DD274446B5 - Verfahren zur herstellung der parentalzellinie cb-fu2 - Google Patents
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Description
AusfOhrupgsboisplole
1. Herstellung der ParentalzelllnleCB-Fu2:
Periphere Blutlymphozyten von einer Patientin mit Rheumatoldarthritis wurden durch Zontrifugation im Dichtegradienten gewonnen. 5 χ 10'mononukleäre Zellen wurden mit 107 Zellen der Maus-MyelomzellinioP3 x 63Ag8/653lnsorumfroiem Zellkulturmedium RPM11640 (Flow-Lab., BRD) gemeinsam sodimontiort. Dor Überstand wurde verworfen und das Sediment aufgelockert. Die Fusion wurde durch den Zusatz eines Gomischos aus 45% Polyothylonglykol (PEG 1500), 10% Dimothylsulfoxid (DMSO) und 45% RPM11640 induziert. Nach dem langsamen Verdünnen des Fusionsmediums mit RPM11640 wurden die Zellen in 5 96-well-Zollkulturplatten überführt, so daß sich 106 mononukleäre Zellen/well ergaben. Nach Zugabe von HAT-Zellkulturmedium in der üblichen Konzentration wurden die Zellen bei 370C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Nach ca. 2-3 Wochen konnton die heranwachsenc in Klone hinsichtlich ihrer Antikörperproduktion getestet werden. Es wurden danach solche Kulturen ausgewählt und kloniert, Jie keine Antikörperproduktion aufwiesen. Aus den Klonierungen wurden die am schnellsten wachsenden Klone vergrößert una In ein Zellkulturmedium RPM11640 mit 10% FKS und 20Mg/mI 8-Azaguanin aufgenommen und je nach Wachstum alterierend mit Medium mit und ohne8-Azaguanin gefüttert. Zellkulturen mit stabilem Wachstum in 8-Azaguanin-haltigem Medium werden aarin mehrfach kloniert. Aus diesen Klonierungen wurden wiederum die am schnellsten wachsenden Zellklone vergrößert. Eine der so entstandenen HAT-sensitiven Zellinie wurde mit CB-Fu 2 bezeichnet.
2. Charakterls'erung der Parentalzellinle CB-Fu2
Die stablierte Ht'teromyelomzellinie CB-Fu 2 wird durch folgende Parameter charakterisiert:
2.1. Herkunft:
Heteromyelomz' llinie, die aus Fusion von humanen Lymphozyten mit der Maus-Myelomzellinie P3 χ 63 Ag8/653 hervorgegangen ist,
2.2. Zellkulturmedium:
RPM11640 (oder ein anderes geeignetes Medium) supplemontiert mit 5-10% FKS.
2.3. Immunglobulinproduktion:
Die Zellinie CB-Fu 2 produziert und sezerniert selbst keine Immunglobuline bzw. deren Fragmente. Nach Fusion mit humanen B-Lymphozyten produzieren die Hybridoma zwischen 1 und30pg/mllmmunglobulin/24h/5 x 10s Zellen.
2.4. Verdopplungszeit:
In der logarithmischen Wachstumsphaso beträgt die Verdopplungszeit 16—18h.
2.5. Karyotyp:
Durch klassische G-Bänderung werden 75-80 Chromosomen pro Zellkern festgestellt. Der Anteil humaner DNA wurde durch Hybridisierung mit 32P-markierten Plasmiden, welche humanspezifische Alu-Sequenzen enthielten, verifiziert.
2.6. Selektionsmarker:
CB-Fu 2 ist HAT-sensitiv und Quabain-resistent. Revertanton worden bisher nicht beobachtet. Die Zellinie kann mit anderen Selektionsmarkern modifiziert werden, wie z. B. Transfektion von Resistenzgenen gegen Hygromycin oder Neomycin.
2.7. Klonierungsbedingungen:
Die Zellen CB-Fu 2 sowie die davon abstammenden Hybridoma können durch die Grenzverdünnungstechnik auf Peritonealmakrophagen der Maus kloniert werden.
2.8. Fusionskapazität:
Die Fusionsfrequenz, gemessen an der Anzahl wachsender Klone, beträgt mit peripheren Blutlymphozyten 10~4 bis 10~s und 10~3 mit EBV-transformierten Zellen. 70 bis 100% der initialen Zellkulturen produzieren Immunglobulin bei einer Zelleinsaat von lOVwell.
Ähnliche Fusionsraten (10~4 bis 10~e) werden mit Milzzellen von der Maus und vom Menschen erzielt. Es können auch Lymphozyten aus anderen Organkompartimenten immortaüsiert werden.
