DD277126A1 - Verfahren zur herstellung traegergestuetzter elektrophoretischer gele - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung traegergestuetzter elektrophoretischer Gele. Das Verfahren bezieht sich auf die Herstellung elektrophoretischer Gele, mit denen sowohl Trenn- als auch Transfertechniken ausgefuehrt werden koennen. Man erzeugt ultraduenne Gele auf kalandrierten Polyestervliesstoffen, die durch hydrodynamische Faserstoffverwirbelung hergestellt sind. Solche Gele sind fuer Elektro-Blotting-Techniken geeignet.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung elektrophoretischer, trägergestützter Gele, mit dem sowohl Trenn- als auch Transfertechniken durchführbar sind.
Moderne elektrophoretische Trennverfahren wie z. B. die isoeiektrische Fokussierung (IEF) und die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophorese verwenden Flachgele. Dabei werden ultradünne Gele entweder auf Glasplatten oder haftvermittelnde Kunstoffolien (RADOLA, B. J., Electrophoresis 1 (1980), 43-56) aufgebracht, um die Gele während der weiteren Behandlung zu stabilisieren. Diese Trägermaterialien besitzen einen entscheidenden Nachteil. Sie sind f lüssigkeits- und stromundurchlässig und damit für Transfertechniken (Diffusions- und Elektroblotting) ungeeignet. Für diese Techniken mußte man daher auf Gele zurückgreifen, die durch Gewährleistung einer ausreichenden mechanischen Festigkeit in den Verarbeitungsbädern eine Schichtdicke von mindestens 1-2 mm aufweisen müssen. Diese Gele besitzen im Vergleich zu den ultraciünnen Gelen eine Reihe von Nachteilen:
- geringere Trennschärfe
- geringere Nachweisempfindlichkeit
- erhöhter Zeitbedarf für Bearbeitungsschritte (Fixierung, Färbung, Entfärbung und Trocknung)
- erhöhter Reagenzienverbrauch von z.T. sehr kostenintensiven Reagenzien.
Um die Vorteile der ultradünnen Gele nutzen zu können und trotzdem entsprechendeTransfertechniken zu ermöglichen, wurden in der Fachliteratur eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen. So werden zur Herstellung ultradünner trägergestützter Polyacrylamidgele unterschiedliche Polyestergewebe eingesetzt (Nishisawa et al., Electrophoresis 6 [1985), 349-350; Kinzkofer et al., Elektrophorese Forum 1986,253-257), die nach der Durchführung des olektrophoretischen Trennprozesses ein Elektroblotting gewährleisten. Nachteilig wirkt sich bei der Verwendung der Polyestergewebe die notwendige Vorbehandlung derselben aus, die zur Entfernung der zur Herstellung der Gewebe notwendigen Hilfsmittel (Präparationen, Schlichten) unverzichtbar ist. Diese Substanzen (Paraffine (CH2)n ä 4 Fluortenside, aliphatische Ester) besitzen stark ausgeprägte hydrophobe Eigenschaften, die das Benetzungs- und Färbeverhalten der Gewebe nachteilig beeinflussen. So wird ein mehrmaliges Waschen mit Wasser und eine Nachbehandlung mit Tensidlösung vorgeschrieben. Das angegebene Herstellungsverfahren kann darüber hinaus eine blasenfreie (frei von Lufteinschlüssen) Gel-Herstellung nicht garantieren. Bei den zum Teil verwendeten Polyestergeweben mit Porengrößen > 80>m bildet sich die Gewebestruktur im Gel ab, was zu Gelinhomogenitäten führt. Zu Gelinhomogenitäten führen weiterhin Gewebeanomalien, verursacht durch Qualitätsschwankungen der eingesetzten Seiden und Appretur, Faserstoffauspleißung der Seiden während der Flächenbildung und dgl. Nicht zu übersehen ist die Wirtschaftlichkeit, da die Polyestergewebe in der notwendigen Qualität äußerst preisintensiv sind.
Für konventionelle Agarosegele wurden 0,089mm dicke, hydrophile Polypropylenfolien mit 35-pm-Poren eingesetzt (Saravis et al. Elektrophoresis 4 [19831,367). Neben der durch das Haftverhalten limitierten Anwendung (nur für Agarosegele geeignet) sind besonders die notwendigen Vorbehandlungen der Folien nachteilig. So sind die Folienkanten mit speziellen Adhäsiven zu behandeln, um ein Durchsickern der Agarose zu verhindern oder ein mögliches Eintrocknen der Ränder des Flachgeles zu vermeiden. Weiterhin sind die Poren mittels Vakuumbehandlung luftfrei zu machen bzw. anschließend mit Agarose zu belegen, wobei überschüssige, erstarrte Agarose mit einem scharfen Messer entfernt werden muß. Es ist daher leicht einzusehen, daß diese Vorbehandlungen sehr zeitintensiv sind, zu mechanischen Defekten an der Folienoberfläche führen können und daher Gelinhomogenitäten nicht auszuschließen sind.
