DD268001A1

DD268001A1 - Schnelltest zum nachweis von h tief 2 o tief 2-bildenden aunstratspezifischen oxidasen

Info

Publication number: DD268001A1
Application number: DD31178687A
Authority: DD
Inventors: Margrit Passarge; Peter Liebs; Brigitte Schlegel
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-12-30
Filing date: 1987-12-30
Publication date: 1989-05-17

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Schnelltest zum Nachweis von H2O2-bildenden substratspezifischen Oxidasen, die als neue, spezifische Enzyme eine zunehmende Bedeutung bei der analytischen Erfassung von Substraten und Enzymen bei chemischen und biotechnologischen Prozessen, vor allem aber in der klinischen Diagnostik spielen. Erfindungsgemaess wird zu Kulturloesungen bzw. Zellextrakten von verschiedenen Mikroorganismen ein Gemisch, das ein Chromogen, Peroxidase und das spezielle Substrat der Oxidase enthaelt, zugesetzt. Bei Verwendung von Mikrotiterplatten wird nach Inkubation der entstehende Farbstoff visuell oder quantitativ als Schnelltest ausgewertet.

Description

Anwendungsgebiet

DS* Erfindung betrifft einen Schnelltest zum Nachweis von HjOi-büdenden, extra- und intrazellularen Oxidasen. Diese spielen als neue, spezifische Enzyme zunehmend eine Rolle bei der analytischen Erfassung von Substraten und Enzymen bei chemischen und biotechnologischen Prozessen, vor allem aber in der klinischen Diagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In den !atzten Jahren werden zunehmend Η,Ο,-bildende Oxidasen für den Einsatz in der Analytik kommerziell angeboten. Aus ökonomischen Gründen erfolgt die Isolierung der Enzyme zunehmend und bevorzugt aus Mikroorganismen. Das Screening nach H]O]-bildenden Oxidasen gestaltet sich hierbei arbeitsaufwendig und langwierig. Durch ampe:ometrische Messung des Sauerstoffverbrauchs bzw. der H₂O₂-Bildung beschrieben KAMEI et al. (Chem.Pharm.Bull. 31,1307 (1963)) ein Screening nach einer L-Glutamatoxidase, bei dem etwa 500 Actinomycetales-Stamme untersucht wurden. Geleichfalls werden analytische Verfahren bei der Such« nach HjOj-bildenden Oxid« sen beschrieben, bei denen im quantitativen kolorimetrischen Test nach EMERSON (J. org. Chem. 8,41711943)) und TRINDER (Ann. Clin. Biochem. 6,24 (1969)) Oxidasen nochgewiesen werden können. Der Nachteil der analytischen Verfahren liegt jedoch in deren Ineffektivst.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, einen Schnelltest zum Nachweis H,O₂-bllriend«r Oxidasen zu entwickeln, der für Screeningzwecke geeignet und effektiv ist. Der Test ist schnell, billig und für Serienuntersuchungen im Screening geeignet:

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen analytischen Schnelltest zu entwickeln, der es gestattet, HjOj-blldende Oxidasen, vorzugsweise mikrobielle, extra- bzw. intrazellulär lokalisierte, nachzuweisen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man durch einen Mikrotitertest zu Kulturlösungen bzw. Zellextrakten verschiedener Mikroorganismen ein Chromogengemisch gibt. Bei Verwendung von Mikrotiterplatten wird nach Inkubation der durch die Reaktion der Oxidase entstehende Farbstoff vi uell oder quantitativ mit Hilfe eines Auswertegerltes bestimmt. Das eingesetzte Chromogengemisch enthält Chromogene, Per« tidase, das spezielle Substrat der nachzuweisenden Oxidase und einen geeigneten Puffer. Der relativ einfache Mikrotitertest, vorwiegend für bakteriologische und immunologische Untersuchungen in der bakteriologischen und medizinischen Praxis und Forschung eingesetzt, gestattet allein auf einer Mikrotiterplatte die Analyse von 8 χ 12 Proben in 45 s. Der erfindungsgemlfte Test zum Nachweis von Oxidaten ist billig, schnell, effektiv und besonders für Serien- bzw. Screeninguntersuchungen geeignet. Die Erfindung wild nachfolgend an Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Screening nach einer mlkroblellen L-Glutamttoxldase