3. Herstellung spezifischer humaner monoklonaler Antikörper
Wie unter !.beschrieben, werden periphere Blutlympnozyten gewonnen und z. B. 5 χ 107 mononukleäre Zellen mit 1 χ 107 CB-Fu 2-Zellen, wie angegeben, fusioniert. Die B-Lymphozyten können vorher auch mit EBV, wie folgt, transformiert und angereichert werden. 5 -10x 106mononukleäreZellen werden im ZellkulturüberstandderEBV-produzierendenZellinieB95/8 4h bei 370C inkubiert. Danach werden die Zellen gewaschen und mit einer Dichte von 20-50 χ 103/ml unter Standardbedingungen kultiviert. Nach 3-6 Wochen können die wachsenden Klone hinsichtlich der spezifischen Antikörperproduktion getestet und u.U. für die Fusion mit CB-Fu 2-Zellen verwendet werden.
Beispielsweise kann so mit peripheren Blutlymphozyten von HlV-infizierten Probanden verfahren werden. 14-21 Tage nach Fusion können die wachsenden Klone mit Enzymimmunoassays (oder anderen geeigneten Verfahren) hinsichtlich der Immunglobulinproduktion und der Sezernierung spezifischer Antikörper, z. B. gegen HlV-Strukturproteine, getestt' werden. Positive Zellkulturen werden bis zur sicheren Monoklonalität mit der Grenzverdünnungstechnik kloniert. Auf diese Weise wurden humane monoklonale Antikörper gegen das p25-Core-Protein (CB-hp25-1 bis -3) und das gp41-Transmembran-Protein (CB-hgp41 -1 und -2) des HIV erzeugt. Die Spezifität der Antikörper wurde in Western-Blot- und Immunfluoreszenzuntersuchungen bestätigt. Die Antikörperproduzierenden Zellinien zeigen eine derartige Stabilität, daß sie bis zur Maßstabsvergrößerung in einem 50-l-Bioreaktor vermehrt und zur Antikörperproduktion gezüchtet werden können. Die Hybridome werden als H-CB-hp25 und H-CB-hgp41 bezeichnet. Sie sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert: H-CB-hp25-1 alsZIM-0315 H-CB-hp25-2 alsZIM-0316 H-CB-hp25-3 alsZIM-0317 H-CB-hgp41-1alsZIM-0318 H-CB-hgp41-2alsZIM-0319.
Claims (2)
- Verfahren zur Herstellung einer Parentalzellinie aus Human- und Mauszellen, dadurch gekennzeichnet, daß periphere Blutlymphozyton eines an Rheumatoidarthritis erkrankten Menschen mit der MausmyelomzellinieP3 x 63Ag8/653fusioniertwerden und die Heteromyelomzellinie CB-Fu 2 (ZIM-0314) selektiert wird, die keine eigene Antiköroerproduktion aufweist.Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Parentalzelllnie CB-Fu 2 (ZIM 0314), die zur Immortalislorung antikörperproduzierendor B-Lymphozyten, insbesondere des Menschen, geeignet ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin.Die effektive Gewinnung humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) gegen die verschiedensten Antigonspezifitäten ist weltweit bisher durch zwei Hauptprobleme erschwert (Engleman, E.G., S. K. Foung, J.Larrick u. A.Raubitschek: Human hybridomas and monoclonal antibodies. Plenum Press, New York 1985):1. Die Verfügbarkeit einer Fusionszellinie, die mit vergleichbarer Fusionsfrequenz wie im Maus x Maus-System in der Lage ist, humane B-Lymphozyten zu immortalisieren.
