DD283937A5 - Praeparat mit antikoerperaktivitaet und breitem wiekungsspektrum, daraus bestehende ode4 diese enthaltende mittel und deren verwendung zur behandlung von bakteriellen oder toxin-bedingten erkrankungen und zur bekaempfung von protozen - Google Patents

Praeparat mit antikoerperaktivitaet und breitem wiekungsspektrum, daraus bestehende ode4 diese enthaltende mittel und deren verwendung zur behandlung von bakteriellen oder toxin-bedingten erkrankungen und zur bekaempfung von protozen Download PDF

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DD283937A5
DD283937A5 DD89327699A DD32769989A DD283937A5 DD 283937 A5 DD283937 A5 DD 283937A5 DD 89327699 A DD89327699 A DD 89327699A DD 32769989 A DD32769989 A DD 32769989A DD 283937 A5 DD283937 A5 DD 283937A5
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diarrhea
toxin
colostral
bacterial
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DD89327699A
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Herbert Dichtelmueller
Wolfgang Stephan
Reinhard Lissner
Ruediger Arndt
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Biotest Pharma Gmbh,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Praeparates mit Antikoerperaktivitaet, erhaeltlich aus Kolostralmilch nicht immunisierter Saeuger der ersten 30, vorzugsweise jedoch der ersten 10 Stundne post partum durch Verduennung der Kolostralmilch mit Wasser, Pasteurisierung, Abtrennung von Casein und Fett, Ankonzentrierung und Stabilisierung, mit einem hohen Immunglobulingehalt * und niedriger antikomplementaerer Aktivitaet, zur oralen Applikation beim Menschen und zur intravenoesen Verabreichung im veterinaermedizinischen Bereich. Das Praeparat kann allein oder in Kombination mit anderen Pharmazeutika mit Erfolg zur Behandlung von bakteriell- oder toxin-bedingten Erkrankungen, insbesondere von schwerer Diarrhoe bei AIDS-Erkrankungen oder anderen immunologischen Defektzustaenden, von Reisediarrhoe und toxin-bedingter Saeuglingsdiarrhoe, von Magen- und Darmulcera sowie von chronischen und akuten Yersinien-Infektionen, und zur Bekaempfung von Protozoen eingesetzt werden.{Praeparat; Antikoerperaktivitaet; Kolostralmilch; Saeuger, nicht immunisiert; Pharmazeutika; Erkrankungen, bakteriellbedingt, toxinbedingt; Diarrhoe; AIDS}

Description

Verwendung eines Präparates mit Antikörperaktivität
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Präparates mit Antikörperaktivität, welches nach bekannten Verfahren aus Kolostralmilch von nicht immunisierten Säugern erhältlich ist, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von bakteriell- oder toxin-bedingten Erkrankungen, insbesondere von Diarrhö bei AIDS oder anderen immunologischen Defektzuständen, von Reisediarrhö und toxin-bedingter Säuglingsdiarrhö, von Magen- und Darmulcera sowie von chronischen und akuten Yersinien-Infektionen, und zur Bekämpfung von Protozoan.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Immunglobuline - eine Gruppe hochwirksamer und gleichzeitig sensibler Proteine - werden u.a. zur Prophylaxe und Behänd-
lung bakterieller oder viraler Erkrankungen und gegebenenfalls in Form spezieller Kompositionen gegen bestimmte Toxine eingesetzt. Sie können nach relativ aufwendigen Verfahren aus humanem Plasma oder auf etwas einfachere V/eise au3 Milch bzw. Kolostralmilch von Säugern gewonnen werden.
Zur Gruppe der aus humanem Plasma erhältlichen Immunglobuline gehören beispielsweise Imtnunglobulin G, ein zur Prohylaxe und Behandlung verschiedenster Infektionen wirksames Protein.
Die aus Milch bzw. Kolostralmilch gev/onnenen bekannten Immunglobulin-haltigen Präparate weisen eine etwas niedrigere Reinheit auf als die aus humanem Plasma erhältlichen. Sie werden vorwiegend im veterinärmedizinischen Bereich zur Behandlung infektionsbedinger Erkrankungen eingesetzt.
Zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Immunglabulinen aus Milch oder Kolostralmilch sind bisher bekannt.
Beispielsweise wird in der US-PS 4 526 715 ein Verfahren zur Bereitstellung von Immunglobulinen aus Milch über verschiedene chromatographische Trennungsschritte beschrieben,
Die US-PS 3 128 230 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines aus Milch erhäl bl'.'.chen Präparates zur Behandlung verschiedener bakterieller Infektionen.
