DD279262B5 - Messanordnung zur Sofortbestimmung von Gasen und/oder fluessigen Substanzen, die fuer ihren Nachweis Luftsauerstoff oder Gase benoetigen, mittels Biosensoren - Google Patents
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Description
Hierzu 1 Seite Zeichnung
Die Erfindung ist anwendbar im Umweltschutz, in der medizinischen Laboratoriumsdiagnostik, der Toxikologie, der Lebensmittelindustrie und Biotechnologie. Sie ist insbesondere geeignet zur Bestimmung des Biochemischen Sauerstoffverbrauchs (BSB) und von Substanzen, für deren Nachweis Sauerstoff benötigt wird einschließlich der Bestimmung von Enzymaktivitäten sowie zur Bestimmung von gasförmigen bzw. flüchtigen Substanzen und toxischen Stoffen in der Luft, Aerosolen und wäßrigen Lösungen.
Zur Bestimmung von Gasen (z. B. NH3) sowie von flüchtigen Substanzen (z. B. Alkohol) werden Biosensoren eingesetzt, die an Stelle einer Dialysemembran eine gasdurchlässige Membran aufweisen, so daß nur die gasförmigen Bestandteile der Meßflüssigkeit in die biokatalytische Schicht des Biosensors gelangen können (Karube,! and Suzuki, S. Joh. Select. Elec. Rev. 6, 15-59 [1984); Karube et al. Enzyme Engineering (Ed. Weertall, M. M. and Royer, G. P.) 5,563 (1980); JP 54128393). Darüber hinaus sind Meßsysieme für Biosensoren auf der Basis amperometrischer Sauerstoffelektroden bekannt, die nach dem Durchflußprinzip arbeiten, z. B. zur Bestimmung des des Biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB) (Hikuma et al. Europ. J. Appl. Microbiol. 8,289 [1979); GP 1586291). Dieses Meßsystem ist dadurch charakterisiert, daß ein Luft-Flüssigkeits-Strom am Sensor vorbeigeführt wird, der etwa die 100-200fache Luftmenge im Vergelich zur Flüssigkeit enthält. Mit dieser bekannten Anordnung sind keine Meßzeiten unter 8-18min erreichbar und keine schnellen (kinetischen) Messungen möglich. Deshalb ist diese Apparatur nur für relativ langsame Endpunktbestimmungen einsetzbar. Die Vorteile der im DD-Patent 253045 A1 beschriebenen Sofortbestimmung können nicht genutzt werden. Es sind keine Gase meßbar, und außerdem sind die Messungen mit Fehlern behaftet infolge großer Schwankungen der Null-Linie des Grundstrome.s.
Ziel der Erfindung ist es, ein kontinuierlich arbeitendes (Durchfluß-) Biosensorsystem zu entwickeln, das eine Sofortbestimmung sowohl von Gasen bzw. der Beeinflussung von Reaktionen durch Gase als auch die Bestimmung von Substanzen, für deren Nachweis Sauerstoff benötigt wird, wie z. B. BSB, nach dem kinetischen Meßprinzip ermöglicht.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mittels einer Geräteanordnung im Durchflußsystem Gase bzw. flüchtige Substanzen sowie die Beeinflussung von Enzymen durch Gase und von Substanzen, die für ihren Nachweis Sauerstoff benötigen, sofort zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine eine Mischkammer (7) mit einer Substanzpumpe (3) und einer Gaspumpe (4) gekoppelt ist und der Mischkammer (7) ein temperiertes Austauscherrohr (8) mit hydrophober Innenfläche nachgeschaltet ist. Das Austauscherrohr (8) mündet unmittelbar in eine Meßzelle (10), die den Biosensor (11) enthält. Die Mischkammer (7) in Verbindung mit dem Austauschorrohr (8) dient dazu, eine gleichmäßige und konstante Luft-Flüssigkeits-Suspension aus einem Teil Flüssigkeit und etwa hundert bis fünfhundert Teilen Luft bzw. Gas zu erzeugen und zentral auf den Biosensor (11) in der Meßzelie (10) zu sprühen. Dadurch wird eine vollständige Sättigung der Probenflüssigkeit mit Luft oder Gas erreicht. Erfindungsgemäß weist das Austauscherrohr (8) eine Länge von < 1000 mm und einen Innendurchmesser von < 1 mm auf und ist mit einem Durchmesser von < 50 mm gewendelt. Mit dieser Art der Dimensionierung des Austauscherrohres (8) wird gewährleistet, daß bei einer hohen Fließgeschwindigkeit ein optimaler Gas-Flüssigkeitsaustausch erreicht wird. Gleichzeitig ermöglicht die hydrophobe Innenfläche und die wendeiförmige Ausführung des Austauscherrohres (8) einen verschleppungsarmen Transport der Proben und eine optimale Reinigung von der Probelösung. Vorzugsweise wird eine hydrophobe Innenfläche durch Einsatz von Polytetrafluorethylen erreicht.
