DD270466A5 - Verfahren zur rueckgewinnung von somatropinen aus verduennten waessrigen loesungen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rueckgewinnung von Somatotropin aus verduennten waessrigen Loesungen, dadurch gekennzeichnet, dass man zu der waessrigen Loesung ein Salz eines Uebergangsmetalles zugibt, um einen unloeslichen Komplex mit dem Somatotropin zu bilden. Der unloesliche Komplex kann aus der Loesung abgetrennt werden, entweder durch Zentrifugieren oder Filtration und kann mittels konventioneller Methoden getrocknet werden, beispielsweise durch Lyophilisieren oder durch Entfernung von Wasser bei niedrigen Temperaturen unter Vakuum. Das Verfahren fuehrt zur Rueckgewinnung eines trockenen, bioaktiven Somatotropins.
Description
Die Erfindung betrifft ein Veifahren z. Rückgewinnung bioaktiver Proteine aus verdünnten wäßrigen Lösungen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Rückgewinnung von bioaktivem Somatotropin aus wäßrigen Lösungen durch Zugabe von Übergangsmetallsalzen zu diesen Lösungen.
Somatotropine, auch als Wachstumshormone bekan ;, sind polypeptidhormone, die von vielen Lebewesen über die Hypophyse abgesondert werden. Diese Hormone sind für eine Anzahl therapeutischer Verwendungen wertvoll, und Zusammensetzungen, die Somatotropine enthalten, können bei der Behandlung von Hypophysenmangelerscheinungen beim Menschen und bei gastrointestinalen Blutungen eingesetzt werden oder auch bei der Beschleunigung des Heilprozesses von Knochenfrakturen sowie für die Förderung des Heilprozesses bei Prellungen und anderen Wunden. Somatotropine ist auch einsetzbar zur Beschleunigung der Fleisch- und Milchproduktion bei Tieren, wenn sie über verschiedene Mittel zur Freisetzung von Arzneimitteln oder über eine Injektion verabreicht werden (siehe E. J. Turman »Some Effects of Piutiary Anterior Growth Factor", Thesen, Purdue University, April 1953; L. J. Machlin, J. Anim. Sei. 35: 794-800 [1972]; T. R. Kasser et al., J. Anim. Sei. 53:420-426 [1981]; L. J. Machlin, J. Dairy. Sei. 56:575-580 [1973]). Obgleich Somatotropine einigermaßen artspozifisch sind, gibt es eine beträchtliche Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen tierischer Somatotropine, und diese Hormone haben ausgeprägte Wirksamkeit zwischen den Spezies gezeigt.
Darüber hinaus wurden verschiedene wirksame Fragmente von Somatotropine entdeckt.
Traditionell srhält man Somatotropine durch Isolierung aus entnommenen Hypophysengeweben. Mit der Einführung der rekombinanten DNA-Technologie wurde es möglich, Somatotropine aus gerdtisch erzeugten Mikroorganismen zu erhalten, die rekombinante DNA enthalten, die die Produktion von Somatotropin lenkt (siehe beispielsweise europäische Patentanmeldung 83304574.3, Voröffentlichungsnummer 0 103 395, für Biogen N. V.}. Ob die Herkunft des Somatotropins tierisch oder mikrobiell ist, ist eine Reinigung erforderlich, um Verunreinigungen wie anders Proteine, Polypeptide und zelluläres nekrotisches Gewebe zu entfernen, und um zu gewährleisten, daß das Protein in seiner richtig gefalteten, bioaktiven Form vorliegt. Das Somatotropin kann nach einer oder mehreren bekannten Proteinreinigungsmethoen gereinigt werden, zu denen die Gelchn imatografie, Affinitätschromatographie, lonenaustauschchromatographie. Ultrafiltration, Dialyse, Fällung mit Salzen wie Ammoniumsulfat, Extraktion aus Einschlußkörperchen unter Verwendung von Guanidin-HCI oder Natriumdodecylsulfat und eine Reihe anderer Verfahren gehören. Beispiele für einige der verschiedenen R'.inigungstechniken können aus Kirk-Othmer, Enzyklopädie der Chemischen Technologie, 3. Auflage, Bd. 11 entnommen werden sowie aus der US-PS 4 371 462 (Hecht) und aus Hart et al., Biochem. J., 218: 573-581 (1984).
Das Ergebnis einiger dieser Reinigungsverfahren ist eine verdünnte wäßrige Lösung, die Somatotropin enthält. Somit ist ein Rückgewinnungsprozeß erforderlich, um das gereinigte Somatotropin aus diesen verdünnten wäßrigen Lösungen wieder zu erhalten.
Zu gängigen Methoden zur Rückgewinnung von Somatotropin gehören das Gefriertrocknen einer verdünnten Lösung des Hormons. Allerdings ist die Lyophilisierung eine kostspielige Rückgewinnungsmethode für getrocknete, biologisch aktive Materialien wegen der geringen Produktionsziffer, den hohen Kosten für die Geräte und der Notwendigkeit, sehr niedrige Drücke während der Sublimierung der Wassersubstanz aus dem gefrorenen Zustand zu gewährleisten. Die Lyophilisierung ist insbesondere bei einem großen Umfang kostenintensiv, da große Lösungsvolumina miteinbezogen sind.
Es ist daher ein Verfahren erforderlich, das weniger kostenintensiv ist, und keine Nebenwirkung hinsichtlich der Bioüktivität des Somatotropins aufweist.
Ziel der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein solches Verfahren bereitgestellt, das im Vergleich zu den Kosten für die Ausrüstung bei konventionellen Verfahren wesentlich niedrigere Kosten dafür erfordert.
Weiterhin wird ein Verfahren zur Rückgewinnung von Somatotropin aus wäßrigen Lösungen bereitgestellt, das mit geringeren Arbeitskosten auskommt im Vergleich zu den Arbeitskosten bei konventionellen Rücl'.gewinnungsverfahren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein billiges ROckgewinnungsverfahren von Somatotropin aus wäßrigen Lösungen ohne Verlust der SioaUivität bereitzustellen.
Erfindungsgemäß beansprucht wi. d ein Vorfahren zur Rückgewinnung von Somatotropin aus wäßrigen Lösungen, gekennzeichnet di'roh Zusatz von Salzen der Übergangsmetalle zu den wäßrigen Lösungen, um mit dem Somatotropin unlösliche Komplexe zu bilden.