In der US-PS 4 265 925 und der US-PS 1 573 995 werden Verfallen zur Herstellung von Proteinkonzentraten aus Lactoserum beschrieben, wobei diese Proteine aufgrund einer Hitzebehandlung größtenteils denaturiert werden.
Schließlich werden in der DE-OS 28 13 284 sowie in der
EP-A O 046 909 und der EP-A 0 064 103 Kolostralmilchaufbereitungsvorfahren beschrieben, wobei Immunglobulin enthaltende Produkte als entzündungshemmende Mittel erhalten werden.
Bei der Herstellung pharmakologisch wirksamer immunglobulinhaltiger Präparate nach don obengenannten Verfahren wird von Milch bzw. Kolostralmilch hyperimmunisierter Säuger, insbesondere Rinder, ausgegangen. Hierbei müssen also, um eine antibakterielle oder antivirale Effizienz gegen bestimmte Krankheitserreger zu erzielen, den Tieren zunächst ein oder mehrere einen Antikörper bzw. eine Gruppe spezifische Antikörper induzierenden Bakterienstämme bzw. deren Antigene injiziert werden.
Die Wirksamkeit der so gewonnenen Präparate entspricht der Art und Anzahl der verabreichten Bakterienstämme.
Auch zur Bereitstellung eines aus Milch erhältlichen Präparates mit einer spezifischen Antikörperaktivität (z. B. gegen bakterielle Antigene) wird zunächst der Säuger mit speziellen Antigenen immunisiert. Die dann gewonnene Milch weist einen hohen Antikörpertiter gegen das spezielle Antigen auf, wobei die Milch als Trägermedium dient.
Ziel der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung wird ein hochreines Immunglobulinpräparat mit einer hohen AntikörperarCtivität, das zur Herstellung pharmakologisch wertvoller Präparate verwendet wird, bereitgestellt.
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Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Immunglobulinpräparat hoher· Reinheit mit einer hohen Antikörperaktivität nach einem einfachen und wirtschaftlichen Verfahren bereitzustellen, welches im humanmedizinischen und auch im veterinärmedizinischen Bereich angewendet werden kann, ohne daß zuvor eine Hyperimmunisieruno vorgenommen werden muß, um spezifische Antikörp^rtiter bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird ertindungsgemäß dadurch gelöst, daß Kolostralmilch nicht immunisierter Säuger, insbesondere Rinder, nach bekannten Verfahren aufbereitet wird und
A) zur Herstellung eines Mittels zur Neutralisation von humanpathogenen Mikroorganismen und Toxinon bei Diarrhöe, infolge AIDS oder anderer immunologischer Defektzustände, bei Reisediarrhoe, bei Toxin-bedingter Säuglingsdiarrhoe, bei Magen- und Darmulcera sowie nicht-ulcerösen Dyspepsien, Infektionen durch Yersinien und Protozoen,
oder
B) zur Herstellung eines Mittels zum Schutz der Magen- bzw. der Darmschleimhaut vor Befall durch Mikroorganismen (a) zur Verhütung schwerer Diarrhöe bei AIDS oder anderer immunologischer Defektzuständen, (b) zur Verhütung von Reisediarrhoe, (c) von Toxin-bedingter Säuglingsdiarrhoe, (d) von Magen- und Darmulcera sowie (e) von nicht-ulcerösen Dyspensien, (f) von Yersinien und (g) von Protozoen-Infektionskrankheiten verwendet wird. Dabei
wird ein Immunglobulin enthaltendes Präparat hoher Reinheit mit einem Immunglobulin-Gehalt von >80%, bezogen^auf den Gesaratproteingehalt, sowie sehr geringen Anteilen an Fett (<0,4 %) und Lactose «0,1 %) erhalten, welches eine höhere Antikörperaktivität aufweist als das bisher als bestwirkgamstes humanes Immunglobulin-Präparat bekannte "Pentaglobin"^ '. Aufgrund der extrem niedrigen antikomplementären Aktivität ist dieses erfindungsgemäße Präparat zur oralen Applikation beim Menschen sowie zur intravenösen Verabreichung in der Veterinärmedizin geeignet.
Erfindungsgemäß wird vorzugsweise Kolostralmilch der ersten 10 Stunden post partuin verwendet. Das beispielsweise nach Reinigungs- und Trennverfahren, wie sie üblicherweiee in der Milchverarbeitung angewendet werden, erhaltene Präparat kann entweder als Lösung oder als Pulver in lagerstabiler Form bereitgestellt werden.