Eine optimale Temperierung des Austauscherrohres (8) und der Meßzelle (10) wird ermöglicht durch Umwickeln des Austauscherrohrs (8) mit einer Heizwendel bei gleichzeitigem Umwickeln der Msßzelle (10). Zwei Temperaturfühler (9) an der Heizwendel sorgen für eine konstante Temperierung des Flüssigkoits-Gas-Gemisches.
Ein konstantes Flüssigkeits-Gas-Verhältnis hoher Präzision wird durch ein zwangsgekoppeltes System (6) von Substanz- (3) und Gaspumpe (4) realisiert.
Um höher konzentrierte Proben vorverdünnen zu können, ist der Mischkammer (7) eine im Mischverhältnis variable Verdünriungsp'jinpe (5) zugeordnet.
L1:- '/iößzelle (10) enthält je nach zu bestimmender Substanz einen Enzym- oder mikrubiellen Sensor. Mit der erfindungsgemäßen Meßanordnung werden Ansprechzeiten von 15-3Os bsi einer hohen Nullstabilität des Grundstromes der Elektrode und einer hohen Präzision sowie hoher Langzeitstabilität erreicht, was über eine Auswerteeinheit (12) erfaßt wird.
Die Erfindung wird nachfolgend an Beispielsen näher erläutert. Die zugehörige Abbildung 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen Meßanordnung.
Zur BSB-Bestimmung wird einein der Abbildung wiedergegebene Apparatur benutzt, wobei ein Biosensor mit Ti ichosporon cutaneum eingesetzt wird. Durch die Meßzelle (10) werden pro min etwa 1,5ml 0,1 mol Phosphatpuffer mit der Substanzpumpe (3) und 250ml Luft mit der Gaspumpe (4) gepumpt, wobei das L.uft-Flüssigkeits-Gemisch nach Einsprühen der Flüssigkeit in den Luftstrom in der Mischkammer (7) durch das Austauscherrohr (8) mit einem Durchmesser von 0,5mm und einer Länge von 500 mm, das mit einer Heizwendel umwickelt und darüber hinaus um die Meßzelle (10) gewickelt ist, zentral auf die Membran des mikiobiologischen Sensors (11) gesprüht wird. Die Messung wird bei 300C durchgeführt. Zur Dosierung der Proben wird der Pufferstrom durch den Probestrom mittels Umschalten von Ventil 1(1) ersetzt. Als Meßsignal dient das Maximum der Stromänderung (kinetische Messung), welches einer Auswerteeinheit (12) zugeführt wird, wobei die Probendosierung nach Erreichen des Maximums der Stromänderung beendet wird. Die Probedosierung und die Messung dauern durchschnittlich 15 bis 30s. Nach Erreichen des Grundstromes wird die nächste Probe automatisch dosiert. Der Meßbereich (Linearitätsbereich) beträgt, nach Kalibrierung mit Glucose-Glutaminsäure-Standardlösung (150mg/l Glucose und 150 mg/l Glutaminsäure entsprechen 220 mg/1 BSB) 1 bis 100mg/i BSB. Bei 22 mg/l BSB wurde ein Variationskoeffizient von 3% ermittelt. Die Untersuchung eines peptidhaltigen Modellabwassers erbrachte bei einer Verdünnung von 1:25 einen Meßwert von 75mg/l (= 1500mg/l der Probe) im Vergleich zum BSB5 mit 1800.
