DD273164A3

DD273164A3 - Verfahren zur anreicherung von lipoproteinen

Info

Publication number: DD273164A3
Application number: DD27306585A
Authority: DD
Inventors: Hans Taubert
Original assignee: Saechsisches Serumwerk
Priority date: 1985-02-06
Filing date: 1985-02-06
Publication date: 1989-11-08

Abstract

Lipoproteine des Serums werden speziell im Rahmen labordiagnostischer Untersuchungen benoetigt, vor allem in Form von Kontrollseren oder Vergleichsmaterialien. Die Anreicherung der Lipoproteine erfolgt nach dem dargelegten Verfahren in der Weise, dass man die Lipoproteine selbst in Loesung laesst und die Begleitsubstanzen durch Faellung mit Ammoniumsulfat in einer Finalkonzentration von 1,40 mol/l und anschliessende Ultrafiltration entfernt. Dieses Verfahren erfasst den groessten Teil der Serumlipoproteine und ist in einfacher Weise in groesserem Massstab durchfuehrbar. Die erhaltenen Konzentrate werden entweder direkt oder nach Zusatz zu Serum fuer Kalibrier- oder Kontrollzwecke in der Lipidanalytik verwendet.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Dio Lipoproteine des Blutes sind eine Gruppe von Molekülen, die neben dem Proteinanteil einen relativ großen Lipidanteil

besitzen aber qualitativ und quantitativ in der Protein- und Lipidzusammensetzung größere Unterschiede aufweisen können. Die

Molekulargewichte reichen von etwa 2 χ 10⁵ bis über 2 χ 10⁷. Der Proteinanteil h'jt verschiedene Funktionen, unter anderem ist

er für die Löslichkeit der Moleküle mit den zum größten Teil wasserunlöslichen Lipidbestandteilen verantwortlich, und er bedingtauch die Fällbarkeit mit Proteinfällungsmitteln. Dar Lipidanteil verleiht den Molekülen eine Dichte, die unter der von reinen

Proteinen und Glykoproteinen liegt, er ist verantwortlich für die relativ leichte Aggregation der Moleküle, wie sie z. B. im Aufrahmen des Serums zum Ausdruck kommt, und er bedingt die Wechselwirkung mit Reagenzien, die mit Proteinen nicht oder

nur wesentlich schwächer reugieren.

Alle diese Eigenschaften der Lipoproteine werden in der einen oder anderen Form von den Verfahren zu ihrer Gewinnung aus Plasma oder Serum genutzt. Die bisherigen Methoden beziehen sich vor allem auf ihre Reinstdarstellung im Labormaßstab, auf

die Gewinnung der ß-Lipoprotelne und auf die Isolierung von Lipoproteinfraktionen im Rahmen einer umfassenderen

Fraktionierung. Die Verwendung der Ultrazentrifuge liefert zwar sehr reine Lipoproteine, sie gestattet aber nur kleinere Durchsätze und kommt

daher für den technischen Maßstab kaum in Frage.

Die Einschrittfällungsmethoden erfassen im wesentlichen nur die ß-Lipoproteine aber nicht den High-Density-Lipoprotein-Anteil

(HDL-Fraktion). - Wenn die Fällung unspezifisch erfolgt, z. R. mit Alkohol oder anderen organischen Lösungsmitteln, erhält manmeist relativ höh 9 Anteile an unerwünschten Serumproteinen, die sich bei der Herstellung hoher Lipidkonicentrationen in

Kontrollmaterialmn störend bemerkbar machen. Wenn andererseits spezifischere Fällungsmittel verwendet werden, z. B.' Dextransulfat oder Heparin, sind zum Zentrifugieren hohe Beschleunigungen erforderlich, die im technischen Maßstab schwer

zu realisieren sind.

Bei der labormäßigen Gewinnung von Lipoproteinen gibt es Verfahren, bei denen die Lipoproteine zunfichut ausgefällt werden

und anschließend nach Zusatz bestimmter Substanzen das Fällungsmittel aus dem Niederschlag durch einfache Dialyse in

Schläuchen entfernt wird, wodurch eine weitgehende Klärung eintritt. Solche Verfahren sind aber nicht auf die für größere Chargen erforderliche Ultrafiltration mit tangential Überströmung der Mombranen umzustellen, weil hierfür nur von vornherein klare Lösungen eingesetzt werden können. Die Anpassung eines anderen Verfahrens an die Ultrafiltration, nämlich die Ausfällung der Lipoproteine mit Rivanol, Lösung des Niederschlages und Entfernung des Fällungsmittels durch Dialyse, war nicht möglich, weil sich die Lipoproteine schon nach

kurzer Zeit zu Tröpfchen zusammenballten und damit für den vorgesehenen Zweck nicht mehr verwendbar waren.