Hierzu wird Kolostralmilch z. B. von Rindern der ersten 10 Stunden post partum mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:3 verdünnt. Aus dieser Lösung wird nach Pasteurisierung das Fett abgetrennt, anschließend Casein ausgefällt und separiert, z.B. durch Filtration. Die-so gewonnene Molke wird auf einen gewünschten Gehalt ankonzentriert. Zur Stabilisierung des Produktes kann eine Sterilfiltration erfolgen, wobei eine sterile Lösung des Präparates erhalten wird.
Darüber hinaus ist eine Stabilisierung auch mittels Sprühtrocknung möglich. Hierbei wird das Produkt in pulverisierter Form erhalten. Dabei zeigte sich überraschenderweise, daß bei den für dit Sprühtrocknung notwendigen Temperaturen (Eingangstemperatur etwa 145 0G bis 180 0C, Ausgangstemperatur etwa 65 - 70 0C) keine Denaturierung der Proteine erfolgt. Ss tritt also unter diesen Bedingungen der Sprühtrocknung keine extreme Aggregatbildung und damit
kein Anstieg der antikomplementären Aktivität der Proteine auf, wie dies eigentlich für solche Temperaturen bekannt und zu erwarten war. Auch bei Anwendung dieser Stabilisierungsmethode wird also ein Produkt mit einem unverändert hohen Immunglobulingehalt von >80 % bei unverändert niedriger antikomplementärer Aktivität und vollständiger biologischer Aktivität erhalten.
Zusätzlich kann sowohl vor als auch nach der Durchführung des Stabilisierungsschrittes gemäß einer der genannten Methoden eine Fällungsreaktion mit Octansäure durchgeführt werden. Dabei wird eine weitere Anreicherung des Immunglobulingehaltes auf mehr als 90 % erzielt, ohne daß die antikomplementäre Aktivität negativ beeinflußt wird.
Ein Immunglobulin enthaltendes Präparat mit hoher Antikörperaktivität kann auch nach anderen, ebenfalls bekannten Verfahren aus Kolostralmilch der ersten 10 Stunden post partum bereitgestellt werden. Dpzu kann beispielsweise ein Verfahren gemäß der DE-PS 3 432 718 angewendet werden. Hierzu wird Kolostralmilch nicht immunisierter Rinder zunächst angesäuert und grob filtriert (Caseinentfernung) und anschließend mit Kochsalzlösung verdünnt. Die so erhaltene Suspension wird tangential filtriert, anschließend ankonzentriert und dann neutralisiert. Zur Stabilisierung der konzentrierten Molke kann entweder eine Sterilfiltration oder eine Sprühtrocknung, gegebenenfalls auch eine Octansäurefällung zur Erhöhung der Reinheit des Präparates durchgeführt werden.
Aus führungsbeispieIe Herstellung des Immunglobulin-Präparates Beispiel 1
110kg tiefgefrorene Rinderkolostrrlmilch der ersten 10 Stunden nach dem Kalben wurden bei 5-10 0C aufgetaut und mit
7-2 O 6 Γ 4ί>
destilliertem Wasser im Verhältnis 1:3 verdünnt. Anschliessend wurde die Milch pasteurisiert und nachfolgend das Fett abgetrennt. Dabei wurden 270 kg Magermilch erhalten. Diese wurde mit IN HCl angesäuert und das ausgefällte Casein über Filtertücher abgetrennt. Der so gewonnene Überstand (186 kg) wurde ultrafiltriert, wobei 38 kg Konzentrat erhalten wurden.
Dieses Konzentrat wurde zur Stabilisierung entweder auf herkömmliche Weiae sterilfiltriert oder sprühgetrocknet. Die Sprühtrocknung erfolgt bei einer Eingangstemperatur von 175eC und einer Ausgangstemperatur von 65*C. Hierbei wurde ein trockenes Pulver erhalten, welches in 83%iger Reinheit Immunglobulin enthält, entsprechend einer Gesamtausbeute von 3,8 kg Immunglobulin.
Die Antikörperaktivität dieses Präparates vor Sprühtrocknung entsprach der nach Sprühtrocknung und auch der eines durch Sterilfiltration stabilisierten Präparates.