Zur Ermöglichung des Transfers von Proteinen werden Polyacrylamidgele weiterhin mit thermisch bzw. adhäsiv gebundenen Polyestervliesstoffen stabilisiert (Starita-Goribaldi et al., Elektrophoresis 9 [19881,234-236). Dabei werden Polyacrylamidgele mit einer Dicke von 1,5mm auf Vliesstoffe mit einem Flächengewicht von 10g/m2 und einem Faserdurchmesser von 30μητι aufgebracht. Derartige Vliesstoffe sind sehr inhomogen und mechanisch instabil. Ihre Verbindung mit dem Gel ist ungleichmäßig ausgebildet. Dadurch treten u.a. erhebliche Schwierigkeiten bei der Herstellung der Gelküvetten und vor allem bei dor weiteren Vorarbeitung (Einrollen in Fixier-, Färbe- und Entfärbebädern) auf. EinTrocknen ist nur mit straff aufgespannten Gelen möglich, wonn Form- und Dimensionsstabilität angestrebt sind.
Gleiche Schwierigkeiten in der Handhabung treten bei der Verwendung von Nylongeweben (Kopacek, Biomedical Application of Chromatography and Elektrophoresis, Zinkovy 1988) auf, die zusätzlich noch den Nachteil einer presistierenden blauen Untergrundfärbung bei der Verwendung sonst üblicher Färbeverfahren aufweisen und eine geringe Trichloressigsäure-Beständigkeit haben.
Die Erfindung hat das Ziel, ein vereinfachtes und ökonomisch günstiges Verfahren zu entwickeln, nach dem unter Verwendung eines spezifischen, stromdurchlässigen Trägermaterials elektrophoretische Gele herstellbar sind, die für Blottingverfahren vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung mechanisch stabilisierter, elektrophoretischer Gele mit einem spezifischen stromdurchlässigen Trägermal erial zu entwickeln, das die Bildung beidseitig offener Gele ermöglicht, die für Blottingverfahren besonders geeignet sind. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe überraschenderweise dadurch gelöst, daß man ultradünne Gele auf einen bindemittelfreien, durch hydrodynamische Faseistoffverwirbelung verfestigten und kalandrierten Polyestervliessto'f erzeugt.
Besonders vorteilhaft lassen sich trägergestützte (JeIe gemäß der Erfindung herstellen, wenn man bei der hydrodynamischen Faserstoffverwirbelung Polyesterfasern mit einerr. Einzelfaserdurchmesser von 10-18μΓη verwendet. Auf diesen Träger mit einem Flächengewicht von 1O-50g/m2 werden Gele auf Basis Polyacrylamid und/oder Agarose oder deren Derivate mit einer Schichtdicke von 0,1 bis 0,75 mm aufgebracht. Die so hergestellten Polyestervliese besitzen gutes Saugvermögen für die Gellösungen. Die trockenen Gele sind dimensionsstabil gegenüber mechanischer Beanspruchung und sind sehr widerstandsfähig. So hergestellte elektrophoretische trägergestützte Gele werden in nahezu idealer Weise allen Anforderungen, die im Zusammenhang mit der elektrophoretischon Trennung, den Verarbeitungsschritten hinsichtlich Immobilisierung, Visualisierung und Archivierung und dem Elektroolotting gestellt werden, gerecht. Für die Herstellung von lufteinschlußfreien (blasenfreien) Gelen ist das Benetzungsverhalten des Wirbelvliesstoffes von entscheidender Bedeutung. Es beruht auf dem strukturellen Aufbau des Vliesstoffes, insbesondere auf seiner geringen Dichte und der an der Vliesstoffoberfläche vorhandenen hohen Anzahl von freien, im Vliesstoff fest eingebundenen Faserenden, sowie darauf, daß die zur Verwirbelung eingesetzton, unter hohem Druck stehenden Wasserstrahlen de η Vliesstoff von allen Fremdbestandteilen, wie Präperationsmittel, Fett usw. sowie von losen Faserbruchstücken vollständig befreien. Der Vliesstoff ist schnittkantenfest.
