DD272134A1 - Verfahren zum simultanen nachweis von antigen und spezifischen antikoerpern - Google Patents

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DD272134A1 DD31524788A DD31524788A DD272134A1 DD 272134 A1 DD272134 A1 DD 272134A1 DD 31524788 A DD31524788 A DD 31524788A DD 31524788 A DD31524788 A DD 31524788A DD 272134 A1 DD272134 A1 DD 272134A1
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Tomas Porstmann
Baerbel Porstmann
Ruediger Von Baehr
Elsa Nugel
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Univ Berlin Humboldt
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum simultanen Nachweis von Antigen und Antikörper im Festphasenimmunoassay. Sie dient dem Nachweis von Infektionserregern. Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe liegt darin, dass der Zwei-Seiten-Bindungstest zum Antigennachweis mit der Brückenantikörpertechnik oder der Antiglobulin-(Sandwich)-technik zum Antikörpernachweis kombiniert wird oder dass Antigenstruktur-tragende Antikörper (Antigen-Antikörperkonjugate) im Zwei-Seiten-Bindungstest eingesetzt werden. Die Erfindung eignet sich z. B. zum simultanen HIV- und HBsAg-Nachweis. Das Anwendungsgebiet ist die medizinische Diagnostik.{Infektionserreger. Antigen, Antikörper, Nachweis, Festphasenimmunoassay, Kombination, Zwei-Seiten-Bindungsassay, Brückentechnik, Medizin, Diagnostik, HIV-Nachweis, HbsAg-Nachweis}

