DD270657A1

DD270657A1 - Verfahren zur zuechtung von bordetella pertussis

Info

Publication number: DD270657A1
Application number: DD31484988A
Authority: DD
Inventors: Hans-Edmund Nikolajewski; Sonja Swidsinski; Harald Liepert; Ingrid Mrasek; Gudrun Wettig; Edith Kant
Original assignee: Staatliches Inst Fuer Immunpra
Priority date: 1988-04-18
Filing date: 1988-04-18
Publication date: 1989-08-09

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zuechtung von Bordetella pertussis. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Impfstoffproduktion. Erfindungsgemaess erfolgt die Zuechtung von Bordetella pertussis in einem fluessigen Naehrmedium unter Zudosierung von Glutaminsaeure und synchroner Regulation des Sauerstoffeintrages.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivation von Bordetella pertussis-Bakterien zur Herstellung einer pertussisvakzine zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten und zur Gewinnung von Anttgenpräparaten zur Antikörperbestimmung gegen B. pertussis. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie (Impfstoffproduktion).

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik Die herkömmlichen Pertussis-Impfstoffo zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten enthalten meist abgetötete Keime von Bordetella pertussis. Von den Pertussis-Keimen ist bekannt, daß sie beim Impfling häufig lokal an der Impfstelle Schmerzen und Entzündungen, aber auch Fieber und in seltenen Fällen zudem neurologische Komplikationen, wie z. B. Enzephalitis,

verursachen.

Dir* seit einiger Zeit unternommenen Bemühungen zur Entwicklung einer nebenwirkungsfreien oder -armen Pertussis-Vakzine

führten zur Aufklärung der Rolle einer Reihe von protektiven Antigenen im Krankheitsverlauf des Keuchhustens, die von

B. pertussis produziert werden. Zu den als wesentlich erkannten protektiven Antigenen von B. pertussis gehören die Hämagglutinine FHA (Filamentöses Hämagglutinin) und PT (Pertussis-Toxin). So wurde seit 1981 in Japan eine zellfreie Vakzine aus FHA und ΡΪ entwickelt, die im Vergleich zur Vollkeim-Vakzine vergleichbare

immunologische und deutlich verringerte reaktogene Wirkungen aufweist.

Dazu ist es erforderlich, diese durch B. pertussis Phase-I-Stämme produzierten Komponenten in möglichst hoher Ausbeute

sowie in hochgereinigter Form zu isolieren.

Beschrieben ist die Herstellung der zellfreien Pertussis-Vakzine durch Beimpfung eines geeigneten Mediums mit B. pertussis Phase-I-Bakterien und und Kultivation in Roux-Schalen unter „statischen" Bedingungen für etwa 5 Tage und bei etwa 35"C (Sato, Japan, Patent Nr.5203/1982). Für die anschließende Aufarbeitung und Reinigung der Antigene werden eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden

vorgeschlagen (Y. Sato et al., Infect. Immun., 41 (1], 313-320 (1983); Y.Sato ot al., Semin. Infect. Diss., 4,371-379 [1982);

A. L.Winters et al., J. Biol. Stand., 14,261-271 (1986)). Nachteilig bei dieser Züchtungsmethode ist der dazu notwendige und für eine Großproduktion unakzeptabel hohe Arbeits- und Zeitaufwand. Weiter wird vorgeschlagen, die Kultivation in Schüttelgefäßen, in denen ein gutes Bakterienwachstum gefunden wurde,

durchzuführen. Demgegenüber konnten dabei jedoch nur geringe Hämagglutinationstiter erhalten werden (H. Aral, J. J.Munoz,

Infect. Immun., 25,764-767 (1979)).

Bekannt sind weiterhin Versuche, durch Zusätze (Additive) zum Züchtungsmedium eine Steigerung der Zellausbeute an B. pertussis und eine Erhöhung der Ausbeute an FHA und/oder PT zu erzielen. So untersuchte A. G. Lane (Appl. Microbiol., 19, 512-520 [197O)) den Einfluß verschiedener, dem Nährmedium zugesetzter Aminosäuren, insbesondere Glutaminsäure, auf Zellwachstum von B. pertussis und biologische Eigenschaften der daraus gewonnenen Vakzine. Die Addition von bis zu 3g Na-Glutamat pro Liter Nährmedium führte zu einer Steigerung der Zellausbeute um bis zu 43,5%, ohne daß die Protektivität der Vakzine abnahm. Bei Zugaben von mehr als 3g Na-Glutamat pro Liter Nährmedium wurde eine Inhibition des Wachstums von B. pertussis gefunden.