Die unlöslichen Komple*ü können aus der Lösung abgetrennt werden, entweder durch Zentrifugieren oder Filtration, gefolgt von einer Trocknung durch Lyophilisieren, Entfernen des Wassers bai niedrigen Temperaturen unter Vakuum oder durch andere Verfahren. Das Verfahren führt zu einer Rückgewinnung eines trocknen, bioaktiven Somat tropins. Die Erfindung ist somit gerichtet auf ein Verfahren zur Rückgewinnung von Somatotropin (nachfolgend auch als ST bezeichnet) aus verdünnten wäßrigen Lösungen, die aus der Reinigung von Somatotropin aus einem Hypophysenhomogenisat oder einem Fermentationsmedium herrühren. Das Verfahren dieser Erfindung kann dazu verwendet werden, verschiedene Arten von Somatotropin aus verdünnten wäßrigen Lösungen zurückzugewinnen, einschließlich natürliche oder rekombinante vom Schwein, Ochsen, Schaf, Menschen, Hühnervögeln oder Fisch.
Der Begriff Somatotropin, wie er hier verwendet wird, erfaßt natürliches oder rekombinantes Somatotropin der vollen Länge sowie Derivate davon, die wachstumsbeschleunigende Eigenschaften aufweisen. Zu Derivaten gehören biologisch aktive Fragmente des Polypeptidhormons, wie die A4-Konstruktion von Ochsensomatotropin (ein Polypeptid mit 4 fehlenden Aminosäuren am N-Terminal, beschrieben in der obengenannten EP-Anmeldung von Biogen), und ein als A7-Schweinesomatotropin bezeichnetes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die der des Schweinesomatotropins entspricht, abzüglich der ersten sieben Aminosäuren des reifen Hormons der vollen Länge (beseht, iben in dor EP-/-,nme!dung 0 104 920 von Biogen N. V.). Der Begriff Somatotropin umfaßt auch ein aktives Fragment des Polypeptide, das ein äußeres Nterriinales Methionin enthält.
Der Begrif .biologisch aktiv", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid, das bei Verabreichung an ein Lebewesen einen nachweisbaren Effekt auf einen lologischen Prozeß des Lebewesens ausübt. Ein biologisch aktives Somatotropin kann die Wachstumsrate eines Lebewesen erhöhen, wenn es dem Lebewesen in Mengen, die das Wachstum erhöhen, verabreicht wird. Ebenfalls erhöhen kann ein biologisch aktives Somatotropin die Nahrungsverwertung, Nährmittelverteilung oder Schlachtfleischqualität eines Lebewesens, wenn es dem Lebewesen in geeigneten Mengen verabreicht wird. Das erfindungsgemäße Vorfahren besteht in der Zugabe von Übergnngsmetallsalzen zu einer verdünnten wäßrigen Lösung, die das Somatotropin enthält. Es ist wünschenswert, wenn das in der Lösung befindliche Somatotropin in seiner richtig gefalteten bioaktiven Form vorhanden ist. Die Salze der Übergangsmetalle bildun unlösliche Komplexe mit dem Somatotropin, wodurch das Somatotropin aus den verdünnten wäßrigen Lösungen ausgefällt wird. Diese Komplexe werden gebildet durch Somatotropinmoleküle und Meialli.onen wie Zn2*, Cu2*, Co2*, Mn2*, Fe2* oderFe3*. Diese Komplexe enthalten Ligandbindungen zwischen dem Metallion und dem Stickstoffatom von einigen Aminosäureresten im Somatotropinmolekui. Nach der Fällung des Somatotropin-Metall-Komplexes wird der Niederschlag von der Hauptmenge des wäßrigen Mediums in Form einer konzentrierten wäßrigen Aufschlämmung abgetrennt. Die unlöslichen Komplexe können dann zwecks Entfernung des restlichen Wassers getrocknet werden. Das erhaltene Produkt ist ein trockener Somatotropin-Übergangsmetall-Komplex. Das Vorhandensein des Übergangsmetalls im Produkt zeigt keine signifikante Nebenwirkung auf die Bioaktivität des Somatotropins, wenn das Produkt einem Lebewesen verabreicht wird.
Wie bereits festgestellt, enthalten, wie bei konventionellen Verfahren zur Gewinnung eines Somatotropins, die Lösungen von natürlichen Somatotropinen in einem Hypophysenhomogenisat oder das rekombiianten Somatotropins in einem Fermentationsmedium große Mengen Wasser im Verhältnis zum Somatotropin. Derartige Lösungen können beispielsweise etwa 100 Gramm Wasser pro Gramm Somatotropin enthalten oder mehr. Wi3 bei üblichen bekannten Rückgewinnungsverfahren wird die' gesamte Wassermenge der Lyophilisation unterworfen. Wenn allerdings mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gearbeitet 'vird, und ein Übergangsmetallsalz der Lösung hinzugesetzt wird zwecks Auslällung des Somatotropins aus der Lösung als Somatotropin-Übergangsmetall-Komplex, kann die Hauptmenge des anfänglichen großen Wassarvolumens leicht vom Niederschlag abgetrennt werden, wobei ein konzentrierter wäßriger Schlamm anfällt, der getrocknet wird. Wenn man die obige Angabe des Verhältnisses 100:1 Wasser zu Somatotropine in der Anfangslösung als Beispiel weiterführt, so kann das Verhältnis von Wasser zu Somatotropin in der konzentrierten Aufschlämmung dagegen normalerweise 5 Gramm:1 Gramm betragen. Somit hat die entfernte große Wassermenge den Faktor um das Zwanzigfache ernit irigt.
Darüber hinaus kann das Wasser, das mit dem bioaktiven Komplex des Somatotropins mit einem Übergangsmetallion assoziiert ist, wesentlich leichter und mit einer weniger kostspieligen Technik entfernt werden als das bei der Lyophilisierung der Fall ist. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu sehr wesentlichen Einsparungen von Geldaufwendungen für technische Geräte und Gebäude sowie für die mit dem Trockenverfahren verbundene Arbeit.
Zu den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Übergangsmeta..3n gehören Zink, Kupfer, Mangan, Eisen und Kobalt. Die bevorzugten Metalle sind Zink, Kupfer und Mangan, am bevorzugtesten ist Zink. Salze dieser Metalle, die für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugt sind, sind die Chloride von Zink, Kupfer, Mangan, Eisen und Kobalt, jedoch können auch andere Salze, wie die Sulfate, Acetate oder Tartrate im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nützlich für die Rückgewinnung von Somatotropin aus verdünnten wäßrigen Lösungen, die aus verschiedenen Reinigungsverfahren herrühren. Das Somatotropin, das mittels des Verfahiens ner Erfindung zurückgewonnen werden kann, erhält man durch Isolierung aus entnommenen Hypophyseng awebj oder von genetisch erzeugten Mikroorganismen, die rekombinante DNA enthalten, die für die Produktion von Somatotropin s pazifisch ist.