Description

Hierzu 7 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft diagnostische Verfahren zur Erkennung von Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin. Daa Verfahren dient dem kombinierrten Nachweis mehrerer Infektionserreger, wobei man sich der Diagnostik zirkulierenden Antigens und zirkulierender Antikörper bedient. Es kann auf dem Gebiet der Humanmedizin, in der Klinischen Chemie und Laboratoriumsdiagnostik, in der mikrobiologisch-virologischen und der klinisch-immunologischen Diagnostik eingesetzt werden. Ferner findet es Anwendung in Hygieneeinrichtungen zur Aufklörung epidemiologischer Situationen hinsichtlich der Verbreitung der nachzuweisenden Erreger sowie in Blutspendezentralen und der Pharmaindustrie bei der Elimination erregerhaltiger biologischer Flüssigkeiten oder Organe, die zum Zwecke eines therapeutischen Einsatzes entnommen wurden und aufgearbeitet werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Festphaseimmunoassaytechniken ί ind die arn häufigsten angewendeten Methoden zum Nachweis infektiöser Crreger (Bakterien, Viren). Da die Infektion mit einem Erreger in dem befallenen Organismus die Erzeugung spezifischer Antikörper hervorruft, wird deren Nachweis als indirekter Beweis eines stattgefundenen Kontaktes mit dem entsprechenden Erreger gewertet und überall dort angewendet, wo sich virales oder bakterielles Antigen aufgrund sehr geringer Konzentration in dem Untersuchungsgut nicht sicher nachweisen lassen. Kommen letztere in den für die Nachweistechniken ausreichenden Konzentrationen vor, wird ihrem Nachweis als direkter Beweis für die Infektion der Vorzug gegeben (Literaturübersicht bei Porstmann, T. und B. Porstmann, Dt. Gesundheitswesen 36,1986-1990(1981]). Damit werden Antikörper- und Antigennachweis als Immunoassayvarianten nebeneinander in verschiedenen Testen praktiziert. Die ständige Zunahme der sich als pathogen herausstellenden Infektionserreger führt zu einer steigenden Zahl unterschiedlicher Teste bei der Diagnostik, vor allem aber bei der Überwachung der für die Therapie vorgesehenen biologischen Pr.. dukte. Bisher wurde für den Nachweis eines Erregers mindestens ein Test benötigt. Dabei bodient man sich beim Antigentest bekannter Verfahren wie des kompotitiven Festphasenimmunoassays mit insolubilisiertem Antigen oder Antikörper sowie des Zwei-Seiten-Bindungstestes (Abb. 1) Schnur, A. H.W. M. und B. K. van Wemen: Chin Chim. Acta 81,1-40 [1977]). Für den Nachweis spezifischer Antikörper sind vier verschiedene Verfahren — Antiglobulin- oder Sandwichtechnik, Kompetitionstechnik, Capturetechnik und Brückentechnik (Abb.2) — beschrieben worden (R.Tedder: in J.C.GIuckmann und E.Vilmer [Hrsg.]: Acquired Immuno Deficiency Syndrome; Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. Parix, 1986, S.173-181).
Ziel der Erfindung
Es ist das Ziel der Erfindung, Antigen bakterieller oder viraler Infektionserroger sowie spezifische Antikörper gegen andere Infektionserreger in ein und demselben Ansatz nachzuweisen und damit die Zahl der Testansätze gegenüber der Anwendung bei bisherigen Testverfahren zu reduzieren.
Darlogung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum simultanen Nachweis von Antigen und spezifischen Antikörpern im Fostphasenimmunoassay zu entwickeln. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Antikörper zur Bindung nachzuweisenden Antigens und Antigen zur Bindung spezifischer Antikörper koimmobilisert werden bzw. daß Antigen an den Antikörper vc>; seiner Immobilisierung kovalent gebunden wird. Bei vomandenem Erregerantigen oder/und Antikörper gegen ein Antigen eines anderen Erregers bindet sich entweder ein markierter Antikörper oder ein markiertes Antigen; bei Doppelinfektionen befinden sich beide parallel. Durch Kovalentbindung unterschiedlicher Peptide sowie durch deren Koimmobilisie;ung und Enzymmark'erung lassen sich spezifische Antikörper gegen mehr als einen Erreger gleichzeitig in einem Ansatz nachweisen. Das Wesen der Erfindung zielt darauf ab, die Aussagen von zwei oder mehreren Testen in einem zu vereinigen, wobei in dem Fall auf die exakte Erregerdiagnose verzichtet werden kann, wenn bereits einer der nachgewiesenen Erreger definierte antiepidemische Maßnahmen odt>r die Sperrung des biologischem Produktes nach sich zieht. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß der zwei-Seiten Bindungsassay zum Antigennachweis mit der Brückenantikörpertechnik zum Antikörpernachweis kombiniert wird. Dazu wird bakterielles oder virales Antigen (z. B. gereinigt aus Viri.'slysat, rekombiniertes Antigen oder synthetische Peptide) entweder mit dem Antikörper zur Bindung des zusätzlich nachzuweisenden Antigens nach bekannten Verfahren an der festen Phase koimmobilisiert odei aber an den Antikörper kovoient gebunden, und nur dieser wird an der festen Phase nach bekannten Verfahren insolubilisiert. Im Falle der Kovalentbindung von Peptiden an den Antikörper wird dessen Reaktivität kaum beeinflußt, so daß mehrere (unterschiedliche) Peptide, die Sequenzen aus Proteinen verschiedener Erreger (z. B. HIV-1 und HIV-2) simulieren, koimmobilisiert werden können. Bei vorhandenem Antigen und/oder spezifischem Antikörper in der zu untersuchenden Probe wird ersteres von dem insolubilisierten Antikörper gebunden, während sich letzterer an das koimobilisierte bzw. kovalent an den Antikörper fixierte Antigen bindet (Abb. 3 u. 4). Nach bekanntem Verfahren wird die Probe zwischen 30-120min bei 20-370C inkubiert und nach deren Entfernung durch Absaugen unspezifisch gebundene Bestandteile durch Spülung mit Waschpuffer bekannter Zusammensetzung entfernt. Im Anschluß daran erfolgt die Inkubation mit einer Kombination von markierten Antikörpern und markiertem Antigen oder markierten Antikörpern unterschiedlicher Spezifität (Abb. 3) bzw. die Inkubation mit einem markierten Antigen-Antikörperkonju^at (kovalente Bindung von Antigen an den Antikörper vor oder nach Markierung) über einen Zeitraum von 30-120 min bei 20-37°C. Nach erneuter Abtrennung der ungebundenen Bestandteile erfolgt die Substratreaktion nach bekannten Verfahren bzw. die Radioaktivitätsmessung oder die Bestimmung der Fluoreszenzintensität.
