DD268481A5 - Pruefmittel und verfahren zur bestimmung von antibiotika in milch und dabei zu benutzender, neuer stamm von streptococcus thermophilus - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Pruefmittel, das zur Bestimmung von Antibiotika in Milch geeignet ist und das ein Konzentrat von Streptococcus thermophilus T101 und einen Schutzstoff auf Wasserbasis in einem Verduennungsverhaeltnis von 4 bis 510 2 enthaelt. Die Erfindung bezieht sich weiter auf einen im Pruefmittel benutzten, neuen Stamm von Streptococcus thermophilus T101 sowie auf ein Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika in Milch, bei welchem Verfahren das erwaehnte Pruefmittel benutzt wird.
Description
Berlin, den 8.9.1988 70 160/12
Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika in Milch und dabei zu benutzender, neuer Stamm von Streptococcus thermophilus
Dio Erfindung bezieht sich auf ein Prüfmittel, dae zur Bestimmung von Antibiotika in Milch geeignet ist. Die Erfindung bezieht sich weiter auf einen im Prüfmittel benutzten, neuen Stamm von Streptococcus thermophilus und auf ein Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika in Milch, bei welchem Verfahren das erwähnte Prüfmittel benutzt wird.
In vielen Situationen ist es sehr wichtig, daß kleine Mengen von Antibiotika festgestellt werden können. So ist es beispielsweise in der Lebensmittelindustrie, die durch einen erhöhten Gebrauch von Antibiotika und chemotherapeutischen Mitteln in der Tierpflege einen Bedarf geechaffen hat, ein einfaches, zuverlässiges und empfindliches Bestimmungsverfahren zustandezubringen· Weil Antibiotika auch in der Pflege von Milchkühen verwendet werden, und weil Rückstände von Antibiotika in Milch sowohl gesundheitliche als auch lebensmitteltechnologische Schäden verursachen können, ist es besonders wichtig, Verfahrensweisen zu entwickeln, die zum genauen und schnellen "Screening" von Milch benutzt werden können.
Zur Bestimmung von Rückständen von Antibiotika in Milch werden im allgemeinen mikrobiologische Verfahren benutzt, die die Fähigkeit von Bakterien ausnutzen, Säure zu bilden, Farben zu
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reduzieren und Kultur auf einem Agarboden hervorzubringen. Die Verfahren basieren auf der baktericiden, inhibierenden und morphologischen Wirkung der Antibiotika auf gewisse Mikroorganismen,
Das Thermocult-Verfahren ist ein in Finnland allgemein benutztes und als offizielles Verfahren zur
Bestimmung von Antibiotika angenommenes Agardif fusionsverfahren, dessen PrüfOrganismus aus B. stearothermophilus var. calidolactis besteht. Day Verfahren ist auf der Basis eines Standardverfahrens von IDF (IDF 1970. Detection of penicillin in milk by a disk assay technique. International Standard FIL-IDF 57. Brussels) entwickelt worden.
Ein Verfahren mit entsprechender Empfindlichkeit ist von van OS u.a. (Diffusion test for the determination of antibiotic residues in milk. Neth. Milk and Dairy J. 29 (1975) 16) angeführt wordm. Der Prüforganismus des Delvotest.-Verfahrens besteht auch aus B. stearothermophilus var. calidolactis. Eine Probe (0,1 ml) wird auf in einer Ampulle befindlichen Agar zugetropft und in die Ampulle wird eine Tablette mit Nährstoffen und einem pH-Indikator eingesetzt. Das Verfahren basiert auf der Säurebildungsfähigkeit des Prüforganismus. Ampullen werden 2/5 Stunden bei 64 0C inkubiert. Die Auslegung basiert auf einem FarbenumschJag der Agarschicht.
Als standardisiertes Verfahren wird auch der Intertest (BCP-Test) angeführt. Die Prüfmikrobe des Verfahrens ist Str. thermophilus. Einer Milchprobe wird eine Prüftablette zugesetzt, die lyophilisierte Kultur der Prüfmikrobe, Nährstoffe und ainen pH-Indikator (Bromkresolpurpur) enthält. Die Inkubationszeit ist 4 Stunden bei 45 0C. Wenn die Probe keine Antibiotika enthält, geht die Farbe der Lösung von blau in grün und weiter in gelb über. Wenn die Farbe mit einer Farbenkarte verglichen wird, so ist es möglich, die Menge der Antibiotika gewissermassen zu folgern (THORO-GOOD u.a. An evaluation on the Charm Test - A rapid method for the detection of penicillin in milk. J. Dairy Research 50 (1983) 185).