Y.Suzuki et al. (Japan. Patent 54680/1983; 58548/1983; EP 0121249) schlagen den Einsatz von Cyclodextrine^ insbesondere methylierter ß-Cyclodextrine, z. B. Heptakis 2,6-0-dimethyl-ß-cyclodextrin, als Additiv in Mengen bis zu 10g pro Liter Nährmedium vor. Nach ihren Angaben kann die Kultivation von B. pertussis in einem Rührfermentor unter Kontrolle von pH-Wert, Schaumentwxklung und Gelöstsauerstoffkonzentration bei Addition von methylierten Cyclodextrinen im Vergleich zur statischen Kultur ohne Cyclodextrin zu einer Erhöhung der Zellausbeute auf das 2,5fache und der Pertussis-Toxinmenge (LPEu/ml) auf das 1O-15fache führen. Im Gegensatz dazu wurde bei der Fermentorkultivation in cyclodextrinhaltigen Nährmedien keine Beeinflussung der FHA-Ausbeute gefunden. Nachteilig ist, daß die für den Züchtur.gszweck als geeignet beschriebenen ß-Cyclodextrine nur auf kompliziertem Wege zu synthetisieren sind, wodurch ihr Einsatz beschränkt ist und zu einer erheblichen Erhöhung der Produktionskosten führt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines einfachen und kostengünstigen Verfahrens zur Kultivation von B.-pertussis-Bakterien zur Herstellung einer zellfreien Vakzine zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe an sich bekannter und üblicher Kuliivationstechniken, worunter der Einsatz von z. B. Schüttelfermentoren, Blasensäulen- oder Rührfermentorön oder anderen, geeigneten Kultivationsgefäßen zu verstehen ist, ein Verfahren zur Kultivation von B. pertussis mit hohen Zeil- und Antigenausbeuten zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einem üblicherweise für die Kultivation von B. pertussis eingesetzten Flüssig· Nährmedium, 2.B. dem Nährboden nach COHEN-WHEELER, Glutaminsäure (als Na-Glutamat) in Konzentrationen von 2-20g pro Liter Nährmedium, vorzugsweise 3-10g/l, zusetzt und gleichzeitig Ηβη für die Stoffwechseltätigkeit der Bakterien notwendigen Sauerstoffeintrag in das Nährmedium in einer Weise reguliert, daß zwischen 15-35mmol Sauerstoff pro Liter Nährmedium und Stunde (mmol/lh), vorzugsweise 25-32mmol CVIh in das Nährmedium eingetragen werdon. Erfindungsgemäß wird die Glutaminsäure entweder vor der Beimpfung des Nährmediums komplett zudosiert, oder man gibt zunächst eine Teilmenge (z.B. 50%) der Glutaminsäure zum Nährmedium und fügt zu einem oder mehreren späteren Zeitpunkten die restliche Menge an Glutaminsäure zu.

Zur Realisierung der erfindungsgemäßen Lösung ist es notwendig, die Belüftung für des jeweils verwendete Fermentationssystem, z. 6. Schüttelfermentor, Blasensäulen- oder Rührfermentor, so zu regulieren, daß ein Sauerstoffeintrag zwischen 15-35mmol O₂/lh gewährleistet ist.

Zu diesem Zweck wurde für jedes Fermentationssystem die Effektivität des Sauerstoffeintrags in Abhängigkeit von Belüftungsintensität, Zusammensetzung des Gasgemisches und des Nährmediums sowie des Füllvolumens mit Hilfe der Methode der Sulfitoxidation bestimmt (Nikolajewski, Liepert „Gasometric Measurement of Sulfite Oxidation", Acta Biotechnol. 7,371-375,1987).