Die wäßrigen Lösungen, aus denen Somatotropin zurückgewonnen werden kann, können unterschiedliche Mengen an Somatotropin enthalten. Das Übergangsmetallsalz wird in einer für die Fällung von Somatotropin wirksamen Menge hinzugegeben. Im allgemeinen kann bei Reaktionen im Labormaßstab das Metallsalz in solchen Mengen zugegeben werden, daß seine Konzentration im Bereich von etwa 0,12 mMol bis etwa 12 mMol pro 0,025 mMol Somatotropin in 1,0 Liter Lösung liegt. Eine typische eingesetzte Metallmenge in solchen Reaktionen kann etwa 1,2 mMol Metallsalz pro 0,025 mMol ST in 1,0 Liter wäßriger Lösung sein. Allerdings kann die für eine wirksame Fällung des Somatotropins ausreichende Menge an Übergangsmetallsalz schwanken. Bei einer großtechnischen Reaktion im Beispiel X dieser Anmeldung wurde beispielsweise gofunden, daß ein Verhältnis von etwa 10 Molen Zinksalz auf ein Mol rekombinantes Schweine-ST wirksam war, das ST auszufällen. Wirksame Mengen können vom Fachmann durch Routineuntersuchungen bestimmt werden. Üblichetweise wird für die vollständige Fällung des Somatotropins
-4- ,.70 466
in der Lösung ein Überschuß des Metallsalzes eingesetzt. Das Endprodukt, der Somatotropin-Metal'salz-Komplex, enthält im allgemeinen wenigstens 1-8 Mole Motall/ein Mol ST. Auf Bisis von Massenanteilen in Prozent Übergangsmetall enthält das Produkt zwischen 0,3 und 8 Massenanteile in 90. Vorzugsweise enthält das Produkt etwa 0,4 bis etwa 0,7 Massenanteile in % Metall. Die Fällung des Somatctropins wird vorzugsweise in nahezu neutralen oder basischen Lösungen durchgeführt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung liegt vorteilhaft zwischen 6,8 und 9,8. Die verdünnten wäßrigen Lösungen des Somatotropins liegen am bevorzugtesten bei einem pH zwischen etwa 7,4 und 9,0 für eine effektive Rückgewinnung des Sometotropins. Es wurden verschiedene Puffer in den wrßrigen, Somatotropin enthaltenden Lösungen verwendet. Die Puffer werden hinzugegebün, um dabei zu helfen, das Somatotropin bei einem gegebenen pH-Wert vor der Zugabe des 'Jbergangsmetallsalzes in Lösung zu halten. Solche Puffer sollten mit Vorsicht verwendet werden, die Anionen enthalten, die unlösliche Salze mit den Metellionen Zn2*, Cu2*, Co2*, Hn1' Fe2* oder Fe3* bilden. Zu üblichen Puffern, die sich für das vorliegende Verfahren eignen, gehören Carbonatpuffer (0,42 mM Na2CO3,0,50 niM NaHCO3, eingestellt auf einen pH zwischen 7,4 und 9,8); 50 mM TrisHCI bei etwa pH 7,4: und 60 mM Ethanolamin bei etwa pH 9,8.
Die Zugabe des Übergangsmetallsalzes zu der verdünnten, wäßrigen Somatotropin enthaltenden Lösung führt zur Fällung eines Metall-Somatotropin-Komplexes. Die Lösung wird während des Ausfällens des MetallSomatotropinKompioxes aus der wäßrigen Lösung zweckmäßigerweise gerührt.
Nachdem das Salz des Übergangsmetalls zu der verdünnten wäßrigen Somatotropin enthaltenden Lösung hinzugegeben worden ist und das Somatotropin-Metallsalz-Komplex ausgefällt wurde, können die unlöslichen Komplexe aus der wäßrigon Lösung abgetrennt und getrocknet werden. Die Abtrennung kann mittels üblicher Methoden erfolgen, wie z. B. Zentrifugieren oder Filtrieren oder einer Kombination beider Verfehren. Das ausgefällte Material kann durch Zentrifugieren bei Zimmertemperatur pelletisiert werden oder durch Filtration abgetrennt werden, und kann danach mittel:: einer üblichen Methode getrocknet werden, wie z. B. durch Entfernung von Wasser bei niedrigen Temperaturen unter Vakuum oder durch Lyophilisierung. Wenn das zentrifugierte oder filtrierte Somatotropin bei niedrigen Temperaturen unter Vakuum getrocknet wuroe, kann die Temperatur zwischen 0° und 25 0C liegen. Das beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende getrocknete Somatotropin weist im wesentlichen die gleiche Bioaktivität auf wie das durch Lyophilisierung gewonnene Somatotropin oder wie natürliches Somatotropin. Darüber hinaus zeigten vorgenommene in vitro-Versuche von rekombinantem Schweine-Somatotropin, daß die Aufrechterhaltung der Löslichkeit (in Anwesenheit von EDTA) verbessert wurde, wenn das Somatotropin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zurückgewonnen wurde, im Vergleich zum Rückgewinnungsverfahren bei der üblichen Lyophilisierung.
Ausführungsbeispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung dn vorliegenden Erfindung und sind nicht als einschränkend für den Schutzumfang anzusehen.
Fällung von rekombinantem Schweine-Somatotropin
Gereinigtes, lyophilisiertes A7-rekombinantes Schweine-Somatotropin (A7rpST) von International Minerals and Chemical Corporation, Chargennummer CF 008-OBA.94.1, wurde in deionisiertem Wasser (dH2O) auf ehe Konzentration von 10 mg A7rpST pro ml rekonstituiert. Das Material wurde dialysiert gegen > 100 Volumina Carbonatpuffer (0,42 mM Na2CO3; 0,50 mM NaHCO3, eingestellt auf einen pH von 7,4 mit HCI), und eine Portion dieses dialysierten Materials wurde in neun Teilen Carbonatpuffer, pH 7, verdünnt. Die beiden erhaltenen Lösungen von A7rpST( 10,0 und 1,0 mg A7rpST/ml) wurden mit markiertem "5l-A7rpST (dieselbe !MC-Chargennummer) bis zu einer Endkonzentration von 0,02 pCurie pro ml versetzt, um den Prozentsatz der Fällung durch Messung der Radioaktivität in der überstehenden Fraktion nach der Zentrifugierung zu bestimmen.
