DD279267A1 - Verfahren zur herstellung mikrobieller lipase - Google Patents
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Landscapes
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Das Verfahren betrifft die mikrobielle Herstellung von Lipase mittels Hefen. Durch die Verwendung des neuen Hefestammes Yarrowia lipolytica IMET 43896 in einem aeroben Kultivierungsverfahren mit kostenguenstigen und verfuegbaren Neutralfetten als eine oder alleinige C-Quelle kann eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute an extrazellulaerer Lipase realisiert werden.
Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Lipase durch Kultivierung eines neuen Hefestammes. Sie kann in entsprechenden mikrowellen Enzymsyntheseanlagen Verwendung finden.
Zur Herstellung von Lipasen mittels Mikroorganismen sind verschiedene Verfahren bakannt, in welchen Bakterien, Hefen oder Pilze als mikrobielle Produzenten auf verschiedenen Nährmedien, wie Maisquellwasser, Molke, Bouillon u. ä. gezüchtet werden.
Aber auch andere kohlehydrathaltige Medien, die Glucose, Saccarose, Mannitol, Sorbitol, Dextrin, Cellulose oder Stärke enthalten, werden verwendet. Darüber hinaus werden wasserlösliche Fettsäureester als C-Quelle in der Fermentation eingesetzt.
Der Nachteil der bisherigen Verfahren besteht im allgemeinen darin, daß bei Verwendung von Pilzen, aufgrund ihrer geringen Wachstums- und Enzymbildungsgeschwindigkeiten, sehr lange Fermentationszeiten erforderlich sind. So liegt die Kultivierungsdauer bei Verwendung von Rhizopus chinensis Hl-S zwischen 3 und 7 Tagen (US 4665029). Die Enzymbildungsgeschwindigkeit beträgt dabei 4χ 102EE/lxh. Auf der anderen Seite haben Bakterien, die meist mit relativ guter Geschwindigkeit wachsen, den Nachteil, daß sie nur geringe Volumenaktivitäten an extracellular Lipase ergeben.
Beispielsweise wird gem. EP 204204 bei der Kultivierung von Pseudomonas fragi 22.39 B bei einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden nur eine geringe Volumenaktivität von 2 Enzymeinheiten pro ml erreicht (eine Enzymeinheit EE entspricht der Menge Fettsäure in umol, die in 1 Minute aus einer Triacylglycerol-Emulsion freigesetzt wird). Die entsprechende Enzymbildungsgeschwindigkeit betrug in diesem Fall 0,4χ 102EE/lxh.
Mit verschiedenen Stämmen von Staphylococcus capitis werden bei Fermentationszeiten von 24 bis 72 Stunden maximale Volumenaktivitäten von 6-12EE pro ml erreicht (EP 187869).
Weiterhin ist bekannt, daß der Bakterienstamm Acinetobacter calcoaceticus unter Verwendung wasserlöslicher Fettsäureester (Tween) als teurer C-Quelle Lipase produziert (DD 249712). Die dabei erreichte Enzymbildungsgeschwindigkeit lag bei nur 2x 102EE/lxh.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, Lipase in einem mikrobiellen Verfahren mit hohen Produktivitäten auf der Grundlage verfügbarer Rohstoffe zu produzieren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Hefestamm zu selektiern und einzusetzen, der eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute an extrazellulärer Lipase lealisiert und dabei nicht die Verwendung von wasserlöslichen Fettsäureestern als C-Substrat erfordert.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Kultivierung des neuen Hefestammes Yarrowia lipolytica IMET 43896 im pH-Bereich von 3-7 und im Temperaturbereich von 15-4O0C unter Verwendung von Neutralfetten als eine oder alleinige C-Quelle gelöst.
Vorzugsweise ist dabei ein pH-Wert von 4-5 und ein Temperaturbereich von 20-3O0C einzustellen.
Die Kultivierung erfolgt dabei diskontinuierlich bei einer Kultivierungsdauer von 6 bis 18 Stunden.
Als Neutralfette können Glycerolester, Fette und Öle, vorzugsweise Rapsöl, sowie Gemische derselben eingesetzt werden, wobei ihr Anteil am Kultivierungsmedium 0,1 bis 10Ma.-% beträgt. Sie können als alleinige C-Quelle dienen, andererseits aber auch in Kombination mit kohlehydrdthaltigen oder n-alkanhaltigen Substraten verwendet werden.
Unter den erfindungsgemäßen Kultivierungsbedingungen werden Enzymbildungsgeschwindigkeiten über 105 EE/I χ herreicht, was dem 5 bis 250fachen der gemäß Stand der Technik erraichten Leistung entspricht.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene Lipase ist wie folgt zu charakterisieren:
Die Lipase besitzt ein Temperaturoptimum bei 40°C und ist über einen Beroich von 15 bis GO°C aktiv.
Die Lipase ist im pH-Bereich von 3 bis 11 aktiv, wobei das pH-Optimum im schwach alkalischen Bereich liegt. Bei einer Temperatur von 5°C ist das Enzym lagerstabil und weist im Zeitraum bis 6 Monate keinen Aktivitätsverlust auf.
