DD285992A5

DD285992A5 - Zellfusionsverfahren

Info

Publication number: DD285992A5
Application number: DD33100189A
Authority: DD
Inventors: Guenter Dreyer; Peter Stolley; Ingrid Walther; Dieter Paul; Claudia Junge; Katrin Weihnert; Klaus Richau; Hans-Hartmut Schwarz
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-07-20
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1991-01-10

Abstract

Es wird ein Zellfusionsverfahren zur Fusion im elektrischen Feld dargestellt. Das Verfahren ist fuer die Biotechnologie, insbesondere die Hybridomtechnik und die Medizin anwendbar. Die erfindungsgemaesze Verwendung eines Flaechentraegers zur antigenspezifischen Immobilisierung von Zellen aus einem Zellgemisch, zur Durchfuehrung der Elektrofusion und zur Kultivierung der fusionierten Zellen ermoeglicht eine hohe Ausbeute und eine einfache, schnelle Durchfuehrung des Verfahrens.{Zellfusionsverfahren; Elektrofusion; Hybridomtechnik; Flaechentraeger; Immobilisierung, selektiv}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung i-«t üuf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Gen· und Immuntechnik, und zur Schaffung der Voraussetzungen für Antikörper-Therapien in der Medizin anwendbar.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bei den bekannten Fusionsverfahren werden die Fusionspartner gemeinsam suspendiert, durch mechanische oder elektrische Kräfte (Zentrifugation oder Dielektrophorese) in einen Zustand innigen Zell-Zell-Kontaktes versetzt und durch chemische Stoffe oder elektrische Felder miteinander fusioniert. Art und Häufigkeit der entstehenden Fusionsprodukte unterliegen dem Zufall. Die Ausbeute an interessierenden Fusionsprodukten ist gering, insbesondere wenn einer der beiden Fusionspartner im Zellgemisch nur in geringer Konzentratton vorhanden ist (z.B. antigenspezifisch stimulierte B-Lymphozyten in einem Leukozytengemisch). Die interessierenden Fusionsprodukte werden mit Hilfe von Selektionsmedium aus dem Zellgemisch isoliert. Dieser Vorgang ist langwierig und verringert außerdem die Vitalität der Zellhybride. Die in DE 3505147 angegebene technische Lösung ersetzt die rein zufälligen Paarungen durch eine getrennte Fixierung der Fusionspartner (z. B. der Myelomzellen und der Leukozyten) auf zwei Flächenträgern, die mechanisch aufeinander zu bewegt werden, bis es zum Zell-Zell-Kontakt kommt. Nachfolgend wird die

Zellfusion elektrisch Induziert. Die interessierenden Fusionsprodukte (z.B. Hybridoma) müssen allerdings ebenfalls mittels Selektionsmediums isoliert werden, da z. B. eine Separierung der stimulierten B-Lymphozyten aus einem Leukozytengemisch vor der Fusion bei diesem Verfahren nicht möglich ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist, bei einem Zelifusionsverfahren Arbeitszeit und Selektionsmaterial einzusparen und einen effektiveren, breiteren Einsatt der Hybridomtechnik für die biotechnologische Produktherstellung zu ermöglichen.

Darlegung de« Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Et findung besteh'· darin, ein Verfahren zu finden, mit dessen Hilfe die Ausbeute der elektrisch induzierten Zellfusion bei der Hybridomtechnik gesteigert wird und die weitere Kultivierung der Hybridoma einfach und effektiv ist; insbesondere soll der Anteil an Fusionsprodukten aus einer Myelomzelle und einem antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten erhöht werden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß z.B. ein Leukozytengemisch mit antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten auf einen Flächenträger gegeben wird, dessen Oberfläche chemisch aktiviert ist und an der die zur Stimulierung verwendeten Antigenmoleküle kovalent gebunden sind. Die stimulierten Zellen werden durch die Wechselwirkung zwischen den Zellmembranrezeptoren und den trägerfixierten Antigenmolekülen spezifisch um Flächenträger gebunden. Die restlichen Zellen werden durch Spülen entfernt. Die chemischen Aktivierungsmittel dürfen am Flächenträger zu keinen zusätzlichen positiven Festladungen führen, damit die unspezifische Bindungsfähigkeit für Zellen gering bleibt. Die poröse Struktur des Flächentrf gers ermöglicht eine lonenleitfähigkeit in Richtung der Flächennormalen, so daß ein in dieser Richtung angelegtes elektrisches Feld auf die trägerfixierten Zellen in nahezu gleicher Weise wirkt wie euf suspendierte Zellen in Abwesenheit des Flächenträgers. Der Durchmesser und der Abstand der Poren sind klein gegenüber dem Durchmesser der Zellen. Dadurch wird eine unspezifische Festsetzung der Zellen verhindert und darüber hinaus bei einer Dicke des Flächenträgers kleiner als 500pm eine fast völlige Nutzung der trägerfixierten, stimulierten Zellen für die Zellfusion erreicht. Die erfindungsgemäße Mindestdicke des Flächanträgers von 100pm ermöglicht in allen Verfahrensschritten eine gute Handhabung. Nach dem Spülen wird der Flächenträger mit den gebundenen, stimulierten Zellen auf die untere Elektrode einer horizontalen Parallelplattennnordnung gelegt und mit einer dichten Myelorruellensuspension überschichtet. Die obere Plattenelektrode wird der unteren bis zum Kontakt mit der Myelomzellsuspension genähert. Erfindungsgemäß ist es nicht notwendig, e^!t en besonders kleinen Abstand der Plattenelektroden einzustellen, da die Myelomzellen auf dem Flächenträger sedimentieren. Die hohe Myelomzelldichte und ein zusätzlich angelegtes elektrisches Hochfrequenzfeld gewährleisten, daß nahezu alle trägergebundenen Zellen mit einer Myelomzelle in Membrankontakt gelangen. Die elektrisch induzierte Fusion erfolgt in allgemein bekannter Weise. Durch eine Spülung werden die überflüssigen, nicht fusionierten Myelomzellen vom Flächenträger entfernt, so daß nur die trägergebundenen Fusionsprodukte verbleiben. Sie werden mit dem Flächenträger zur Kultivierung im Wachstumsmedium überführt.

