schweinen im Vergleich zu dem Bezugsinsulin (eiehe die folgenden Beispiele 4 und 5). Vorzugsweise liegt der Gehalt an Prota'iin unter etwa EO %, möglichst unter etwa 40 % und am besten unter etwa 30 % (Meese/Masse), Erfindungsgemäße Protamin-lnsulin-Pröparate r .ben gegenüber verzögert-wirkenden neutralen Insulin-'Protamin-Suspensionon einen Vorteil, weil die Unannehmlichkeit der Sedimentation nicht auftritt. Die bekannten neutralen Protamin-Insulin-Präparate sind Suspensionen, während ee sich bei den bevorzugten erfindungogemößen Protamin-Insulin-Pröparaten um Lösungen mit unter etwa 6,2 1,1 τ gen de η pH-Werten handelt.

Von den erfindungsgemäßen Lösungen wird angenommen, daß sie besonders gut für die Verabreichung durch füllhalter-artige Geräte, wie sie für eine mehrmalige Insulin-Injektionstherapie verwendet werden, geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Präparate können ein natürlich vorkommendes Insulin und/oder oin Derivat davon enthalten« Bevorzugte Imiuliriü für dio praktische Ausführung der Erfindung sind d.ip, von Menschen, Schweinen und Rindern stammenden, am boaten von Meriechßn. Für die erfindungagemöße Praxis können auch andere natürlich vorkommende Insuline angewandt werden. Vorzugsweioe wird Insulin mit hohem Reinheitsgrad verwendet. Im Kontexc der Erfindung sollen unter der Bezeichnung Insulin, wenn sie im Plural odsr als Gattungebegriff angewandt wird, sowohl natürlich vorkommende Insuline als auch Insulindorivate zu verstehen sein.

Man kann davon ausgehen, daß zwischen natürlich vorkommenden Insulinen und Insulinderivaten einige Unterschiede bestehen.

Erfinduncjsgomäß wird die Bezeichnung Derivate von Insulin (odor Insulinderivate) für Peptide angewandt, die einen den Blutzucker senkende Wirkung haben und eine Aminosäurezuoammensetzung aufweisen, die mit der von Humaninsulin unter der Vc-rauseetzung identisch ist, daß einige wenige der Aminosäurereste durch andere Aminosöurereste ersetzt sind, und die G-terminals Carboxylgruppe der B-Kette wahlweise geschützt ist. Beispiele für derartige Insulinderivate werden unter anderem in zwei Europäischen Patentanmeldungen, den Veröffentlichungen Nr. 86301755 und 85306721 beschrieben, deren Inhalt hier unter Bezugnahme oinbezogen wird»

Wenn Human-, Schweine« oder Rinderinsu^in für erfindungsgemäße Lösungen eingesetzt wi-d, muß der Zinkgehalt de9 Insulins niedrig sein, vorzugsweise unter 0,1 Zinklonen/Hexamer (das ent-

spricht weniger ale 0,02 % (Masse/Masse) auf der Basis von Insulin) liegen, um eine Precipitation von insulin bei den über etwa 4 liegenden pH~Werton zu verhindern, und das gleiche gilt auch für Protamin enthaltende Lösungen. Aus zinkinsulinkri&tallen kann das zink entfernt werden, z. B, durch Ausealzungsverfahren und anschließende Prözipitation bei einem pH-Wert von 5 (Schlichtkrulli Acta Chem. Scand. 10 (1956), 1455 - 58). Wenn ,Jedoch Mittel vorhanden uind, die mit zink Komplexe bilden können, wie Citrat, kann der Zinkgehalt höher sein.

Werden Insulinderivate angewandt, braucht der Zinkgehalt nicht in dem gleichen Maße kritisch zu sein. In einigen Folien von Xnsulinderivaten kann ein hoher Anteil von Zinkionen (z. B. bis zu 10 Zinkionen/Hexamer) unter den Bedingungen der erfindungegemäßen Lösungen mit Jen Insulinlöslichkeiten vereinbar sein und kann sogar wünschenswert sein (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 86301755).