Insbesondere beim Eincatz eines Blasensäulenfermentors zur Züchtung von B. pertussis, bei dem der Eintrag von Luft und Sauerstoff über eine Glassinterplatte am Boden des Gefäßes erfolgt, kann es während der Züchtung infolge barker Schaumentwicklung zum Ausfrieren von Bakterien und damitzu einer Verminderung der Ausbeute an Bakterien und Antigenen kommen. Zur Vermeidung dieses Effektes werden gegebenenfalls mechanisch wirkende Mittel, wie ein interner Sprühkopf (Nikolajewski und Liepert, WP 2997146), ein externer Schaumabscheider mit Rückpumpsystem oder chemisch wirkende Antischaummittel (z. B. Silikonöle vom Typ Antifoam A, Hersteller: Sigma Chemical Company, St. Louis, USA oder Fettsäureester, z. B. Sonnenblumenöl) oder eine Kombination mechanisch bzw. chemisch wirkender Mittel eingesetzt. Weiterhin ist das Verfahren durch die Einhaltung eines pH-Bereiches im Nährmedium während der Kultivation zwischen 6,5-9,0, vorzugsweise zwischen 7,3-8,5 gekennzeichnet. Die pH-Regulierung erfolgt durch Einleiten von gasförmigem Kohlendioxid (COj). So wird während der Züchtung nach Erreichen eines pH-Wertes zwischen 7,5-7,9 steriles CO₂-GaS mit einem Durchsatz von 0,01-0,08 wm (Gasvolumen in Liter/Volumen Nährmedium in Liter · Minute) kontinuierlich oder in Intervallen in das Nährmedium eingetragen und auf diese Weise der pH während der Züchtung zwischen 7,5-8,5 reguliert. Wie aus Tabelle 2 (Zeilen 1 und 2) zu entnehmen ist, ist durch die alleinige Zudosierung von Glutaminsäure zum Nährmedium bei ungeregeltem Sauerstoffeintrag nur eine geringe Zunahme des Zellwachstums und des HA-Titers im Vergleich zum glutaminsäi refreien Nährmedium zu erzielen.

Der Pertussis-Toxintiter weist dabei keine Ände ung auf. Andererseits kann zwar durch geregelten Sauerstoffeintrag während der Züchtung von B. pertussis im glutaminsäuu ''eien Nährmedium eine Erhöhung der Zelldichte bis zu 125 10⁹ Keime/ml (125 lOU/ ml) erreicht werden, eine wesentliche Steigerung der Antigenausbeuve ist jedoch sowohl bei HA als auch bei PT nicht nachzuweisen (Tabelle 2, Zeilen 3-5). Nachteilig ist weiterhin die relativ rasch abfallende Aktivität des HA im Nährmedium nach Erreichen eines Maximums (Bild 1 a).

Überraschenderweise ist beim erfindungsgemäßen Verfahren durch das Zudosieren von Glutaminsäure bei dazu synchroner Regulierung der Belüftung des Nährmediums auf einen Sauerstoffeintrag zwischen 15-35mmol O₂/lh sowohl eine deutliche Steigerung der Zellausbeuten an B. pertussis als auch eine Erhöhung des PT-Titers und insbesondere des FHA-Titers zu verzeichnen (Tabelle 2, Zeilen 6-11).

Als weiterer überraschender Effekt des Zusammenwirkens von zudosierter Glutaminsäure und reguliertem Sauerstoffeintrag tritt eine wesentlich verbesserte Stabilität der Aktivität des HA ein (Bild 1 b).

Ausführungsbeispiel Das erfindungsgemäße Verfahren soll beispielhaft an einer Züchtung von Bordetella pertussis In einem 3-l-Schüttelfermentor

beschrieben werden.

Die für den notwendigen Sauerstoffeintrag erforderliche Belüftungsrate und Schüttelfrequenz wurden zunächst in Vorversuchen

ermittelt.

Die zur Anzucht verwendeten lyophilisiertenB.-pertussis-Bakterien (Stamm: Tohama I) wurden 72 Stunden auf BORDET- GENGOU-Agar mit 20% Humanblut vermehrt und anschließend auf Kohle-Kasein-Agar überimpft. Nach 48 Stunden Bebrütung

bei 36°C legte man eine Subkultur in 200ml COHEN-WHEELER-Nährmedium (Zusammensetzung s. Tabelle 1) an, welche 28 Stunden bei 36⁰C geschüttelt wurde und anschließend als Inokulationsmaterial für den 3-l-Schüttelfermentor diente.