- 2. Die geringe Frequenz an Antigen-spezifischen B-Precursorzellen im peripheren Blut dos Menschen.Mit diesen beiden Problemen ist eine geringe Ausbeute an Hybridomzellklonen verbunden, die spezifische Antikörper gegen ein vorgegebenes Antigen produzieren. Damit ist auch mit großer Wahrscheinlichkeit der Umstand zu erklären, daß weltweit trotz intensiver Bemühungen die Herstellung hmAk gegen Strukturproteine des HIV durch somatische Zellhybridisierung bisher nur in wenigen Fällen beschrieben wurde (Bonapour, R., K.Rosonthal, L.Rabin, V.Sharma, L.Young, J.Fernandez, E.Engleman, G.Reyes und J.Lifson: Characterizatation and epitope mapping of a human monoclonal antibody reactive with the envelop glycoprotein of human immunodeficiency virus. J. Immunol. 139 (1987), 4027-4033; McClure, J., EP 251612).Es ist bereits bekannt, durch Fusion humaner B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen Zellinien herzustellen, die keine oigano Antikörperproduktion aufweisen und als Parentalzellinien für eine weitere Fusion mit humanen antikörperproduzierenden Zellen (z, B. EBV-transformierten B-Lymphozyten) zur stabileren Produktion humaner mAk zu verwenden (Baron, D,, und U.Hartlaub:Humane monoklonal Antikörper, Theorie - Herstellung - Anwendung, Gustav-Fischor-Vorlag Stuttgart New York 1987, tabellarischeÜbersichtS.24; US 4634666(C 12 N 5/00); James, K., und G.T. BeIIJ. Immunol. Meth. 100 (1987) 5-40, besonders Tabelle IV, S. 15).Bekannt ist auch die Herstellung von Heteromyelomzellen durch Fusion humaner peripherer Blutlymphozyten mit Mau£m- ilomzellen der Zellinie P3 χ 63 Ag8/653. Die erhaltene Zellinie ist HAT-sensitiv und weist Resistenz gegenüber 8-Azaguanin auf (lchimori, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Com 129 (1985) 26-33).Die bisherigen Ergebnisse bei der Fusionierung von menschlichen Lymphozyten mit Mäuse-Myeloma waren nicht zufriedenstellend. So heißt es in der DT-OS 3616324:„Die Fusion von menschlichen Lymphozyten mit Mäuse-Myeloma bringt Zellen mit den gleichen ausgezeichneten In-vitro-Charakterstika wie die Maus-Maus-Hybridomas hervor, jedoch mit dem großen Nachteil, daß solche Hybride tine inherente genetische Instabilität aufweisen. In diesem Zusammenhang ist es speziell nachteilig, daß sie das menschliche Chromosom, das die Information für die leichten Kappa-Ketten des Immunglobin-Moleküls trägt, ausstoßen" und an anderer Stelle (DT-OS 33012AQ), daß bei dieser „Methode auch bei sorgfältigstem Klonen die Produktivität nicht erhalten werden kann".Die zitierten Literaturstellen zeigen kritisch das ungelöste Problem der Human-Hybridom-Technik auf: die niedrige Fusionsrate.Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Diagnostik eine Fusionszellinie zur Verfügung zu stellen, die sich zur Immortalisierung antikörperproduzierender B-Lymphozyten eignet und die eine hohe Fusionsfrequenz aufweist.Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem sich eine hocheffektive Fusionszellinie zur Immortalisierung von Lymphozyten, insbesondere von humanen B-Lymphozyten, herstellen läßt. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß humane B-Lymphozyten von einer Patientin mit Rheumatoidarthritis mit Zellen der Maus-Myelomzellinie P3 χ 63Ag 8/653 fusioniert wurden. Durch mehrfache Klonierungen wurde aus diesen Fusionen eine Reihe von Hybridzellinien gewonnen, die keine eigene Antikörperproduktion aufwiesen. Die Zellinien wurden in einem 8-Azaguanin-haltigen Zellkulturmedium hinsichtlich eines Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase(HGPRT)-Defektes selektiert. Von diesen Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin(HAT)-sensitiven Zellinien wurden die fusiogenen und Wachstumseigenschaften getestet.Auf der Grundlage dieser Parameter wurden die Eigenschaften der Zellinien durch mehrfache Klonierung stabilisiert.Eine der so gewonnenen Heteromyelomzellinien hat die Bezeichnung CB-Fu 2 (ZIM-0314) erhalten. Diese Human-Maus-Heterofusionszellinie zeichnet sich überraschenderweise durch eine hohe Fusionsfrequenz und eine hohe Immortalisierungsrate von immunglobulinproduzierenden B-Lymphozyten aus. Mit dieser Zellinie CB-Fu 2 können sowohl humane als auch B-Lymphozyten von anderen Spezies effektiv immortalisiert werden; dazu gehören auch Virus-transformierte, z. B. durch Epstein-Barr-Virus (EBV), humane B-Lymphozyten.Das überraschend gute Ergebnis wird darauf zurückgeführt, daß als Quelle der B-Lymphozyten eine Patientin mit Rheumatoidarthritis gewählt wurde. Das heißt, daß diese Quelle gegenüber gesunden Probanden aktiviert war, was für die Heteromyelomzellinie günstige Wachstumseigenschaften mit sich brachte.Unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Zellinie wurde eine Reihe von humanen monoklonalen Antikörpern (hmAk) gewonnen. Dazu gehören mAk gegen Strukturproteine des Human-Immunodeficiency-Virus (HIV) und gegen bakterielle Antigene.Die neue Heteromyelomzellinie CB-Fu 2 ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie (ZIM) der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch, unter der N immer ZIM-0314 registriert. Sie zeichnet sich gegenüber bisher bekannten Fusionszellinien (James, K., G.T. Beil., J. Immunol. M Uh., 100 [1987] 5-40) durch- eine hohe Fusionsfrequenz mit peripheren Blutlymphozyten- eine hohe Stabilität der Hybridzellinien- eine hohe Antikörper-Produktionsrate der Hybridzellinien aus.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EP | Request for examination under paragraph 12(1) filed | ||
| B5 | Patent specification, 2nd publ. accord. to extension act | ||
| RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |