DD281420A5

DD281420A5 - Verfahren zum nachweis von biomolekuelen

Info

Publication number: DD281420A5
Application number: DD30636687A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger; Gerhard Behrendt; Gerhard Schmidt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1990-08-08

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekuelen mittels markierter molekularer Sonden erhoehter Empfindlichkeit, das in der Molekularbiologie, Genetik, Biotechnologie, Phytopathologie, Landwirtschaft, Medizin und Veterinaermedizin angewendet werden kann. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz in Loesung befindliche oder an eine feste Phase I gebundene Biomolekuele von einer an ein Enzym gekoppelten molekularen Sonde erkannt werden, das Enzym mit dem Substrat in Anwesenheit eines Cosubstrates zur Reaktion gebracht wird und das umgesetzte Substrat an einer festen Phase II oder III nachgewiesen wird.{molekulare Sonden; Markierung; Nachweisverfahren; Kopplung; Enzyme; Substrat; Cosubstrat; feste Phasen; hohe Empfindlichkeit}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen mit gesteigerter Empfindlichkeit, das vor allem in der Molekularbiologie, aber auch in der Genetik, der Biotechnologie, der Phytopathologie, der Landwirtschaft, Medizin und Veterinärmedizin angewendet werden kann.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Kopplung von molekularen Sonde/} an Enzyme (siehe z. S. S. Avrameas, T.Ternynck, J.-L. Guesdon, Scand. J. Immunol.

[1978] 8,7-23) und der Nachweis von Biomolekülen mittels enzymgekoppelter Sonden (siehe z. B. Immunoenzymatic Techniques, Hsrg. S. Avrameas et al., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1983) ist bekannt. Dabei wurde bisher nur eine sehr begrenzte Anzahl von Enzymen zu Nachweisverfahren herangezogen (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glactosidase, Glucoamylase, Glucoseoxidase, Glucoronidase, Lactatdehydrogenase, Ribonucloase, Tyrosinase). Ein Grund für' diese Einschränkungen ist die schlechte Nachweismöglichkeit für andere Substrate. So wurden vorwiegend Substrate verwendet, die nach der Enzymreaktion farbige Reaktionsprodukte ergaben.

Bei Nachweisverfahren für Biomoleküle, die an feste Phasen gebunden sind, mittels enzymgekoppelter Sonden erfolgte der Nachweis des umgesetzten Substrates bisher stets auf der gleichen festen Phase, auf der sich auch das Biomolekül befand. Die Nachweisempfindlichkeit dieser Verfahren, bei denen meist wasserunlösliche, farbige Reaktionsprodukte der Substrate auf dem Trägermaterial abgeschieden wurden, ist gering.

Speziell zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen aus minimalen Mengen biologischen Materials werden wesentlich empfindlichere Methoden benötigt.

Bisher war es nicht möglich, Biomoleküle durch enzymgekoppelte Sonden auf einer vom Biomolekül unabhängigen Trägerschicht nachzuweisen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen mit gesteigerter Empfindlichkeit zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens dar Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen zu entwickeln, bei dem durch die Verwendung an molekulare Sonden gekoppelter Enzyme und einer speziellen festen Phase zur Bindung und zum Nachweis des umgesetzten Substrates eine höhere Empfindlichkeit als bisher erreicht wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Biomoleküle, die sich in Lösung befinden, im Gel enthalten oder an eine feste Phase I gebunden sein können, vor einer an ein Enzym gekoppelten molekularen Sonde erkannt werden, das an die molekulare Sonde gekoppelte oder abgespaltene Enzym mit einem Substrat in Anwesenheit eines Cosubstrates zur Reaktion gebracht und das umgesetzte Substrat an einer festen Phase Il oder III nachgewiesen wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erstmalig eine Methode zur Verfügung gestellt, durch die Erkennungsschritt und Nachweisschritt in Nachweisverfahren von Biomolekülen unter Beteiligung von Enzymen an verschiedenen Phasen, z. B. zwei Flächenträgern, durchgeführt werden und dadurch an der zweiten Phase die Verstärkungsmöglichkeiten durch die Enzymreaktion voll ausgeschöpft werden können.

Für das orfindungsgemäße Verfahren sind nun eine ganze Reihe von Varianten möglich, die jedoch alle in prinzipiellen Schritten ablaufen. Der Nachweis der Biomoleküle erfolgt erfindungsgemäß deshalb in folgenden Schritten:

a) Erkennungsschritt, in dem die durch ein gekoppeltes Enzym markierte moleki'lare Sonde an das in Lösung befindliche, im Gel enthaltene oder an eine feste Phase I gebundene Biomolekül mit dafür spezifischer Affinität angelagert wird;

b) Waschschritt, in dem überschüssige markierte molekulare Sonde ausgewaschen und/oder abgetrennt wird;

c) Enzymreaktionsschritt, in dem das Substrat in Anwesenheit eines Cosubstrates durch das Enzym umgesetzt wird;

d) Trennschritt, in dem nicht umgesetztes Cosubstrat und ggf. Substrat ausgewaschen oder abgetrennt wird;

e) Auswertungsschritt, in dem das umgesetzte Substrat an einer festen Phase Il oder III gemessen oder durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird.

Innerhalb eines jeden dieser Schritte sind auf Grund der vielfältigen Techniken zum Nachweis von Biomolekülen wiederum eine Reihe von Variationen möglich. So ist es z. B. denkbar, daß das nachzuweisende Biomolekül in Lösung oder an einer festen Phase gebunden vorliegt. Dabei kann die feste Phase nicht nur ein tejlchenförmiger oder Flächenträger sein, sondern auch ein Gel, in dem die Biomoleküle frei beweglich sind, aber nicht gebunden vorliegen. Als Gele kommen die in der Molekularbiologie häufig verwendeten Agarosegele und Polyacrylamid-Gele in Betracht, die in der Regel zu Trennoperationen verwendet werden. Eine'Vielfalt von Variationen sind in den Waschschritten und in den Trennschritten möglich, da unter diesen eine Anzahl von Einzelschritten zusammengefaßt sind, die nach bekannten Methoden durchgeführt werden. So können z. B. Waschungen an fester Phase mit verschiedenen, auf das System eingestellten Puffern durchgeführt werden. Es kann aber auch notwendig werden, eine oder mehrere Komponenten abzutrennen, was mittels Säulen, Trenngelen oder durch eine chromatographische Methode erfolgen kann. Andererseits ist es möglich, nur den Komplex von Biomolekül und an das Enzym gekoppelter Sonde abzutrennen und dann im Enzymreaktionsschritt nachzuweisen. Es ist sogar möglich, in einem dieser Schritte das Enzym wieder von der Sonde abzuspalten und dann nur das System auf Grund seiner Reaktion mit Substrat und Cosubstrat an einer festen Phase nachzuweisen.

Folglich existieren auch vielfältige Möglichkeiten zur Ausgestaltung des Enzymreaktionsschrittes. Dieser kann ebenfalls in Lösung stattfinden, er kann an einer festen Phase oder in einem Gel durchgeführt werden. Wird der Enzymreaktionsschritt z. B. in Lösung durchgeführt, muß anschließend das Umsetzungsprodukt des Substrates an eine feste Phase gebunden und dort nachgewiesen werden. Das bedeutet, daß ein Trägermittel zur Verfügung gestellt wird, das das umgesotzte Substrat selektiv bindet. Wenn jedoch der Enzymreaktionsschritt bereits an fester Phase durchgeführt wird, d. h. das Substrat und/oder das Enzym, das noch an den Komplex aus Biomolekül und molekularer Sonde gekoppelt oder bereits von ihm abgespalten ist, befinden sich an einem festen Träger, dann wird d3s Substrat an der festen Phase umgesetzt und anschließend, wobei nicht umgesetztes Cosubstrat sorgfältig abgetrennt werden muß, dort nachgewiesen. Auch wenn das Enzym, das von dem Komplex aus Biomolekül und molekularer Sonde abgespalten worden ist, in Lösung vorliegt oder in einem Gel eingeschlossen ist, kann diese Umsetzung an einer festen Phase erfolgen und das umgesetzte Substrat dann an dieser nachgewiesen werden. Die , Abtrennung des nicht umgesetzten Substrates kann dabei ebenfalls erfolgen, sie ist jedoch in den meisten Fällen nicht nötig. Einige der bevorzugt durchgeführten Varianten werden im Folgenden näher beschrieben.

Variante I

a) Biomoleküle werden in Gelen oder anderen Trenn- und Trägermaterialien aufgetrennt und die die Biomoleküle enthaltenden GeIa oder anderen Trenn- und Trägermateridlien werden mit einer Lösung, die eine an ein Enzym gekoppelte molekulare Sonde enthält, in Kontakt gebracht, wobei Biomolekül und Sonde miteinander reagieron, so daß ein Komplex aus Biomolekül und enzymgekoppelter molekularer Sonde im Gel entsteht (Erkennungsschritt);

b) im Waschschritt wird die überschüssige markierte molekulare Sonde aus dem Gel ausgewaschen oder abgetrennt;

c) im Enzymreaktionsschritt wird das Gel mit einem zweiten Gel oder Trenn- und Trägermaterial, das das Substrat und das Cosubstrat enthält, in Kontakt gebracht und das Substrat umgesetzt;

d) im Trennschritt wird das zweite Gel oder Trenn- und Trägermaterial mit dem umgesetzten Substrat mit einer festen Phase III in Kontakt gebracht und das umgesetzte Substrat selektiv an ihr gebunden;

e) nach Was^hschritten wird im Nachweisschritt das umgesetzte Substrat auf der festen Phase III durch Messung der Radioaktivität, durch Autoradiographie oder ein anderes geeignetes Nachweisverfahren nachgewiesen.