Bei den mittels modifizierter Klapptechnik nach Radola hergestellten Gelen werden etwa vorhandene kleinere Luftblasen durch dieses Saugvermögen beim Schließen des Sandwiches eliminiert. Im einzelnen beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren folgende Teilschritte:
1. Das Aufziehen einer Deckfolie (Polyesterfolie, ΙΟΟμητι, unbehandelt) auf eine Trägerglasplatte.
2. Kantengenaues Auflegen des Wirbelvliesstoff ss aus Polyester auf die Deckfolio nach Pkt. 1.
3. Befestigen von Spacern auf den zwei gegenüberliegenden längeren Seiten des Wirbelvliesstoffes, wodurch die Gelschichtdicke bestimmt wird.
4. Aufziehen einer Deckfolie (Polyesterfolie, 100μηη, unbehandelt) auf eine Deckglasplatte. Im Falle einer SDS-Elektrophorese ist die Deckfolie mit Slotformern zu versehen.
5. Aufgießen der Gelbeschichtungslösung auf den nach Pkt. 3 vorbereiteten Wirbelvliesstoff. Die Gelbeschichtungslösung sollte etwa die dreifache Menge der theoretisch berechneten betragen.
6. Schließen der Sandwiches, wobei die mit der Deckfolie versehene Deckglasplatte (Pkt.4) langsam auf den nach Pkt. 5 vorbehandelten Wirbelvlie&r-toff abgesenkt wird, wodurch die Gelbeschichtungslösung zum anderen Ende hin keilförmig auseinandergedrückt wird.
7. Polymerisationsdauer: 1 Stunde.
8. Nach der Polymerisation liegt ein durch zwei Deckfolien geschütztes, tragerstabilisiertes Gel vor, das zur Elektrophorese und für anschließende Blottingverfahren einsetzbar ist.
Die wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in folgenden Punkten zu sehen:
Der erfindungsgemäß angewandte, hydrodynamisch verfestigte Wirbelvliesstoff ist ohne zusätzliche Vorbehandlung direkt für elektrophoretische Trennungen (IEF, SDS-Elektrophorese) und Blottingverfahren einsetzbar.
Die intensive Verbindung zwischen Gel und Wirbelvliesstoff ist bei den unterschiedlichsten Gelzusammensetzungen (C- und T-Werte) und während aller Teilverarbeitungsschritte gewährleistet.
Hinsichtlich der Restanfärbung, des Trennprozesses und Transfers verhält sich der Vliesstoff inert.
Mit dem Verfahren sind ultradünne Gele (0,1 bis 0,75mm) problemlos herstellbar.
Vliesstoffgestützte Gele sind während des gesamten Verarbeitungsprozesses sowie im trockenen Zustand form- und dimensionsstabil. Mittels Reflexionsmessung ist eine densitomotrische Auswertung möglich.
Die Erfindung soll durch nachstehende Ausführungsbeispiele näher erläutert werden:
Schichtdicke: 0,2 mm
Gellösung: 2,5 ml einer Acrylamidlösung (20,0g Acrylamid und
0,54 g N.N'-Methylenbisacrylamid in 100 ml H2O)
1,5 ml Glycerol (87%) 1,0mlServalytT4-9 1 ,Ornl einer Acriflavinlösung (10 mg Acriflavinhydrochlorid in 100 ml Wasser) 4,0 ml Wasser
Die Polymerisation der im Wasserstrahlvakuum entgasten Lösung erfolgt durch einstündiges Belichten (weißes Neonlicht). Nach dem Aufziehen der Deckfolie mit dem armierten Gel mit n-Nonan auf den Kühlbock der Elektrophoresekammer schließt sich die IEF unter Benutzung folgender Spannungsführung an:
| 200 V | 60 min einer Vorfokussierung |
| Probenapplikation (Testgemisch) | |
| 200 V | 60 min |
| Entfernen der Applikationsstreifchen | |
| 400 V | 30 min |
| 800 V | 30 min |
| 1200V | 60 min |
Anolyt: 0,73mol Phosphorsäure
Katholyt: 0,51 mol Ethylendiaminlösung Als Strombrücken dienen „Elektrophoresis strips" von PHARMACIA.
Fixierung: 30min mit Trichloressigsäure (20%)
Färbung: 30 min mit Serva Blau G 250(0,1%) in „Universalgemisch" (Wasser:Methanol:Eisessig wie 5:4:1)
Entfärbung: „Universalgemisch" bis zur Farblosigkeit des Untergrundes
Trocknung: Lufttrocknung der aufgehängten armierten Gele
Gel-Schichtdicke: 0,4 mm
Gellösung: 15 ml einer Acrylamidlösung (siehe IEF)
10 ml eines SDS-Puffers pH 8,8 (193,7g Tris, 60g Glycin, 4,0 g EDTA-Natrium und 4,0 g SDS in 800 ml Wasser lösen, pH-Wert auf 8,8 einstellen und auf 1000 ml auffüllen
8,4 ml Glycerol (87%) 100μΙ TEMED 100 μΙ Ammoniumpersulfatlösung (50,0 g/l)
Die Polymerisation erfolgt 30min bei Raumtemperatur und 30min bei etwa 5O0C.