Zu den Übergangsmetallsalzen, die für diesen Fällungsversuch ausgewählt worden waren, gehörten Zinkchlorid, Manganchlorid und Kupferchlorid. 24 mM, 2,4 mM und 0,24 mM Lösungen jedes dieser Salze wurden hergestellt. Als positivos Fällungskontrollmittel diente Trichloressigsäure (20%). Die Metallsalzlösungen oder Trichloressigsäurelösungen (0,5 ml) wurden zu den wäßrigen Lösungen hinzugegeben, die das A7rpST (0,5 ml) Somatotropin enthielten, und die Fällung wurde über eine Stunde hei Zimmertemperatur durchgeführt. Das ausgefällte Material wurde durch Zentrifugieren bei 15000 x g über 10 Minuten bei Zimmertemperatur pelletisiert. Aus den Doppelröhrchen wurden einfache 0,5 ml Aliquote des Überstehenden entnommen und in Polypropylenröhrchen gezählt. Die Minimalanzahl der Counts lag beim Vierfachen über der Untergrundzählrate. Die Pelletbildung wurde visuell beurteilt, und es zeigte sich eine gute Übereinstimmung zwischen der Pelletgröße und dem Prozentsatz an pelletisiertem "5l-A7rpST. Daraus geht hervor, daß sich das "5l-A7rpST ähnlich wie das nicht markierte A7rpST verhielt. Tabelle I erläutert das Ergebnis der Versuche. Bei 0,5 mg A7rpST/ml und 5 mg A7rpST/ml zeigten sowohl Zinnchlorid als auch Kupferchlorid gute Fällungseigenschaften bei einer oder mehreren Reagenzkonzentrationen. Steigende Mengen an Metallsalz führten zu gleicher oder steigender A7rpST-Fällung, außer im Falle des Kupferchlorids.
| Fällungs | Konzen | Tempe | % '"pelletisiert* | 0,5 mg/ml |
| mittel | tration | ratur | 5 mg/ml | rpST |
| rpST | ||||
| Metalle | 77 + 0,96 | |||
| Zink | 12 mM | ZT* | 76 ± 0,38 | 74 + 0,56 |
| chlorid | 1,2 mM | ZT | 76 ±1,5 | 61+0,21 |
| 0,12 mM | ZT | 55 ±0,41 | 21 +1,6 | |
| Mangan | 12 mM | ZT | 27 ±1,2 | 19 + 2,4 |
| chlorid | 1,2 mM | ZT | 22 ± 0,31 | 15 + 2,0 |
| 0,12 mM | ZT | 8,7 ± 0,64 | 17 + 2,9 | |
| Kupfer | 12 mM | ZT | 23 ± 4,6 | 44 + 6,7 |
| chlorid | 1,2 mM | ZT | 64 ±8,7 | 67+0,12 |
| 0,12 mM | ZT | 42 ±0,11 | ||
| Kontrolle | 13 + 1,2 | |||
| nichts | _ | ZT | 4,3 + 0,89 | 18 + 0,80 |
| _ | 40C | 7,2 ± 2,1 | 96 + 0,59 | |
| Trichlor- | 10% Ug. | ZT | 98 + 0,33 | 97 ± 0,26 |
| essigsäure | 10%Lsg. | 40C | 98 + 0,24 | |
a Die dargestellten Daten bedeuten + Standardabweichung, wobei η = 2 ' ZT = Zimmertemperatur
Gereinigtes lyophilisiertes A7rpST (gleiche Chargennummer wie im Beispiel I) wurde in dH2O bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml wieder rekonstituiert, und es wurden Aliquote gegen einen der folgenden Puffer dialysiert: (1) Carbonatr i-'fer, pH 7,4,
(2) 40 mM TrisHCI, pH 7,4 oder (3) 60 mM Ethanolamin, pH 9,8. Die drei Proben wurden mit markiertem "5IA7rpST wie im Beispiel I versetzt. Jede Probe wurde 1:1 mit einer Lösung von 24 mM ZnCI2 verdünnt und der Prozentsatz der Fällung von A7rpST wie im Beispiel I bestimmt. Tabelle Il erläutert die Ergebnisse des Versuches. Die aufgeführten Werte zeigen, daß Zink für eine effektive Fällung von A7rpST aus einer Vielzahl von Puffern bei unterschiedlichen pH-Werten wirksam ist.
Prozentsatz Fällung von "5l-A7rpST aus einer Lösung, bestehend aus gleichen Volumina von 10 mg pro mi A7rpST und 24 mM ZnCI2 in Anwesenheit von (1) Carbonatpuffer pH 7,4(2) 5OmMTMs, pH 7,4 oder (3) 60 mM Ethanolamin
Puffer
pH Prozentsatz l25IA7rpST
politisiert (a)
Carbonat 7,4 76 ±0,38
50mMTris 7,4 81 ±0,11
60 mM Ethanolamin 9,8 90 + 0,52
a Die dargestellten Daten bedeuten +/0 Standardabweichung, wobei π = 2
Löslichkeit und Bioaktivität von gefälltem A7rpST
Für die Vorbereitung des Fällungsversuches wurden 500 mg A7rpST (dieselbe Chargennummer wie im Beispiel I) in 50 ml deionisiertem Wasser (dH2O) rekonstituiert, wobei man einen pH von 13,0 wegen restlich«.' Carbonationen erhielt. Das Material wurde extensiv gegen Carbonatpuffer von etwa pH 7,4 dialysiert bis der pH des Dialysates 7,d betrug. Die Volumenzunahme betrug 5 ml während der P'ilyse. Der pH des Dialysates wurde auf 7,4 durch 3 mÄq. HCI verringert und die Lösung durch Zentrifugieren bei 1 500 x g bei Zimmertemperatur geklärt.
10 Milliliter Aliquote c er neutralen A7rpST-Lösung wurden mit einem gleichen Volumen von entweder 2,4 mM ZnCI2 oder 2,4 mM CuCI2 vereinigt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur wurden die Suspensionen durch dreißigminütiges Zentrifugieren bei 15000 x g pelletisiert. Jedes Pellet wurde bei -800C eingefroren und lyophilisiert, zusammen mit einer Roll-Schicht-gefrosteten Kontrollprobe, bestehend aus 20 ml der A7rpST-Lösung mit neutralem pH verdünnt in 20 rr>l dH2O.
Es wurden die Trockenmasse und der Prozentsatz der Proteinreinheit (gemessen mit dem BCA-Proteintest, Pierce Chemical Co., Rockford, lll'nois) der lyophilisierten Proben bestimmt, um eine Berechnung der Wirksamkeit jeder Fällungsmethode im Verhältnis zur Lyophilisierungsbehandlung ohne Fällung zu gestatten. Tabelle IM zeigt die Ergebnisse dieser Bestimmungen.
| Tabelle III | Prozentsatz A7rpST (Mayse/Masse) | Trocken masse (mg) | Masse A7rpST (m<?) | relative Fällungs- effekti ität |
| Fällungs methode | 115 105 118 | 54,5 48,0 65,7 | 62,7 50,4 77,5 | 81 65 100 |
| ZnCI, CuCI2 Lyophilisierung | ||||
Um die Wirkung der Metallsalze auf die Bioaktivität des A7rpST zu bestimmen, wurde ein Wachstumstest durchgeführt (Bentimmung der Körpermassezunahme) unter Verwendung von Hypophysen-ausgesch^lret^n Ratten (siehe Parlow, S. F., et al.. Endocrinology 77:1126 bis 1134 [1965]). Der Test erfolgte, um die Bioa*tivität des Somatotropins durch Messung der wachstumsbeschleunigenden Aktivität bei Ratten bei einer Dosierung von A7rpST zu demonstrieren, wobei das ST nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zurückgewonnen worden war.