In einer speziellen Ausführungsform dieses Verfahrens wird nach den Schritten a und b dus Gel. das den Komplex aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde enthält, mit einer feston Phase II, an die ein Substrat gebunden ist, in Gegenwart eines Cosubstrates in Kontakt gebracht und das enzymatisch umgesetzte Substrat an der festen Phase Il nachgewiesen. Diese spezielle Ausführungsform läßt sich auch als Enzymtest zum Nachweis der Wirksamkeit des Enzyms verwenden, so daß dadurch eine weitere Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegeben ist.

Variante Il

a) Im Erkennungsschritt befinden sich die an ein Enzym gekoppelte molekulare Sonde und das Biomolekül in Lösung und werden dort aneinander angelagert;

b) im Waschschritt wird überschüssige markierte molekulare Sonde abgetrennt;

c) im Enzymreaktionsschritt wird das Enzym des Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde in Lösung mit dem Substrat in Gegenwart des Cosubstrales zur Reaktion gebracht;

d) irn Trennschritt wird die Abtrennung des enzymatisch umgesetzten Substrates vom überschüssigen Cosubstrat durch eine das Substrat selektiv bindende feste Phase III durchgeführt; und

e) im Auswertungsschritt wird das umgesetzte Substrat an der festen Phase III gemessen oder autoradiographisch bestimmt. Der Schritt b), d. h. die Abtrennung der überschüssigen markierten molekularen Sonde, kann z. B. an Säulen, insbesondere Affinitätssäulen, oder an Teilchensuspensionen mit einer Affinitätswirkung erfolgen.

Der Enzymreaktionsschritt kann nach dieser Variante mit dem Enzym, das sich gekoppelt an der Sonde und diese wiederum angelagert an oas Biomolekül befir :let, erfolgen, oder das Enzym kann durch einen zwischengeschalteten Schritt von dem Komplex aus Sonde und Biomolekul abgespalten werden. Dabei kann diese Spaltung sowohl an der ursprünglichen Bindungsstelle von Enzym und molekularer Sonde erfolgen (d. h., es ist eine reversible Bindung) oder es kann in der Molekülkette („spacer'-Molekül), die zur Kopplung von Enzym und molekularer Sonde verwendet worden ist, gespalten werden. Eine solche Spaltung ist natürlich nicht nur in dieser Variante möglich, sondern kann auch in anderen Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden.

Variante III

a) Im Erkennungsschritt wird die durch ein gekoppeltes Enzym markierte molekulare Sonde an das an eine feste Phase I gebundene Biomolekül angelagert;

b) im Waschschritt wird überschüssige markierte molekulare Sonde ausgewaschen und/oder abgetrennt;

c) im Enzymreaktionsschritt wird das Enzym des an eine feste Phase I gebundenen Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde mit in Lösung befindlichem Substrat und Cosubstrat zur Reaktion gebracht;

d) im Trennschritt wird nicht umgesetztes Cosubstrat und ggf. Substrat abgetrennt und umgesetztes Substrat an eine feste Phase III gebunden; und

e) im Auswertungsschritt wird das umgesetzte Substrat an der festen Phase III gemessen oder autoradiographisch bestimmt. Nach dieser Variant j befinden sich sowohl das Biomolekül, an das die molekulare Sonde angelagert wird, als auch das umgesetzte Substrat jeweils an einer festen Phase, Diese festen Phasen können gleich sein, sind dabei aber immer dem speziellen Biomolekül und dem umgesetzten Substrat angepaßt.

Der Enzymreaktionsschritt kann wieder mit dem vollständigen Komplex aus Biomolekül, Sonde und gekoppeltem Enzym oder mit dem abgespaltenen Enzym, wie es in der Variante Il beschrieben worden ist, durchgeführt werden. Eine weitere Variation dieser Verfahrensvariante besteht darin, daß die feste Phase I mit daran gebundenem Biomolekül und daran angelagerter markierter molekularer Sonde nach den Schritten a) und b) mit einem Gel oder anderen Trenn- und Trägermaterial überschichtet wird, wobei sich darin Substrat und Cosubstrat befinden, so die Enzymreaktion durchgeführt und anschließend aus dem Gel das umgesetzte Substrat auf eine feste Phase III übertragen wird.

Variante IV

Diese Variante stellt eine bevorzugte Aufsführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Die Verfahrensschritte werden danach wie folgt durchgeführt:

c) im Enzymreaktionsschritt wird das Enzym des an eine feste Phase I gebundenen Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde mit einem an eine feste Phase Il gebundenen Substrat in Gegenwart eines sich in Lösung befindlichen Cosubstrates zur Reaktion gebracht; und

d) im Trennschritt wird überschüssiges Cosubstrat ausgewaschen oder abgetrennt; und

e) im Auswertungsschritt wird das umgesetzte Substrat an der festen Phase Il gemessen oder autoradiographisch bestimmt. . Bei dieser Variante besteht die Möglichkeit, und das is! eine völlig neue Art der Durchführung des Nachweises von Biomolekülen, zwei feste Träger, insbesondere Flächenträger, miteinander in Kontakt zu bringen und durch Zugabe der Lösung eines Cosubstrates die Enzymreaktion in Gang zu setzen. Dabei werden Flächenträger bevorzugt, z. B. solche, wie sie in der WP 254 012 beschrieben worden sind. Es ist jedoch ebenfalls möglich, Teilchen miteinander umzusetzen, die unterschiedlich beschichtet sind, unter anderem auch Latexpartikel aus Kunststoffen mit einem magnetischen Kern.

Das Enzym kann im Reaktionsschritt c) sowohl an die molekulare Sonde gekoppelt als auch von ihr wieder abgespalten sein. Dieser letzte Fall ist besonders dann günstig, wenn DNSaIs Substrat verwenden wird und das Enzym z. B. eine Ligase oder ein anderes Reparaturenzym ist.

Im Erkennungsschritt ist bei allen Verfahrensvarianten möglich, daß bereits hier eine Verzweigung der Reaktion stattfindet oder daß zwischen das Biomolekül und die markierte molekulare Sonde weitere Moleküle zwischengeschaltet werden. Das kann sich bei empfindlichen Enzymen als vorteilhaft erweisen. Es ist dabei möglich, das bekannte Avidin/Biotin-System zu verwenden und damit eine mögliche Verstärkung bereits im Erkennungsschritt auszunutzen. Als letzte Stufe des Erkennungsschrittes erkennt dabei die markierte molekulare Sonde nicht direkt das Biomolekül selbst, sondern die vorhergehenden Reaktionspartner-Moleküle der Kaskade. Folglich besteht im Erkennungsschritt die Möglichkeit, daß das Biomolekül in einem oder mehreren Erkennungssystemen und einer oder mehreren Reaktionsstufen zunächst von einem oder mehreren Molekülen mit spezifischer Affinität erkannt bzw. mit einem oder mehreren Molekülen umgesetzt wird und die mit einem Enzym gekoppelte molekulare Sonde mit mindestens einem dieser Moleküle reagiert.

Als feste Phasen sind eine Reihe von Materialien geeignet, die nach dem Stand der Technik bekannt sind und als Trägermaterialien für Biomoleküle eingesetzt werden. Die feste Phase I, an die das Biomolekül gebunden ist, kann ein kovalent bindender, ionisch bindender oder über elektrostatische Wechselwirkungen bindender Träger sein. Über elektrostatische Wechselwirkungen binden z.B. Nitrocellulose und Polyvinylidenfluorid, während Polyamide (z. B. Nylon-Membranen) oder geladene Polyamide sowie Diethylaminoethylcellulose über ionische Kräfte binden. Kovalent bindende Träger sind z. B. derivatisierte Cellulose, z. B. Diazobenzyloxymethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose (z. B. nach DD-WP 220.316). Darüberhinaus können Polystyren ohne oder mit Aktivierung (z.B. durch Sulfonierung oder Aminierung/ Diazotierung) oder chemisch aktiviertes Glas verwendet werden. Bevorzugt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden feste Phasen I, die in Form von Flächengebilden vorliegen.

Die feste Phase Il ist ein Träger, der das Substrat, das wiederum vom an die molekulare Sonde gekoppelten Enzym abhängt, zu binden vermag. Auch hier können, in Abhängigkeit vom Substrat, wieder kovalent bindende, über ionische Kräfte bindende oder über elektrostatische Wechselwirkungen bindende Träger eingesetzt werden, wie sie bereits genannt worden sind. Folglich kommen für die fest Phase Il wiederum Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polyamid, geladenes Polyamid, Diethylaminoethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose, aktiviertes Polystyren, chemisch aktiviertes Glas oder andere derivatisierte Cellulosen in Betracht. Vor allem die ionisch bindenden Cellulosen, z.B. Phosphorcellulose (ein Umsetzungsprodukt der Cellulose mit Phosphorsäure und daher Phosphorsäuregruppen an den Anhydroglucoseeinheiten der Cellulose), Carboxymethylcellulose oder durch Cyanurchlorid und eine Verbindung, die eine Aminogruppe und eine Carbonsäure-, Phosphorsäure- oder Sulfonsäuregruppe aufweist, modifizierte Cellulose, wie sie z. B. in der WP 254012 oder im DD-WP 237.844 beschrieben worden sind.

