DD279506A1

DD279506A1 - Vorrichtung und verfahren zur sequenzanalyse von dna durch chemische degradation an fester phase

Info

Publication number: DD279506A1
Application number: DD32514089A
Authority: DD
Inventors: Andre Rosenthal; Heide-Renate Billwitz; Horst Kagelmaker; Monika Graetschus; Eckart Erzgraeber; Gerhard Behrendt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1990-06-06

Abstract

Die erfindungsgemaesse Vorrichtung zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase besteht aus Probenhaltern, Traegern fuer Reaktionsgefaesse und ggf. einer Stanze. Der zentrale Teil der Einrichtung ist der Probenhalter - eine quader- oder wuerfelfoermige Grundplatte mit duennen Stiften, auf die ggf. mit dem Stanzer durch Stechen oder durch Klemmen, Kleben und Passen vor dem Verfahrensablauf jeweils kleine geformte Traegersegmente angebracht werden. Die Stifte des Probenhalters koennen auch mit ungeformtem organischen Traegermaterial beschichtet werden. Zur Durchfuehrung der wesentlichen Operationen des Verfahrens zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase wie Immobilisierung, Waschen, DNA-Modifikation, Waschen und Piperidin-Reaktion sowie chemische Elution taucht man die Probenhalter in die jeweiligen Loesungen (markierte DNA-Fragmente, Waschloesungen, DNA-Modifikationsreagenzien, Piperidinloesungen) ein und belaesst sie dort fuer die jeweilig notwendige Zeit. Durch die Verwendung separierter Traegersegmente an den Probenhaltern werden alle Sortierungs- und Pipettierungsschritte sowie andere manuelle Operationen ueberfluessig. Dadurch wird eine einfache manuelle und automatisierte Durchfuehrung des Verfahrens moeglich. Die Erfindung wird in der Molekularbiologie, molekularen Genetik und Gentechnik verwendet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase, Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Molekularbiologie, Gentechnik, molekulare Genetik und betrifft dort die Sequenzanalyse von DNA sowie Oligodesoxyribonucleotiden nach chemischer Synthese durch chemische Degradation an fester Phase.

Charakteristik dos bekannten Standes der Technik

Ein von ROSENTHAL und HUNGER entwickeltes Festphasensequenzierungsverfahren zur chemischen Degradation von DNA an einem geeigneten Flächenträger umfaßt 7 Operationen:

1. Immobilisierung der Nucleinsäuren

2. Waschen des Trägers

3. Modifikationsreaktion

4. Waschen des Trägers

5. Sortieren der Trägersegmente

6. Piperidin-Reaktion, chemische Elution der Nucleinsäuren vom Träger und Abtrennen der Eluate

7. Lyophilisierung der Eluate

und erlaubt, bei manuellem Betrieb 10 verschiedene DNA-Fragmente in etwa 3h basenspezifisch abzubauen (A. Rosenthal und H.-D. Hunger, DD-WP 228906; A. Rosenthal et al. Nucleic Acids Res. 13 [1985| 1173-1184, A. Rosenthal et al.. Methods in Enzymol.

155(1987)301-331).

Um mehr als 10 DNA-Fragmente durchzusetzen, muß man erheblich mehr Zeit für die Immobilisierung (Operation Hund Sortierung der Fragmente (Operation 5) aufwenden. Auch die Entfernung des Trägers aus der Piperidinlösung im Anschluß an die chemische Elution (Operation 7) nimmt bei größeren Probenzahlen mehr Zeit in Anspruch.

Der routinemäßige Durchsatz von 10 bis etwa 100 Proben bei Einhaltung einer Zykluszeit von 2 bis 3 Stunden ist nur durch die Verwendung einer Vorrichtung zur mechanisierten manuellen Durchführung aller Operationen des Festphasensequenzierungsverfahren möglich. Eine solche Vorrichtung wurde durch ROSENTHAL et al. kürzlich beschrieben (A.Ros. nthal, H.-D.Hu.nger, H.Kagelmaker, M.Gätschus DD-WP 237329; A.Rosenthal et al., Methods in Enzymol. 155 (1987)

