DD283737A7 - Verfahren zur kultivierung von methanotrophen bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von methanotrophen Bakterien. Die Erfindung gehoert in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweiszgewinnung. Die Erfindung verfolgt das Ziel, fuer das Erdgasverfahren ein Prozeszregime zu entwickeln, das die Konzentrationen des Gasgemisches auszerhalb des explosiven Bereiches vorsieht, das maximales Wachstum beim Anfahren und bei Druckfermentation gewaehrleistet und damit zu einer sicheren kontinuierlichen Prozeszfuehrung und Verkuerzung der UEbergangszeit von diskontinuierlichem zu kontinuierlichem Betrieb fuehrt. Es wurde gefunden, dasz das Verhaeltnis n1/n2 der Konzentration des geloesten Sauerstoffs in der Kulturfluessigkeit zur Konzentration des Sauerstoffs im Gasgemisch eine geeignete Prozeszfuehrungsgroesze ist. Die Prozeszfuehrung sieht eine Gasversorgung in den Grenzen fuer n1/n2 von 5-30, bevorzugt 8-25 vor, wobei der obere Grenzwert entweder durch Druckerhoehung oder Erhoehung der O2-Konzentration im Gasgemisch eingestellt und der untere Wert nach entsprechendem Wachstum erreicht werden.{Bakterien; Druckfermentation; Sauerstoffkonzentration; Eiweiszgewinnung; diskontinuierlich; Erdgas; kontinuierlich}

Description

Verfahren zur Kultivierung von methanotrophen Bakterien

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung und kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen Methan oder Erdgas mit Hilfe methanotropher Bakterien mikrobiologisch umgesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen [lösungen

Die bekannten Verfahren gehen davon aus, daß methanotrophe Bakterien in einem Nährstoffe enthaltenden Fermentationsmedium in Gegenwart eines methan- und sauerstoffhaltigen Gases kultiviert werden, wobei diskontinuierlich und kontinuierlich gearbeitet wird.

Temperatur und pH-Wert des Fermentationsmediums werden in den für die jeweilige Kultur optimalen Bereichen gehalten

Es sind Verfahren bei Normaldruck und bei erhöhtem Systemdruck bekannt, wobei für extrem hohe Drücke ( 40 at in GB-PS 1150401, 1500 psig in GB-PS 1320722 ) allerdings keine Beispiele gegeben werden.

Die Zusammensetzung des Begasungsgemisches schwankt in weiten Bereichen, in DE-CS 2610478 Verhältnis Methan zu Luft von 2:1 bis 1:6 , in GB-PS 1320722 Methan 1-97 %, Ö2 3-74 % oder in DE-OS 2241258 Methan 10-50 %, bevorzugt 15-25 %, O2 10-19 % bevorzugt 16-18 %.

Auf die Vermeidung explosiver Gasgemische wird mehrfach hingewiesen ü.B. GB-PS 1150401, dagegen arbeitet das Verfahren aus DE-OS 2417848 ausdrücklich im explosiven Bereich und sieht eine energetische Verwendung des Abgases vor.

Die Zusammensetzung des Begasungsgemisches wird nach verschiedenen Gesichtspunkten z.B. ökonomischen oder vom Stoffübergang

bedingten gewählt, dabei kommt es aber nie zu einer optimalen CH4- bzw. 02- Versorgung für die Kultur selbst.

Zwar wird von Inhibierung des Wachstums bei einem zu hohen Angebot an O2 in der GB-PS 1320722 gesprochen und eine Gelöstkonaentration von 1-30 ppm 0?. vorgeschlagen, doch ist bei all den vorgeschlagenen Verfahren nicht gewährleistet, insbesondere bei Anwendung von erhöhtem Druck, daß limitierende oder inhibierende Konzentrationen der gelösten Gase vermieden werden, wenn das momentane Wachstum nicht mit dem Angebot der Gaskomponenten übereinstimmt, die meist in konstanten Verhältnissen dosiert werden. Nur in der DE-OS 2308087 , die allerdings den Schwerpunkt auf die Gasrückführung legt, wird davon gesprochen, verbrauchtes Gas dem jeweiligen Prozeßzustand angepaßt zu ergänzen.