In einer besonderen Ausführungsform kann die feste Phase Il in Form eines optisch durchlässigen Mediums ausgebildet sein,

z. B. einem Film, der das Substrat binden kann. Solche Materialien sind besonders zur routinemäßigen Auswertung, z. B. bei medizinischen Bestimmungsverfahren, besonders geeignet, da eine große Anzahl von Proben gleichzeitig maschinell ausgewertet werden kann. Die feste Phase !I wird zum Nachweis bevorzugt als Flächenmaterial eingesetzt; die Filme stellen dann den Fall eines optisch durchsichtigen Flächenmaterials dar.

Die feste Phase III, die das Substrat und/oder das enzymatisch umgesetzte Substrat selektiv binden kann, kann nun ein Gel oder ein anderes Trenn- und Trägermaterial sein. Ebenso kann diese feste Phase III ein kovalent bindender, ein ionisch bindender oder ein über elektrostatische Wechselwirkung.*" bindender Träger sein. Hier kommen, da die umgesetzten Substrate verschiedenartigster Natur sein können, im Prinzip die gleichen bekannten Materialien in Betracht, wie sie bereits weiter oben beschrieben worden sind, nämlich Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polyamid, modifiziertes Polyamid, Diazobenzyloxymethylcellulose, Diethylaminoethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose, aktiviertes Polystyren, chemisch aktiviertes Glas, Phosphorcellulose, Carboxymethylcellulose oder durch Cyanurchlorid und eine Verbindung, die eine Aminogruppe und eine Cat'' isäure-, Phosphorsäure- oder Sulfonsäuregruppe aufweist, modifizierte Cellulose. Auch die feste Phase III kann in Form eines optisch durchlässigen Mediums verwendet werden. Es gelten hier die gleichen Möglichkeiten und Vorteile wie bei der festen Phase II. Bevorzugt wird der Nachweis mit der festen Phase III als Flächenmaterial durchgeführt, wenn sie z. B. als Film, Membran oder als Wirrfaservlies ausgebildet ist. Cellulosematerialien können in Papierform verwendet werden.

Die Auswertung bei den optisch durchlässigen festen Phasen, insbesondere dann, wenn sie in Form eines Filmes ausgebildet sind, erfolgt mittels optischer Methoden, z. B. bei gefärbten Produkten durch Densiometrie, durch Coloriemetrie oder Photographic. Die Biomoleküle können auf die feste Phase I nach üblichen Verfahren aufgetragen werden. So werden sie insbesondere durch Tüpfeln, nach der Auftrennung in Gelen oder anderen Trenn- und Trägermaterialien durch sog.

Übertragungs- oder Transfertechniken (Blottingverfahren) aufgebracht.

Die molekulare Sonde, die zur Erkennung des Biomoleküls dient, kann ein mono- oder polyklonaler Antikörper, ein Antiserum, ein Protein, ein Peptid, eine einzelsträngige, doppelsträngige oder parieil doppelsträngige DNS oder ein Fragment davon, ein Oligodesoxyribonucleotid, eine RNS oder ein Fragment davon, ein Oligoribonucleotid, ein Protein mit spezifischer Affinität zu einem anderen Biomolekül oder eine chemische Verbindung mit Affinität zu einem Biomolekül sein. Das Protein mit spezifischer Affinität zu einem anderen Biomolekül ist dabei bevorzugt Avidin oder Streptavidin. Die chemische Verbindung mit Affinität zu einem Biomolekül ist bevorzugt Biotin.

Die Kopplung des Enzyms an die molekulare Sonde zu ihrer Markierung kann nach verschiedenen Verfahren, die im Prinzip für bestimmte Enzyme beschrieben sind, erfolgen. Die Bindung der Sonde an das Enzym kann z. B. kovalent durch eine Reihe von ' bifunktionellen Kopplungsreagenzien erfolgen. Derartige Kopplungsreagenzien sind z.B. Glutaraldehyd, Benzochinon, Bis-succinimidylester wie Bis-sulfosuccinimidylsuberat und Disuccinimidyltartrat, Bisimidate wie Dimethylsuberimidat und Dimethyladipamidat, Azide wie N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxy-succinimid oder 4,4'-Dithio-bis(phenylazid). Dabei kann ein Kopplunpsmolekül zwei unterschiedliche Gruppen tragen oder ggf. im Molekül reduktiv oder photochemisch spaltbare Gruppen aufweisen. Beispiele tür solche Kopplungsreagenzien sind N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat oder Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrubenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropicnat.

Weiterhin können molekulare Sonde und Enzym direkt kovalent miteinander verbunden sein. Eine solche Kopplung kann z. B. in Gegenwart von Kondensationsmitteln wie Carbodiimiden durchgeführt werden.

Die Bindung des Enzyms an die molekulare Sonde kann ebenso über ionische Bindungen erfolgen. Eine ionische Bindung kann

z. B. direkt zwischen Protein und DNS gebildet werden. In der Regel werden jedoch Reagenzien zugesetzt, die eine Bindung ermöglichen, z. B, Polyethylenimine unterschiedlicher Molmassen, Polyelektrolyte oder Ampholyte.

Da Enzyme über Hydrophobe und hydrophile Bereiche verfugen, ist es möglich, sie auch über elektrostatische Wechselwirkungen an die molekulare Sonde zu binden. Als elektrostatische Wechselwirkungen sollen weiterhin von der Waalssche Kräfte, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen verstanden werden.

Ein besonderer Fall ist es, wenn ein Fusionsprotein als markiei te molekulare Sonde verwendet wird, das entweder natürlich vorkommt oder gentechnisch erzeugt werden kann. Bei diesen können Enzym und molekulare Sonde direkt miteinander verbunden sein und bereits so hergestellt werden.

Die Kopplungsstelle von molekularer Sonde und Enzym kann nun wieder spaltbar sein. Es werden dann z.B. solche Moleküle eingebaut, wie sie weiter oben bereits genannt wurden, die z. B. eine -S-S-Gruppierung im Molekül aufweisen oder eine photochemisch spaltbare Gruppe. Darüber hinaus kann die Kopplung so durchgeführt werden, daß sie reversibel ist, indem z. B.

die oben genannten ionischen Bindungen oder ein über elektrostatische Wechselwirkungen arbeitendes Bindungsprinzip angewendet wird.

Als Enzyme kommen zwei große Gruppen in Betracht, die Transferasen (nach E.C. Gruppe 2) und die Ligasen (E. C. Gruppe 6).

Unter den Transferasen werden insbesondere die bevDrzugt, die radioaktiv markierbare Gruppen übertragen, z. B.

Acyltransferasen(E.C. 2.3), Phosphor enthaltende Gruppen übertragende Enzyme (E. C. 2.7)oderPolymerasen(E.C. 2.7.7).

Insbesondere werden folgende Enzyme als besonders geeignet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrachtet:

Arnnoglucosid-Phosphotransferase (E.C. 2.7.1), insbesondere die Kanamycin-Phosphotransferasen (E.C. 2.7.1.95), Proteinkinasen (E.C. 2.7.1), T4-Polynucleotid-Kinase (E.C. 2.7.1.78), Nucleotidyltransferasen (E.C. 2.7.7), DNA-Polymerasen (E.C. 2.7.7.7), Polynucleotid-Adenyltransferase (E.C. 2.7.7.19), DNS-Nucleotidyiexotransferase (E.C. 2.7.7.31), Revertasen (E.C. 2.7.7.49), Phosphorester bildende Enzyme (repair enzymes) (E. C. 6.5), DNS-Ligasen (E.C. 6.5.11). Jedes dieser Enzyme reagiert nun mit einem speziellen Substrat. Die im folgenden aufgeführten Substrate gelten folglich nicht

für jedes Enzym, sondern nur für solche, für die das Substrat spezifisch ist. Manche Substrate werden jedoch von mehreren

Enzymen umgesetzt, jedoch in der Regel nach unterschiedlichen Mechanismen und auf unterschiedliche Art und Weise oder

unter Bildung unterschiedlicher Reaktionsprodukte. Substrate sind also:

Chloramphenicol, Aminoglucosid-Antibiotika, insbesondere Kanamycin, Neomycin, Gentamycin und Paromomycin;

phosphorylierbare Proteine, z. B. Histone;

DNS, RNS, Desoxyribo- oder Ribo-oligonucleotid, Desoxy- oder ribopolynucleotid, doppelsträngige DNS, einsträngige DNS plus Primer (Starter). Die Enzyme benötigen zusätzlich zu ihrem Substrat ein Cosubstrat. Dieses Cosubstrat ist der Baustein, der zur Veränderung des Substrates verwendet wird. Bei der Acyltransferaso kann so das Cosubstrat z. B. ein ¹⁴C-oder ³H-markiertes AceuM sein. Bei den Phosphotransferasen ist das Cosubstrat in der Regel Adenosintriphosphat und/oder durch ³²P markiertes Adenosiitriphosphat

(ATP). Daneben können auch die vier Desoxynucleosidtriphosphate (die des Adenosins, des Guanosins, des Cytidins und des

Thymidins) übertragen werden. Die Markierung der Desoxynucleosidtriphosphate kann in der alpha- oder in der gamnia- Stellung erfolgen und je nach Enzym wird dann die eine oder andere Form umgesetzt. Außer durch ³²P können die Desoxynucleosidtriphosphato durch ³⁵S, ³H oder ¹²⁵I markiert sein, wobei jedes Nucleosid markiert sein kann, oder es kann nur

ein Nucleosid markiert sein.

Weiterhin kann das Cosubstrat ein biotinyliertes Nucleotid sein, so daß nach der Enzymreaktion z. B. eine Reaktion mit an Avidin

oder Streptavidin gebundenen Enzymen möglich und damit eine Auswertung mit Farbstoffen genutzt wird.