Die Schritte der Immobilisierung der Nucleinsäuren (Operation 1) und des Sortierens der Trägersegmente vor der Durchführung der Piperidinreaktion durch Stanzen (Operation 5) mit der bekannten Vorrichtung verlangen das exakte, geometrisch genaue Einlegen von geeigneten Flächenträgern in spezielle Halterungen bzw. in eine Stanze, die gegenwärtig manuell ausgeführt werden müssen. In Hinblick auf einen automatischen Setrieb der Vorrichtung mit Hilfe eines kommerziellen Industrie- oder Laborroboters müssen diese Schritte jedoch eliminiert werden, da sie automatisch nicht oder nur mit einem ökonomisch nicht vertretbaren Aufwand realisiert werden können. Auch das Trennen der Eluate von den Trägersegmenten in Operation 6 erfordert zusätzliche Pipettierungsschritte und Reaktionsgefäße, auf die beim potentiellen automatischen Betrieb möglichst verzichtet werden sollte. Des weiteren ist für die Durchführung des Schritts der Immobilisierung die Verwendung eines Probendosierers für das gleichzeitige Beimpfen von Trägern mit vielen verschiedenen Proben erforderlich. Der Probendosierer, als Multikanalpipette realisiert, stellt ein relativ teures Einzelgerät in der Gesamtvorrichtung dar.

Insgesamt ist die bekannte Vorrichtung in Hinblick auf eine automatische Durchführung des Festphasensequenzierungsverfahrens mit Hilfe kommerzieller Industrie- oder Laborroboter technologisch ungünstig. Auch die manuelle Durchführung des Verfahrens mit Hilfe der bekannten Vorrichtung erfordert noch zu viele kompliziurte Operationen.

Ziel der Erfinduiuj

Ziel der Erfindung ist es, den verfahrenstechnischen bzw. technologischen Ablauf des Verfahrens zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase durch eine Vorrichtung so zu verändern und zu vereinfachen, daß mit Hilfe der Vorrichtung die manuelle Durchführung des Festphasenabbaus bzw. in Kombination mit einem kommerzieli erhältlichen Industrie- oder Laborroboter die automatische Durchführung des Verfahrens leicht und ökonomisch möglich wird und eine große Anzahl von 'erschiedenen DNA-Fragmenten verwechslungsfrei sequenziert werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu entwickeln, mit deren Hilfe eine gleichzeitige Immobilisierung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten möglich ist und eine spezifische Folge von zwei physikalischen Operationen (Waschschritten) und zwei chemischen Weiterbehandlungen (DNA-Modifikation, Piperidin-Reaktion und chemische Elution) sowie am Endo der Prozedur eine Nachbehandlung der eluierten Proben durch Vakuumzentrifugation durchgeführt werden kann.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit einer Vorrichtung, die erfindungsgemäß Probenhalter, Träger für Reaktionsgefäße und ggf. einen Stanzer aufweist.

Die Probenhalter stellen den zentralen Teil der Erfindung dar. Sie bestehan aus ^;eweils einer quader- oder würfelförmigen Grundplatte, in die entsprechend der Anzahl η der zu sequenzierenden Proben jeweils η Stahl- oder Plastestifte eingelassen sind. Der Abstand der Stifte wird entsprechend dem Muster der Reaktionsgefäße gewählt, die in die Träger eingelassen oder eingearbeitet sind. Die Stifte der Probenhalter sind so lang, daß sie bequem in die Reaktionsgefäße passen. Die Stifte der Probenhalter sind mechanisch so gearbeitet, daß sie leicht diskrete, geformte Trägersegmente aufnehmen können, die für die Immobilisierung der DNA-Proben dienen. Die Trägersegmente werden an den Stiften der Probenhalter durch z. B. Stechen, Klemmen, Stecken oder Passen befestigt. Die Beladung der Stifte der Probenhalter kann auch durch Beschichtung mit einem

geeigneten organischen Trägermaterial erfolgen, wobei die Probenhalterstifte in eine entsprechende Suspension, Dispersion oder Lösung ungeformter organischer Polymere bzw. ihrer monomeren Komponenten ggf. mit Lösungsmittelzusätzen eingetaucht, ggf. eine Reaktion durchgeführt und danach getrocknet werden. Eine Orientierung an der Grundplatte gibt die Orientierung des Probenhalters in bezug auf die Träger für die Reaktionsgefäße an und bewirkt, daß Vertauschungen von Proben ausgeschlossen werden.