Züchtungsbedingungen: Füllvolumen: 11 Nährmedium: COHEN-WHEELER-Nährmedium Einimpfdichte: 8 Mro'. Keime/ml Sohüttelfrequenz: 184-195/min Belüftungsrate: 11 Luft/min Temperatur: 36 ⁰C Zusätze: 5 g Glutaminsäure/l

0,1 ml Sonnenblumenöl/l pH-Regulierung: durch Zudosieren von 80ml COj/min für jeweils 1 Minute in Intervallen zwischen."-10 Minuten

Ergebnisse: Zelldichte an B. pertussis: 140-16010⁹ Keime/ml HA-Titer der Bakteriensuspension: 1:512-1:1024/ml PT-Titer der Bakteriensuspension: 1:128 000-1:256000 Tabelle 1 Zusammensetzung des modifizierten Nährmediums nach COHEN-WHEELER

Komponente	g/l	Gehalt	ml/l	50
			130 mg.-% Aminostickstof f	0,2
Kaseinhydrolysat, salzsauer	2,2			0,3
lösl. Stärke nach ZULKOWSKI	0,005
Nikotinsäure	0,005
Nikotinsäureamid	0,43
KH₂PO₄	0,011
MgSO₄
Hefedialysat
FeSO₄ (0,5% wäßr. Lösung)
CuSO₄(I %wäßr. Lösung)		ad 1000 ml
aquadest		6,5-7,0
pH
Additiv	2-20
Glutaminsäure (Na-SaIz)

Eingesetzter Bordetella-pertussis-Stamm: Tohama I Einimpfdichte: 8 Mrd. Keime/ml (8 lOU) Anzucht: a) BORDET-GENGOU-Agar, 72 Stunden bei 35⁰C

b)Kohle-Kasein-Agar, 48 Stunden bei 35"C

c) COHEN-WHEELER-Kulturmedium mit 5 g/l Glutaminsäurezusatz

Tabelle 2 Beeinflussung von Zeil- und Antigenausbeute" durch zusammenwirkenden Effekt von Glutaminsäurezusatz und reguliertem Sauerstoffeintrag

Glutaminsäure· Sauerstoffeintrag Zelldichte HA-Titer PT-Titer zusatz (g/l) (mmol/lh) (lOU/ml) 10*

- 2) 5 2)

- 13,7

- 17,2

- 26,7 5 13,7 5 17,2 5 26,7 5 31,2

10 26,7

15 26,7

1) Kultivationszeit: 23 Stunden

2) ungeregelter Sauerstoffeintrag zwischen 2,5-8,55mmol O₃/lh

54-92	10-128	48-64
57-106	352-576	48-64
96	4	96
112	257	64
126	130	48
139	1280	256
127	1536	256
120-125	3000-4096	48-256
125	3000	256
96	512	96
111	3072	32

Claims

1. Verfahren zur Züchtung von Bordetella pertussis in einem flüssigen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Kultivationsbedingungen Glutaminsäure zudosiert und in dazu synchroner Weise den Sauerstoffeintrag reguliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zudosierung von Glutaminsäure in Form von Na-Glutamat entweder komplett vor Beimpfung des Nährmediums mit B. pertussis oder in Teilmengen vor und während der Züchtung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutaminsäure in Mengen zwischen 2-20g/l Nährmedium zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutaminsäure in Mengen zwischen 3-10g/l Nährmedium zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belüftung des Nährmediums so reguliert wird, daß ein Sauerstoffeintrag zwischen 15-35mmol O₂/lh gewährleistet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Belüftung des Nährmediums so reguliert wird, daß ein Sauerstoffeintrag zwischen 25-32 mmol O₂/lh gewährleistet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Kultivation auftretender Schaum durch Einsatz mechanisch wirkender Mittel und/oder chemischer Anti-Schaum-Reagenzien bekämpft wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung zwischen 6,5-9,0 einstellt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung zwischen 7,3-8,5 einstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 1,8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulation des pH-Wertes durch Einleiten von gasförmigem Kohlendioxid (CO2) erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Regulation durch CO₂-GaS mit einem Durchsatz von 0,01-0,08vvm kontinuierlich oder in Intervallen in das Nährmedium erfolgt.