Als Cosubstrate können darüber hinaus bereits markierte DNS oder Desoxyribopolynucleotide ggf. im Gemisch mit ·

unmarkierten Molekülen eingesetzt werden, die insbesondere als Cosubstrate für Ligasen in Betracht kommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein neues Prinzip des Nachweises von Biomolekülen dar. Die Verwendung von

molekularen Sonden mit daran gekoppelten Enzymen und der Nachweis des umgesetzten Substrates an einer festen Phase hateine große Vielfalt an Ausführungsformen. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden und istdeshalb universell anwendbar. Bei der Anwendung wird ein Verstärkungsfaktor von mindestens 10 erreicht, er liegt imallgemeinen jedoch wesentlich darüber. Die erreichbare Verstärkung ist von den eingesetzten Stoffen und von der gewählten

Verfahrensvariante abhängig und kann nur für den speziellen Fall exakt angegeben werden. Durch d!e unterschiedlichen Ausführungsformen besteht beim Arbeiten nach bestimmten Varianten die Möglichkeiten, die verwendeten Biomoleküle mit

mehreren Sonden nachzuweisen, d. h. die blots sind z. B. wiederverwendbar. Die Anwendung des erfindungsgemäßen

Verfahrens ist nicht ai>f die beschriebenen Verfahrensvarianten beschränkt, sondern wird bei weiterer Ausarbeitung des Verfahrens darüber hinausgehen. Verwendete Pufferlösungen PBS: 8g NaCI, 0,2g KH₂PO₄, 2,9g Na₂HPO₄ 12H₂0,0,2g KCI werden in Wasser gelöst und auf 11 aufgefüllt, pH = 7,4 TBS: 0.15M NaCI, 50mMTris-(hydroxymethyl)aminomethan(Tris), pH = 7,4 GET: 2,5mM Tris/HCI, pH = 8,0,5mM Glucose, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalz (EDTA) Lysepuffer: 125mM Tris/HCI, pH = 6,8,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 20% Glycerol, 10% ß-Mercaptoethanol Elutionspuffer: 2OmM Tris/HCI, pH = 7,4,1OmM Dithiothreitol, 0,1 % SDS Lösepuffer: in 100ml 2OmM Tris/HCI, pH = 8,8, werden 48g Harnstoff gelöst und dazu 1%Nonidet NP40und

10% ß-Mercaptoethanol gegebon.

Enzympuffer: 2OmM Tris/HCI pH7,2,125mM NH₄CI, 2OmM MgCI₂1OmM Dithiothreitol Ausführungsbel&plele Beispiel 1 Kopplung von polyklonalem Antikörper an Kanamycin-Phosphotransferase

1 ml Anti-Humanserumalbumin-Antiserum (Kaninchen) mit 0,9% NaCI wird mit 10mg Benzochinon in 0,3ml Ethanol 1 Stundebei Zimmertemperatur zur Reaktion gebracht. Danach wird überschüssiges Benzochinon mittels einer Sephadex-G25-Säuleabgetrennt und der Komplex Benzochinon-Antikörper fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen werden in einem Immuntest gegen

Humanserumalbumin (HSA) geprüft. Die gesuchte Fraktion wird mit 1 mg Kanamycin-Phosphotra.isferase in 1 ml 1M Bicarbonat-Puffer (pH-Wert 9) über Nacht bei Zimmertemperatur im Dunkeln zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsprodukt wird über Nacht gegen 0,9% NsCI-Lösung dialysiert und so verwendet. Es kann nach der Dialyse auch in Aliquots aufgeteilt und bei -20⁰C gelagert werden. Beispiel 2

Immunologischer Nachwelt von HSA durch einen Kanamycin-Phosphotransferase gekoppelten Antikörper mit Nachwels des umgesetzten Substrate« auf einer festen Phase III

Ein Gemisch aus verschiedenen Markerproteinen und HSA wurde in einem Polyacrylamid-Gel (PAA-GeI) elektrophoretisch aufgetrennt und durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose übertragen (Biot). Dieser Blot wird mit einem Kanamycin-Phosphotransferase-gekoppeltert Antikörper nach Beispiel 1 in TBS (durch Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan gepufferte Kochsalzlösung von 0,9%) und 1 % Gelatine 4 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert (Verdünnung 1:500). Danach wird der Blot mit dem angelagerten, an Enzym gekoppelten Antikörper 4mal 15 Minuten in TBS gewaschen und mit einem 1-%-Agarosegel (im Reaktionspuffer hergestellt) mit 2OmMoI Tris/HCI, pH = 7,2,125mMol NH₄CI, 1 mMol Dithioerylhrol, 2OmMoI MgCI₂,2nMol Adenosintriphosphat (ATP), das 1 μθί gamma-³²P-ATP/ml und 2(^g/ml Kanamycin enthält, 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Das Agarosegel wird anschließend auf Phosphorrellulose-Flächenträger aufgelegt und das Kanamycin auf die Phosphorcellulose übertragen (0,5kg/3 Stunden, Zimmertemperatur). Der Nachweis des mit ³²P markierten phosphorylierten Kanamycins erfolgt durch Autoradiographie des Phosphorcellulose-Flächenträgers (2 Stunden, Zimmertemperatur).

Beispiel t

Immunologischer Nachweis von HSA mittels eines Kanamycin-Phosphotransferasa-markierten Antikörpers auf eine feste Phase Il

Humanserum wird in einem 1,5-%-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wird mit einem an Kanamycin- Phosphotransferase gekoppelten Antikörper 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit TBS mit 2 % BSA (Rinderserumalbumin) (Verdünnung 1:500> inkubiert und danach 1 Stunde mit TBS gewaschen.

DasGei wird zunächst in einem Reaktionspuffer wie in Beispiel 2, bestehend aus 2OmMoI Tris/HCI, pH = 7,2 125 mMol NH₄CI, 1 mMol Dithioerythrol, 20 mMol MgCI₂ und 2 nMol ATP, das 1 \iC\ gamma'²P-ATP enthält, eine halbe Stunde inkubiert und danach mit einem Träger nach WP 254012, der aus Cellulose, die mit Cyanurchlorid und anschließend mit Sulfanilsäure umgesetzt wurde, besteht und an dieses Produkt ionisch Kanamycin gebunden wurde, in Kontakt gebracht und 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Nach Waschung 30 Minuten in Wasser des Trägers Il mit dem Substrat und dem phosphorylierten Substrat wird dieser 1 Stunde bei Zimmertemperatur autoradiographiert und so das ^3:P-rnarkierte Kanamycin auf dem Träger Il nachgewiesen, wodurch d&c Vorhandensein von HSA im Trenngel bewiesen wird.

Beispiel 4 ·

Immunologischer Nachwels von Humanserumalbumin nach Protein-Blot auf Nitrocellulose unter proteinfreien Blockbedingungen (Verwendung eines Protein A-NPT Il-Fuslonsproteins)

a) Konstruktion eines Protein A-NPT Il-Fusionsprotelnvektors, Expression und Gewinnung das Fusionsproteins

In den Multi-cloning-site eines Protein A-Fusionsprotein-Vektors pRIT 2 (B. Nielsen, L. Abrahmsen, M. Uhlen, EMBO-Journal 4(4] (1985), S. 1075-1080) wird das NPT Il-Gen (Tn 5) (S. Brenner, Nature 329 [1987], S.21) aus E. coli im offenen Leseraster eingesetzt. Die Transformation von E. coli (NF 1) und die Selektionierung des entsprechenden Klones über d\e Ampicillinrosistenz erfolgen nach üblichen Methoden.

Die Anzucht des Protein A-NPT Il-Fusionsprotein-Klones erfolgt im Flüssigmedium NB1 (Immunpräparate Berlin, DDR) nach über Nacht durchgeführter Vorkultur 6 Stunden bei 30⁰C. Nach Temperaturerhöhung auf 42⁰C wird das Fusionsprotein exprimiert (Promoter PR des Phagen ). Nach 2 Stunden werden die Zellen aozentrifugiert, einmal mit GET-Puffer gewaschen, in GET resuspendiert und in Portionen zu je 10¹⁰ Zellen in Eppendorf-Röhrchen abzentrifugiert. Zur Gewinnung des Fusionsproteins werden einmal 10'° Zellen im Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml 2OmM Tris/HCI-Puffer, pH = 6,8, bei O⁰C resuspendiart und 5mal kurz von außen beschallt. Nach Abkühlung in Eis wird erneut 3mai kurz beschallt. Die Zellreste werden hei 4"C abzentrifugiert (5 Minuten). Der Überstand wird vorsichtig abpipettiort und in ein zweites Eppendorf-Röhrchen überführt.

b) Immunologischer Nachweis

Eine Verdünnungsreihe aus Proleinen mit Humanserumalbumin (HSA) im Nanogramm-Picogramm-Bereich wurde im SDS-PAA-GeI elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Elektrotransfer auf Nitrocellulose-Membran transferiert. Anschließend wurde die Nitrocellulose-Membran IBIot) 30 Minuten an der Luft getrocknet und danach in TBS mit 1 Vol.-% Tween 20 eine Stunde bei 37⁰C geblockt. Eine weitere Blockierung erfolgt anschließend in TBS mit 0,2 Vol.-% Tween 20 innerhalb von 30 Minuten (Block I).