Ausführungsbeispiel
Methode
Monoklonales anti-HBsAg IgG (finale Konzentration 10mg/ml) wurde mit einem 21er Peptid aus dem envGenbereich von HIV-1 (Aminosäuresequenz 58&-606) (Wang, J. J. G., S.Rteel, R. Wisniewolski und C. Y. Wang:Proc.Notl.Acad. Sei., USA83,6159-6163 [1986]) mit Carbodiimid (finale Konzentration 5mmol/l) im molaren Verhältnis 1:50 über 120min bei 20°C nach bekannter Methode (Talamo, P.C., E.Haber und K.F.Austen: J. Imunol. 101,333-341 [1963]) gekoppelt und anschließend von freiem Carbodiimid und nicht gebundenem Peptid durch Gelfiltration über Sephacryl S 200 getrennt. Ein Teil dieses Konjugates wurde mit perjodataktivierter Merrettichperoxidase (finale Perjodatkonzentration 10mmol/l, Aktivierungsdauer 10min, Abtrennung von freiem Perjodat durch Sephadex G-25 Gelfiltration) im molaren Verhältnis von IgG zu POD von 1:4 nach Wilson und Nakane (In: Knapp/Holubar/Wick [Hrsg]: Immunofluorescence and related staining techniques, Eiservier, Amsterdam, 1978, S. 215-221) über zwei Stunden bei Raumtemperatur gekoppelt. Die Konjugatstabilisierung erfolgte durch Reaktion mit Natriumborhydrid (finale Konzentration 5 mmol/l) über zwei Stunden bei 40C. Anschließend wurde überschüssiges Natriumborhydrid durch Dialyse gegen P8S entfernt.
Peptid-Antikörper Konjugat wurde in einer Konzentration von 10μρ IgG/ml nach bekanntem Verfahren (Catt, K. und G.W. Tregear, Science 158,1570-1572 [1967]) an der festen Phase (Polysty ronmikrotestplatten) adsorbiert. Anschließend wurde ein Serum mit bekanntem Gehalt an HBsAg und ein Serum mit Antikörpern gegen HIV-1 sowie ein Gemisch gleicher Volumenteile beider Seren geometrisch verdünnt und in jeweils separate Kavitäten 2 h bei 370C inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Serumgemisch von 10 Einzelseren, die weder HBsAg noch anti-HIV-1 Antikörper enthielten, geometrisch verdtinni und unter gleichen Bedingungen in den Kavitäxen inkubien. Nach Abtrennung der ungebundenen Reaktanten erfolgte die Substratreaktion mit O-Phenylendiamin und H2Oj nach bekanntem Verfahren (T. Porstmann, 8. Porstmann, R. Wietschke, R. vn Baehr und E. Egger: J. Clin Chem. Clin Biochem. 23,41-45 [1985]) und die Messung des Produktes bei 492 nm. Ergebnis:
— HBsAg ist in diesem Kombinationstest bis zu einer Konzentration von I.Opg/l nachweisbar (Abb. 5)
— anti-HIV-Antikörper (anti-gp 41) in einem opositiv reagierenden Kontrollserum lassen sich in diesem Kombinationstest bis zu einer Verdünnung von 1:1280% nachweisen (Abb.6)
— das Gemisch der HBsAg-positiven und anti-HIV-Antikörperhaltigen Probe weist eine höhere Extinktion als die entsprechenden Einzelproben auf (additiver Effekt) (Abb. 7)
— das Gemisch der 10 negativen Seren überschreitet mit seiner Extinktion weder den Grenzwert für den Nachweis einer HBsAg-reaktiven Probe (X Ext. NKS + 0,05 Extinktionseinheiten) noch den Grenzwert für den Nachweis einer anti-HIV-Antikörper-reaktiven Probe (x Ext NKS -) 0,10 Extrinktionseinheiten).
Die Erfindung bezieht sich demnach auf einen Festphasenimmunoassay zum Nac hweis von verschiedenen Antigenen und/oder Antigenen und spezifischen Antikörpern in einem Ansatz. Darin werden Erreger entweder direkt als Antigen oder indirket über induzierte Antikörper simultan erfaßt.
Immunoassay-(ETA)-Varianten zum Nachweis von Antigen
1. Kompetitionstechnik mit immobilisinrtem antigenspeiifischen Antikörper und enzymmarkiertem Antigen
2. Kompetitionstechnik mit immobilisiertem Antigen und enzymmarkierten antigenspe;:ifischen Antikörper
3. Zwei-Seiten-Bindungstechnik mit im.olubilisiertem und enzymmarkiertem Antikörper
Abb. 2 Immunoassay-(ELISA)-Varianien zum Nachweis spezifischer Antikörper
1. Antiglobulin- oder Sandwichtechnik mit insolubilisiertem Antigen und enzymmatkiettem anti-human IgG (IgM) Antikörper
2. Kompetitionstechnik mit insolubilisiertem Antigen und enzymmarkiertem nntigenspozifischen Antikörper
3. Capturetechnik mii insolubilisiertem anti-human IgG- (igM)-Antikörper, unmarkiertern Antigen und enzymmarkiertem antigenspezifischen Antikörper
4. Brückenantikörpertechnik mit insolubilisiertem und enzymmarkiertem Antigen
Abb. 3 Kombinationsteste zum simultanen Nachweis von Antigen und spezifischen Antikörpern durcii Reaktanten-Koimmobilisierung ι. Kombinationstest mit koimmobilisiertem Antigen und Antikörper und einem Gemisch aus enzymmarkiertem Antigen und
Antikörper 2. Kornbinationstest mit !Oirrv.obilisiortem Antigen und Antikörper und einem Gemisch enzymmarkierter Antikörper unterschiedlicher Spezifitcc
Abb. 4 Kombinationsteste zum simultanen Nachweis von Antigen und spezifischen Antikörpern durch Antigenstruktur tragende Antikörper
1. Kombinationstsst mit 1 -Antigenstruktur tragendem immobilisierten und enzymmarkierten Antikörper
2. Kombinationstest mit 2-Antigenstruktur tragendem immobilisierten und enzymmarkierten Antikörper
Abb. 5 Standardkurve Pi r Hepatitis-B-Oberflächenantigen im sukzessiven Zwei-Seiten-Immunoassay mit insolubierten und
enzymmarkierten mono/donalen anti-HBs-Antikörpern ohne (O O) (Assayprinzip 3, Abb.2) und mit koimmobilisiertem und
enzymmarkiertem HIV-1-Antigen {9 ·) (Assayprinzip 1, Aab.3)
Abb. 6
Titration eines anti-HIV antikörperhaltigen Serums in der Antitilobulin-ISandwichl-technik (D Q) und in der
Brückenantikörpertechnik mit kr immobilisierten und enzymmarkierten anti-H3s-Antikörpei η (· ·) sowie ohne
koimmobilisierte und enzymmarkierte Antikörper (O O) sowie die Reaktion eines Gemischs von 10 anti-HIV
antikörpernegativen Seren in den drei Testvarianten
Abb. 7 Extinktion eines Gemischs von 10 Normalseren (D), eines HBsAg positiven Serums (D), sines anti-HIV antikörperhaltigen Serums (O) sowie eines HBsAg positiven Serums, welches anti-HIV-Antikörper enthält ( ).