Von Protamin ist bekannt, daß es ein hetarogenes Gemisch ist. Protaroin kann von Fischen wie Oncorhynchus kata gewonnen werden. Ee kann aber auch von anderen Fischen stammendes Protamin verwendet worden. Normalerweise wird Protamin als Protaminsulfat verkauft. Es können aber auch andere Salze eingesetzt werden. Vorzugsweise wird Protamin mit hohem Reinheitsgrad verwendet .

Als Beispiele für andere bevorzugte erfindungsgemäße Präparate können sowohl Zink ale auch Protamin enthaltende Präparate angeführt werden. In derartigen Präparaten, bei denen es sich um Lösungen von Insulindorivaten im pH-Wertbereich von 3 bis 4 oder neutrale Suspensionen von Säugetierinsulin handeln kann, kann der Zinkgehalt bis zu etwa 25 Zinkionen pro Hexamer Insulin oder Insulinderivat botragen.

y ₁₀

Der Ineulingehalt In erfindungsgomäßen Lösungen kann im Bereich von 20 bis 500 IU/ml, vorzugsweise im Bereich von 40 bis 100 IU/ml, bei Präparaten für die Injektion liegen, pur andere Zwecke der paronteralen Verabreichung kann der Insulingehalt jedoch höher sein. Die Insulinlöoung kann mit einem festen Insulinmaterlal wie Zinkinsulinkrietallen oder Zink-Protamin^AIneulinkristallen vermischt werden«

Erflndungsgemäß können die verschiedensten löslichen Magnesiumsalze, sowohl einzeln als auch vormischt, verwendet werden. Beispiele für mögliche Anionen sind Chlorid, sulfat, Monocarboxy-Ia to wie Acetat, Propionat und Butyrat und Dicarboxylic to wie Succlnat, Aspartat und Glutamat. Die optimale Konzentration von Magnoslumionen wird von dem (den) angewandten Salz(en) abhöngig sein und sollte in bezug auf die Bedingungen für den verlangten zeitlichen Ablauf der Herstellung, die Insulinlöslichkeit und die Annäherung der Zusammensetzung an leotonlsche Bedingungen gewählt werden* Isotonische Konzentrationen von Magnesiumsalzen zeigen große Unterschiede, wie durch die isotoniechen Konzentrationen von Magnesiumchlorid und Magnesiumsulfat erläutert werden kann, die annähernd 0,1 M bzw. 0,26 M betragen. Andere Salze, Aminosäuren und nicht-ionische Mittel (neben Konservierungemitteln) können vorhanden sein, wenn sie nicht-toxisch und mit dem Insulinpröparat insgesamt verträglich sind.

Effindungsgemäß betrögt der Bereich anwendbarer Magneeiumionenkonzentrotionen etwa 0,005 M bis 0,5 M, vorzugsweise über O,o5 M. Die obere Grenze ist etwas willkürlich, wobei sie unter der Voraussetzung gewählt wird, daß eine gewisse Überschreitung der Jsotonizität in einigen Fällen (z. B. für die Intraperitoneale Infusion) annehmbar sein kann. Gemäß einem bevorzug-

ten erfindungsgemftßen Ausführungsbeispiel enthalten die Präparate etwa 0,08 M bis 0,3 M Magnesiumionen.

Oae in dem erfindungsgemäßen Insulinpräparat vorhandene Konservierungsmittal kenn dem bisher in herkömmlichen Insulinpräparaten entsprechen, zum Beiepiol Phenol, m-Creeol und Methylparaben sein.

?.ur Herstellung wäßriger erfindungegemäßer IneulinlÖeungen kann eiine achwach saure Lösung von Insulin mit einer alle anderen EJestandteile dos fertigen Präparates enthaltenden Lösung vermischt worden* Anschließend folgen die Einstellung des pH-Wertes, wenn erforderlich, Rühren bis eine klare Lösung gewonnen wird, und abschließend sterile Filtration· Wenn verlangt, kann eins sterile verzögernd-wirkende Insulinsuspension der 3terilen Insulinlösung zugesetzt werden, wodurch ein Präparat mit zweiphasigor Wirkung entsteht. Zum Schutz der Präparate gegen Denaturierung, dio durch gelegentliches Erwärmen und Schütteln auftreten kann, können bekannte stabilisierungsmittel wie phospholipide zugegeben werden.