Es sind auch Verfahren bekannt, die durch Nutzung von oxidierten Derivaten des Methans (DE-OS 2460672) oder von Stoffwecheelprodukten (DE-OS 2610478) maximales Wachstum bewirken sollen, doch nutzen diese nicht die Potenzen einer optimalen Gasversorgung, denn die in diesen Verfahren beanspruchten Ziele maximales Wachstum und maximale Gasnutzung schließen einander aus

Schließlich beanspruchen die meisten Verfahren nur bestimmte stationäre Zustände des kontinuierlichen Prozesses, lassen aber die ' meist schwierige instationäre Phase des Anfahrens, in der z.B. zu jeder Zeit Limitierungen und Inhibierungen, Auswaschen der Kultur oder explosive Gasgemische vermieden werden müssen, offen. Lediglich in der DE-OS 2460672 und in der DE-OS 2535782 wird der übergang von der diskontinuierlichen zur kontinuierlichen Phase beschrieben, allerdings nur bezüglich der Zufuhr des flüssigen Nährmediums, nicht aber bezüglich der Gasversorgung. So wird in DE-OS 2460672 zu Beginn des Wachstums Medium mit D = 0.08 n-¹ zugeführt und dann in zweitägigen Intervallen D um 0.02 bis zum Erreichen von D =0.22 h-¹ erhöht. In DE-OS 2535782 Beginn des kontinuierlichen Prozesses nach 24 h, aller 2 h wird D um 0.02 bis zum Erreichen von 0.175 h-i erhöht. In den beschriebenen Verfahren dauert der Vorgang des Anf ahrens verhältnismäßig lang, es werden nur geringe Biomasse-· konzentrationen erreicht. Maßnahmen zur Gestaltung des An-

fahrene und zur Führung des Prozesses unter erhöhtem Druck werden überhaupt nicht gegeben.

Insgesamt haben die beschriebenen Verfahren den Nachteil, daß nie gleichseitig eine optimale Gasversorgung und damit optimales Wachstum und die Sicherheit, daß sich das Gasgemisch außerhalb des explosiven Bereiches befindet, gewährleistet sind.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für ein Verfahren zur Züchtung methanotropher Bakterien ein Prozeßregime au entwickeln, das Gaskonsentrationen außerhalb des explosiven Bereiches von Methan-Sauerstoff-Gemischen vorsieht, maximales Wachstum beim Anfahren und bei Druckfermentation gewährleistet und damit eine sichere kontinuierliche Prozeßführung sowie Verkürzung der Übergangszeit vom diskontinuierlichen zum kontinuierlichen Betrieb bewirkt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bestimmte Prozeßparameter, die als Maß für die Proseßführung geeignet sind, auszuwählen und deren Grenzen festzulegen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Verhältnis nl/n2 der Konzentration des gelösten Sauerstoffs (in ppm) im Fermentaticnsmedium zur Konzentration des Sauerstoffs im Fermentationsabgas (in Volumenanteilen) einschließlich der Grenzwerte dieses Verhältnisses als Parameter für die Proaeßführung verwendet werden.

Die Grenzwerte dieses Verhältnisses nl/n2 liegen bei 5 und 30, bevorzugt bei 8 und 25. Die Prozeßführung sieht eine Gasversorgung innerhalb dieser Grenzwerte vor, wobei der obere Wert entweder durch Druckerhöhung oder durch Erhöhung der O2-Konzentration im Gasgemisch eingestellt und der untere Wert nach entsprechendem Wachstum erreicht wird.

Wird das Verhältnis nl/n2 über einen Wert von 30, 2.B. erhöht, wird eine 02-Inhibierung beobachtet, die Wachstumsgeschwindigkeit sinkt beträchtlich und die Übergangszeit von diskontinuierlichem zum kontinuierlichem Betrieb verlängert sich, bzw. im kontinuierlichen Prozeß erfolgt eine Ausschwemmung der Kultur.

Sinkt das Verhältnis unter 5 , wird entweder eine O2-Limitation beobachtet oder das Gasgemisch befindet sich im explosiven Bereich.

Durch die nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

In einen Rührfermentor werden 5 1 Flüssigkeit gegeben, die mit einer Suspension des methanoxidierenden' Bakterienstammes ZIMET B 502, auf eine Anfangskonzentration von 1.5 g/l gebracht wurde und ein flüssiges Nährmedium, das für einen Biomassezuwachs von 1-2 g/l berechnet wurde, enthält.

Die Zusammensetzung der Nährlösung war pro Liter Wasser ( für Ig Biomasse ) folgende :

H3PO4 ( 80 %-ig ) 0.028 ml

KK2PO4 35 rag

MgSO4 * 7 H2O 25 mg

CuSC)4 * 5 H2O 0.785 mg

M11SO4 * 4 H2O 1.825 mg

FeCl2 * 4 HzO 1.200 mg

Z11CI2 0.322 mg

C0SO4 * 7 H2O 0.036 mg

NiSO4 * 7 H2O 0.109 mg

Al2(SO4)3 * 18 HzO 0.186 mg

Ca(NO3)2 * 4 H2O 0.883 mg

Na2Mo04 * 2 H2O 0.041 mg

H3BO3 1.286 mg

CrCl3 * 6 HzO 0.077 mg

Ein Überschuß an Nähr- und Spurensalzen wird ständig in Abhängigkeit vom Biomassezuwachs geschaffen. Es werden eine Temperatur von 38°C und ein pH-Wert von 5.7 eingestellt

Dann beginnt man, in den Fermentor Gase einzuleiten. Zuerst leitet man N2 als Inertgas ein ( 100 l/h ), um noch vorhandenen Sauerstoff auszutreiben. Dann beginnt man mit dem Einleiten von Methan ( 35 l/h ), wobei man während des gesamten Versuches darauf achtet, daß stets Methan im Überschuß ( keine Methanlimitation ! ) vorhanden ist. Schließlich leitet man Luft in einer Menge von 69 l/h ein.