Claims (8)

1. Verfahren zum simultanen Nachweis von Antigen und spezifischen Antikörpern in Festphasenimmunoassays, gekennzeichnet dadurch, daß In einem Ansatz Erreger
a) direkt als Antigen
b) indirekt über induzierte Antikörper
simultan erfaßt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper zur Bindung nachzuweisenden Antigens und Antigen sowie Antigene zur Bindung spezifischer Antikörper koimmobilisiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antigen sowie Antigene zur Bindung spezifischer Antikörper an Antikörper kovalent zu antigenstrukturtragenden Antikörpern gebunden werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenstrukturtragenden Antikörper wahlweise immobilisiert oder markiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß bei vorhandenem Erregerantigen oder/und Antikörper gegen ein Antigen eines anderen Erregers entweder markierter Antikörper sich bindet oder markiertes Antigen gebunden wird und bei Doppelfunktionen sich beide parallel binden.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid sowie unterschiedliche Peptide kovaient am Antikörper gebunden werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide Proteinsequenzen von Erregern sind.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Proteinsequenzen des HIV-I und HIV-2 verwendet werden.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993025910A1 (en) * 1992-06-05 1993-12-23 Pharmacia Biosensor Ab Assay for multiple analytes with co-immobilized ligands

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WO1993025910A1 (en) * 1992-06-05 1993-12-23 Pharmacia Biosensor Ab Assay for multiple analytes with co-immobilized ligands

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