Präparate, die ein Irisulinderivat enthalten, werden in analoger Weise hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Insulinpräparate können für die Behandlung von Diabetes eingesetzt werden. Es ist zu empfehlen, daß die Dosierung der erfindungsgemäßen Insulinpräparate von einem Arzt in einer ähnlichen Weise wie die Wahl der Dosierung bekannter Insulinpräparate für Injektionen festgelegt wird.

- 12 -

Die folgenden Beispiele zeigen, wie Magneeiumionen die Löslichkeit von Insulin erhöhen, wie bevorzugte erfindungsgemäße Insulinpräparate hergestellt werden können und wie sie nach der Injektion bei Schweinen wirken«

Au8f ührungsbelepiele

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Saure Lösungen, die 200 IU zi.ikfreies Human-Monokomponenten-

125 Insulin pro ml, eine Spurenmenge von Human-Mono- I-(A19)-Insulin, 2 g Phenol/Liter und ein (in der folgenden Tabelle I aufgeführtes) Salz in einer annähernd isotonischen Konzentration enthalten, wurden/auf die in Tabelle I angegebenen pH-Werte eingestellt. Die Löslichkeiten wurden mit Hilfe von Messungen der Radioaktlvitätakonzentrationen in den überstehenden Flüssigkeiten und die Umwandlung der Ergebnisse auf IU/ml bestimmt (1 IU entspricht 38 ^Jg Insulin). Oer Einfluß der Salze auf die Löslichkeit von Insulin (IU/ml) bei Raumtemperatur gsht aus Tabelle I heivor.

Tabelle I	0,1 M	0,15 M	O₄15 M	0,15 M
	MgCl₂	NaCl	KCl	NH₄Cl
pH	über 200	über 200	über 200	über 200
3,5	135	79	98	109
4,0	85	20	26	29
4,5	104	16	17	22
5,0	124	18	21	25
5,5	70	25	32	29
6,0	21	41	56	27
6,5

Y 13

Tabelle I zeigt, daß die Löslichkeit des Insulins in einer annähernd isotonischen Magnesiumchloridlösung überraschenderweise viel höher ist als die LÖelichkeiten in entsprechenden Lösungen von Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumchlorid, jeweils bei jjH-Werten von 4 bis 6, und fast 100 iu/ml erreicht, eine normalerweise angewandte Konzentration von Insulinpräpareten für dio Injektion.

Die Löelichkoit von Insulin (IU/ml) bei Raumtemperatur, bei einem pH-Wert von 5,5 und bei verschiedenen Konzentrationen der Salze wurde ermittelt und wird in der folgenden Tabelle II dargestellt*

Tabelle II	über	MgCl₂	NaCl	KCl	NH₄Cl
Salz-Konz*	über
M	über	12	4	4	5
0,025	über	33	5	6	5
0,050	über	72	7	9	8
0,075	üb'jr	101	11	12	11
0,10		200	21	21	25
0,15	200	37	34	39
0,20	200	41	54	66
0,25	200	76	74	108
0,30	200	69	84	123
0,35	200	100	119	146
0,40

Aus Tabelle Il geht eine höhere Löslichkeit in Magnesiumchlorid· lösungen im Verhältnis zu Natriumchlorid-, Kaliumchlorid- und Ammoniumchloridlöeungen über einen breiten Bereich von Salzkonzentrationen hervor.

lenses ^1Λ

Beispiel 2

Es wurde eine als 1 bezeichnete Lösung mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt j 0,15 M Magnesiumbutyrat, 0,006 M Zitronensäure, 2 g/Liter Phenol und 100 iu/ml zinsfreies Human-Monokomponenten-In3ulinj pH-Wert = 5,8.

f=ine als 0 bezeichnete Lösung, die als schnell-wirkendes Stondard-Insulinpräparat, A.ctrapid™HM, hergestellt wurde und folgende zusammensetzung hatte, wurde als Bezugspräparat verwendet: 16 g Glycerol/Liter, 2 g Phenol/Liter und 100 IU/ml Human· Monokomponenten-In8ulin (2 Zinkionen/Hexamer)j pH-Wert 7,4. Das Mittel entspricht den Anforderungen der United States Pharmacopeia XIX für Neutrale Insulin Injektion.