Mit diesem Gasgemisch ( 7.5 % O2 am Eingang ) erreicht man 5.8 % O2 im Abgas und eine Gelöst-02-Konzentration von 1.46 ppm, was einem Verhältnis nl/n2 von 25 entspricht.

Dann wartet man so lange, bis durch das Wachstum die Gelöst-02-Konzentration auf 0.38 ppm und die Abgaskonzentration auf 4.75 % gesunken sind. Das entspricht einem Verhältnis nl/n2 von 8.

Jetzt erhöht man den Luftdurchsatz auf 123 l/h ( entspricht 10 % O2 am Eingang). Die 02-Konzentration im Abgas steigt auf 8.5 % (Sicherheitsgrenze des explosiven Bereiches ) und die Gelöst-02-Konzentration auf 2.03 ppm. Diese Werte entsprechen einem Verhältnis nl/n2 von 24.

Man wartet wiederum, bis sich die Gelöst-02-Konzentration(CL) und die Abgaskonzentration so gesenkt haben, daß das Verhältnis nl/n2 den Wert 8 annimmt. Das ist bei 7.28 % O2 und Ci = 0.6 ppm der Fall.

Dann beginnt man, den Systemdruck zu erhöhen. Zuerst auf 0.178 MPa ( hier wird nl/n2 = 24.8 bei Ci = 1.81 ppm und 7.3 % O2 erreicht ), in einem zweiten Schritt auf 0.233 MPa, wobei in beiden Fällen gewartet wird, bis sich nach entsprechendem Wachstum der untere Wert des Verhältnisses nl/n2 von 8 einstellt.

Weil die Abgaskonzentration nach weiterer Druckerhöhung unter 5% sinken würde ( momentan beträgt sie 5.5 % ), wird erst wieder die Luftmenge gesteigert. Man erhöht sie auf 158 l/h und dann den Druck in zwei weiteren Schritten auf 0.284 und 0.336 MPa, immer bis zu einem Anfangswert nl/n2 = 25 und mit einer Wartezeit bis

Vi	= 44	und
Vi	= 27	und
Vi	= 17	und
Vi	= O	und

sum Absinken auf nl/n2 = 8 .

Vor der letzten Druckerhöhung in diesem Versuch ( auf 0.391 MPa ) wird nochmals die Luftmenge erhöht ( auf 180 l/h ) und danach auf 199 l/h, immer bei Einhaltung der Grenzwerte für nl/n2 zwischen 8 und 25 .

Die letzten Maßnahmen in diesem Versuch betreffen die stufenweise Substitution des Inertgases durch Luft bzw. Methan im Rahmen der angegebenen Grenzen für nl/n2. Die einzelnen Schritte sind ( Vi = Inertgas, Vm = Methan, Vl = Luft, alle in l/h ) : Vi = 85 und Vl = 214 , Vi = 69 und Vl = 230 ,

Vm = 60

Vl = 247 ,

Vm = 70

Vl = 260 .

Durch dieses Vorgehen wird nach 9 h eine Biomaesekonaentration von 10 g/l erreicht und bis auf die erste Phase durchgehend eine Wachstumsgeschwindigkeit von 0.25 h"¹ aufrechterhalten

Nach Erreichen von 10 g/l Biomassekonzentration wird der kontinuierliche Prozeß mit D = 0,2 h- ^l begonnen bei einer Produktivität von 2.5 g/l*h .

Beispiel 2

In einen Fermentor werden 0.1 m³ Flüssigkeit, die Nährmedium für einen Biomassezuwachs von 1-2 g/l und eine Suspension des Bakterienstammes -ZIMET B 502 von 1 g/l enthält, gegeben und unter den gleichen Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, regelmäßige Ergänzung des Nährmediums) wie in Beispiel 1 kultiviert. Man beginnt die Begasung mit Inertgas ( 6 m³/h ), Methan (0.6 m3/h) und Luft ( 2 m3/h ). Der erste Wert für nl/n2 ergibt sich zu 30 (aus Ci = 1.38 ppm und 4.6 % O2 ). In der Startphase wartet man, bis sich der untere Wert des Verhältnisses nl/n2 von 5 (Ci =0.2 ppm, 4 % O2) eingestellt hat, sonßt werden immer die Grenzen 8 und 24 eingehalten