Beispiel 2
13 1 Rinderkolostralmilch, die in den ersten 5 Stunden nftph, dem Kalban entnommen und tiefgefroren worden war, wurden aufgetaut. Der pH-Wert betrug 6,27. Durch Ansäuern mit 700 ml IN I4Cl wurde dieser auf 4,8 eingestellt. Die so erhaltene Suspension wurde 30 Minuten lang auf 401C erwärmt und dann über Nacht bei 4"C aufbewahrt. Anschliessend wurde die Suspension zur Abtrennung grober Partikel durch ein Gazefilter aus Polyamidgaze in ein Vorratsgefäss gepumpt und dort mit 0,9%iger Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 26 1 verdünnt.
Dann erfolgte die erste Tangentiaifiltration der so erhaltenen Suspension durch eine Hohlfaserpatr^ne mit einer mittleren Porengrösse von 0,4 ym, einer Oberfläche von 3 ma
und einem Faserdurchmesser von 1,2 mm durch Diafiltration unter Verwendung von 100 1 einer ü,9%igen Kochsalzlösung bei einem Überdruck von 0,2 bis 0,6 bar.
Noch während dejs Verlaufs der ersten Tangentialfiltration wurde das angefallene Diafiltrat einer zweiten Tangentialfiltration unter Verwendung einer aus drei Hohlfaaerpatronen mit jeweils einer Trenngrenze von 10 000 D und einer Oberfläche von 1,4 m* bestehenden Anlage zugeführt. Jn dieser Anlage wurde das Diafiltrat der ersten Tangentialfil tration zunäcnst ankonzentriert, sodann unter Verwendung von 100 1 einer 0,?*;igen Kochsalzlösung diafiltriert und schliesslich auf ein Gesamtvolumen von 25 1 ankonzentriert. Das die niedermolekularen Bestandteile enthaltende Filtrat wurde entfernt.
Die erhaltene Immunglobulinlösung wies einen Proteingehalt von 6% (bestimmt durch Biuret-Reaktion) auf und wurde in bekannter Weise sterilfiltriert.
Beispiel 3
25 1 Konzentrat von Rinderkolostrum wurden nach Beispiel 2 hergestei j.u. Ein Aliquot von 10 1 10%iger Immunglobulinlösung wurde der Sprühtrocknung bei einer Eingangstemperatur von 145*C und einer Ausgangstemperatur von 65'C unterzogen. Erhalten wurden 1 270 g eines weisslichen Immunglobuiin-Pulvers.
Antikörperaktivität und antikomplementäre Aktivität entsprachen der vor der Sprühtrocknung sowie der des nach Beispiel 2 hergestellten sterilfiltrierten Präparates.
Beispiel 4
200 ml einer Immunglobulinlösuncj, hergestellt nach
~ 8 —
Beispiel 1, wurden vor dem Stabilisierungsschritt bei pH 4,8 und einer Temperatur von 23*C 5 Stunden mit Octansäure (2,5%) versetztt Anschliessend wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt und der überstand gegen 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert.
Dör Gehalt an Immunglobulin des ao erhaltenen Präparates betrug >90%. Die antikomplemantare Aktivität entsprach dem niedrigen Wert einer intravenös verträglichen humanen IgG-Präparation.
Beispiel 5
Von einem gemäss Baispiel 1 hergestellten (sprühgetrockneten) Immunglobulinpulver wurden 200 ml steriifiltrierte Lösung mit einem Proteingehalt von 5% hergestellt. Eine ^olche Lösung (5 g Pulver, eingerührt in H2O ad 100 ml) weist folgende Zusammensetzung auf (wobei für alle Proteinwerte eine relative Streubreite von _^10% zu berücksichtigen ist) :
Protein ge^mt 4,2 g/100 ml
davon IgG 3,0 g/100 ml
IgA 0,35 g/100 ml
IgM 0,96 g/100 ml
pH-Wert 4,6
Lactalbumin 1,0 % CAF
Diese Lösung wurde mit 2,5% Octansäure bei pH 4,8 und T=23'C während 5 Stunden inkubiert. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und der überstand diafiltriert. Die antikomplementäre Aktivität entsprach der eines humanen IgG-Präparates gleicher Konzentration (5%) für intravenöse Anwendung.
Das nach den beschriebenen oder analogen Verfahren
erhältliche Immunglobulinpräparat weist eine höhere Antitoxinaktivität auf als Pentaglobin.
Neutralisation bakterieller Toxine
Die Neutralisation h^molysierender Bakterientoxine wurde im Hämolyse-Hemmtest (HHT* gegen toxinhaltige überstände verschiedener Bakterien bestimmt.