Die Beladung der Stifte der Probenhalter mit den Trägersegmenten kann mit veiscniedenen Mitteln vorgenommen werden, erfolgt aber grundsätzlich vor Beginn der chemischen Degradation an fester Phase. Im Falle einer Stechverbindung wird dazu erfindungsgsmäß eine Stanze verwendet. Sie besteht aus einer Platte mit eingesetzten Stanzstiften, einer Schnittplatte und einem Flächenträgerhalter und zoichnet sich dadurch aus, daß die Stanzstifte ein gleiches Verteilungsmuster wie die Stifte der Probenhalter, aber einen größeren Durchmesser aufweisen. Außerdem sind in die Stanzstifte Hohlräume eingearbeitet, in die die Probenhalterstifte aufgrund ihres nur geringfügig kleineren Durchmessers genau passen. Nach Einlegen eines geeigneten geformten Trägermaterial, z. B. eines Flächenträgers, in den Flächenträgerhalter der Stanze und Einpassen der Stifte eines Probenhalters in die Stanzstifte werden durch Stanzen Trägersegmente auf die Stifte des Probenhalters überführt. Die Träger für Reaktionsgefäße bestehen aus einem quader- oder würfelförmigen Körper, in den Reaktionsgefäße aus geeignetem Glas- oder Plastematerial eingelassen oder eingearbeitet sind. Als Reaktionsgefäße verwendet man standardisierte oder speziell tief gezogene Mikrotiterplatten sowie einzelne Gefäße mit einem Volumen zwischen 5 und 2 000 μΙ, die in die Träger eingearbeitet bzw. eingelassen werden. Einzelgefäße werden mit Hilfe eines gemeinsamen Rahmens manipuliert. Alle Reaktionsgefäße - Mikrotiterplatten oder einzelne Gefäße mit Rahmen - müssen leicht auswechselbar sein. Der Träger weist außerdem eine Markierung auf, um eindeutig mit dem Probenhalter kombiniert werden zu können. Während ein Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen zur Bevorratung der markierten DNA-Fragmente dient, braucht man die anderen Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen zur Durchführung der Piperidin-Reaktion und der gleichzeitig ablaufenden chemischen Elution. Dazu wird der Probenhalter mit den an den Trägersegmenten fixierten DNA-Proben in die Reaktionsgefäße des Trägers eingeführt. Man führt die Strangbruchreaktion und gleichzeitig die chemische Elution aus, nachdem man die entsprechende Piperidinlösung hinzugefügt und die Lösung auf 90⁰C erhitzt hat. Die Reaktionsgefäße können dabei ggf. mit entsprechenden Deckeln und Dichtungen verschlossen werden. Die Piperidinreaktion kann aber auch mit unverschlossenen Trägern durchgeführt werden.

Das Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase erfolgt mit einer Vorrichtung, zu deren Grundausstattung zweckmäßigerweise vier Probenhalter, fünf Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen und wahlweise Deckel mit entsprechenden Abdichtungen sowie ggf. eine Stanze gehören. Alle wesentlichen Operationen werden mit den Probenhaltern ausgeführt. Die zu sequenzierenden DNA-Proben werden an die Trägersegmente der Probenhalterstifte gebunden und als Immobilisate durch Tauchen in die entsprechenden Reagenzien und Lösungen durch alle Operationsschritte des Festphasenverfahrens geführt. Im Anschluß »n die Piperidinreaktion und chemische Elution werden die Trägersegmente durch Entfernen der Probenhalter mit ihren Stiften aus den Reaktionsgefäßen der Träger schnell und problemlos von den P'peridineluaten separiert, die die abgebauten DNA-Proben enthalten. Anschließend werden die Eluate durch Vakuumzentrifugation eingeengt.

Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung sind im neuen Operationszyklus keine Operationen wie das Sortieren von Flächenträgersegmenten, das Einlegen von Flächenträgern in spezielle Halterungen zum Zwecke der Durchführung von Immobilisierungs- und Stanzoperationen, Pipettierungsschritte zur Immobilisierung sowie manuelle Operationen zum Separieren der Eluate von den Trägersegmenten im Anschluß an Piperidinreaktion und chemische Elution mehr enthalten. In Kombination mit einem kommerziell erhältlichen Industrie- oder Laborrobotor kann das Verfahren leicht und ökonomisch vorteilhaft automatisiert werden, da alle Operationen mit don an den Probenhaltern fixierten DNA-Proben in geordneter Weise durch einfache Tauchoperationen in entsprechende flüssige Medien realisiert werden.

Ausführungsbeispie!

Die Erfindung wird an einem Ausführungsbeispiel und an Hand von Zeichnungen noch näher erläutert.