Die Deckfolie ist mit Slotformer für die Probenapplikation versehen.
Elektrophoresepuffer: 100ml eines Stammpuffers (24g Tris, 115,2g Glycin, 2,0g EDTA-Natrium, 2,0g SDA und 0,5g Natriumazid in Wasser zu 1000 ml lösen) werden auf 800 ml verdünnt.
Nach Aufziehen der Deckfolie mit dem armierten Gel auf den Kühlbock der Elektrophoresekammer (n-Nonan als Kontaktflüssigkeit) erfolgt der Probenauftrag. Danach wird der elektrische Kontakt zwischen Puffer und Gel hergestellt. Nach einer 5minütigen Vorelektrophorese bei 100V wird die Spannung auf etwa 300 V erhöht. Wenn die Bromphenolblaubande 4cm zurückgelegt hat, wird die Elektrophorese abgebrochen.
Fixierung: 30 min in Trichloressigsäure (20%) Färbung: 60 min in einer 0,1%igen Servablaulösung in Universalgemisch (siehe IEF) Entfärbung: Mit Universalgemisch bis zur Farblosigkeit des Untergrundes. Zusatz von 2% Glycerol (87 %)
zum letzten Entfärbebad Trocknung: Lufttrocknung der aufgehängten armierten Gele
Ein Material gemäß StaritaGeribaldi (Elektrophoresis 2 [1988] 234-236) wird wie beschrieben mit Gel beschichtet und anschließend entsprechend Durchführungsvorschrift isoelektrisch fokussiert bzw. zum Erhalt des Pherogramms den beschriebenen Vorarbeitungsschritten unterworfen.
Boispiol 1 wird wiodorholt unter Verwendung des erfindungsgemäßen Vliesmaterials, wobei das Trägermaterial ein kalandrierter Wirbelvliesstoff aus Polyester (PE-F-bt-0,16tex, 38mm) mit einem Plächongowicht von 30g/m2 ist.
Ein Nylongewebe nach Kopacek (Biomedical Applications of Chromatography and Elektrophoresis, Zinkovy 1988) wird als Trägormatorial zur Durchführung oinor SDS-Trennung verwendet.
Beispiel 3 wird wiederholt unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vliesmaterials, wobei das Trägermaterial ein kalandrierter Wirbelvliesstoff aus Polyester (PE-F-bt-0,13tex, 38mm) mit einem Flächengewicht von 35g/m2 ist. Mit den Trägermaterialien der Beispiele 1-4 wurden folgende Ergebnisse erreicht:
elektroph. Trennung
Verarbeitung nach elektrophoret. Trennung
Blotting-transfer
Beispiel 2 Beispiel 3
keine Beanstandung
keine Beanstandung keine Beanstandung
keine Beanstandung
keine Dimensionsstabilität nach Färbe- und Entfärbebad
keine Beanstandung
partiell Gewebeaufiösung im Trichlor-
essigsäurebad starke Restanfärbung
keine Beanstandung
bei dimensionsstabilen armierten Gelen keine Beanstandung keine Beanstandung keine Beanstandung bei dimensionsstabilen armierten Gelen keine Beanstandung keine Beanstandung
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Vliesstoff in der Anwendbarkeit den Materialien des Standes der Technik deutlich überlegen ist.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung trägergestützter elektrophoretischer Gele auf Basis Polyacrylamid und/ oder Agarose für elektrophoretische Trennprozesse oder Transfertechniken durch Auftragen von Trennmedium auf ein Vlies, gekennzeichnet dadurch, daß man ultradünne Gele auf bindemittelfreiem, durch hydrodynamische Faserstoffverwirbelung verfestigtem und kalandriertem Polyestervliesstoff erzeugt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man für die hydrodynamische Faserstoffverwirbelung Polyesterfasern mit einem Durchmesser von 10 bis 18μηι verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Gele einer Schichtdicke von 0,1 bis 0,75 mm auf den Polyestervliesstoff aufbringt.
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| DD32188688A DD277126A1 (de) | 1988-11-17 | 1988-11-17 | Verfahren zur herstellung traegergestuetzter elektrophoretischer gele |
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