Der Nachteil dieser Verfahren besteht darin,
daß ihre Empfindlichkeit für die Bedürfniese der Milchtechnologie zu klein ist·
Rückstände von Antibiotika in Milch werden bedeutend weniger mittels chemischer oder physikalisch-chemischer Verfahren bestimmt als mittels mikrobiologischer Verfahren, Kolorimatrische und chromatopraphische Verfahren setzen fachmännisch ausgebildetes Personal und oft komplexe und teure Analysengeräte voraus. Die Verfahren eignen sich selten zu routinemäßigen Analysen,
Der Charm-Test (CHARM, S, E, A 15-minute assay for penicillin and other antibiotics. Cultured Dairy Products 0. 14 (1979) 24) basiert auf der Bestimmung von Radioaktivität. Einer Probe werden lyophilisierte Kultur von B, stearothermcphilus und lyophilisiertes, C-markiertes Penicillin zugesetzt. Die
C-Menge der Bakterienzellen wird mittels eines Geiger-Zählers festgestellt; je niedriger die Penicillinkonzentratrion der Probe ist, um so höher ist die Ablesung des Geiger-Zählers, Die Bestimmung dauert nur 15 Minuten, und die Empfindlichkeit des Verfahrens ist 0,005 I.E, Penicillin/ml, Auch dieses Verfahren ist zu routinemäßigem Gebrauch nicht geeignet, es ist teuer und komplex und setzt fachmännisch ausgebildetes Personal und teure Geräte voraus, um ausgeführt werden zu können.
Mit der Erfindung wird ein Prüfmittel zur Verfügung gestellt, das zur Bestimmung von Antibiotika in Milch geeignet ist, sowie das Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika in Milch,
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Die Aufgabe der Erfindung besteht darin» ein Prüfmittel und *»i.r. empfindliches Verfahren, das ein so weites Spektrum hat wie möglich, bereitzustellen. Das Verfahren sollte auch einfach sein, und dabei sollten vorzugsweise gebrauchefertige Mittel benutzt werden, wobei kein ausgebildetes Personal zur Ausführung einer Prüfung nötig ist, sondern die Prüfung kann beispielsweise auf einer Landstelle ausgeführt werden«
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Prüfmittels gelöst, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass es ein Konzentrat von Streptococcus thermophilus TlOl und einen Schutzstoff auf Wasserbasis in einem Verdünnungsverhältnis von 4 - 5 χ 10""2 enthält. Die Bestimmung wird erfindungsgemäss so aisgeführt, dass dem Prüfmittel, das das Konzentrat von Streptococcus thermophilus TlOl und den Schutzstoff auf Wasserbasis im Verdünnungsverhältnis von 4 - 5 χ 10~2 und eventuell einen Indikator enthält, eine Probe zugesetzt wird, und wenn das Prüfmittel keinen Indikator enthält, auch ein Indikator zugesetzt wird, das Prüfmittel mit der Probe etwa 4 Stunden bei 38 - 42 0C inkubiert wird, und die Farbe kontrolliert wird.
Die Erfindung basiert auf einem neuen Stamm von Streptococcus thermophilus TlOl, der in Valios Käserei in Lammi isoliert worden ist. Der Stamm ist am 3.3.1987 unter der Hinterlegungsnummer DSM 4022 bei dei Hinterlegungsstelle Deutsche Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt worden und weist folgende Eigenschaften auf:
- gram-positiv
- bildet lange Kokkenketten
- Wachstumstemperatur: wächst bei 50 0C, wächst nicht bei 10 0C
- Salztoleranz:
wächst bei NaCl-Gehalt von 2 %
wächst nicht bei NaCl-Gehalt von 6,5 %
- titrierte Acidität 25 - 29 0SH nach 7-s^ndiger Kultur bei 42 0C (eine sterilisierte, 10-prozentige Lösung aus Milchpulver)
- Milchsäure-%: 0,8 % (2-tägige Kultur bei 42 0C in Milchpulvermilch}
- fermentiert Lactose, Saccharose und Glucose Der nous Mikroorganismusstamm ist, besonders
mit Rücksicht auf Penicillin und Oxytetracyclin, deut-
lieh empfindlicher als die bekannten Stämme von Streptococcus thermophilus auf der Basis der in der Literatur angegebenen Werte.