Die Inkubation mit dem Antiserum Anii-HSA-Immunoglobulin (Kaninchen) erfolgte in einer Verdünnung von 1:200 eine Stunde bei Zimmertemperatur. Danach wurde eine Stunde mit TBS mit 0,1 Vol.-% Tween 20 bei Zimmertemperatur gewaschen (6 Wechsel). Nach erneuter Blockung mit TBS und 0,2 Vol.-% Tween 20 (30 Minuten bei Zimmertemperatur) (Block II) wurden 50μΙ des oben hergestellten Lysates mit dem Fusionsprotein aus Protein A und NPT Il in ein Volumen von 10ml gegeben und eine Stunde bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend werden die Nitrocellulose-Membranen (Hybond C, Amersham International) eine Stunde mit TBs gewaschen (6 Wechsel).

Ein nach DD-WP 254.012 aus mit Cyanurchlorid aktivierter Cellulose und Sulfanilsäure hergestellter und mit Kanamycin beladener Träger wiu auf eine Glasplatte gelegt und mit dem Enzympuffer, der ^3ίΗ-γ ATP mit einer Konzentration von 2 Mill, cpm/ml (spezifische Aktivität 150TBq/mMol) enthält, getränk. Die oben erhaltenen Blots auf Nitrocellulose werden mit der beim Elektrotransfer gelseitigen Seite auf den fsuchtfin, das Kanamycin tragenden Träger gelegt. Anschließend wird die Nitrocellulose-Membran nochmals von eben mit dem "P-y-ATP enthaltenden Er.zympuffer getränkt und schließlich mit einer Glasplatte gleicher Größe abgedeckt. Dieses System wird allseitig mit PE-Folie verschlossen und zunächst eine Stunds bei 37⁰C inkubiert, wobei während dieser Zeit die Glasplatten mittels eines Gewichtes leicht zusammengedrückt werden. Nach der Inkubation wird aus dem System der Kanamycin tragende Träger entnommen und eine Stunde mit bidest. Wasser gewaschen. Die Nitrocellulose-Membran wird sofort erneut auf einen Kanamycin enthaltenden Träger aufgelegt, mit "P-y-ATP enthaltendem Enzympuffer befeuchtet und über Nacht bei 37⁰C inkubisrt. Anschließend wird mit bidest. Wasser gewaschen. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie der im Kontakt verwendeten, mit Kanamycin beladenen Träger. Die Nitrocellulose-Membranen werden nach Waschung mit bidest. Wasser (frei von "P-γ-ΑΤΡ) zur Kontrolle mit autoradiographiert.

Durch die Autoradiogramme der im Kontakt verwendeten Träger wird die Lage der HSA-ßfinden bis in den Picogramm-Bereich

als geschwärzte Banden auf dem Röntgenfilm dargestellt (Exposition: 30 Minuten bei Zimmertemperatur, Röntgenfilm HS 11,

VEB ORWO Wolfen). Da proteinfreie Blockbedingungen verwendet wurden, kann das Protein aus der Nitrocellulose-Membran mit Ponceau S

angefärbt werden (Färbung: 2 Minuten, Entfärbung mit Wasser: 5 Minuten). Zur Auswertung wird di& Autoradiographie des im

Kontakt verwendeten Trägers über die angefärbten Nitrocellulose-Blots gelegt, so daß die Banden genau zugeordnet werden

können.

Beispiel 5 Immunologitcher Nachwelt von HSA nach Protein-Blotting auf Nitrocellulose unter Protein-Blockungs-Bedingungen Es wird ebenso wie in Beispiel 4 verfahren, jedoch wird als Block I TBS mi: 0,5Gew.-% Gelatine (1 Stunde) und TBS mit

0,25Gew.-% Gelatine (30 Minuten) sowie als Block Il TBS mit 0,25Gew.-% Gelatine (30 Minuten) verwendet.

Die Auswertung erfolgt wie in Beispiel 4 durch Autoradiographie der im Kontakt verwendeten Träger.

Beispiel β

Immunologischer Nachwels von a-Fetoproteln Im Tüpfeltest auf Nitrocellulose Eine Verdünnungsreihe von a-Fetoprotein (AFP) wird auf einen Streifen Nitrocedulose-Membran (Hybond C, Amersham Int.)

aufgetüpfelt und bei Zimmertemperatur 30 Minuten trocknen gelassen. Die Blockierung erfolgt im Block I mit TBS und 1 %

Tween 20 1 Stunde bei 37°C und danach in TBS mit 0,2% Tween 20 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Zunächst wird mit

einem monoklonalen Antikörper (Maus) gegen HSA (Verdünnung 1:1000) inkubiert, danach mit TBS + 1 % Tween 20gewaschen, erneut mit TBS + 0,2% Tween 20 geblockt und mit einem zweiten Antikörper (Kaninchen-Anti-Maus) 1 Stundeinkubiert (Verdünnung 1:500). Nach Waschung mit TBS + 0,1 % Tween 20 eine Stunde bei Zimmertemperatur wird erneut mit

TBS + 0,2% Tween 20 geblockt. Danach werden 35 μΙ E.coli-Lysat, das nach Beispiel 4 a hergestellt worden ist, und das das Fusionsprotiin aus Protein A und NPT Il enthält, zugegeben und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Waschen mit TBS (eine Stunde bei Zimmertemperatur) wird die Nitrocellulose-Membran mit dem kanamycinbeladenen Träger (hergestellt nach DD-WP 254.012) in Kontakt gebracht und der Nachweis wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Nachweisgrenze liegt im Picogramm-Bereich. Beispiel 7 Nachweis von Kartoffel-Virus nach Tüpfeln von Pflanzensäften auf Nitrocellulose mittels NPT ll-gakoppelten Antikörpern

(Nachweis auf Trägern nach DD-WP 254.029)

a) Kopplung von Neomyein-Phosphotransferase Il an Anti-Kartoffelvlrut-Immunogiobuline mittels GLtaraldehyd

400 VQ nach Beispiel 4 a hergestellte und gereinigte NPT Il werden zusammen mit 1 mg Anti-Kartoffelvims-Immunoglobuiinen in einem Dialyseschlauch gegen PSB (16 Stunden, 4⁰C, 800ml, 2 Wechsel) bei einem Schlauchvolumen von 1 ml dialysiert. Nach Umfüllen der dialysierten Probe in ein Glisröhrchen werden 5μΙ C'-'taraldehyd (25%ige Lösung, Berva) zugegeben und 2 Stunden unter leichtem Schütteln bei Zimmertemperatur umgesetzt. Anschließend wird der Kopplungsansatz in den Dialyseschlauch zurückgefüllt und zunächst gegen PBS (4°C. über Nacht) und danach gegen TBS (4⁰C, 800ml, 2 Wechsel, 16 Stunden) dia.'vsiert. Das Reaktionsprodukt wird in Glasröhrchen abgefüllt.

b) Durchführung ies Nachwelses

Eine Verdünnungsleihe Kartoffelblatt-Preßsaft wird auf einen Strei'~n Nitroceüulose-Membran aufgetüpfelt und 30 Minuten eintrocknen lassen. LNe so behandelte Membran wird 1 Stunde bei 37°C in TBS -h 1 % Tween ?3 und anschließend 30 Minuten bei Zimmertemperatui in TBS + 0,2% Tween 20 geblockt. Danach wird das oben hergestellte Kopplungsprodukt in einer Verdünnung von 1:200 z igesetztund 1 Stunde inkubian. Nach der Waschung mit TBS erfolgt der radioaktive Nachweis auf dor mit Kanamycin beladenen Trägerschicht nach dem Kontaktverfahren analog Beispiel 4. Die Nachweisgrenze liegt im Picogramm-Bereich.

Beispiel 8 Nachweis von Kartoffelvirus aus Pflanzensäften nach Tüpfel auf Nitrocellulose mittels Protein A-NPT Il-Fusionsprotein

(Kontaktträger P 81)

Es wird eine Verdünnungsreihe mit Kartoffelblatt-Preßsaft wie in Beispiel 7 hergestellt. Nach der Blockierung wird jedoch oine Stunde mit Anti-Kartoffelvirus-Immunogiobulinen (Kaninchen) (Verdünnung 1:1000) inkubiert. Nach Waschen mit TBS + 0,1 % Tween 20 wird erneut mit TBS + 0,2% Tween 20 geblockt und danach 50μΙ Lysat nach Beispiel 4 a zugegeben und 1 Stunde

inkubiert. Nach der Waschung mit TBS wird das Kontaktverfahren analog zu Beispiel 4b zum Nachweis durchgeführt.

Als kanamycinbeladener Träger wird jedoch Phosphorcellulose (P 81, Whatman, England) eingesetzt. Im Enzympuffer wird eine

spezifische Aktivität des "P-ATP von 10 Mio cpm/ml verwendet.

Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie de' Phosphorcelluiose-Träger nach Waschu.ig mit Wasser (1 Stunde). Die Empfindlichkeit liegt wiederum im Picogramm-Bereich. Beispiel 9 Immunologischer Nachwels von HSA nach Tüpfeln auf Nylon-Membranen mittels Protein A-NPT Il-Fuslonsprotein

(Kontaktträger: kanamycinbeladene Phosphorcellulcse)

Eine Verdünnungsreihe HSA wird auf einen Streifen Nvlon-Membran (Hybond N, Amersr 5m Int.) aufgetüpfelt und 30 Minuten

trocknen gelassen. Die Blockierung I erfolgt 2 Studnen i,i TBS mit 3 % Rinderserumalbumin IBSA) und danach 30 Minuten in TBSmit 1 % BSA. Das Gesamtverfahren erfolgt ebenso wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographieder Phosphorcellulose (P-81 I-Träger.

Beispiel 10 Immunologischer Nachweis von HSA nach Protein-Blotting auf Nitrocellose-Membranen unter proteinfreien Blockierungsbedingungen Die Durchführung des Verfahrens erfolgt, wie es im Beispiel 4 beschrieben worden ist. Jedoch wird als kanamycinbeladener Träger Phosphorcellulose (P 81, Whatman) eingesetzt. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie der Phosphorcellulose mittels Röntgenfilm (Exposition: 15 Minuten, Zimmertemperatur). Beispiel 11 Immunologischer Nachweis.von HSA nach Protein-Blockierung auf Nltrocellulose-Membranen unter proteinfreien Blockierungsbedingungen (Kontaktverfahren mit nomyclnbeladener Phosphorcellulose) Die Durchführung des Gesamtverfahrens erfolgt, wie es im Beispiel 4 beschrieben worden ist. Es wird jedoch als mit

antibiotikumbeladener Träger mit Neomycin beladene Phosphorcellulosa (Inkubation der Phosphorcellulose 30 Minuten miteiner Lösung aus 400mg Neomycin in 60ml Wasser und Waschen mit Wasser 30 Minuten) eingesetzt. Die Auswertung erfolgtdurch Autoradiographie der Phosphorcellulose mittels Röntgenfilm (Exposition: 15 Minuten, Zimmertemperatur).

Beispiel 12 Immunologitcher Nachwelt von HOA nach Blotting von Proteinen auf Nitrocellulose unter proteinfreien Blockierungsbedingungen (Kontakt mit Photphorcelluloie, Kanamycin Im Enzymreaktlons-Puffer) Die Durchführung des Gesamtverfahrens erfolgt wie in Beispiel 4. Als Kontaktträger wird jedoch Phosphorcellulose (P 81, Whatman) ohne vorherige Beladung mit Antibiotika verwendet. Dem Enzympuffer wird Kanamycin mit einer Konzentration von 4 mg/ml zugesetzt. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie der Pnosphorcellulose. Beispiel 13 Wiederverwendung von Protein-Blots Die Protein-Blots auf Nitrocellulose (Hybond C) werden nach der Durchführung des Gesamtverfahrens, wie es im Beispiel 4

beschrieben worden ist (Runde 1), bei 70°C 2mal 15 Minuten mit dem Elutionspuffer 3% SDS, 0,1 M ß-Mercaptoethanol in TBSgewaschen und damit der 1 .Antikörper einschließlich der enzymmarkierten Sonde eluiert. Nach der Waschung wird mit

TBS + 0,1 % Tween 20 erneut geblockt und das Verfahren, wie es im Beispiel 4 beschrieben worden ist, wiederholt. Die Kontaktträger der 1 und der 2. Runde werden gemeinsam autoradiographiert. Es wird kein Intensitätsverlust nach der Wiederverwendung der Blots festgestellt. Beispiel 14 Immunologischer Nachwels von HSA nach Protelnblottlng auf Nitrocellulose unter proteinfreien Blockierungsbedingungen

(Kontaktträger: mit Kanamycin beladene Carboxymethylcellulose)

Die Durchführung des Gesamtverfahrens erfolgt, wie es im Beispiel 4 beschrieben worden ist Als Kontaktträger wird mit Kanamycin beladene Carboxymethylcellulose (CM-rViombranen, Renner GmbH) verwendet. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie der CM-Membranen. Beispiel 15

Immunologischer Nachwolt von HSA nach Protein-Blotting auf Nitrocellulose unter proteinfreien Blockungsbedingungen (Verwendung eines Kopplungsproduktes aut Protein A und NPT Il mit einem Toluylendllsocyanat-2,4-Prapolymeren) A) Herstellung eier enzymmarkierten Sonde

a) Elektrophoretische Reinigung von NPT Il aus E. coli-Lysaten

Das Zellpellet von 10 ml E.coli (NPTII überexprimierend) Zellkultur (pRK 89) wird in 1 ml Lysepuffer aufgenommen und beschallt. Zellreste werden bei 4°C abzentrifugiert. Das Zeliysat wird auf ein präparatives PAA/SDS-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wird nach Waschen mit Wasser in eine kalte Lösung von 0,25 M KCI gelegt, die sichtbar gewordene NPT Il-Bandö mit einem Skalpell herausgeschnitten und zerkleinert. Das Protein wird mittels Elutionspuffer innerhalb von 3 Stunden bei Zimmertemperatur eluiert. Die durch Elution erhaltenen Lösungen werden zentrifugiert und der Überstand mit dem vierfachen volumenkaiten Aceton versetzt und 3 Stunden bei -20°C stehengelassen. Danach wird bei O⁰C zentrifugiert. Nach Waschen wird das Pellet in 200 μΙ Lösepijffer gelöst und gegen 2OmM Natriumphosphatpuffer über Nacht dialysiert (4⁰C). Im Endvolumen von etwa 200 μΙ befinden sich ungefähr 200μρ NPTII.

b) Kopplung

Zur Kopplung wird ein Präpolymeres aus 17,4g 'risch destilliertem Toluylendiisocyanat-2,4 und 30g Polyethylenglykol 600 bei 50-60⁰C hergestellt. 100mg dieses Präpolymeren werden in 500mg Aceton gelöst; nach vollständiger Lösung werden 300mg dieser Lösung in 700mg Wasser emulgiert.

800μΙ des urter a) erhaltenen Lysates werden mit 150\ig Protein A in 150μΙ Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen vermischt. Zu dieser Lösung werden 200μΙ der oben hergestellten Emulsion zugegeben und 1 Stunde unter Schütteln umgesetzt. Nach einer Stunde werden erneut 100 μ! frisch hergestellte Emulsion zugesetzt und noch eine Stunde umgesetzt. Danach wird mit einer Lösung von 200 μρ Lysin in 150 μΙ Wasser 30 Minuten bei Zimmertemperatur gestoppt.

c) Nachweis

Die Durchführung des Gssamtverfahrens erfolgt wie in Beispiel 4. Jedoch wird an Stelle des gentechnisch hergestellten Protein A-NPT Il-Fusionsproteins 50μΙ des oben hargesnll'en Kopplungsproduktes als enzymmarkierte Sonde verwendet. Der Nachweis erfolgt wieder durch Autoradiographie.

Beispie! 16

Immunologischer Nachwelt von HSA ncch Tüpfeln auf CCA-Papler (Kontaktträger nach DD-WP 254.012)

Eine Verdünnungsreihe von HSA wird auf CCA-Papier (hergestellt nach EP 0134.026) aufgetüpfelt und 30 Minuten an der Luft

trocknen gelassen. Danach wird der Träger in eine Lösung aus 10% Sulfanilsaure und 10% Triethanolamin (pH = 7,5) eine

Stunde bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Der Block I erfolgt in TBS mit 0,5% Gelatine und 30 Minuten in TBS mit 0,25% Gelatine. Danach wird das Verfahren . ie in Beispiel 5 durchgeführt.

Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie des Kontaktträgers nach DD-WP 254.012 und das CCA-Papiers. Auf beiden Trägern läßt sich durch "P-γ-ΑΤΡ markiertes Kanamycin nachweisen.

Beispiel 17 Immunologischer Nachwels von HSA nach Tüpfeln auf ein negatlvlertes Papier (Kontaktträger Phosphorcellulose)

Ein negativierter Träger wird aus CCA-Papier und Sulfanilsaure nach DD-WP 237.841 hergestellt. Auf diesen Träger wird eine Verdünnungsreihe von HSA aufgetüpfelt und als Blockierungsmittel (Block I und II) eine Lösung von 10% Sulfanilsaure und 10% Triethanolamin vom pH = 7,5 verwendet. Als mit kanamycinbeladener Träger wird mit Kanamycin beladene Phosphorcellulose (P 81, Whatman) verwendet. Der Nachweis erfolgt dann wie in Beispiel 4. Der Nachweis des HSAerfolgt durch Autoradiographie an beiden Trägern.

Beispiel 18 Immunologischer Nachwels von HSA nach Tüpfeln auf einen hydrophoben Trager (Kontaktträger nach DD-WP 254.012)

Ein hydrophober Träger wird nach DD-WP durch Umsetzung des CCA-Papiers (nach EP 0134.025) mit äquimolekularen

Mengen Bi-n-octylamin und Sulfanilsaure als Natriumsalz hergestellt. Auf diesen Träger wird eine HSA-Verdünnungsreihe aufgetragen. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur sind die Tropfen auf dem Träger eingetrocknet, man läßt noch weitere 15 Minuten nachtrocknen. Die Blockierung erfolgt im Block I und Il mit TBS plus Gelatine, wie es in Beispiel 5 beschrieben worden ist. Die Durchführung des Verfahrens erfolgt ansonsten, wie os im Beispiel 4 beschrieben worden ist.

Der Nachweis erfolgt durch Autoradiographie auf beiden Trägern.

Beispiel 19 Immunologischer Nachweis von HSA nach Proteinblotting auf Nitrocellulose (Kontaktträger Phosphorcellulose) und Verstärkung der Nachweisreaktion

Eine Verdünnunysreihe wird auf Nitrocellulose (Hybond C, AmersharrOgeblottet und anschließend geblockt, wie es im Beispiel 4 beschrieben worden ist. Nach der Inkubation mit dem ersten Antikörper wird zunächst mit TBS + 0,1 % Tween 20 1 Stunde gewaschen, danach wieder geblockt (TBS mit C °% Tween 20) und mit 1Qpg Protein A in 10ml Lösung leicht geschüttelt. Daran anschließend wird erneut mit TBS + 0,1 % Tween 20 gewaschen und erneut geblockt.