Beispiel 6
Eine Übernachtkultur in Brain Heart Infusion Nährbouillon von Staphylococcus aureus Smith 3 wurde bei 10.000 xg 10 mit» zentrifugiert und der überstand sterilfiltriert. Der keimfreie hämolysierende Toxine enthaltende überstand dieser Kultur wurde für Hämolyse-Hemmtests verwendet.
I f* 1,
Eine 5%igt Lösung eines nach Beispiel 2 hergestellten Immunglobulinpräparates wurde auf die toxinneutralisierende Wirkung geprüft. Hierzu wurden 0,1 ml gewaschene Humanerythrozyten zu 10 yl Staphylococcus aureus Toxin in 900 bis 990 yl NaCl (0,9%) bei 37'C während 30 min inkubiert, wobei jeweils 10-100 yl Immunglobulinlösung (5%) zugesetzt wurden. Als Vergleichspräparation diente eine 59ύ kommerziell verfügbare Immunglobulin-Pra'paration (Pentaglobin). Das Ergebnis zeigt Abbildung X, wobei ais Mass fur die Hämolyse bzw. deren Hemmung die Ελ"\nktion bei 542 nm zur Messung verwendet wurde,
Beispiel 7
Es wurde wie in Beispiel 6 angegeben vorgegangen, jedoch wurde hier der toxinhaltige überstand eines gram-negativen Keimes - Ps. aeruginosa - zur Prüfung auf Toxinneutra1isation verwendet. Die Hämolyse wurde wie in Beispiel 6 bzw. 8 im Bereich zwischen 0 und 100 yl der 5% Immunglubulinösung,
1:10 verdünnt in NaCl (0,9%), gemessen. Beispiel Q
Für die nachstehend aufgeführte Untersuchung wurde der toxinhaltige Überstand von Staphylococcus aureus verwendet. Die Toxinneutralisation wurde mit einem gemäaH Beispiel 1 (sprühgetrocknet) hergestellten Präparat (5%ige Lösung) getestet.
Als Vergleich im HHT diente Pentaglobin in gleicher Konzentration.
Die Hämolyse wurde im Bereich von 0 bis 100 yl Immunglobulinlösuag (R%, 1:10 verdünnt in NaCl) gemessen.
Die Ergebnisse aus den Versuchen der Beispiele 6-8 sind in den Abbildungen 1-3 aufgezeigt.
Abbildung 1 zeigt die Neutralisation bakterieller hämolysicrendtr Toxine von Staphylococcus aureus Smith 3 gemäss Beispiel u i.urch Immunglobulin aus Rinderkolostrum, hergestellt nach Beispiel 2, und durch Pentaglobin als Vergleich.
Abbildung 2 zeigt die Neutralisation bakterieller Toxine von Pseudomonas aeruginosa gemäss Beispiel 7 durch Immunglobulin aus Rindarkolostrum, hergestellt nach Beispiel
Abbildung 3 zeigt die Neutralisation bakterieller Toxine von Staphylococcus aureus gemäss Beispiel 8 durch Rinderkolostrum-ImmungloLulin, hergestellt nach Beispiel 1 und durch Pentaglobin \ls Vergleich.
Wie aus den Abbildungen 1-3 ersichtlich ist, bewirkt die aus Rinderkolostrum gewonnene Immunglobulin-Präparation eine effektivere Hemmung der toxinbedingten Hämolyse ai3 das in der Zusammensetzung vergleichbare, aus humanem
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Plasma gewonnene Pentaglobin.
In Tabelle I sind die Ergebnisse der Versuche gemäss den Beispielen 6-8 zusammengefasst.
Tabelle I
Beispiel PG(Vergl)* RG(Erf.)** Konzentration bei 50% Hämolyse Konzentration bei 80% Hämolyse
6 RG (Erf.) 50 yl 10 yl 93 yl 50 yl
7 PG (Vergl.) RG (Erf.) 18 yl 35 yl
8 42 yl ' 10 yl 80 yl 40 yl
* PG = Pentaglobin
** RG = Immunglobulin aus Rinderkolostrum
Die Beispiele 6 und 8 belegen, dass für eine 50%ige Hämolyse (Toxinneutralisation) eine'um das Dreifache höhere Menge des bekannten Pentaglobins erforderlich ist als für das erfindungsgemässe Präparat. Um eine 80%ige Toxinneutralisation zu erzielen, muss eine doppelt so hohe Menge Pentaglobin eingesetzt ./erden.
Wie aus Beispiel 7 hervorgeht, bewirkt das erfindungsgemässe Immunglobulin schon bei sehr geringen Konzentrationen (40 yl) eine fast 100%ige Toxinneutralisation, auch gegen Toxine gram-negativer Bakterien.