Die Prüfmittel werden in der folgenden Weise» verfertigt: Ein Stamm von Mikroorganismen wird bei einem pH-Wert von 6,2 bis 6,5 und Lei einer Temperatur von 38 bis 42 0C auf einem Nährboden auf Molkenpermeatbasis in einem Fermentor kultiviert. Das Wachsen wird verfolgt und mit der Kultur wird am Ende der logarithmischen Wachstumsphase aufgehört, wonach die Kulturflüssigkeit durch Filtration zu einer 20-fältigen Konzentrat.'on konzentriet wird. Das Koi zentrat wird in einem Verdünnungsverhaltnis von etwa 4 - 5 χ 10"^, vorzugsweise von etwa 5 χ 10"^, in einen Schutzstoff dosiert. Als Schutzstoff können bei Herstellung von lyophili.siexten Mikrobenpräparaten verwendete Schutzstoffe auf Wasserbasis benutzt werden. Vorzugsweise wird als Schutzstoff eine Wasserlösung verwendet, die 1,1 % Natriumglutamat, 1,1 % Askorbinsäure und gegebenenfalls 7 % Lactose enthält und deren pH-Wert 6,5 ist. Ein Indikator kann dem Schutzstoff zugesetzt werden, oder er kann bei der Bestimmung dem Prüfmittel zugesetzt werden. Als Indikator wird beispielsweise ein Säure-Base-Indikator, wie Bromkresolpurpur, verwendet. Das Konzentrat wird in ein Gefäss dosiert, das eine übliche Ampulle, ein zu schliessendes Reagenzglas, eine Probeflasche o.dgl. sein kann. Man lässt das Gefäss in einem Kohlensäure-Sulphitsprit-Bad gefrieren, lyophilisiert es und bewahrt es im Vakuum geschlossen auf. Das fertige Prüfmittei enthält etwa 1 - 2 χ ΙΟ6 Bakterien/ml.
Die Bestimmung von Antibiotika wird so durchgeführt, dass eine flüssige Probe und eventuell ein Indikator dem Prüfmittel zugesetzt wird. Das Prüfmittel mit der Probe wird inkubiert, und Farbenumschläge werden
g *111
beobachtet. Wenn die Probe Antibiotika enthält/ sind die Mikroorganismen des Prüfmittels nicht imstande, zu wachsen, und die Farbe schlägt nicht um. Wenn aber die Probe keine Antibiotika enthält, wachsen die Mikroorganismen und veranlassen beim Wachsen einen Farbenumschlag.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens ist mit den entsprechenden kommerziellen THERMOCULT (Orion Üiagnostica) und DELVOTEST P (Gist-Brocades) Verfahren und mit dem CHARM II Verfahren verglichen worden. Die Probe bestand aus 5 Minuten bei 95 0C vorgewärmter Milch, und die Bestimmungen wurden gemäss den Arbeitsanweisungen der Hersteller ausgeführt. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt, aus der auch die von dem Hersteller Intervet gegebenen Auskünfte über INTERTEST ersichtlich sind. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass das erfindungsgemässe Verfahren empfindlicher ist als die anderen Verfahren, und dass es ein Vorhandensein von allen Typen von Antibiotika und deren Kombinationen deutlich zeigt..
experimentell festgestellte Empfindlichkeiten für Antibiotika (ug/ml) der geprüften Bestimmungsverfahren
| ANTIBIOTIKUM | ERFINDUNGSGEMÄSSES VERFAHREN A B | 0,001- 0,002 I.E. | THERMOCULT | (SsS) a) | DELVOTEST | P | INTERTEST b) | CHARM TEST II |
| 0,25-0,4 | eigene Best. | 0,005- 0,0075 | eigene Best. | SSS) a) | ||||
| PENICILLIN | 0,001- 0,002 I.E. | 0,05 | 0,006-0,0075 | 2,5-5,0 | 0,0025 | 0,0025 | 0,005 | 0,003 |
| STREPTOMYCIN | 1,25 | 0,05 | 5,0 | 0,1 | 5,C | 2,5-5,0 | 5,0 | 0,1 |
| TETRACYCLIN | 0,05-0,1 | 0,003 | 0,2 nicht festzustellen | 0,1 | 0,2 | 0,1 | 0,5 | 0,2 |
| OXYTETRACYCLIN | 0,1 | 0,01 | 0,2 nicht festzustellen | 0,005 | 0,2 | 0,1 | 0,2 | |
| AMPICILLIN | 0,01 | 0,1 | 0,01 nicht festzustellen | 0,5-0,75 | 0,01 nicht festzustellen | 0,005 | 0,005 | |
| ERYTHROMYCIN | 0,01-0,05 | 0,1-0,2 | 0,1 nicht festzustellen | 7,5 | 0,1 nicht festzustellen | 0,75-1,0 | 0,1 | 0,01 |
| CHLORAMPHENICOL | 0,1-0,5 | 1,0 nicht festzustellen | 1,0 | 1,0 nicht festzustellen | 7,5-10,0 | 1,0 | 0,05 | |
| NEOMYCIN | 0,5 | 0,05 | 0,5 | 1,0 | 0,5 | 20,0 | ||
| STREPTOMAX (Penicillin +Streptom.) | 0,004 I.E. PEN +0,001 pg/ml STREPTOM. | 0,31 I.E. PEN +0,008 pg/ml STREPTOM. | ||||||
| MASTALONE (Oxytetracyclin +die übrigen) | 0,1 1 | 0,2 nichc festzustellen | ||||||
A Indikator zugesetzt bei Prüfung (Dauer der Prüfung 4 h)
B Indikator zugesetzt vor Lyophilisierung (Dauer der Prüfung 5 h)
a) Sandström S Sivela 1984, Kariantuote 4
b) vom Hersteller angegebene Gehaltwerte
Bakterien aue dem Stemm Streptococcus thermophilus TlOl werden in einen Nährboden mit folgender Zusammensetzung geimpft ι5 % Molkenpemeatpulver
1,5 % Kaeeinhydrolyeat
0,5 % Tryptone
1 % Hefeextrakt
Der Nährboden ist 15 bis 20 Minuten bei 120 0C sterilisiert worden, und sein pH nach der Sterilisation ist 6,4.