Die klassische Plasmafraktionierung ist relativ aufwendig und wäre dann besonders sinnvoll einzusetzen, wenn die Hauptplasmabestandteile wie Albumin, Immunglobuline oder andere Fraktionen gewonnen werden sollen und die Lipoproteine

mit relativ geringem Aufwand aus einer der anfallenden Fraktionen isoliert werden könnten. Ihr alleiniger Einsatz zur Gewinnungder Lipoproteine in größerem Maßstab ist zu aufwendig.

Ziel der Erfindung

Aufgabe der Erfindung war daher die Entwicklung eines einfachen und robusten Verfahrene zur Anwendung Im technischen Maßstab, mit dem der größte Teil der Serumlipoproteine einschließlich der HDL-Fraktion mit relativ geringen Beimengungen anderer Serumbestandteile gewonnen werden kann.

-?.- 273164 Darlegung des Wesen· der Erfindung

Wenn man von der Ultrafiltration absieht, dann wird bei den bisherigen Verfahren das Prinzip verwendet, die Lipoproteine durch Fällung von den sie begleitenden Substanzen des Serums abzutrennen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß das umgekehrte Prinzip, nämlich das Inlösunglassen der Lipoproteine und das Abtrennen der unerwünschten Begleitsubstanzen, ein für technische Zwecke gut geeignetes Verfahren ergibt, wenn ganz bestimmte Bedingungen eingehalten werden. Dazu werden in der ersten Stufe die meisten Nichtlipoproteine mit Molekulargewichten oberhalb 1,5 x 10 ausgefällt, und in der zweiten Stufe werden das Fällungsmittel und andere niedermolekulare Substanzen sowio Proteine bis zu einem Molekulargewicht von etwa β χ 10⁴, vor allem Albumin, durch Ultrafiltration abgetrennt. Bei der Fällung in der ersten Stufe muß unbedingt eine finale Ammoniumsulfatkonzentration von 1,40 ± 0,05mol/l eingehalten werden. Bei höheren Konzentrationen werden die Lipoproteine schon goschädigt bzw. In eine aggregierte Form gebracht, die zwar für das bloße Auge nicht sichtbar ist, die aber die Ultrafiltration sehr stark behindern kann, offenbar durch Verstopfen der Poren. Bei geringeren Konzentrationen an Ammoniumsulfat werden dagegen zu wenige der unerwünschten Begleitproteine abgetrennt. Der sehr enge Konzentrationsbereich für das Ammoniumsulfat ist vor Allem dadurch erforderlich, daß sich die Molekulargewichte von abzutrennenden Begleitproteinen - etwa 1,5 χ 10^s bis über 2x10* bei Immunglobulinen bzw. Immunkomplexen - und niedermolekularen Lipoproteinen - etwa ab 2 χ 10^s- deutlich überlappen. Der Fällung kommt der Umstand entgegen, daß bei 1,4 mol/l an Ammoniumsulfat ein Teil der Immunglobuline zusammen mit den anderen Proteinen ausfällt, während sie in reiner Form höhere Ffillungsmittelkonzentrationen ber Stigen.

Die zur Ultrafiltration benötigten Membranen m issen einerseits Albumin gut durchlassen, andererseits dürfen die niedermolekularen Lipoproteine, nämlich die mengenmäßig sowieso am wenigsten vorhandenen HDL, nicht durchgelassen werden. Daher ist eine Porengröße mit dem Nominalmolekulargewicht von 10^s am günstigsten.

Da die Ultrafiltration der Eiweiße im Verhältnis zum Wasser seh; langsam vor sich geht, muß im Verlauf der Prozedur eine größere Menge wäßriger Lösung zu dem zu reinigenden Konzentrat gegeben werden. Diese Waschlösungen können beliebig zusammengesetzt sein, sie dürfen lediglich keine ungünstige Wirkung auf die Lipoproteine bzw. die Begleitproteine haben. Zweckmäßigerweise verwendet man daher verdünnte Salzlösungen, z. B. 1%ige Kochsalzlösung. Zum Schluß kann man bei Bedarf auch mit einer Lösung von der Zusammensetzung waschen, die man endgültig in dem Lipoproteinkonzentrat haben möchte, z.B. eine dem Serum an niedermolekularen Substanzen äquivalente Lösung.