Zur Durchführung des Tests worden junge (36 Tage alt bei Beginn des Testzeitraumes) weibliche, Hypophysen-ausgeschaltete Rfltteo in Ghidoo" vrr. 10 Rot"·:· . eingeteilt. Die Ratten wurden nach Körpormasse aufgeteilt, wobei die Masse und die Verteilung auf die Gruppen so eingerichtet wurde, daß die mittlere Startmasse jeder Gruppe nahezu gleich war. Jede Gruppe der Ratten wurde einer Behandlung unterworfen.
Die Ratten wurden subkutan an jedem der neun Tage entweder mit einer Somatotropinlösung oder mit einer Kontrollösung injiziert. Die Injektionen erfolgten unterhalb des Schädels nahe des subscapulären Bereiches. Um das Somatotropin zu solubilisieren, wurden die folgenden Parlow-Puffer eingesetzt
I. NaHCO3 (0,03 M), NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 10,8 mit 8 M NaOH
II. NaHCO3 (0,03 M), NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 9,5 mit 8 M NaOH.
Eine bekannte Menge des A7rpST (siehe Tabelle ill) wurde in pH 10,8-Puffer gelöst, mit 2 N HCI auf pH 9,5 eingestellt und mit pH 9,5-Puffer auf das Volumen gebracht.
Eine Gruppe von 10 Ratten wurde als negative Kontrollgruppe eingesetzt und mit der Trägersubstanz injiziert, die zur Solubilisierung des Somatotropins verwendet worden war. Eine zweite Gruppe wurde mit einer Lösung von lyophilisiertem A7rpST injiziert. Die anderen Gruppen wurden mit Lösungen einer ausgewählten Dosis von Übergangsmetall-gefälltem A7rpST dieser Erfindung injiziert. Die Ratten wurden am 1., 2., 9. und 10. Tag gewogen und ihre Körpermassu notiert. Am Ende des Testzeitraumes 10. Tag) wurden die Daten der Zunahme der Rattenkörpermasse analysiert.
Der Wachstumstest mit den Hypophysen-ausgeschalteten Ratten (einzelne tägliche Dosis 14 Mikrogrammj zeigte, daß ZnCI2-gefälltes A7rpST eine signifikant höhere (p größer als 0,01) wachstumsbeschleunigende Aktivität aufwies als die negative Kontrollgruppe und daß dessen Aktivität von der der lyophilisierten A7rpST-Kontrolle, die keine Übergangsmetallsalze enthielt, nicht unterscheidbar war. Ahnliche Ergebnisse erhielt man bei der Fällung mit Kupferchlorid.
| Tabelle IV | Dosis (M9) | mittl. Prozentsatz | Massezu- ± nähme S. D. |
| Probe | 0 24 24 24 | 4,0 18,6* 15,6* 17,1* | 4,2 1,7 4,7 2,4 |
| neg. Kontrolle A7rpSTZnCI2gefällt A7rpST CuCI2-gefällt A7rpST lyophilisiert | |||
' signifikant höher (P größer als 0,01) gegenüber negativer Kontrolle bei Einsatz eines einseitigen Dunnett-Tesls nach Varianzanalyse.
Fällung von Ä4-rekombinantem Ochsen-Somatotropin
Gereinigtes, lyophilisiertes A4rekombinantes Ochsen-Somatotropin (A4rbST) wurde in deionisiertem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 mg A4rbST pro ml rekonstituiert. Dieses Material wurde gegen mehr als 100 Volumina Carbor itpuffer (wie in Beispiel I definiert) dialysiert, und ein Teil dieses Materials wurde in neun Teilen Carbonatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die erhaltenen Lösungen wurden mit markiert«* η l25l-A4rbST bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Mikro Curie pro ml versetzt, um eine Bestimmung der prozentualen Füllung durch Messung der Radioaktivität in der überstehenden Fraktion nach dem Zentrifugieren zu ermöglichen.
Zu den verwendeten Übergangsmetallsalzen gehörten Zinkchlorid, Manganchlorid und Kupferchlorid. Es wurden 24-mM-, 2,4-mM- und 0,24-mM-Lösungen von jedem Salz hergestellt. Als positive Fällungskontrolle wurde Trichloressigsäure (20%) eingesetzt. Die Metallsalze oderTrichloressigsäure-Lösungen (0,5 ml) wurden zu den wäßrigen, A4rbST enthaltenden (0,5 ml) Lösungen hinzugegeber, und die Fällung unter Rühren über eine Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das gefällte Material wurde durch Zentrifugieren bei 15000 x g über 10 Minuten bei Zimmertemperatur pelletisiert. Einzelne 0,5 ml Aliquote des Überstehenden wurden aus den Doppelröhrchen entfernt und in Polypropylenröhrchen gezählt. Die Minimalzanl der Counts Iac beim Vierfachen über der Untergrundzählrate. Die Pelletbildung wurde visuell beurteilt. Die Versuchsergebnisse sind ähnlich denen in Beispiel I.
Löslichkeit und Bioaktivität von gefälltem A4rbST
Zur Vorbereitung dieses Fällungsexperimentes wurden 500 mg des im Beispiel III hergestellten A4rbST in 50 ml deionisiertem Wasser JdH2O) rekonstituiert. Das Material wurde extensiv gegen Carbonatpuffer von pH 7,4 dialysiert, bis der pH des Dialysates 7,6 betrug. Der pH des Dialysates wurde mit 3 mÄqu. HCI auf pH 7,4 erniedrigt und die Lösung durch eine 1500 x g Zentrifugierung bei Zimmertemperatur geklä>1.
Zehn Milliliter Aliquote der n&utrclnn Ä4rbST-Lösung wurden mit einem gleichen Volumen von entweder 2,4 mM ZnCI2 oder 2,4 mM CuCI2 vereinigt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur wurden die Suspensionen durch eine 15000 x g Zentrifugierung über 30 Minuten pelletisiert. Jades PeIIc t wurde bei -800C eingefroren und zusammen mit einer Roll-Schicht-gefrosteten Kontrollprobe lyophilisiert, bestehend aus 2C ml der neutralen A4rbST-Lösung, verdünnt auf 50% in dH2O.
Die Trockenmasse und der Prozentsatz an Reinheit der lyophilisierten Proben wurdtr bestimmt, um eine Berechnung der Effektivität jeder Fällungsmethode im Vergleich zu o'er Lyophilisierungsbehandlung ohne Fällung zu ermöglichen.