Die neue Lipase ist in der Lage, natürliche und synthetische Triglycerole, Fette und Öle (Triolein 100% bei T = 37°C) zu hydrolysieren:
Triolein 100
Tributyrin 114
Olivenöl 125
Rapsöl 104
Leinöl 85
Rindertalg 80
Rinderfußöl 108
Die Lipase vermag weiterhin. Ester wie ρ Nitrophenylacetat und -plamital zu hydrolisieren.
Der neue Hefestamm Yarrowia lipolytica IMET 43869 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR hinterlegt.
DeV neue Stamm ist wie folgt zu charakterisieren:
Kreideweiß, stark gefaltete Oberfläche
- Zellen überwiegend sehr langgestreckt, wenig ovale Zellen
- nach 3 Tagen Hautbildung (Inseln! und Sediment im flüssigen Medium
- Blastosporen +
- Pseudomycel +
Wachstum bei:
2O0C mittleres Wachstum auf Agar 3O0C gutes Wachstum auf Agar 370C mittleres Wachstum auf Agar Assimilation von:
Erythritol, D-Mannitol, D-Galactosidase, Glycerin, L-Sorbitose, Succinat, D-^'ücitol, D-Glucose, Ethanol, Lactat, Citrat, D-Ribose keine Assimilation von:
Maltose, Cellobiose, Inositol, Lactose, Saccharose, Melibiose, Raffinoso, D-Xylose, Stärke, Salicin, D-Arabinose, Melizitose, Inulin, L-Arabinose, Trehalose, L-Rhamnose, Nitrat Die Erfindung wird durch folgendes Beispiel näher erläutert:
Ein flüssiges Nährmedium (pH = 5), das 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Rapsöl und 0,03% Tween 80 enthält, wird mit dem Hefestamm IMET 432869 beimpft und 6 Stunden bei 250C im Schüttelkolben kultiviert. 3,51 Nährmedium, das folgende Zusammensetzung pro Liter aufweist:
| NH4CI | 3,8 g |
| CaCI2X 6H2O | 0,22 g |
| KH2PO4 | 0,68 g |
| K2HPO4 | 0,87 g |
| MgSO4 χ 7 H2O | 1,78 g |
| FeSO4 χ 7 H2O | 0,12 g |
| ZnSO4 x 7 H2O | 11 mg |
| MnSO4 x 4 H2O | 20 mg |
| CuSO4 χ 5 H2O | 19mg |
| Na2MoO4 χ 2 H2O | 6 mg |
| sowie 50 ml Rapsöl |
werden mit 0,5i Vorkultur in einem 12-1 Rührfermentor beimpft. Die Temperatur beträgt 250C und der pH-Wert 5,0. Als Stickstoffqi'elle wird eine 5%ige Ammoniaklösung verwendet, die gleichzeitig zur pH-Regelung dient.
Nach einer Zeitdauer von 10 Stunden wird der Fermontorinhalt zentrifugiert und die zeilfreie Rohenzymlösung steht für weitere Untersuchungen und Aufarbeitungen zur Verfügung.
Die extrazelluläre Volumenaktivität beträgt 105EE/ml.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung mikrobieller Lipase mittels Hefen, gekennzeichnet durch
- aerobe Kultivierung des neuen Hefestammes Yarrowia lipolytica IMET 43896
- im pH-Bereich von 3-7
- im Temperaturbereich von 15-400C
und
und
- Verwendung von Neutralfetten als eine oder alleinige C-Quelle
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen pH-Bereich von 4-5.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Temperaturbereich von 20-300C.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Glycerolester, Fetten oder Ölen, vorzugsweise Rapsöl, sowie Gemischen derselben im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10Ma.-% als C-Quelle.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, gekennzeichnet durch die Verwendung von Neutralfetten in Kombination mit kohlenhydrathaltigen oder n-alkanhaltigen Substraten als C-Quelle.
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| DD32482489A DD279267A1 (de) | 1989-01-05 | 1989-01-05 | Verfahren zur herstellung mikrobieller lipase |
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| WO1996038389A1 (de) * | 1995-05-29 | 1996-12-05 | Biorem Ag | Verwendung der hefe yarrowia lipolytica zur gewerblichen biodegradation von ölen und fetten in abwässern, sowie verfahren zur biodegradation unter verwendung dieser hefe |
| WO2006055322A2 (en) | 2004-11-04 | 2006-05-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | High arachidonic acid producing strains of yarrowia lipolytica |
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-
1989
- 1989-01-05 DD DD32482489A patent/DD279267A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1996038389A1 (de) * | 1995-05-29 | 1996-12-05 | Biorem Ag | Verwendung der hefe yarrowia lipolytica zur gewerblichen biodegradation von ölen und fetten in abwässern, sowie verfahren zur biodegradation unter verwendung dieser hefe |
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| EP2392664A2 (de) | 2003-05-07 | 2011-12-07 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in ölhaltigen Hefen |
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| WO2006055322A2 (en) | 2004-11-04 | 2006-05-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | High arachidonic acid producing strains of yarrowia lipolytica |
| EP2458000A1 (de) | 2004-11-04 | 2012-05-30 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Grosse Mengen an Arachidonsäure produzierende Yarrowia lipolytica Stämme |
| EP2649887A2 (de) | 2004-11-04 | 2013-10-16 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Stämme von Yarrowia lipolytica zur Herstellung hochkonzentrierter Eicosapentaensäure |
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