In diesem Beispiel wird von Anfang an bei Erhöhung der Luft-

2 6 3 7 3 7

menge die Inertgasmenge um den Betrag dee Zuwachses der Luftmenge reduziert. Die Erhöhung der Luftmenge erfolgt dann, wenn bei Einhaltung des Verhältnisses nl/n2 = 24 die Sauerstoffkonzentration den Wert 8.5 % nicht überschreitet. Deshalb werden nach der Startphase nach Erhöhung der Luftmenge jeweils zwei stufenweise Erhöhungen des Systemdruckes eingefügt. Dieser Vorgang wird insgesamt 3 mal wiederholt über die Zwischenstufen Vl=3.88 m3/h, P=O.178 , P= 0.23 MPa, Vl=4.7, p=0.281, p=0.332, Vl=5.2, p=0.383, P=O.435 .

Wenn die Abgaskonzentration CH4 den Wert 5 % unterschreitet, wird die Methanmenge ( bei Substitution von Inertgas ) auf 1.3 mVh erhöht. Das ist nach der Druckerhöhung und dem anschließenden Wachstum der Fall. Inzwischen ist die Biomassekonzentration auf über 9 g/l gestiegen und der O2-Verbrauch so hoch, daß Luftmengen- und Druckerhöhungen im Wechsel erfolgen können, ohne daß bei der Luftmengenerhöhung die Abgaskonzentrationen im explosiven Bereich liegen. Dieser Wechsel erfolgt 7 mal ( über die Zwischenstufen Vl = 5.54, p=0.486, Vl=5.84, P=O.537, Vl=6.1, p=0.588, Vl=6.34, p=0.639, Vl=6.54, p=0.689, Vl=6.72, P=O. 739, V.r,=6.9, p=0.79 ).

Durch Erhöhung der Methanmenge auf 1.7 mVh ( bei Substitution der restlichen Inertgasmenge ) wird schließlich erreicht, daß nur noch mit Methan und Luft begast wird ( 6.06 % O2, 13.72 % CH4 im Abgas).

In einem letzten Versuchsabschnitt der Übergangsphase nach Erreichen des gewünschten Systemdruckes von 0.79 MPa wird in 11 Schritten die Luftmenge auf 10.32 mVh weiter erhöht, um mit 8.08 für die Sauerstoffabgaskonzentration einen für den Stoffübergang günstigen möglichst hohen Wert unterhalb des explosiven Bereiches zu erhalten.

Nach 13 h beträgt die Biomassekonzentration 21.5 g/l . Während der Ubergangsphase wurde ständig eine Wachstumsgeschwindigkeit von /u = 0.25 h-¹ gewährleistet.

Anschließend wurde der kontinuierliche Prozeß mit D = 0.2 h-i begonnen bei einer Produktivität von 5.37 g/l*h .

Beispiel 3

Die Kultivierungsbedingungen gleichen denen von Beispiel 1

Erhöht man den Druck nicht stufenweise , sondern plötzlich auf den Wert 0.39 MPa, beträgt das Verhältnis nl/n2 100 (bei einer Gelöst-Oz-Konaentration von 8 ppm, Abgaskonaentration von 8 % ), und die Wachstumsgeschwindigkeit geht auf 50 % aurück.

Beispiel 4

Die Kultivierungsbedingungen gleichen denen von Beispiel 1.

Ein noch stärkerer Rückgang der Wachstumsgeschwindigkeit (auf 0.11 h-¹) durch Limitierung wird beobachtet, wenn nach Erreichen des unteren Wertes nl/n2 = 5 keine Maßnahme ergriffen wird. Dann sinkt das Verhältnis auf den Wert 2 ( Ci = 0.16 ppm, 02 = 8 % ) .

Der Wert nl/n2 = 2 wird aber auch erhalten, wenn die Abgaskonaentration im explosiven Bereich liegt ( z.B. Ci = 0.3, O2 = 15 % ).

Claims (2)

1. Patentanspruch

   1. Verfahren zur Kultivierung methanotropher Bakterien» gekennzeichnet dadurch, daß die augeführte Sauerstoffmenge und der Druck stufenweise erhöht werden unter Einhaltung bestimmter Verhältnisse von Gelöstsauerstoffkonzentration in der Kulturflüssigkeit sum Volumenanteil Sauerstoff im Abgasgemisch.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet dadurch, daß das einzustellende Verhältnis Gelöstsauerstoffkonzentration in der Kulturflüssigkeit au Volumenanteil Sauerstoff im Abgasgemisch in den Grenzen 5 bis 00, bevorzugt 8 bis 25 , liegt.