Beiden Lösungen wurde Human-Mono- I-(A-19)-Insulin in Spuren-Konzentrationen (0,3 bis 1 ,uCi/ml) zugesetzt. Anschließend wurde 0,1 ml jeder Lösung getrennt zwei Schweinen subkutan injiziert. Die Absorption wurde durch äußerliche Überwachung der Radioaktivität, die an der Injektionsstelle zurück blieb, mit HilfJ eines Szintillationskristalldetektors, der mit einem Spektrometer verbunden war, analog einer Methode verfolgt, die für Absorptlonsuntersuchungen bei Menschen "Absorption von injiziertem Insulin" (Doktorarbeit) entwickelt worden war (Binder 1969). Zur Bestimmung von plasmaglucose und Plasmainsulin wurden Blutproben entnommen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III enthalten.

Tabelle III zeigt die zeitliche Bestimmung von Restradloaktlvltät, plasmaglucose und Plasma-IRI (immuno-reaktivem Insulin, bestimmt durch Radioimmunoanalyee)♦ Die Werte der Radioaktiv!-

tot an der Injektionastelle elnd in Prozent dee unmittelbar nach der Injektion gemessenen Wertes (Zeit « O) angeführt. Die Plasmaglucosekonzentrationen sind in Prozent des Wertes der Blutprobe, die unmittelbar vor der Injektion entnommen wurde (Zeit β O), angegeben.

Lösung O: Bozugslösung, die einem Schwein verabreicht wurde

(Masee: 77 kg)

Lösung JLi Testlösung, die einem anderen Schwein verabreichtwurde (Masse » 79 kg).

Tabelle III:

Zeit nach % Radioaktivität % Plasmaglucoae der Injek- O 12 1 tion min

Plasma IRI, ,uu/ml O

-15	100	-	98	98	unter 5	unter 5
O	91	100	100	100	unter 5	unter 5
30	76	67	95	41	16	25
60	69	54	67	49	18	23
90	56	40	56	43	19	18
120	38	27	51	41	13	14
180	23	11	47	45	10	5
240	14	5	58	78	9	unter 5
300	3	65	108	7	unter 5

Wie aus Tabelle III zu entnehmen ist, wird das Testinsulin schneller absorbiert als das Bezugsinsulin. Das stimmt vollkommen mit den Beziehungen zwischen dem zeitlichen Verhalten des Prozentanteils der Plasmaglucose bei den Lösungen O und bzw· zwischen dem zeitlichen Vernalten von Plasma-IRI bei den Lösungen O und JL überein.

9 CV 16

Beispiel 3

Ee wurde eine ale Z bezeichnete Lösung mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 0,175 M Magneeiumacetat, 0,0375 M Essigsäure, 2 g/Liter Phenol, 100 IU/ml zinkfreies Human-Monokonipononten-Insullnj pH-Wert 5,5.

Spureninsulin wurde wie in Beispefol 2 zugegeben· 0,1 ml der Löoung 2 wurde einem Schwein an einer Seite des Halses subkutan injiziert, wo ιrend 0,1 ml Bezugeinsulinlööung, 0 (nach der Beschreibung 11 Beispiel 2 hergestellt) dem gleichen Schwein an der anderen oeite des Halses subkutan injiziert wurde«

Die Absorption wurde wie in Beispiel 2 beobachtet. Nach einer Woche wurde der Versuch unter Vertauschen der Injektionsetellen wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV enthalten.

Tabelle IV Zeitliche Bestimmung von % Restradioaktivität. Mittelwerte aus

zwei Versuchen an dem gleichen Schwein

Zelt nach der % Radioaktivität Injektion min

0	2
100	100
92	79
86	63
73	53
63	44
42	26
25	12
15	5

Aus dieser Tabelle ist zu entnehmen, daß das Testinsulin schneller als das Bezugsinsulin absorbiert wird»

Beispiel 4

Ee wurden zwei als 3A und 3B bezeichnete Lösungen mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt ι 3As 0,14 M MgSO₄₁ 0,05 M MgCl₂I 2 g/Liter phenol, 100 IU/ml zinkfreies Human-Monokomponenten-Ineulini pH-Wert eingestellt auf 5,5 mit HCl. 2>Bi wie 3A, aber mit einem Zusatz von 1 g Protarninsulfat/ml.