Sine 100%ige Hämolyse wird in dem betrachteten Konzentrationsbereich (maximal 100 yl einer 5%igen Lösung) für Penta·
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globin nicht erreicht. Da das aus Kolostralmilch hergestellte Immunglobujinpräparat im Gegensatz zum Pentaglobin keine 100%ige Reinheit aufweist (80-90%), iat der therapeutische Index anhand vorstehender Ergebnisse für aas erfindungsgemäasa Antitoxin mindestens doppelt so hoch wie für das bekannte Pentaglobin.
Wie weiterhin aus TabeJle I sowie Abbildung 3 ersichtlich ist, bleibt das gewählte Verfahren zur Bereitstellung des Produktes ohne Einfluss auf dessen Aktivität. Es kann sowohl nach bekannten Methoden der Milchwirtschaft wie auch durch speziellere Aufbereitungsverfahren (z.B. Tangentialfiltration) erhalten werden.
Das erfindungsgemässe Produkt ist im veterinärmedizinischen Bereich intravenös applizierbar und kann am Menschen oral verabreicht werden. Es weist keine anomale Toxizität auf, wie in nachstehenden Beispielen 9 bis 11 dargelegt, und kann sowohl flüssig als auch in fester Form gelagert werden.
Verträglichkeit - Anomale Toxizität Beispiel 9
Je 5 Mäuse erhielten eine wie vorstehend getestete 5%ige Immunglobulinlösung (gemäss den Beispielen 6-8) intraperitoneal appliziert (0,1 ml/Tier). Die Tiere wurden bis 3 Stunden beobachtet und bis 5 Tage nach Gabe gehalten.
Ergebnis: Kein Tier verstorben, keine Reaktion sofort, keine Reaktion bis 3 Stunden nach Gabe, keine Veränderungen.
Dosierung: 0,29 g/kg (Gewicht Maus: 17 g).
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2B3937
Beispiel 10
Je 5 Mäuse erhielten Q,5 ml der 5% Lösung, pH 4,6 oral mittels Schlundsonde verabreicht und wurden bis 3 Stunden nach Gabe beobachtet und bis 5 Tage nach Gabe gehalten.
Ergebnis: Kein Tier verstorben, keine Reaktion sofort, keine Reaktion bis 5 Stunden, keine Veränderungen.
Dosierung: 1,47 g/kg; (Gewicht Maus = 17 g) Beispiel 11
Je 3 Maure erhielten 1,0 ml einer 10% Suspension, pH 4,6 oral mittels Schlundsonde verabreicht.
Ergebnis: Keine Symptome wurden sofort bis 1, nach 3 und nach 24 Stunden beobachtet. Nach 5 Tagen waren aij.e Tiere unverändert.
Dosierung: Die Dosis von 1,0 ml 10% Lösung (0,1 g/Tier) entspricht einer Dosierung von 5,0 g/kg bzw. 350 g/70 kg (Gewicht Maus = 20 g).
Das aus Kolostralmilch erhältliche erfindungsgemässe Immunglobulin-Präparat ist auf sehr einfache'ökonomische Weise herstellbar und weist eine unerwartet hohe Antitoxinaktivität gegenüber verschiedensten Bakterientoxinen auf. Es zeichnet sich durch eine ausgezeichnete Verträglichkeit (keine anomale Toxizxtät) aus und kann in hoher Reinheit (>90%) sowohl in flüssiger Form als auch als Pulver in stabilifa- «rter Form gelagert werden.
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Beispiel 12
überraschend wurde gefunden, dass die erfindungsgemässep. Präparat« ausyezeichnec zur Behandlung schwerer Diarrhöen als FolgeerKrankungen von HIV-Infektionen oder von anderen immunologischen Defektzuständen geeignet sind. Bei Verabreichung der erfindungsgemässen Präparate traten innerhalb kürzester Zeit eine erhebliche Reduzierung der Zahl der täglichen Durchfälle bis hin zum kompletten Sistieren der Diarrhö ein, wie die folgende Tabelle II zeigt. Den an AIDS erkrankten Patienten wurden jeweils täglich 10 g des erfindungsgemässen Präparates über einen Zeitraum von 10 Tagen verabreicht.
Tabelle II
Durchfälle pro Tag Körpergewicht kg
Patient Vor Therapie Tage nach Therapiebeginn vor nach
1 3 5 IQ Therapie
(1) 10 5 1 1 1 42, 0 η. t.