Fig. 1: halbgeschnittener Probenhalter und Träger mit tiefgezogenen Reaktionsgefäßen während der Probennahme

(Immobilisierung) Fig. 2: halbgeschnittene Stanze mit Probenhalter beim Aufbringen der Trägersegmente auf die Probenhalterstifte vor

Durchführung des Verfahrens Fig. 3: Ablaufschema der Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase

Die Grundausstattung der Vorrichtung besteht aus vier Probenhaltern 1, fünf Trägern für Reaktionsgefäße 2 und ggf. ei. Stanze 10. Der Probenhalter 1 besteht aus einer quaderförmigen Grundplatte, in die entsprechend der Anzahl η zu sequenzierender DNA-Proben η Stifte 1.1 eingelassen sind, die aus Stahl, Plaste oder anderen Materialien bestehen können. Die Stifte 1.1 müssen exakt gleiche Länge aufweisen. Der Abstand der Stifte 1.1 wird entsprechend dem Gefäßmuster standardisierter oder speziell tiefgezogener Mikrotiterplatten oder einzelner Gefäße gewählt, die als Reaktionsgefäße 2.1 in die quaderförmigen Körper eingelassen oder eingearbeitet sind, die als Träger für die Reaktionsgefäße 2 dienen. Die Reaktionsgefäße, z. B. tiefgezogene Mikrotiterplatten, müssen leicht auswechselbar sein. Die Länge der Stifte 1.1 des Probenhalters 1 wird so gewählt, daß die Probenhalterstifte 1.1 exakt in die Reaktionsgefäße 2.1 des Trägers 2 passen, und daß die an den Stiften 1.1 fixierten Trägersegmente 3 1 durch ein minimales Volumen an Reaktionslösung bedeckt werden können. Die Stanze 10 besteht aus einer Grundplatte mit η eingelassenen Stanzstifien 3.1, einer Schnittplatte 3.3 und einem Flächenträgerhalter. Die Stanzstifte 10.1 haben einen größerei, Durchmesser als die Stifte 1.1 des Probenhalters 1, weisen aber das gleiche räumliche Verteilungsmuster wie diese auf. Am Ende besitzen die Stanzstifte 10.1 einen Hohlraum 10.2, der einen etwas größeren Durchmesser, absr nur einen Bruchteil der Länge wie die Stifte 1.1 des Probenhalters 1 aufweist. Vor der Durchführung der Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase wird der Probenhalter 1 mit der Stanze 10 so kombiniert, daß die Stifte 1.1 des Probenhalters 1 genau in den Hohlraum 10.2 der Stanzstifte 10.1 passen. Nach

Einlegen des Flächenträgers 3 in den Flächenträgerhalter der Stanze 10 werden durch Stanzen des Flächenträgers, z. B. CCS-Papier 3, die Stifte 1.1 eines Probenhalters 1 mit η Flächenträgersegmenten3.1 versehen, das a's Trägermaterial für die nachfolgende Immobilisierung der DNA-Fragmente verwendet wird. Alle vier Probenhaiter 1 werden auf diese Weise mit Trägersegmenten beschickt (Fig. 2). Zur Immobilisierung der markierten DNA-Fragmente an die Trägersegmente 3.1 der Probenhalterstifte 1.1 werden diese mit den markierten Lösungen 4 der verschiedenen DNA-Fragmente befeuchtet, die in den Reaktionsgefäßen 2.1 einer Mikrotiterplatte bevorratet sind. Dazu taucht man die Stifte 1.1 eines jeden Probenhalters 1 (je ein Frobenhalter für eine der vier notwendigen Modifikationsreaktionen G, A + G, T > Pu und C) in die markierten Lösungen 4 ein. Die DNA-Modifikationsreaktionen 7 und die Waschoperationen 6 der chemischen Degradation an fester Phase mit den immobilisierten DNA-Proben 5 werden realisiert, indem man die Stifte 1.1 der Probenhalter 1 in größere Gefäße mit den jeweiligen Lösungen bzw. chemischen Reagenzien eintaucht und dort für den notwendigen Zeitraum beläßt. Zur Durchführung der Piperidinreaktion sowie der chemischen Elution taucht man die Stifte 1.1 der vier Probenhalter 1 in vier verschiedene Mikrotiterplatten 2.1 der Träger für Reaktionsgefäße 2, die mit 10% Piperidinlösung 8 gefüllt sind, und erhitzt die Lösung für 30 min auf 9O⁰C. Die Reaktionsgefäße 2.1 können, müssen aber während der Piperidinreaktion nicht verschlossen sein. Wähl und der Piperidinreaktion erfolgt ein partieller Strangbruch und die chemische Elution des DNA-Materials 5 vom ^Trägersegment 3.1. Anschließend zieht man die Probenhalter 1 aus den Piperidinlösungen S und separiert dadurch auf einfache Weise die Trägersegmente 3.1 vom Eluat. Die Nachbehandlung der degradierten DNA-Proben urfolgt durch Vakuumzentrifuga'Jon 9 in einer speziellen Zentrifuge, deren Rotor die Mikrotiterplatten 2.1 aufnehmen kann.