Die BSB-Bestimmung wird wie im Beispiel 1 beschrieben mit einer Durchflußapparatur, die zusätzlich eine Pumpe (Verdünnungspumpe[5l) zum Verdünnen dyr Abwasserprobe enthält. Diese Verdünnungspumpe (5) erlaubt eine Verdünnung der Abwasserprobe im Verhältnis 1:25, so daß eine Vorve^dünnung der Probe entfällt. Die Beispiel im 1 eingesetzte Probe erbrachte direkt: einen BSB-Wert von 1550mg/l.
Zur Bestimmung von Ethanol wird ein Trichosporon cutaneum-Sensor eingesetzt. Mittels Gaspumpe (4) über Ventil 2 (2) wird ein Luft- bzw. als Probe ein Luft-Ethanolgemisch mit 250 ml/min angesaugt und mit 1,5ml Puffer, der mit der Substanzpumpe (3) gefördert wird in die Mischkammer (7) gebracht und durch das Austauscherrohr (8) gemischt und de. Meßzello (10) mit dem Biosensor (11) und einer Referenzsauetstoffelektrode (13) zugeführt. Das als Probe mit Luft angesaugte dampfförmige Ethanol
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bewirkt auch eine Verminderung der Sauerstoffmenge des angesaugten Gasgemisches, die mit der Referenzelektrode erfaßt wird. Eine Ethanolprobe führt zu einer Reduzierung des Stromes der Referenzelektrode und des Biosensors, gemessen als Stromänderung promin. Die gemessenen Signale, die einer Auswerteeinheit (12) zugeführt werden, betragen bei dem Biosensor 250nA/min und bei der Referenzeleklrode 50nA/min. Die Differenz von 200nA/min representiert den Ethanolwert. Eine Kalibrierung des Biosensors mit definierten Ethanollösungen wird mittels Probestrom über die Substrapumpe (3) vorgenommen. Der ermittelte Ethanolwert der gasförmigen Probe entspricht 1 mmol Ethanol.
Zur Bestimmung von Glukose wird ein Biosensor mit Glukoseoxydase eingesetzt. Die Meßbedingungen und die Meßprozedur entsprechendem Beispiel 1. Der Variationskoeffizient bei 12mMol Glukose wurde zu 2% ermittelt.
Die in der Abbildung dargestellte Apparatur wird in Verbindung mit einem L-Glutamatsensor auf der Basis von Polyurethan immobilisierter Glutamatoxydase und einer Sauerstoffelektrode eingesetzt. Durch die Meßzelle (10) werden pro min 0,7 ml 0,1 mol Phosphatpuffer nach Sörensen pH7,2 und 250ml Luft gepumpt, wobei das Luft-Flüssigkeits-Gemisch durch das Austauscherroltr (8) mit einem Durchmesser von 0,5mm und einer Länge von 500mm, das wie im Beispiel 1 beschrieben temperiert wird. Zur Dosierung der Proben wird der Pufferstrom für 10-15s durch den Probestrom mittels umschalten von Ventil 1 (1) ersetzt. Bei Erreichen der Meßkammer wird das im Luft-Flüssigkeits-Gomisch enthaltene Glutamat, das zu einer Stromänderung der Enzymelektrode führt, nach Kalibrierung mit Glutamat bekannter Konzentration, unabhängig vom Sauerstoffgehalt der Probe bestimmt.
Das im Beispiel 5 beschriebene Meßprinzip mit der im Beispiel 1 dargestellten Apparatur dient als Meßsystem zur Bestimmung von Transaminasen. Temperierte vorinkubierte Lösungen enthalten 1OmMoI alpha-Ketoglutarat und 24OmMoI L-Alanin bzw. 12OmMoI L-Aspartat bei pH7,4 bzw. 7,8 zur Bestimmung von Alanin- bzw. Aspartataminotransferase in Serumproben. Die Vorinkubationslösungen werden je 10:1 mit Serumproben versetzt. Nach definierten Zeitintervallen wird die Vorinkubationslösung dem Probestrom der Durchflußmeßanordnung zugeführt. Das in der Vorinkubation gebildete Glutamat wird ohne Störung durch L-Alanin und L-Aspartat bestimmt. Über eine Eichkurve mit Glutamat und unter Berücksichtigung der Zeitdifferenz der Probenahme aus der Vorinkubationslösung ist die Aktivität der Transaminasen bestimmbar.