(2) 6 1 0* 0* 0* 84, 4 85,5
(3) 10 5 2 2 1 62, 3 62,8
*Stuhl normal
Die erfindungsgemässen Präparate können allein oder in Kombination mit anderen Diarrhoika oder anderen für die Therapie notwendigen oder geeigneten Mitteln verabreicht werden und führt/ innerhalb kürzester Zeit zu einer signifikanten Reduzierung der Durchfallhäufigkeit und damit einer wesentlichen Verbesserung des Allgemeinzustandes des Patienten.
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Beispiel \3
Die erfindungagemäasen Präparate eignen sich überraschend auch zur Behandlung sowohl der sog. Reisediarrhö wie der toxin-bedingten Säuglingsdiarrhö.
In Laboruntersuchungen wurde gefunden, dass das erfindungsgemässe Präparat Antikörper unter anderem gegen das 40 KD-Protein des Verotoxin 1 (VT1) enthält. VT1 oder Shiga like Toxin 1 ist neben Verotoxin 2 das wichtigste zytotoxische Exotoxin säuglingspathogener E. coli 'EPEC) und enterohaemorrhagischer E. coli (EHEC).
Ferner enthält das erfindungsgemässe Präparat Antikörper gegen 30 KD- und 20 KD-Proteine des hitzelabilen Enterotoxins von enterotoxinbildendem E. coli (ETEC), einer Ursache der Reisediarrhö.
Damit enthält das erfindungsgemässe Präparat Antikörper gegen nahezu das gesamte Spektrum der Toxine darmpathogener Coli-Keime (enterotoxinogene, ETEC; säuglingspathogene, EPEC; enterohaemorrhagische, EHEC). Dies ist insbesondere deshalb ein erheblicher Vorteil, weil diese Erkrankungen häufig auftreten und zumindest teilweise die Folge einer Antibiotikatherapie sein können oder die Antibiotikagabe häufig negative. Effekte beim Patienten durch Toxinausschütting bewirkt.
Die Ergebnisse der mittels der Immunoblot-Technik durchgeführten Untersuchungen bei verschiedenen Konzentrationen sind in Abbildung 4 wiedergegeben.
Beispiel 14
Gastritis assoziierte duodenale und gastrale Ulkuser-
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krankungen .'erden bisher mit Wismutsalzen oder Antibiotika behandelt. Die einfachen nebenwirkungsarmen Therapieververfahren (Wismutsalze) haben nur geringe Effektivität, die» wirksamen antibiotischen Kombinations-Schemata sind dagegen sicher, für die Routineanwendung wegen der Nebenwirkungen jedqch wenig praktikabel. Es besteht danach ein Bedarf an einfachen nebenwirkungsarmen und zugleich wirksamen Therapeutika. Für diese Erkrankungen sowie für nicht-ulceröse Dyspepsien hat Campylobacter pylori nach heutiger Kenntnis pathogenetische Bedeutung. Charakteristisch für C. pylori sind ein äusseres Membranprotein von 120 KD, ein spezifisches Geisselantigen (Flagellin) von 69 KD und die Urease mit 45 KD.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass das erfindungsgemässe Präparat auch Antikörper in hoher Konzentration gegen diese drei Proteine besitzt.
Die überprüfung erfolgte mittels der Immunoblot-Technik. Das erfindungsgemässe Präparat mit ein :m Proteingehalt von 4 mg/ml wurde unverdünnt sowie in Verdünnungen von 1:10 und 1:100 überprüft. Die Detection erfolgte durch mit alkalischer: Phosphatasen konjugiertem Rinder-IgG. Wie aus den in Abbildung 5 wiedergegebenen Blots ersichtlich ist, reagiert das erfindungsgemllsse Präparat bei einer Verdünnung von 1:10 mit allen drei vorgenannten Proteinen und in einer Verdünnu.-i von 1:100 noch deutlich mit dem Flagellin und der Urease.
Darüberhinau8 enthält das erfindungsgemässe Präparat noch eine Vielzahl von Antikörpern, die mit der C. pylori-Präparation reagieren.
Damit ist überraschenderweise das erfindungsgemässe Präparat auch für die Behandlung von Infektionen mit Campylobacter pylori ausgezeichnet geeignet.
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Beiapiel 15
Yersinieninfektionen führen nicht nur zu einem akut enteritiachen Verlauf, sondern vor allem auch zu subakuten und und chroniachen Krankheitsformen, die in der Regel mit negativem Kulturbefund einhergehen, wobei sich jedoch immunhistologiach Erreger weiterhin nachweisen lasern. Die wichtigsten Erkrankungen mit poaitivem IgA-Antikörpernachweis ala Zeichen einer beatehenden Infektion sind reaktive Arthritiden, Erythema nodoaum, Uveitia, chronische Enteritis u. dgl..