139 verschiedene Streptomyces Stimme wurden in üblicher Weise in einem Submersverfahren kultiviert, wobei im Verlauf des

Wachstums Proben zum Nachweis einer L-Glutamatoxidase entnommen und zentrifugiert wurden. Während der Überstand

sofort zum Nachweis einer extrazellulären L-Glutamatoxidase verwendet werden konnte, mußte die im Sediment vorhandene

Biomasse zur Gewinnung eines zellfreien Extraktes η ich üblicnem Verfahren vorher aufgeschlossen werden. Vom Kulturfiltrat und zellfreiem Rohextrakt wurden jd 0,2 ml eines Gemisches, das aus 1 ml 0,2% 4-Aminoantipyrin, 2 ml 0,2% Dimethylanilin, 1 ml 0,6mol/l L-Glutamat und 5ml n/15 Kaliumphosphatpuffor pH 7,5 mit 5mg Peroxidase bestand, 0,1 ml Kulturlösung bzw. Zeliextrakt mit einer Multikanalpipetto pipettiert. Nach 15-30 min Inkubation bei 28'C zeigt eine Violettfärbung

das Vorhandensein einer L-Glutama jxldase an.

Cie quantitative Auswertung kann in einem 8-Kanal-Fotometer (z.B. Flow Multiscan der Fa. FLOW-Laboratories-USA oder MTF-10VDE der Ar!W) erfolgen, wobei 8 Parallelen gegen einen Giiridwert vermessen werden können. Es ist möglich, innerhalb

von 45s die 8 x 12 Proben einer Mikrotiterplatte zu vermessen und die Extinktionswerte auszudrucken.

Da Mikroorganismen während der Fermentation auch anderweitig H]Oi bilden können, wurde jeweils ein Kontrclltest ohne Substrat L-Glutamat mitgeführt. Innerhalb weniger Stunden konnten mit Hilfe des Mikrotiter-Nachweissystems die Kulturlösungen und Biomasteaufschlüsse der eingangs beschriebenen 139 Mikroorganismen getestet werden. Beispiel 2 Screening nach einer mikroblellen Alkoholoxldase

46 verschiedene methylotrophe Hefen und Bakterien wurden in üblicher Weiss submers kultiviert und aufgearbeitet.

Während die Überstände der zentrifugieren Proben sofort einem Alkoholoxidase-Nachweiistest unterzogen wurden, wurde die Biomasse des Sediments einem üblichen Zellaufschluß unterzogen und der zellfreie Extrakt dem Alkoholoxidase-Screeningtest

unterworfen. Der durchgeführte Screeningtest entsprach dem im Beispiel 1 beschriebenen, nur daß anstelle des dort verwendeten Substrates L-Glutamat 0,5mol/l Methanol eingesetzt wurde. In einen einzigen Screeningschritt konnten bei einer

Probennahme alle Mikroorganismen auf ihre Fähigkeit zur Bildung einer Alkoholoxidase getestet werden.

Claims

1. Schnelltest zum Nachweis von H₂O₂ bildenden, substratspezifischen Oxidasen, dadurch gekennzeichnet, daß man durch einen Mikrotitertest zu Kulturlösungen bzw. Zellextrakten verschiedener Mikroorganismen ein Chromogengemisch gibt und nach Inkubation den durch die Reaktion der Oxidase entstehenden Farbstoff visuell oder quantitativ bestimmt.

2. Schnelltest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogengemisch das spezielle Substrat der nachzuweisenden Oxidase, Peroxidase, Chromogene und einen geeigneten Puffer enthält.