Um die Wirkung der Metallsalze auf die Dioaktivität von A4rbST zu bestimmen, wurde ein Wachstumstost unter Verwendung von Ratten (Hypophysen-ausgeschalt.it) wie im Beispiel III durchgeführt. Bei der Durchführung des Tests wurden junge (36 Tage alt bei Beginn des Versuuhszeitraumes) weibliche Ratten ohne Hypophyse (Hypophysen ausgeschaltet) in Gruppen von 10 Ratten eingeteilt. Die Ratten wurden nach Gewicht grippiert, wobei die Masse und die Verteilung auf die Gruppen so ausgeglichen wurde, daß din mittlere Startmasse jeder Gruppe nahuzu gleich war. Jede Gruppe der Ratten wurde einer Behandlung unterzogen.
Die Ratten wurden subkutan an jedem der neun Tage entweder mit Somatotropin oder einer Kontroilösung injiziert. Die Injektionen erfolgten unterhalb des Schädels nahe des subscapulären Bereichos.
Zur Solubilisierung von Somatotropin wurden die folgenden Parlow-Pufferlösungen verwendet.
I. NaHCO] (0,03 M), NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 10,8 mit 8 M NaOH
II. NaHCO3 (0,03 M), NüCI (0,15 M), pH erhölit auf 9,5 mit 8 M NaOH.
E;ne bekannte Menge des A4rbST wurde in pH 10,8-Puffer gelöst, mit 2 N HCI auf pH 9,5 eingestellt und mit pH 9,5-Puffer auf das Volumen gebracht.
Eine Gruppe von 10 Ratten wurde als negative Kontrollgruppe eingesetzt und mit der Trägersubstanz injiziert, die zur Solubilisierung des Somatotropins verwendet worden war. Eine zwe :e Gruppe wurde mit einer Lösung von lyophilisisrtem A4rbST injiziert. Die anderen Gruppen wurden mit Lösungen einer ausgewählten Dosis von Übergangsmetallgefälltenn A4rbST dieser Erfindung injiziert. Die Ratten wurden am 1., 2., 9. und 10. Tag gewogen und ihre KöYperrriasse notiert. Am Ende des Testzeitraumes (10. Tag) wurden die Daten der Zunahme der Rattenkörpermasse analysiert.
Fällung von natürlichem Ochsen-Somatotropin
Gereinigte, lyophilisiertes Ochsen-Somatotropin (bST), das original aus Hypophysen erhalten worden war, wurde in deionisiertem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 mg bST pro ml rekonstituiert. Dieses Materia! wurde gegen mehr als 100 Volumina Carbonatpuffer (wie im Beispiel I definiert) dialysiert, und ein Teil dieses Materials wurde in neun Teilen Carbonatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die erhaltenen Lösungen von bST wurden anschließend mit markiertem '25IbST bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Mikro-Curie pro ml versetzt, um eine Bestimmung der prozentualen Fällung durch Messung der Radioaktivität in der überstehenden Fraktion nach dem Zentrifugieren zu ermöglichen.
Zu den verwendeten Übergangsmetallsalzen gehören Zinkchlorid, Manganchlorid und Kupferchlorid. Es wurden 24-mM-, 2,4-mM- und 0,24-mM-Lösungen von jedem Salz hergestellt. Als positive Fällungskontrolle wurde Trichloressigsäure (20%) eingesetzt. Die Metallsalze oderTrichloressigsäure-Losungen (0,5 ml) wurden zu den wäßrigen, bST enthaltenden (0,5 ml) Lösungen hinzugegeben und die Fällung unter Rühren über eine Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das gefällte Material wurde durch Zentrifugieren bei 15000 χ g über 10 Minuten bei Zimmertemperatur pelletisiert. Einzelne 0,5 ml Aliquote des Überstehenden wurden aus den Doppelröhrchen entfernt und in Polypropylenröhrchsn gezählt. Die Minima.'.ahl der Counts lag beim Vielehen über der Untergrundzählrate. Die Pelletbildung wurde visuell beurteil* Die Versuchsergebnisse sind ähnlich denen im Beispiel I.
Löslichkeit und Bioaktivität von gefälltem bST
Zur Vorbereitung dieses Fällungsexperimentes wurden 500 mg des im Beispiel Vl hergestellten bST in 50 ml deionisiertem Wasser (dHjO) rekonstituiert. Das Material wurde extensiv gegen Carbonatpuffer von ρ 7,4 dialysiert und die Lösung durch e'ne 1500 x g Zentrifugierung hei Zimmertemperatur geklärt.
Zehn Milliliter Aliquote der neutralen bST-Lösung wurden mit einem gleichen Volumen von entweder 2,4 mM ZnCI2 oder 2,·· mM CuCI2 vereinigt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur wurden die Suspensionen durch eine 15000 x g Zentrifugierung über 30 Minuten pelletisiert. Jedes Pellet wurde bei -800C eingefroren und zusammen mit einer Roll-Schicht-gefrosteten Kontrollprobe lyophilisiert, bestehend aus 20 ml der neutralen bST-Lösung, verdünnt auf 50% in dH2O.
Die Trockenmasse und der Prozentsatz an Reinheit der lyophiPsierten Proben wurde bestimmt, um eine Berechnung der Effektivität jeder Fällungsnethode im Vergleich zu der Lyophilisierungsbehandlung ohne Fällung zu ermöglichen.
Um die Wirkung der Metallsalze auf die Bioaktivität von bST zu bestimmen, wurde ein Wachsiumstest unter Verwendung von Hypophysen-ausgeschalteten Ratten wie im Beispiel III durchgoführt. Bei der Durchführung des Tests wurden junge (36 Tage alt bei Beginn des Versuchszeitraumes) weibliche Hypophysen-ausgeschaltete Ratten in Gruppen von 10 Ratten eingeteilt. Die Ratten wurden nach Gewicht gruppiert, wo bei die Masse und die Verteilung auf die Gruppen so ausgeglichen wurde, daß die mittlere Startmasse jeder Gruppe nahezu gleich war. Jede Gruppe der Ratten wurde einer Behandlung unterzogen. Die Ratten wurden subkutan an jedem der neun Tage entweder mit Somatotropin oder einer Kontrollösung injiziert. Die Injektionen erfolgten unterhalb des Schädelj nahe des subscapulären Bereiches. Zur Solubilisierung von Somatotropin wurden die folgenden Parlow-Pufferlösungen verwendet
I. NaHCO, (0,03 M). NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 10,8 mit 8 M NaOH.
II. NaHCO3 (0,03 M) NaCI (0.15 M), pH erhöht auf 9,5 mit 8 M NaOH.
Eine bekannte Meng., >'es bST wurde in pH 10,8-Puffer gelöst, mit 2 N HCI auf pH 9,5 eingestellt und nrt pH 9 5-Puffer auf das Volumen gebracht.