Spureninsulin wurde wie in Beispiel 2 zugegeben. 0,1 ml der Lösung 3>A wurde Schwein I und Schwein II an einer Seite des HaI-8θβ subkutan injiziert« 0,1 ml von Lösung 3D wurde entsprechend Schwein III und Schwein IV injiziert. 0,1 ml einer Bezugsineulinlösung, O, (nach der Beschreibung In Beispiel 2 hergestellt) wurde subkutan jedem der vier Schweine an dor anderen Halseeite injiziert. Pid Absorption wurde wie in Boiopiel 2 beobachtet. Die Ergebniese sind in Tabelle V enthalten.

Tabelle V

Zeitliche Bestimmung von Restradioaktivität 3At ohne Protamin, 3E3i mit Protamin

% Radloaktlvität

Zeit nach d.	Schwein I	3A	Schwein II	3A	Schwein III	3B	Schwe	in IV
Injektion	O		O		O		O	3B
min		100		100		100
O	100	89	100	79	100	103	ICO	100
30	97	69	'85	54	92	93	9Λ	95
60	89	63	75	43	77	95	78	93
90	71	45	62	29	60	86	65	88
120	66	25	54	13	50	82	53	82
180	45	12	38	6	30	83	34	73
240	26	6	24	,3	15	73	18	71
300	16	17	9	11	66

Aus dieser Tabollo let zu entnehmen, daß das Test insulin in Abwesenheit von Protamin schneller absorbiert wird als das Bozugsinsulin, aber viel langeamer als das Bezugsinsulin in Gegenwert von Protamin.

Beispiel ΰ

Es wurden drei als A£, 4B und 4C bezeichnete Lösungen mit folgenden Zusammensetzungen hergeetelltj 4As 0,18 M Magneeiumsucclnat, 0,01 M MgUl₂* 0,002 M MnSO₄, 0,02 M Succinsöure, 2 g/Liter Phenol, 100 i.U/ml zinkfreies Human-Monokomponenten-Insulinj pH-Wert 5,6. 4Bi Wie 4A, jedoch mit einer Zugabe von OJBj mg Protaminsulfat/ml, 4Ci Wie 4A< jedoch mit einer Zugabe von 0,73 mg protamlneulfat/ml.

Spureninsulin wurdo wie in Beispiel 2 zugegeben* 0,1 ml der Lösungen 4A, 413 und 4C wurde den Schweinen A, B bzw» C subkutan an einer Seite des Halses injiziert. 0,1 ml einer Bezugsinsulinlösung, O, (nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellt) wurde jedem der drei Schweine an der anderen Halsseite subkutan injiziert» Die Absorption wurde wie in Beispiel 2 verfolgt. Eine Woche später wurde der Versuch unter Vertauschen der Injektionsstellen wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI enthalten.

Tabelle VI

Angaben von Beispiel 5, Zoitliohe Bestimmung von ReRtradioaktivität. Mittelwerte von zwei Versuchen. 4A: ohne Protamin.

4Bs mit Protamin, niedriger Gehalt» 4Ci mit Protamln, hohe,· Anteil»

% Radioaktivität

Zeit nach	Schwein A	4A	Schwein B	4J	Schwein C	4C
der Injek	0		0		0
tion
min		100		AGO		100
0	100	82	100	87	100	89
30	91	71	92	86	92	87
60	78	57	87	80	84	85
90	66	45	74	73	71	81 .
120	51	23	63	6Z	59	70
180	33	15	47	54	40	66
240	21	9	35	46	25	56
300	15	6	25	35	17	45
480	10	4	16	27	9	31
600	8	4	8	17	5	19
720	6	5	4

Aue dieser Tabelle geht hervor, daß das Testineulin im Vergleich zum Bezug8ln8ulln schneller ohne Protamin absorbiert wird, langsamer bei dem niedrigen Gehalt an Protamin und sogar noch langsamer bei dem hohen Pro*\<mingehalt.