Durch Nutzung eines Biosensors auf der Basis immobilisierter Cholinesterase werden mit der in der Abbildung beschriebenen Apparatur toxische Stoffe, wie Organophosphate, Carbamate als auch reversible Inhibitoren o.g. Enzyme nachgewiesen bzw. bestimmt. Hierzu wird entsprechend Anwendungsbeispiel 3 verfahren, indem Luft, Aerosole bzw. wäßrige Lösungen in definierter Menge über die Gaspumpe (4) zur Pufferlösung eingesaugt wird. Über die Substanzpumpe (3) wird in definierten Zoitabständen Substrat (Thiocholinester) gesaugt. Bei der Substratzugabe entsieht ein Signal, das bei Vorhandensein von Inhibitoren in Abhängigkeit von ihrer Konzentration und Einwirkungszeit abnimmt. Die Kalibrierung der Apparatur erfolgt in definierten Zeitabständen mit einer Bezugslösung aus Butyrylthiocholinimid. Bei dem Anwendungsbeispiel wird für die Bestimmung kein Sauerstoff benötigt, die Luft dient nur als Träger der zu vermessenden Substanzen.
Zur gleichzeitigen Bestimmung von Glukose und Glutaminsäure in einer Probe werden zwei Meßzellen in Reihe geschaltet, wobei die eine Meßzelle einen Biosensor mit Glikoseoxydase zur Bestimmung der Glukose und die andere Meßzelle einen Glutamatoxydase-Biosensor zur Bestimmung der Glutaminsäure enthalten. Die Meßbedingungen entsprechen den in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen.
Claims (13)
1. Meßanordnung zur Sofortbestimmung von Gasen, leicht flüchtigen und/oder flüssigen Substanzen, die für ihren Nachweis Luftsauerstoff oder Gas benötigen, mittels Biosensoren in einem Durchflußsystem, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischkammer (V) mit einer Substarizpumpe (3) und einer Gaspumpe (4) gekoppelt ist, der Mischkammer (7) ein mit Temperaturfühler (9) versehenes temperiertes gewendeltes Austauscherrohr (8) mit hydrophober Innenfläche nachgeschaltet ist, welches in eine Meßzelle (10), die den Biosensor (11) enthält, mündet.
2. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherrohr (8) eine Länge von < 1000mm, einen Innendurchmesser <1 mm hat und mit einem Durchmesser von <50mm gewendelt ist.
3. Meßanordnung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherrohr (8) um die Meßzelle (10) gewickelt ist.
4. Meßanordnung nach Anspruch 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Austauscherrohr (8) aus Polytetrafluoräthylen besteht.
5. Meßanordnung nach Anspruch 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß um das Austauscherrohr (8) ein Heizwendel gewickelt ist.
6. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzpumpe (3) und die Gaspumpe (4) eine Zwangskopplung (6) aufweisen.
7. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischkammer (7) zusätzlich eine Verdünnungspumpe (5) zugeordnet ist.
8. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekonnzeichnet, daß die Meßzelle (10) neben dem Biosensor (11) eine Sauerstoffreferenzelektrode (13) enthält.
9. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor ein Enzymsensor ist.
10. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor ein mikrobiologischer Sensor ist.
11. ivießanordnung nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßanordnung zur Bestimmung des Biochemischen Sauerstoffverbrauchs eingesetzt wird.
12. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung toxischer Substanzen in Luft, Aerosolen und wäßrigen Lösungen Luft als Trägermedium dient in Verbindung mit einem Biosensor auf der Basis immobilisierter Cnolinesterase und einer Thioverbindung anzeigenden Elektrode.
13. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Meßzellen mit jeweils verschiedenen Biosensoren zur Bestimmung verschiedener Substrate in einer Probe in Reihe angeordnet sind.
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