Eine Gruppe von 10 Ratten wurde als negative Kontrollgruppe eingesetzt und mit der Trägersubstanz injiziert, die zur Solubilisierung des Somntotropins verwendet worden war. Eine zweite Gruppe wurde mit einer Lösung von lyophilisiertem bST injiziert. Die anderen Gruppen wurden mit Lösungen einer ausgewählten Dosis von Übergangsmetall-gefälltem bST dieser Erfindung injiziert. Die Ratten wurden am 1., 2., 9. und 10. Tag gev\ ogen und ihre Körpermasse notiert. Am Ende des Testzeitraumes (10. Tag) wurden die Daten der Zunahme der Rattenkörpermasse analysiert.
im
Fällung von natürlichem Schweine-Somatotropin L ., Gereinigtes, lyophilisiertes Schweine-Somatotropin (pST), das original aus Hypophysen erhalten worden war, wurde in
deionisiertem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 mg pST pro ml rekonstituiert. Dieses Material v/urde gegen mehr als 100 Volumina Carbonatpuffer (wi9 im Beispiel I definiert) dialysiert, und ein Teil dieses Materials wurde in neun Teilen Carbonatpuffer, pll 7,4, verdünnt. Die erhaltenen Lösungen von pST wurden im Anschluß deren mit markiertem 125IpST bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Mikro-Curie pro ml versetzt, um eine Bestimmung der prozentualen Fällung d'irch Messung der Radioaktivität in der überstehenden Fraktion r.^ch dfim Zentrifugieren zu ermöglichen.
Zu den eingesetzten Übergangsmetallsalzen gehörten Zinkchlorid, Manganchlorid und Kupferchlorid. Es wurden 24-mM-, 2,',-.nM- und 0,24-mM-Lösungen von jedem Salz hergestellt. Als positive Fällungskontrolle wurde Trichloressigsäure (20%) eingesetzt. Die Metallsalze oder Trichloressigsäure-Lösungen (0,5 ml) wurden zu den wäßrigen pST enthaltenden (0,5 ml) Lösungen hinzugegeben und die Fällung unter Rühren über eine Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das gefällte Material wurde durch Zentrifugieren bei 15000 x g über 10 Minuten bei Zimmertemperatur pelletisiert. Einzelne 0,5 ml Aliquote des Überstehender, wurden aus den Doppelröhrchen entfernt und in Polypropylenröhrchen gezählt. Die Minimalzahlen der Counts lag beim Vierfachen über der Untergrundzählrate. Die Pelletbildung wurde visuell beurteilt. Die Versuchsergebnisse sind ähnlich denen im Beispiel I. Beispiel IX
Zur Vorbereitung dieses Fällungsexperimentes wurden 500 mg des im Beispiel VIII hergestellten pST in 50 ml deionisiertem Wasser JdH2O) rekonstituiert. Das Material wurde extensiv gcgin Carbonatpuffer von pH 7,4 dialysiert und dip Lösung durch eine 1500 x g Zentrifugierung bei Zimmertemperatur geklärt.
Zehn Milliliter Aliquote der neutralen pST-Lösung wurden mit einem gleichen Volumen von entweder 2,4 mM ZnCI2 oder 2,4 mM CuCI2 vereinigt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur wurden die Suspensionen durch 15000 x g Zentrifugierung über 30 Minuten pelletisiert. Jedes Pellet wurde bei -800C eingefroren und zusammen mit einer Roll-Schicht-gefrosteten Kontrollprobe lyr philisiert, bestehend aus 20 ml der neu! alen pST-Lösung, verdünnt auf 50% in dH2O. Die Trockenmasse und der Prozentsatz an Reinheit der lyophilisierten Proben wurde bestimmt, um eine Berechnung der Effektivität jeder Fällungsmethode im Vergleich zu der Lyophilisierungsbehandlung ohne Fällung zu ermöglichen.
Um die Wirkung der Metallsalze auf die Bioaktivität von pST zu bestimmen, wurde ein Wachstumstest unter Verwendung von Hypophysen-ausgesrhalteten Ratten wie im Beispiel III durchgeführt.
Bei der Durchführung des Tests wurden junge (36 Tage alt bei Beginn des Versuchszeitraumes) weibliche Hyoophysen-ausgeschaltete Ratten in Gruppen von 10 Ratten eingeteilt. Die Ratten wurden nach Gewicht gruppiert, wobei die Masse und die Verteilung auf die Gruppen so ausgeglichen wurde, daß die mittlere Startmasse jeder Gruppe nahezu gleich war. Jede Gruppe der Ratten wurde einer Behandlung unterzogen.
Die Rotten wurden subkutan an jedem der neun Tage entweder mit Somatotropin oder einer Kontroilösung injiziert. Die Injektionen erfolgten unterhalb des Schädels nahe des subscapulären Bereiches. Zur Solubilisierung von Somatotropin wurden die folgenden Parlow-Pufferlösungen verwendet.
I. NaHCO3 (0,03 M), NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 10,8 mit 8 M .NaOH
II. NaHCO3 (0,03 M), NaCI (0,15 M), pH erhöht auf 9,5 mit 8 M NaOH.
Eine bekannte Menge des pST wurde in pH 10,8-Puffer gelöst, mit 2 N HCI auf pH 9,5 eingestellt und mit pH 9,5-Puffer auf das Volumen gebracht.
Eine Gruppe von 10 Ratten wurde als negative Kontrollgruppe eingesetzt und mit der Trägersubstanz injiziert, die zur Solubilisierung des Somatotropins verwendet worden war. Eine zweite Gruppe wurde mit einer Lösung von iyophilisiertem pST injiziert. Die anderen Gruppen wurden mit Lösungen einer ausgewählten Dosis von Übergangsmetall-gefälltem pST dieser Erfindung injiziert. Die Ratten wurden am 1., 2., 9. und 10. Tag gewogen und ihre Körpermasse notiert. Am Ende des Versuchszeitraumes (10. Tag) wurden die Daten der Zunahme d<:r Rattenkörpermasse analysiert
Beispiel X
Dreiundvierzig Liter gereinigtes A7rpST mit einer Konzentration von 590 mg/1 in 60 mM Ethanolaminpuffer, pH 9,0, erhielt man aus E. coli HB 101, die in einem Fermentationsmedium gezüchtet worden waren. Die Lösung wurde auf etwa 810 mg/1 in einer Querstrom-Ultrafiltrationseinheit (Romicon HF) aufkonzentriert, ausgerüstet mit einer ""^-Kubikfuß-Membranpatrone, die eine Molekülmassen-Nennbegrenzung von nahezu 5000 Dalton aufwies. Die erhaltene konzentrierte Produl tlösung in dem Ethanolpuffer von pH 9,0 wurde in der gleichen UF-Einheit gegen 6 χ Volumina von 50% Carbonatpuffer (0,21 mM Ma2CO3; 0.25 mM NaHCO3) bei pH 8,0 bis 10,0 diafiltriert. Das erhaltene Restprodukt, nunmehr in 50% Carbonatpuffer mit einem pl· oberhalb von 8,0, wurde leicht trüb (OD695 = 0,01) und wurde in einer Querstrom-Mikroporenfiltrationseinheit (Amicon DC-10), ausgerüstet mit einer 5-Quadratfuß-Membranpatrone, die eine 0,1-Mikrometer-Membran hatte, geklärt.