In den Beispielen 6 bis S₁ 10 und 11 wurden die Absorptionseigenschaften der Teetpröparate im Vergleich mit einer Human-Actrapid-Bezugslösung wJLo In den Beispielen 2 bis 5 untersucht« In Beispiel 9 wurde eine andere Bezugslöeung verwendet, siehe unten» Der Einfachheit halber wird das Vergleicheergebnis je-

doch als dao Durchechnittsverhältnis angegeben:

^? " ^T5O ft(^T(38t)/^T50%(^Bezu9)

worin T₅₀(w(TG8t) urd T₅₀^(Bezug) die Zeit darstellen, die vom Z9itpunl<t der Injektion bie zum Absinken der an der InjektioneotQlle gemessenen Radioaktivität auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes bei Tost bzw. Bezug vergangen ist. Die Anzahl der eingesetzten Schweine wird mit N bezeichnet.

Beispiel 6

TestlÖsungi 0,14 M MgSO₄, 0,05 M MgCl₂, 0,01 M Magnesiumacetat, 0,002 M CaCIr₁₁ 2 g m-Cresol/1, 100 J./ml zinkfreies Human-Monokomponenten-lnsulln plus Human-Spureninsulinj pH-Wert mit Chlcrwasserstoffsäure auf 5,7 eingestellt.

0,04 Ml joder Test- und Bezugslösung wurden jedem Schwein injiziert.

Der R-Wert wurde mit 0,73 ermittelt (N 6). Beispiel 7 TestlÖsungj 0,02 M MgCl₂, 0,?? (unleserlich, d. Ü.) M Arginln-

monohydrochlorld, 2 g phenol/1, 100 IU/ml zlnkfreiee Human-Monokomponenten-J.n8ulin plus ;>pureninsulin; pH-Wert mit NaOH auf7,7 eingestellt♦

0,08 ml jeder Test- und Bezugslösung wurden jedem Schwein injiziert.

Der R-ftert wurde ai.s 0,74 ermittelt (N 2). Beispiel 8

Teetlösurig: 0,095 M MgCl₂, 2 g Phenol/l, 100 IU-ÄquiVülente/ml zinkfroiee Schwsine-Monodesamidoinsulin plus Spurenderivat; pH-Wert mit Chlorwasserotoffsöure auf 3,2 eingestellt.

0,08 ml Jeder Test- und Bezugslösung wurde jedem Schwein injiziert. Der R-Wert wurde mit 0,71 ermittelt (N β 2).

Beispiel 9

Testlösung: 0,095 M MgCl_?, 2 g Phenol/l, 100 IU-Äquivalente/ml zinkfreies Human-Insulinderivat mit ser(B9), substituiert durch Λβρ und Thr(B27), substituiert durch Glu, plus Spurenderivatj pH-Wert ajf 7,4 eingestellt.

Oa vorher bekannt war, daß das als Actrapid formulierte Derivat Gchneller absorbiert würde als Human-Actrapld (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 83306721), diente in diesem Beispiel das als Actrapid formulierte Derivat als Bezugslösung mit 100 IU-Äqulvalenten/ml Derivat. 0,08 ml jeder Test- und Bezügslösung wurden jedem Schwein injiziert.

Der R-Wert wurde mit 0,85 ermittelt (N « 5).

So wird auch bei diesem schnell abeorbiorbaren Insulinderivat durch die Magnesiumionen eine verstärkende Wirkung auf die Absorption erzielt.

Beispiel 10

Testlösung jLi 0,0095 M MgCl₂, 0,002 M Zinkaoetat, 1 mg Protaminsulfat/ml, 3 g m-Cresol/ml, 100 lU-Äquivalente/ml zinkfreies Schweine-Monoclesamidoin8ulin plus Spurenuorlvat j pH-Wert mit Chlorwa88Gr«toff8öure auf 3,2 eingestellt.

Tostlöeung £: wie 1,, nur wurden 0,095 M MgCl₂ durch 0,14 M NaCl substitulort«

0,05 ml dor Teetlösung (entweder 1 oder Z) und der Bezugslösung (Human-Actrapid plus Human-Spureninsulin) wurden jedem Schwein injiziert*

ZOG 3t,{

Die R-Worte wurden mit 3,7 (N ο 2) und 2,9 (N =» 2) für die Testlösungen _! bzw. 2 ermittelt.

Die Ergebnisse zeigen dio verzögernde Wirkung von Magnesiumionen neben der der Zinkionen bei Protamin enthaltende Monodesamidoinsulin-Lösungon.