Der Prüfotamm wird bei einem pH-Wert vun etwa 6,2 und bei einer Tenperatur von etwa 42 0C in einem Ferment or kultiviert, und das Wachsen wird durch Beobachtung der Trübe der Kultur verfolgt» Am Ende der logarithmiechen Wachatumaphaae wird mit der Kultur aufgehört, und die Kulturflüesigkeit wird durch Flltrier.ing unter Verwendung von Millipore Pellicon Filtriereinheit (0,45 JJm) zu einer 20fältigen Konzentration konzentriert, wobei der Bakteriengehalt dee Konzentrats etwa
2 χ 10 Stück/ml ist» Das Konzentrat wird mit einer kleinen Menge Schutzstoff gewaschen, und ca« 5 ml wird in 100 ml Schutzstoff dosiert, dein eventuell noch 1 ml Bromkresolpurpurfarbe (eine 0,8prozentige Lösung) zugesetzt wird. Der Bakteriengehalt der erhaltenen Lösung ist etwa 1 χ 10 Stück/ml· 1 ml der Lösung wird in eine konventionelle, trocknungsbeständige und in Vakuum zu schließende Ampulle von 10 ml dosiert« Man läßt die AmρuIb schnell (in 20 bis 60 s) in einem Kohlensäure-Sulphitsprit-Bad von -60 0C gefrieren, sie wird lyophilisiert und im Vakuum geschlossen aufbewahrt« Eine so verfertigte Ampulle enthält 1 bis 2 χ 10 Bakterien/ml.
Bestimmung von Antibiotika in einer Milchprobe Rohmilch wird 5 Minuten bei 95 0C erwärmt. Einem gemäss Beispiel 1 verfertigten Prüfmittel wird 2 ml Milch und eventuell 20 μΐ Farbenindikator zugesetzt. Die Prüf mittel werden 4 Stunden bei etwa 42 0C inkubiert und die Farbe wird kontrolliert. Als Kontrolle wird aus Säuremilchpulver zubereitete Milch benutzt, die 5 Minuten bei 95 0C erwärmt wird. Wenn die Milch Antibiotika enthält, wird die Farbe blau. Die gelbe Farbe indikiert ein negatives Ergebnis.
Claims (4)
- Patentansprüche1. Prüfmi'ctel, das zur Bestimmung von Antibiotika in Milch geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Konzentrat von Streptococcus thermophilus, TlOl, DSM 4022 und einen Schutzstoff auf Waseerbasis in einem Verdünnungsverhältnis von 4 bis 5 χ 10"2 enthält.
- 2. Prüfmictel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Schutzstoff eine Wasserlösung verwendet wird, die 1,1 % Natriumglutamat, 1,1 % Askorbinsäure und gegebenenfalls 7 % Lactose enthält und deren pH 6,5 ist.
- 3. Prüfmittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Indikator enthält.4e Prüfmittel nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator Bromkresolpurpur verwendet wird.
- 5. Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika in Milch, dadurch gekennzeichnet, daß einem Prüfmittel, das ein Konzentrat von Streptococcus thermophilus TlOl und einen Schutzstoff auf Wasserbasis in einem Verdünnungsverhältnis von 4 bis 5 χ 10" sowie eventuell einen Indikator enthält, eine Probe zugesetzt wird, und wenn das Prüfmittel keinen Indikator enthält, auch ein Indikator zugesetzt wird, das Prüfmittel zusammen mit der Probe etwa 4 Stunden bei 38 bis 42 0C inkubiert wird, und die Farbe kontrolliert wird.
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