Die obige geklärte Lösung, 26 Liter mit 800 mg/1 ST-Konzentration und einem pH von 9,0, wurde vorsichtig gerührt und mit 3,7 Litern 0,2 Mikrometer-filtrierter 2,4 mM ZnCI2-Lösung mit e.ner Zugaberate versetzt, bei der die Zugabe in einem Zeitraum von 5 bis 30 Minuten beendet wurde. Die Menge an Zn2''-Zugabe bei diesem Versuch führte zu einem Zn/ST-Molarverhältnis von annähernd 10. Ver der a'ischließenden Rückgewinnung des Zn-Ä7rpST-Niederschlages wurde die Lösung für weitere 20 Minuten gemischt. Die erhaitf.iie Zn-A7rpST-Suspension, nunmehr mit einer Konzentration von 0,08% mit Teilchengrößen von 2 bis 5 Mikrometer, wurde auf annähernd 2 bis 5% in einer Querstrom-Mikroporenfiltrationseinheit mit einer 0,1 Mikrometer Membranbegrenzung aufkonzentiiert.
Die erhaltene Suspension wurde weiterhin auf etwa 250000 mg/1 aufkonzentriert mit Hilfe einer kontinuierlichen Trommel-Zentrifugierung. Alternativ dazu kann die erhaltene Suspension direkt sprühgetrocknet werden oder kann weiter aufkonzentriert werden auf etwa 100000 mg/1 entweder mittels Querstrom-Mikroporenfiltration oder durch Mehrfach-Tellerzentrifugieren (disc-stack centrifugaiion). Die erhaltene Paste wurde dann bis zu einer Dicke von etwa 2 cm ausgebreitet und über zwei Tage gefriergetrocknet, wobei die maximale Produkttemperatur auf 25 0C begrenzt war. Das gefriergetrocknete Material, das im allgemeinen eine Teilchengröße von 10 bis 200 Mikrometer aufwies und eine Schüttdichte von annähernd 0,5, war geeignet für eine direkte Formulierung in ein System zur Abgabe dieses Produktes. Beispiel Xl
Beispiel X wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der 50% Carbonatpuffer durch 2 mM Tris-Puffer bei pH 7,4 ersetzt wurde. Die Charakteristika des Endproduktes und die Fällungseffektivität war bei Tris ähnlich wie bei 50% Carbonatpuffer.
Claims (31)
1. Verfahren zur Rückgewinnung von Somatotropin aus verdünnten wäßrigen Lösungen, dadurch
gekennzeichnet, daß man zu der wäßrigen Lösung ein Salz eines Übergangsmetalies in einer
ausreichenden Menge zugibt, um einen unlöslichen Komplex mit dem Somatotropin zu bilden, und man den Komplex von der Lösung abtrennt.
gekennzeichnet, daß man zu der wäßrigen Lösung ein Salz eines Übergangsmetalies in einer
ausreichenden Menge zugibt, um einen unlöslichen Komplex mit dem Somatotropin zu bilden, und man den Komplex von der Lösung abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte wäßrige Lösung aus der Reinigung des Somatotropins aus einem Hypophysenhomogenisat oder aus einem
Fermentationsmedium herrührt.
Fermentationsmedium herrührt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, ein rekombinantes Somatotropin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Schweine-Somatotropin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, ein biologisch aktives Fragment von Schweine-Somatotropin ist, bei dem die ersten sieben
Aminoterminalen Aminosäuren des reifen Proteins nicht vorhanden sind.
Aminoterminalen Aminosäuren des reifen Proteins nicht vorhanden sind.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Ochsen-Somatotropin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, ein biologisch aktives Fragment von Ochsen-Somatotropin ist, bei dem die ersten vier
Amino-terminalen Säuren des reifen Proteins nicht vorhanden sind.
Amino-terminalen Säuren des reifen Proteins nicht vorhanden sind.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Schaf-Somatotropin ist.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Somatotropin eines Hühnervogels ist.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Somatotropin einen Fisches ist.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Sonrtctotropin, das zurückgewonnen wird, rekombinantes Human-Somatotropin ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, ein natürliches Somatotrcpin ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropie, das zurückgewonnen wird, natürliches Ochsen-Somatotropin ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin, das zurückgewonnen wird, natürliches Schweine-Somatotropin ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekonnzeichnet, daß zu den Metallen Zink, Kupfer, Mangan, Eisen oder Kobalt gehören.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall Zink ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zu den Übergangsmetallsalzen ein Chlorid, Sulfat, Acetat oder Tartrat eines Übergangsmetalles gehören.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zu den Salzen der Übergangsmetalle
Zinkchlorid, Kupferchlorid, Manganchlorid, Eisenchlorid (II), Eisen(lll)chlorid oder Kobaltchlorid
gehören.
Zinkchlorid, Kupferchlorid, Manganchlorid, Eisenchlorid (II), Eisen(lll)chlorid oder Kobaltchlorid
gehören.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz Zinkchlorid ist.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Komplex aus der wäßrigen Lösung abfiltriert und getrocknet wird.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Komplex aus der wäßrigen Lösung durch Zentrifugieren abgetrennt und getrocknet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 1, 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß der abgetrennte unlösliche Komplex unter Vakuum getrocknet oder durch Lyophilisierung getrocknet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Komplex bei einer
Temperatur zwischen 00C und 25 0C getrocknet wird.
Temperatur zwischen 00C und 25 0C getrocknet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte wäßrige Lösung einen
pH-Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 9,8 aufweist und daß das Salz des Übergangsmetalles in einem molaren Überschuß zur Menge des Somatotropins eingesetzt wird.
pH-Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 9,8 aufweist und daß das Salz des Übergangsmetalles in einem molaren Überschuß zur Menge des Somatotropins eingesetzt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der verdünnten wäßrigen Lösung zwischen etwa 6,8 und etwa 9,0 liegt.
-2- 2704Ö6
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet daß die Konzentration des Übergangsmetallsalzes wenigstens etwa 0,12 mMol pro 0,025 mMol Somatotropin in 1,0 Liter Lösung beträgt.
27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene unlösliche Komplex wenigstens etwa 1 bis etwa 8 Mole Metall pro Mol Somatotropin enthält.
28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene unlösliche Komplex etwa 0,3 bis etwa 8 Massenanteile in % Übergangsmetall enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene unlösliche Komplex etwa 0,4 bis etwa 7 Massenanteile in % Übergangsmetall enthält.
30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte wäßrige Lösung einen Puffer enthält, der carbcnatpuffer, 50 mlvi Tris-HCI oder 60 mM Ethanolamin ist.
31. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Puffer auf einen pH-Wert zwischen etwa 7,4 und etwa 9,8 eingestellt wird.
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