Claims

1. Vorrichtung zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase, gekennzeichnet durch mindestens

a) einen Probenhalter (1), der aus einer Grundplatte besteht, in die Stifte (1.1) eingelassen sind, die exakt gleiche Länge aufweisen, und die mit einer Orientierung versehen ist,

b) einen Träger für Reaktionsgofäße (2) mit Reaktionsgefäßen (2.1), die ggf. mit Deckeln und Dichtungen versehen sind,

c) und ggf. einer Stanze (10), die aus einer Grundplatte mit eingelassenen Stanzsiiften (10.1), einer Schnittplatte (10.3) und einem Flächenträgerhalter besteht, wobei die Stanzstifte (10.1) einen größeren Durchmesser als die Stifte des Probenhalters (1.1), jedoch das gleiche räumliche Verteilungsmuster aufweisen, und die am Ende einen Hohlraum (10.2) besitzen, der einen größeren Durchmesser, aber einen Bruchteil der Länge der Stifte des Probenhalters (1.1) aufweist, wobei Probenhalter (1), Träger der Reaktionsgefäße (2) und Stanze (10) so kombiniert sind, daß der Abstand der Stifte des Probenhalters (1.1) dem Muster der Reaktionsgefäße (2.1) des Trägers für Reaktionsgefäße (2) entspricht, und die Stifte des Probenhalters (1.1) genau in den Hohlraum (10.2) der Stanzstifte (10.Ί) passen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Reaktionsgefäße (2.1) Mikrotiterplatten verwendet, die in die Träger der Reaktionsgefäße (2) eingebettet sind und leicht auswechselbar sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Reaktionsgefäße (2.1) Gefäße mit einem Volumen .wischen 5 »ird 2000μΙ verwendet, die in die Träger der Reaktionsgefäße (2) eingelassen sind und mit einem speziellen Rahmen zum gleichzeitigen Auswechseln verbunden sind.

4. Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase mittels Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß jeweils vier Probenhalter (1) und fünf Träger mit Reaktionsgefäßen (2) miteinander kombiniert sind, daß die Trägermaterialien durch Stechen, Klemmen, Kleben, Passen oder Beschichten an den Stiften (1.1) aller Pmbenhalter (1) befestigt werden und anschließend die Sequenzanalyse der DNA durch chemische Degradation an fester Phase nach an sich bekannten Methoden mit den Probenhaltern (1) erfolgt, wobei erstens die zu sequenzierenden und markierten DNA-Proben in den Reaktionsgefäßen des ersten Trägers für Reaktionsgefäße bevorratet sind, zweitens die markierten DNA-Proben durch Eintauchen der Stifte aller vier Probenhalter in die Reaktionsgefäße des ersten Trägers an die Trägersegmente der Probenhalterstifte (1.1) gebunden werden, drittens alle weiteren chemischen und physikalischen Operationen des Verfahrens wie Waschen, DNA-Modifikaf on, Piperidinreaktion und gleichzeitige chemische Elution mit den Immobilisaten durch Teuchen der Probenhalterstifte in die entsprechenden Reagenzien und Lösungen erfolgt, viertens im Anschluß an die Piperidinreaktion und gleichzeitige chemische Elution alle Probenhalter mit ihren Stifte aus den Reaktionsgefäßen aller Träger entfernt und fünftens die Eluate mit den chemisch abgebauten DNA-Proben durch Überführung der Reaktionsgefäße in eine Vakuumzentrifuge und Lyophilisierung bis zur Trockne eingeengt werden.

5. Verfahren nach Anspruch Λ, gekennzeichnet dadurch, daß die Befestigung der Trägersegmente an die Stifte (1.1) aller Probenr alter (1) durch Stechen dadurch erfolgt, daß ein Flächenträger (3) in den Flächenträgerhalter der Stanze (10) eingelegt wird, durch Stanzen Trägersegmente (3.1) auf die Stifte (1.1) aller Probenhalter (1) überführt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Beladung der Stifte (1.1) aller Probenhalter (1) durch Beschichtung mit einem geeigneten organischen Trägermaterial dadurch erfolgt, daß die Probenhalterstifte (1.1) in eine entsprechend Suspension, Dispersion oder Lösung ungeformter organischer Polymere bzw. ihrer monomeren Komponenten ggf. mit Lösungsmittelzusätzen eingetaucht, ggf. eine Reaktion durchgeführt und danach getrocknet werden.

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen