DD283330A5 - Zepareth-herstellungsverfahren aus selektierten zellinien begrenzter vermehrungspotenz (finit lines) - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums aus selektierten Zellinien ist eine Erfindung auf dem Gebiet der Zytologie mit dem Ziel, ein Reaktionsmuster in Vertebratenzellen (RiV), das in wesentlichem aus zytoplasmatischen Partikeln (RiV-Partikeln) besteht und das das morphologische AEquivalent fuer die zellulaer-partikulaeren Resistenzfaktoren darstellt, fuer die Therapie von Virusinfektionen und Tumorerkrankungen nutzbar zu machen. Die sich hieraus ergebene erfinderische Aufgabe besteht darin, Zellpopulationen mit begrenzter Vermehrungspotenz zu finden, die keine Myelinfiguren, onkogene Potenzen oder peristierende Viren enthalten und die eine staendige seuchenhygienische UEberpruefung ihres Herkunftsbestandes nicht erforderten. Die Loesung besteht darin, mit Hilfe der Elektronenmikroskopie und der Immunfluoreszenzmikroskopie Zellinien mit begrenzter Vermehrungspotenz von Wirbeltierembryonen auf RiV-Partikeln-Produktion groszer Quantitaet zu selektieren, um sie einer Zellgroszproduktion zu unterwerfen und anschlieszend RiV-Partikeln nach an sich bekannten Anreicherungs- und Reinigungsschritten aus den Zellsedimenten zu gewinnen und sie als Therapeutikum in der Human- und Veterinaermedizin einzusetzen.

Description

Die der Erfindnng zugrunde liegende technische Aufgabe wird durch folgende Verfahrensschritte gelöst: Erfindungsgemäß werden aus Organen von Wirbeltierembryonen durch bekannte zellzüchterische Maßnahmen Zeilkulturen angelegt, von denen Zellpopulationen (Zellinien) mit größtem Vermehrungsvermöger. selektiert werden; alle Zellinien werden mit Hilfe der Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie auf unerwünschte Bestandteile und auf die Produktion von zellulär-partikulären Resister.zfaktoren in großen Mengen geprüft und standardisiert hinsichtlich Kultivierungsbedingungen und biologischen Eigenschafte:,. Weitere Schritte sind: Verwendung dieser Zellinien in ihren mittleren Passagenbereichen (1b. bis 45. Passage) zur produktionstechnischen Vermehrung in stationärer Form; Gewinnung der ZeH. edimente nach optimaler Kultivierungsdauer (3 bis 4 Tage); Desdruktion der Zellen im Zellsediment auf physikalischem Wege (Ultraschall, Gefriertauzyklen u.a.); Resuspension des Zelldetritus; Trennung der RiV-Partikeln vom Zelldetritus durch einfache Zentrifugation (z.B. 5000U/min für 20min) oder Fällungs- bzw. Filtrationsverfahren; RiV-Partikeln im Überstand; bei RiV-Partikelnkonzentrationen von mehr als 1OVPartikeln/ml therapeutische Wirksamkeit garai itiert, andei nfalls RiV-Partikeln-Anreicherungsschritte (z.B. Ultrazentrifugation entsprechend der RiV-Partikeln-lsodichten: 1,32 bis 1,34g/ml Caesiumchlorid, 1,20 bis 1,23g/ml Saccharose); das resuspendierte Partikelnsediment repräsentiert das Therapeutikum.

Ausführungsbeispiel

Der Embryo eines gesunden Rindes (ohne persistierende Virusinfektionen, Tumoren oder genetische Defekte) wird unter sterilen Bedingungen gewonnen und aus seinen Organen werden mit Hilfe zellzüchterischer Maßnahmen Zellkulturen angelegt zur Gewinnung von begrenzt wachsenden Zellinien, die sorgfältig vor mikrobiellen Kontaminanten zu schützen sind. Von den Zellkulturen müssen Zellpopulationen mit größtem Vermehrungsvermögen ausgewählt und weiterer Passagierung zugeführt werden. Die so erhaltenen Zellen mit begrenzter Vermehrungspotenz gelangen zur elektronenmikroskopischen und zur immunelektronenmikroskopischen Untersuchung. Im Elektronenmikroskop sind die den zellulär-partikulären Resistenzfaktoren zu Grunde liegenden Reaktionsmuster der Zelle (RiV) deutlich erkennbar. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie ist in der Lage, unter Benutzung von Hyperimmunseren gegen RiV-Partikeln eine feingranuläre, zytoplasmatische, zellkernnahe Fluoreszenz zu diagnostizieren, um damit ebenfalls die für das Herstellungsverfahren notwendigen Zellpopulationen zu bestimmen. Die so selektierten Zellinien begrenzter Vermehrungspotenz werden im Passagenbereich zwischen der 15. und 4P. Passage für das Produktionsverfahren bereitgestellt. Die Zellkultivation erfolgt in Rollerflaschen mit 5I Rauminhalt, die Ernte, d. h. die Gewinnung des Zellsediments nach 3 bis 4 Tagen. Die Zellen im geernteten Zellsediment werden mit Hilfe von Ultraschall zerstört, der Zelldetritus resuspendiert und mit Hilfe von Zentrifugationen oder Fällungen die RiV-Partikeln von den anderen Zellbestandteilen getrennt. Der Überstand kann direkt oder nach zusätzlicher Partikelnanreicherung mit der Ultrazentrifuge zur Anwendung gelangen.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums aus selektierten Zellinien, gekennzeichnet dadurch, daß aus Organen von Wirbeltierembryonen Zellinien gezüchtet werden, daß aus diesen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie solche selektiert werden, die im großen Maße zellulär-partikuläre Resistenzfaktoren (RiV-Partikeln) produzieren, daß diese so selektierten Zeliinien in ihrem mittleren Passagenbereich (15. bis 45. Passagen) gezüchtet werden, daß die so erhaltenen Zellen nach jeweils optimaler Kultivierungsdauer (3 bis 4Tage) als Zellsediment geerntet werden, daß die Zelle des Zellsedimentes vorzugsweise durch Ultraschall oder Gefriertauzyklon zerstört und als Zelldetritus resuspendiert werden, daß in an sich bekannter Weise wie Zentrifugation, Fällung, Ultrazentrifugation entsprechend der Partikel-Isodichten unter Vermeidung von chemischen Detergentien (Chloroform) RiV-Partikeln von übrigen Zellbestandteilen getrennt und suspendiert werden und in einer Quantität von mindestens 10⁶/Partikeln/ml alsTherapeutikum hergestellt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums aus selektierten Zellinien zur Behandlung von Virus- und Tumorerkrankungen in der Human- und Veterinärmedizin.

   Charakteristik des bekannten Standes der Technik

   Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von Therapeutika mit vergleichbarer therapeutischer Zielsetzung (DD 125748, DD 144359, DD 145705, DD 156667, DD 137785) beruhen auf der Gewinnung von Viren (Retro- bzw. Papovaviren) oder ihren Bruchstücken oder von löslichen fetalen Proteinen mit dem Zweck, stimulierend oder immunisierend auf den zu heilenden Organismus einzuwirken. Die Herstellungsverfahren basieren auf der Verwendung von primären Zellkulturen, insbesondere aviärer embryonaler Herkunft oder von permanenten Zellpopulationen. Ein wesentlicher Schritt dieser Herstellungsverfahren ist die Anwendung von Detergentien, insbesondere von Chloroform. Die technischen und ökonomischen Mängel, die durch die erfindungsgemäße Lösung beseitigt werden, bestehen in folgendem: Die kurative Verwendung von Präparaten, die oben bezeichneten Viren bzw. ihre Bruchstücke - auch nach Inaktivierung - enthalten, ist nach dem heutigen Stand der Technik wegen möglicher Schädigung des Immunsystems und/oder Stimulierung unerwünschter Reaktionen, wie Manifestation persistierender Virusinfektionen, nicht zweckmäßig. Das Herstellungsverfahren von löslichen fetalen Proteinen schließt ebenfalls die Mitgewinnung von Viren oder ihrer Bruchstücke teilweise ein. Die generelle Anwendung von Detergentien bei den genannten Verfahren zerstört einen wesentlichen Teil wirksamer Bestandteile in den Präparationen. Die Verwendung von primären Zellkulturen erfordert hohen ökonomischen technischen Aufwand für seuchenhygienische Prüfungen des Herkunftsbestandes. Primäre Zellkulturen, insbesondere die aviärer embryonaler Herkunft enthalten unter den für das Herstellungsverfahren notwendigen Kultivierungsbedingungen in großen Mengen irregulärer Myelinfiguren, die bei der weiteren präparativ-technischen Arbeit in kleinere Einheiten zerfallen und als Mitbestandteil des Endproduktes Anlaß zu klinischen Komplikationen geben können (allergische Enzephalitis). Permanente Zellpopulationen enthalten onkogene Potenzen und sind ais Basis zur Herstellung von Therapeutika für die Humanmedizin nicht geeignet.

   ."iol der Erfindung

   Ziel der Erfindung ist es, ein für den technischen Betrieb geeignetes Verfahren zur Herstellung hochwertiger Therapeutika zur Behandlung von Virus· und Tumorerkrankungen zu finden, die eine gleichbleibende Qualität besitzen und schädliche Nebenwirkungen ausschließen.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Der Erfindung liegt die technische Aufgabe zugrunde, Zellpopulationen zu finden, die frei von persistierenden Viren oder anderen Mikroorganismen sind, keine onkogenen Potenzen enthalten, weitgehend frei sind von irregulären Myelinfiguren, keinen ökonomisch-technischen Aufwand erfordern zur seuchenhygienischen Absicherung des Herkunftsbestandes, die in Kultivierungsbedingungen und biologischen Eigenschaften standardisierungsfähig sind und die zur Herstellung des Therapeutikums notwendigen partikulären Resistenzfaktoren in großen Mengen produzieren. Es wurde gefunden, daß Vertebratenzellen zu einem besonderen elektronenmikroskopisch erkennbaren Reaktionsmuster fähig sind (Reaktionsmuster in Vertebratenzellen = RiV), dessen wesentlicher Bestandteil aus in großen Mengen auftretenden etwa 50nm großen, sphärischen Partikeln (RiV-Partikeln) bestehen. RiV ist ein Ausdruck der zellulären Reaktionsfähigkeit bzw. der Antwort auf Virusinfektionen und besitzt bei bisher untersuchten Spezies biochemisch, immunologisch und in der Wirkungsweise nicht unterscheidbare Eigenschaften. RiV-Partikeln repräsentieren zellulär-partikuläre Resistenzfaktoren und stellen das Substrat eines physiologischen Abwehrsystems der Zelle und ihres Verbandes dar, das unterhalb der Ebene des phylogenetisch jüngeren Immunsystems wirkt mit speziesübergreifenden Eigenschaften und großer therapeutischer Breite.