Beispiel 11

E8 wurde eint? pharmako-kinetische Untersuchung bei gesunden Versuchspersonen durchgeführt, Testlösung: 0,14 M MgSO₄, 0,05 M MgCl₂I O₁Ol M Magnosiumacetat, 2 g m-Cresol/1, 100 iu/ml zlnl<~ freies Human-Monokomponenten-Inoulinι pH-Wert mit Chlorwaeserstoffsäure auf 5,7 eingestellt. Bozugslösung (Actrapid™HM): 16 g Glycerol/1, 3 g m-Cresol/1, 100 IU/ml Human-Monokomponenton-Insulin (3 Zlnkionen/iiexamer) j pH~Wert 7,4.

125 Human I-Insulin wurde in Spurenkonzentrationen von 5 und 3.uCi/mi der Test- bzw. Bezugslösung zugesetzt. 4 IU der Testlösung wurden subkutan an einem Oberschenkel und 4 IU der Bezugslösung am anderen Oberschenkel jeder Person injiziert. Die Verteilung der beiden Präparate auf den linken und rechten Oberschenkel erfolgte willkürlich. Die Absorption wurde durch kontinuierliche äußere Überwachung der an der Injektionastelle jedes Oberschenkels zurückbleibenden Radioaktivität verfolgt.

Der R-Wert wurde mit 0,78 ermittelt (N » 15). Somit wird ohne Verzögerungesubstanzen eine verstärkende Wirkung auf die Absorption von insulin durch Magnesiumionen auch bei Menschen er~ zielt.

Die in der obigen Beschreibung und den folgenden Ansprüchen dargelegten Merkmale, sowohl getrennt als auch in jeder beliebigen Kombination, stellen das Material für diü Realisierung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen dar.

Claims

-Zi- Pa tent a n3ρrücnθ

1. Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen für die parenterale Verabreichung, die mindestens 20 Insulineinheiten jo ml enthalten, dadurch gewennzeichnet, daß ein Msgnesiumsalz, Insulin oder »in Insulinderivat und Wasser in angemessenen Mengen vermischt· werden und, wenn erforderlich, der pH-Wert eingestellt wird«

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung von Insulin oder einem Derivat davon und Magnesiumionen in einer im Bereich von etwa 0,005 bis 0,5 M liegenden Magneeiumkonzentration, wobei dio Lösung einen pH-Wert Im Bereich von 3 bis 8,5, vorzugsweise unter 8, aufweist und wahlweise ein verzögernd wirkenden Präzipltat von Insulin oder einem Derivat davon vermischt werden»

3. Verführen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinlösung einen im Bereichvon etwa 4 bis etwa 6,2 liegenden pH-Wert aufweist und vorzugsweise eine Magnesiumkonzentration von über etwa 0,05 M hat·

4. Vorfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche_p dadurch gekennzeichnet, daß die Magnesiumkonzentration der Inoulinlösung über etwa 0,01 M, vorzugsweise über etwa 0,05 Mund am besten im Bereich von 0,08 M bin 0,3 M liegt«

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gakennzeichnet, daß die Insullnlösung eine Aktivität im Bereich von unter etwa 500 Inbulineinheiten je ml, vorzugsweise von etwa 30 bis 200 lünsulineinhelton je ml, und am besten von etwa 40 bis 100 Ineulineinheitan je ml hat.

6. Vorfohren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dor pH-Wert der Insulinlösung im
Bereich von etwa 5 bis 6 liegt«

7. Verfahren nach einom der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinlöbung Zink und/odor
Protaitiin enthält.

8« Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinlösuno weniger als etwa
1 Zinkion je Hexamer Insulin oder Insijlinderivat, vorzugsweise weniger als etwa 0,5 Zinkionen je Hexamer Insulin
oder Insulinderivat und am besten weniger als etwa 0,1 Zinkionen je lloxamer Insulin oder Insulinderivat enthält,

9, Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Insul.inlösung rasch wirkend ist,

10, Verfahren nach den vorstehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet i daß die Insulinlösung mehr als etwa 5 %
(Masse/Masse), vorzugsweise mehr als etwa 10 %_t Protamin in bezur auf den Gehalt von Insulin oder Insulinderivat, und vorzugsweise weniger als etwa 50 % Protamin, am besten weniger als 40 % Protamin, unter der Voraussetzung enthält, daß der pH«Wert unter S,2 liegt»