Der Grad der Konzentrierung der Lipoproteine und des Auswaschens der Begleitproteine richtet sich nach den Erfordernissen. Die Konzentrierung kann nicht beliebig gesteigert werden, da die gleichzeitig steigende Viskosität der Lösung technische Probleme l 'ingt. Eine Konzentration auf 10g Cholesterol/I, das entspricht einer Konzentrierung der Lipoproteine auf mehr als das Fünffache, ist etwa die Grenze, bei der man noch unter normalen Bedingungen arbeiten kann. Eine stärkere Konzentrierung erfordert einen wesentlich höheren Aufwand.

Sollen die Lipoproteine für analytische Zwecke in Kontroll· oder Vergleichsmaterialien eingesetzt werden, genügt es im allgemeinen, wenn man etwa 70 bis 75% der Ausgangsproteine entfernt.

Der besondere Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht darin, daß nicht nur frisches Serum oder Plasma, sondern auch gefrorenes Serum direkt für die Aufarbeitung verwendet werden kann, obwohl hier die Lipoproteine eine gewisse Schädigung ihrer Struktur erleiden. Dadurch kann auch das tiefgefrorene Sammelserum aus Serumabfällen aufgearbeitet werden. Trotzdem waren die Lösungen vor und nach der Ultrafiltration klar filtrierbar, ohne daß Lipoproteinverluste auftraten, und während der Ultrafiltration kam es zu keiner Tröpfchenbildung oder einor anderen merklichen Aggregation.

Ausführungsbelsplel

20~l-Humanserum werdon bei Raumtemperatur und unter Rühren mit 2012,8mol/l Ammonlumsulfatlösung versetzt, wobei die ersten 151 in 20 Minuten und die letzten 51 in 2 Str.nden zugegeben werden. Die Lösung wird noch 1 Stunde gerührt, über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Überstand wird durch anschließende Ultrafiltration mit Membranen dor Ausschlußgrenze 100000 Dalton zunächst suf 151 eingeengt, mit < ι gewaschen (als Waschlösung wird während des gesamten Vorganges 0,9%ige Kochsalzlösuno verwendet), dann auf 121,10/, 81,6,71 und 5,51 eingeengt, wobei bei jeder Stufe mit 41 gewaschen wird.

Danach wird auf 4,81 eingeengt und mit insojsamt 3.01 gewaschen, wobei das Retentate-Volumen zwischen 4,8 und 5,21 gehalten wird. Schließlich wird auf 3,51 eingeengt.

Das Konzentrat enthält je nach Ausgangswerten etwa 10g Cholesterol und etwa 8g Eiweiß pro I. Die Ultrafiltration Ist in 5 Stunden beendet (abhängig von Art und Größe der Membran sowie von der Pumpe und den verwendeten Druckverhältnissen).

Von diesem Konzentrat werden 2 Teile zu 10 Teilen Humansammelserum gegeben, das einen Cholesterolgehalt von 1,8g/l aufweist. Der Cholesterolgehalt des Gemisches beträgt etwas mehr als 3g/l. Das aufgestockte Serum wird sterilfiltriert, in Portionen abgefüllt und lyophilisiert.

Claims

Verfahren zur Anreicherung von Lipoproteinon aus Plasma oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine und Immunkomplexe mit einem Molekulargewicht von über 1,5 x 10⁶ mit Ammoniumsulfat in einer Finalkonzentration von 1,40 ± 0,05mol/l ausgefällt werden und anschließend der Überstand durch Ultrafiltration mit Membranen vom Nominalmolekulargewicht 1 χ 10^s vom Fällungsmittel, niedermolekularen Stoffen des Serums und Eiweißen bis zj einem Molekulargewicht von etwa 6 x 10⁴ befreit wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

In den hochentwickelten Industriestaaten stellen zur Zeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen dia häufigste Todesursache dar. Zu deren Hauptrisikofaktoren gehören Störungon im Lipldhaushaft, die unter anderem das Auftreten von Arteriosklerose und Herzinfarkt fördern. Bei der Prävention und Therapie dieser Störungen ist die Lipidanalytik in klinischen Labors von großer Bedeutung. Die vorliegende Erfindung bezieht sich vor allem auf eine Verfahrensweise zur Gewinnung von Lipoproteine, die zur Herstellung von Kontroll· und Kalibriermaterialien für die Lipidanalytik geeignet sind. Dafür werden als Ausgangsmaterial Serumlipoproteine verwendet, die nach einem besonderen Vorfahren weitgehend von anderen Komponenten befreit und konzentriert werden. Solche Präparationen können auch als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Apolipoproteinen dienen.