Erfahrungsgemäss enthalten Yersinien speziesunabhängig sogenannte YOP-Antigene (u.a.: YOP 2b mit 47 KD, YOP 3 mit 37 KD, YOP 5 mit 26 KD). Unter Verwendung dieser isolierten Antigene wurde das erfindungsgemäsae Präparat in einem sogenannten Westernblot überprüft. Dafür wurde daa Präparat unverdünnt (Proteingehalt 4 mg/ml> sowie in Verdünnungen von 1:10 und 1:1QQ eingesetzt. Pas Präparat reagierte, wie uüs Abbildung 6 ersichtlich ist, mit al}en drei Antigenen bei allen verwendeten Konzentrationen, pie Anfärbung erfolgte dabei mit einem mit alkalische*· Phoaphafcaee Konjugiertem spezifischen anti-Rind-IgG (H- und L-Ketten) in einer Verdünnung von 1:1500 und 1:3000.
Da die danach erkannten Antigene unabhängig von Serotyp und Spezies der Yersinien sind, ist das erfindungsgemässe Präparat auch ausgezeichnet zur Behandlung von Yersinieninfektionen geeignet.
Beispiel 16
Die erfindungsgemässen Präparate eignen sich überraschenderweise auch zur Bekämpfung von Protozoen, wie beispielsweise Crypto8poridien, Isospora belli oder Toxoplasma
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Gondii, für die bisher nicht bei allen Erkrankungsfallen Gegenmittel bekannt waren ι
Cryptosporidien führen zu schweren Durchfallen, die bei immundefekten Patienten mit bisher bekannten Mitteln nicht wirksam behandelt werden konnten. Vier Patienten mit schweren Durchfällen, in deren Stuhl Cryptosporidien nachzuweisen waren, wurden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils 10 g des erfindungsgc-mässen Präparats als TrinklÖBung verabreicht. Nach Beendigung dieser Therapie war bei keinem dieser Patienten Cryptosporidien-spezifisches Antigen nachweisbar.

Claims (1)

  1. Patentanspruch
    Vorwendung eines Präparates mit Antikörperaktivität, erhalten aus Kolostralmilch von nicht immunisierten Säugern, vorzugsweise Rindern, der ersten dreißig, vorzugsweise ersten zehn Stunden post partum durch Verdünnen der Kolostralmilch mit destilliertem Wasser, Pasteurisieren der verdünnten Kolostralmilch, Abtrennung des Fettes, Caseinausfällung und Abtrennung, Ankonzentrierung der Kolostralmolke, Stabilisierung der Kolostralmolke durch Sterilfiltration oder Sprühtrocknung und gegebenenfalls Octansäurebehandlung vor oder nach der Stabilisierung, dadurch gekennzeichnet, daß es
    A) zur Herstellung eines Mittels zur Neutralisation von humanpathogenen Mikroorganismen und Toxinen bei Diarrhöe, infolge AIDS oder anderer immunologischer Defektzustände, bei Reisediarrhoe, bei Toxin-bedingter Säuglingsdiarrhoe, bei Magen- und Darmulcera sowie nicht-ulcerösen Dyspepsien, Infektionen durch Yersinien und Protozoen,
    oder
    B) zur Herstellung eines Mittels zum Schutz der Magen- bzw. der Darmschleimhaut vor Befall durch Mikroorganismen
    (a) zur Verhütung schwerer Diarrhöe bei AIDS oder anderer immunologischer Defektzuständen, (b) zur Verhütung von Reisediarrhoe, (c) von Toxin-bedingter Säuglingsdiarrhoe, (d) von Magen- und Darmulcera sowie (e).von nicht-ulcerösen Dyspensien, (f) von Yersinier und (g) von Protozoen-Infektionskrankheiten .
    HiWlu 1 Seilen 2e.ichy\uhq-el·}
DD89327699A 1988-04-19 1989-04-17 Praeparat mit antikoerperaktivitaet und breitem wiekungsspektrum, daraus bestehende ode4 diese enthaltende mittel und deren verwendung zur behandlung von bakteriellen oder toxin-bedingten erkrankungen und zur bekaempfung von protozen DD283937A5 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US12152058B2 (en) 2020-01-14 2024-11-26 Babylat Ag Apparatus and method for obtaining protein-enriched fractions from breast milk

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