100μΙ des vorgebildeten Komplexes aus HSA-Antihumanserumalbumin-Protein-NPTII-Fusionsprotein (hergestellt aus 50μΙ Lysat nach Beispiel 4,50|ig HSA und 50μΙ Anti-HSA-Immunglobulin [Kaninchen), Inkubation bei 4^rC über Nacht) werden dann zugesetzt und 1 Stunde inkubiert. Anschließend wird mit TBS gewaschen und das Kontaktverfahren nach Beispiel 4 mit einem mi! Kanamycin beladenen Träger nach DD-WP 254.012 durchgeführt. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie des Kontakt-Trägers (30 Minuten bei Zimmertemperatur).

Beispiel 20 Immunologischer Nachweis von -Fetoprot-.in nach Tüpfeln auf Nitrocellulose (Kontaktträger nach DD-WP 254.012)

- Verstärkung durch mit Antikörper vernetztes Protein A-NPT Il-Fusionsprotein Die ersten Schritte des Verfahrens erfolgen, wie es im Beispiel 6 beschrieben worden ist. Nach der Inkubation mit dem I.Antikörper (monoklonal) wird mit TBS + 0,1% Tween 20 gewaschen und mit TBS + 0,2% Tween 20 geblockt. Danach werden 50μΙ biologisch vernetztes Protein A-NPT Il-Fusionsprotein zugesetzt und 1 Stunde inkubiert.

Nach der Waschung tit TBS(I Stunde) wird weiter wie in Beispiel 6 verfahren. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie des Kontaktträgers in 20 Minuten bei Zimmertemperatur.

Herstellung des biologisch vernetzten Protein A-NPT Il-Fusionsproteins

50μΙ eines nach Beispiel 4 hergestellten Zellysates mit Protein A-NPT Il-Fusionsprotein werden mit 5μΙ Kaninchen-Anti-Maus-Antiserum vermischt und bei 4^CC über Nacht inkubiert. Der sich bildende Komplex aus Protein A-NPT Il-Fusionsprotein und Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper wird als 2. Antikörper nach dem Nachweis eines Antigens mit dem ersten Antikörper (Maus) verwendet.

Beispiel 21 Immunologischer Nachweis von HSA (Enzym-Reaktion In Lösung)

Eine Verdünnungsreihe von HSA wird auf einzelne Rundfilter aus Nitrocellulose (Hybond C, Amersham Int.) aufgetüpfelt (Durchmesser 0,5cm²) und zunächst wie in Beispiel 4 weiter bearbeitet. Nach dem Inkubieren mit Protein A-NPT Il-Fusionsprotein werden die Filter 1 Stunde in TBS gewaschen utid danach einzeln in Plastebehälter überführt. Es werden jeweils 0,5 ml Enzympuffer, 1mg Kanamycin und "Ρ-γ-ΑΤΡ (10 Mio. cpm/ml, spezifische Aktivität 5000C/mM) zugesetzt und 1 Stunde bei 37°C umgesetzt. Die Nitrocellulose-Menr.branen werden entnommen, ein Rundfilter aus Phosphorcellulose (P 81,1cm³) zugesetzt und 30 Minuten geschüttelt. Die Phosphorcellulosr.-Filter werden entnommen, 1 Stunde mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Szintillationszähler gemessen. Die Auswer :ung erfolgt direkt über den Meßwert der Radioaktivität (als Kontrolle wird ein Nitrocellulose-Filter ohne HSA mitgeführt).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen mittels markierter molekularer Sonden, gekennzeichnet dadurch, daß in Lösung befindliche, im Gel enthaltene oder an eine feste Phase I gebundene Biomoleküle von einer an ein Enzym gekoppelten molekularen Sonde erkannt werden, das an die molekulare Sonde gekoppelte oder abgespaltene Enzym mit einem Substrat in Anwesenheit eines Cosubstrates zur Reaktion gebracht und das umgesetzte Substrat an einer festen Phase Il oder III nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Nachweis der Biomoleküle in folgenden Schritten durchgeführt wird:

a) Erkennungsschritt, in dem die durch ein gekoppeltes Enzym markierte molekulare Sonde an das in Lösung befindliche, im Gel enthaltene oder an eine feste Phase I gebundene Biomolekü! mit dafür spezifischer Affinität angelagert wird;

e) Auswertungsschritt, in dem das umgesetzte Substrat an oinor festen Phase Il oder III gemessen oder durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß

- im Erkennungsschritt a) Biomoleküle in Gelen oder anderen Trenn- und Trägermaterialien aufgetrennt werden und die die Biomoleküle enthaltenden Trenn- und Trägermaterialien mit einer die enzymgekoppelten molekulare Sonde enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht werden, wobei Biomolekül und markierte molekulare Sonde zu einem Komplex aus Biomolekül und enzymyekoppelter Sonde im Gel oder Trenn- und Trägermaterial umgesetzt werden;

- im Waschiichritt b) überschüssige markierte molekulare Sonde aus dem Gel oder Trenn- und Trägermaterial ausgewaschen wird;

• - im Enzymreaktionsschritt c) das Gel oder Trenn- und Trägermaterial mit einem zweitt η GoI oder Trenn- und Trägermaterial, das das Substrat und das Cosubstrat enthält, in Kontakt gebracht und das Substrat umgesetzt wird;

- im Trennschritt d) das zweite Gel oder Trenn- und Trägermaterial mit d im umges tzten Substrat mit einer festen Phase III in Kontakt gebracht und das umgesetzte Substrat an ihr gebunden wird; und nach Waschschritten

- im Auswertungsschritt e) das umgesetzte Substrat auf der festen Phase III durch Messung der Radioaktivität oder durch Autoradiographie oder ein anderes Verfahren nachgewiesen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekonnzeichnet dadurch, daß nach den Schritten a und b das Gel oder Trenn- und Trägermaterial, das den Komplex aus Biomolekül und enzymmarkierter molekularer Sonde enthält, mit einer festen Phase II, an die dus Substrat gebunden ist, in Gegenwart eines Cosubstrates in Kontakt gebracht und das enzymatisch umgesetzte Substrat auf der festen Phase Il nachgewiesen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß

- sich im Erkennungsschritt a) die an ein Enzym gekoppelte molekulare Sonde und das Biomolekül in Lösung befinden und dort aneinander angelagert werden;

- im Waschschritt b) überschüssige markierte molekulare Sonde abgetrennt wird;

- im Enzymreaktionsschritt c), in dem das Enzym des Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde in Lösung mit dem Substrat in Gegenwart des Cosubstrates zur Reaktion gebracht wird;

- im Trennsc'.ritt d) die Abtrennung des enzymatisch umgesetzten Substrates vom überschüssigen Cosubstrat durch eine das Substrat selektiv bindende feste Phase III durchgeführt wird; und

- im Auswertungsschritt e) das umgesetzte Substrat an der festen Phase III gemessen oder autoradiographisch bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß

- im Erkennungsschritt a) die durch ein gekoppeltes Enzym markierte molekulare Sonde an das an eine feste Phase I gebundene Biomolekül angelagert wird;

- im Waschschritt b) überschüssige markierte molekulare Sonde ausgewaschen und/oder abgetrennt wird;

- im Enzymreaktionsschritt c) das Enzym des an eine feste Phase I gebundenen Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde mit in Lösung befindlichem Substrat und Cosubstrat zur Reaktion gebracht wird;

- im Trennschritt d) nicht umgesetztes Cosubstrat und ggf. Substrat abgetrennt und umgesetztes Substrat an eine feste Phase III gebunden wird;

- im Auswerturrgsschrittdas umgesetzte Substrat an der festen Phase III gemessen oder autoradiographisch bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase I mit daran gebundenem Biomolekül und an dieses angelagerter markierter molekularer Sonde nach den Schritten a und b) im Enzymreaktionsschritt c) mit einem Gel oder einem anderen Trenn- und Trägermaterial, in dem sich Substrat und Cosubstrat befinden, überschichtet wird und anschließend im Trennschritt aus dem Gel oder Trenn- und Trägermaterial das umgesetzte Substrat auf eine feste Phase III übertragen und im Auswertungsschritt e) dort nachgewiesen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß

- im Erkb^nungsschritt a) die durch ein gekoppeltes Enzym markierte molekulare Sonde an das an eine feste Phase I gebundene Biomolekül angelagert wird;

- im Enzymreaktionsschritt c) das Enzym des an eine feste Phase I gebundenen Komplexes aus Biomolekül und markierter molekularer Sonde mit einem an eine feste Phase Il gebundenen Substrat in Gegenwart eines sich in Lösung befindlichen Cosubstrates zur Reaktion gebracht wird;

- im Trennschritt d) überschüssiges Cosubstrat ausgewaschen oder abgetrennt wird; und

- im Auswertungsschritt e) das umgesetzte Substrat an der festen Phase Il gemessen oder autoradiographisch bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß im Erkennungsschritt a) das Biomolekül in einem oder mehreren Erkennungssystemen und in einer oder mehreren Reaktionsstufen zunächst von einem oder mehreren Molekülen mit spezifischer Affinität erkannt oder mit einem oder mehreren Molekülen umgesetzt wird und die mit einem Enzym gekoppelte molekulare Sonde mit mindestens einem dieser Moleküle zur Reaktion gebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 6 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß als feste Phase I, an die das Biomolekül gebunden ist, ein kovalent bindender, ionisch bindender oder über elektrostatische Wechselwirkungen bindender Träger eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß als Träger Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polyamid, geladenes Polyamid, Diazobenzyloxymethylceliulose, Diethylaminoethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose, aktiviertes Polystyren oder chemisch aktiviertes Glas verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase I in Form eines Flächenmaterials eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 2,4 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß als feste Phase Il ein das Substrat bindender Träger eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat bindender Träger ein kovalent bindender, ionisch bindender oder über elektrostatische Wechselwirkungen bindender Träger eingesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß als Träger Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polyamid, geladenes Polyamid, Diazobenzyloxymethylceliulose, Diethylaminoethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose, aktiviertes Polystyren, chemisch aktiviertes Glas, Phosphorcellulose, Carboxymethylcellulose oder durch Cyanurchlorid und eine Verbindung, die eine Aminogruppe und eine Carbonsäure-, Phosphorsäure- oder Sulfonsäuregruppe aufweist, modifizierte Cellulose eingesetzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase Il in Form eines optisch durchlässigen Materials eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase I! in Form eines Flächenmaterials eingesetzt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 und 5 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß als feste Phase IiI ein das Substrat und/oder das enzymatisch umgesetzte Substrat selektiv bindendes GoI, Trenn- oder Trägermaterial eingesetzt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß als selektiv bindendes Gel, Trennoder Trägermaterial ein !covalent bindender, ionisch bindender oder über elektrostatische Wechselwirkungen bindender Träger eingesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet dadurch, daß als Träger Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Polyamid, geladenes Polyamid, Diazobenzyloxymethylcellulose, Diethylaminoethylcellulose, durch Cyanurchlorid aktivierte Cellulose, aktiviertos Polystyren, chemisch aktiviertes Glas, Phosphorcellulose, Carboxymethylcellulose oder durch Cyanurchlorid und eine Verbindung, die eine Aminogruppe und eine Carbonsäure-, Phosphorsäure- oder Sulfonsäuregruppe aufweist, modifizierte Cellulose eingesetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase III in Form eines optisch durchlässigen Materials verwendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase IN in Form eines Flächenmaterials verwendet wird.

23. Verfahren nach Anspruch 2,16 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß der Auswertungsschritt e) an optisch durchlässigen Materialien nach nichtradioaktiven Verfahren mittels optischer Methoden durchgeführt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Biomoleküle auf die feste Phase I durch Tüpfeln oder nach Auftrennung in Gelen oder anderen Trenn- und Trägermaterialien durch Blottingverfahren aufgebracht werden.

25. Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß der Enzymreaktionsschritt c) mit dem an die molekulare Sonde gekoppelten Enzym oder mit dem von dieser abgespaltenen Enzym' durchgeführt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß als molekulare Sonde, die an ein Enzym gekoppelt ist, ein mono- oder polyklonaler Antikörper, ein Antiserum, ein Protein, ein Peptid, eine einzelsträngige, doppelsträngige oder partiell doppelsträngige DNS oder Gin Fragment davon, ein Oligodesoxyribonucleotid, eine RNS oder ein Fragment davon, ein Oligoribonucleotid, ein Protein mit spezifischer Affinität zu einem anderen Biomolekül oder eine chemische Verbindung mit Affinität zu einem Biomolekül eingesetzt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet dadurch, daß das Protein mit spezifischer Affinität zu einem anderen Biomolekül Avidin oder Streptavidin ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet dadurch, daß als chemische Verbindung mit Affinität zu einem Biomolekül Biotin verwendet wird.

29. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als enzymgekoppelte molekulare Sonde eine an das Enzym kovalent gekoppelte Sonde eingesetzt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, daß als enzymgekoppelte Sonde eine mittels Glutaraldehyd, Benzochinon, Bis-succinimidylestern, Bisimidaten oder Aziden gekoppelte molekulare Sonde eingesetzt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch,daß als enzymgekoppelte molekulare Sonde eine über ionische Bindungen gekoppelte molekulare Sonde eingesetzt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß als enzymgekoppelte molekulare Sonde eine über Polyethylenirnin gekoppelte molekulare Sonde eingesetzt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als enzynigekoppelte molekulare Sonde eine über hydrophobe oder andere elektrostatische Wechselwirkungen gekoppelte molekulare Sonde eingesetzt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als markierte molekulare Sonde ein Fusionsprotein aus Enzym und molekularer Sonde verwendet wird.

35. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, daß die kovalent gekoppelte molekulare Sonde vom Enzym abspaltbar ist.

36. Verfahren nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß die Abspaltung photochemisch oder reduktiv durchgeführt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 1,25 und 29 bis 33, gekennzeichnet dadurch, daß als enzymgekoppelte molekulare Sonde eine an das Enzym reversibel gekoppelte molekulare Sonde eingesetzt wird.

38. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym eine Transferase (E. C. 2) eingesetzt wird.

39. Verfahren nach Anspruch 38, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym eine Acyltransferase (E. C. 2.3) eingesetzt wird.

40. Verfahren nach Anspruch 38, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym eine Phosphor enthaltende Gruppen übertragendes Enzym (E. C. 2.7) eingesetzt wird.

41. Verfahren nach Anspruch 40, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphor enthaltende Gruppen übertragendes Enzym eine Aminoglucosid-Phosphotransferase (E. C. 2.7.1) eingesetzt wird.

42. Verfahren nach Anspruch 41, gekennzeichnet dadurch, daß als Aminoglucosid-PhosphotransferaseeineKanamycin-PhosphotransferasefE.C. 2.7.1.95) eingesetzt wird.

43. Verfahren nach Anspruch 40, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphor enthaltende Gruppen übertragendes Enzym eine Proteinkinase (E. E. 2.7.1) eingesetzt wird.

44. Verfahren nach Anspruch 40, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphor enthaltende Gruppen übertragendes Enzym eine T4-Polynucleotid-Kinase (E. C. 2.7.1.78) eingesetzt wird.

45. Verfahren nach Anspruch 40, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphor enthaltende Gruppen übertragendes Enzym eine Nucleotidyltransferase (E. C. 2.7.7) eingesetzt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 45, gekennzeichnet dadurch, daß als Nucleotidyltransferase eine DNS-Polymerase (E. C. 2.7.7.7) eingesetzt wird.

47. Verfahren nach Anspruch 45, gekennzeichnet dadurch, daß als Nucleotidyltransferase eine Polynucleotid-Adenyltransferase (E. C. 2.7.7.19) eingesetzt wird.

48. Verfahren nach Anspruch 45, gekennzeichnet dadurch, daß als Nucleotidyltransferase eine DNS-Nucleotidylexotransferase (E. C. 2.7.7.31) eingesetzt wird.

49. Verfahren nach Anspruch 45, gekennzeichnet dadurch, daß als Nucleotidyltransferase eine Revertase (E. C. 2.7.7.49) eingesetzt wird.

50. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym eine Ligase (E. C. 6) eingesetzt wird.

51. Verfahren nach Anspruch 50, gekennzeichnet dadurch, daß als Ligase ein Phosphorester bildendes Enzym (Repair-Enzyme) (E. C. 6.5) eingesetzt wird.

52. Verfahren nach Anspruch 51, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphorester bildendes Enzym eine DNS-Ligase (E. C. 6.5.11) eingesetzt wird.

53. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat Chloramphenicol eingesetzt wird.

54. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 41, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat ein Aminoglucosid- Antibiotikum eingesetzt wird.

55. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 42.- gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat Kanamycin, Neomycin, Gentamycin oder Paroniomycin eingesetzt wird.

56. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 43, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat phosphorylierbare Proteine eingesetzt werden.

57. Verfahren nach Anspruch 56, gekennzeichnet dadurch, daß als phosphorylierbare Proteine Histone eingesetzt werden.

59. Verfahren nach Anspruch \ bis 9 und 44, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat eine RNS, DMS/ ein Desoxynbo- oder RibooMgonudeotid oder mn Desoxyribo- oder Ribopolynuclöotid eingesetzt wird.

59. Verfahren nach Anspruch t bis 9 und 46, gekennzeichnet dadurch, daß als Substratr eine uoppe\sUängige DNS eingesetzt wird.

60. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 47, gekennzeichnet dadurch, daß a/s Substrat eine RNS eingesetzt wird.

61. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 48, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat eine einsträngige oder doppelsträngige DNS eingesetzt wird.

62. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 49, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat eine einsträngige DN¹S und ein Starter (primer) eingesetzt werden.

63. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 52, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat eine doppelsträngige DNS eingesetzt wird.

64. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9,39 und 53, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat ein ¹⁴C- oder ³H-markiertes Acetat eingesetzt wird.

65. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9,41 bis 44 und 54 bis 58, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat ATP und/oder gamma-³²P-ATP eingesetzt werden.

66. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9,46,48,49,59,61 und 62, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstratein Gemisch der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate eingesetzt wird, wobei eines oder mehrere Desoxynucleosidtriphosphate in alpha-Stellung durch ³²P markiert sind.

67. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9,47 und 60, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat alpha-³²P-ATP oder ein Gemisch aus alpha³²P-ATP und ATP eingesetzt wird.

68. Verfahren nach Anspruch 1-9,46,48,49, 59,61 und 62, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat ein durch ³⁵S, ³H oder ¹²⁶I markiertes Desoxynucleosidtriphosphat oder ein Gemisch von markierten und ggf. unmarkierten Desoxynucleosid-triphosphaten eingesetzt wird.

69. Verfahren nach Arvspruch 1 bis 9,46,48,49,59,61 und 62, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat ein biotinyliertes Desoxynucleosidtriphosphat eingesetzt wird.

70. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 und 52, gekennzeichnet dadurch, daß als Cosubstrat DNS oder markierte DNS und/oder Desoxyribopolynucleotide eingesetzt werden.