Gegenüber bekannten Verfahren verknüpft das erfindungsgemäße Verfahren einfach und vorteilhaft die elektrisch induzierte Zellfusion mit einer Vorselektion der antigenspezifisch stimulierten Zellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt seine Vorteile besonders dort, wo die Konzentration der stimulierten Zellen im Zellgemisch gering ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß der chemisch aktivierte Flächenträger unter bekannten Bedingungen (feucht, steril) lagerungsfähig und verschickbar ist. Dies ermöglicht eine schnelle Fusion und Kultivierung am Ort der Gewinnung des Zellgemisches. .

Ausfuhrungsbeispiel

Die Milzzellen einer mit HSA immunisierten Maus (Balb/c) werden von Erythrozyten befreit (Ficoll-Visotrast-Gradient mit 1,08g/cm³), zweimal in PBS gewaschen und in PBS resuspendiert (Zelldichte 10⁵/μΙ). 25 μΙ der Milzzellsuspension werden auf einen chemisch aktivierten und mit HSA-Molekülen gekoppelten Flächenträger von 144 mm 0 und 0,2mm Stärke geschichtet (Typ UF60, Institut für Polymerenchemie der AdW der DDR, Teltow-Seehof) und 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37⁰C inkubiert. Die chemische Aktivierung erfolgt mit einem Chlorameisensäurenorbornylester und die HSA-Kopplung in Boratpuffer pH8,3 mit 1 pg HSA/ml. Der mit Milzzellen beschichtete Flächenträger wird in PBS gespült, bis nur noch die antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten gebunden bleiben. Der Flächenträger wird in eine isotone, ionenarme Fusionslösung überführt (spezifische Leitfähigkeit 180ps/cm) und auf die untere Plattenelektrode der Fusionskammer gelegt. Auf den Flächenträger werden 30μΙ Myelomzellsuspension geschichtet (1,5 · 10^s Zellen in ionenarmer Fusionslösung), und die obere Plattenelektrode wird der unteren auf einen Abstand von 0,5 mm genähert. An die Plattenelektroden wird 3 Minuten lang oin schwaches, hochfrequentes elektrisches Wechselfeld angelegt (ii» IHz, 12V). Für 2 Sekunden wird die elektrische Spannung auf 35V gesteigert und unmittelbar darauf der elektrische Fus'onsimpuls appliziert (30 V, 8ps). Der Flächenträger wird der Fusionskammer entnommen, mit 30μΙ Wachstumsmedium überschichtet und 10 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert (37⁰C, 8% COj). Durch Spülen mit Wachstumsmedium werden die nicht fusionierten Myelomzellen vom Flächenträger entfernt. Die trägerfixierten Fusionsprodukte werden in 1 ml Wachstumsmedium (RPMI + 15% US) kultiviert. Die Reklonierung und die Analysierung der Kulturüberstände zeigen, daß nahezu alle Zellklone HSA-spezifische Antikörper produzieren.

Claims

1. Zeilfusionsverfahren, bestehend aus dem Einbringen verschiedener Zellen oder Zellgemische in einer schwach leitfähigen, isotonen, wäßrigen Lösung zwischen zwei parallele Plattenelektroden, dem Anlegen eines hochfrequenten elektrischen Wechselfeldes (Oielektrophorese), dem anschließenden Anlegen eines hohen elektrischen Gleichspannungsirnpulses und der Gewinnung der fusionierten Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zellgemisch mit stimulierten Zellen vor dem Einbringen zwischen die Plattenelektroden auf einen Flächenträger gegeben wird, an dessen Oberfläche die zur Zellstimulierung verwendeten Antigenmoleküle kovalent gebunden sind, die stimulierten Zellen über die Wechselwirkung zwischen Zellmembranrezeptoren und den trägerfixierten Antigenmolekülen spezifisch am Flächenträger gebunden werden, die nichtgebundenen Zellen durch Spülen vom Flächenträger entfernt werden, ohne die gebundenen Zellen abzulösen, der Flächenträger mit den gebundenen, stimulierten Zellen zwischen die Plattenelektroden eingebracht wird, Myelomzellen in hoher Dichte auf den Flächenträger gegeben werden, die Myelomzellen durch Sedimentation und unter zusätzlicher Einwirkung eines angelegten hochfrequenten elektrischen Wechselfeldes mit den am Flächenträger gebundenen, stimulierten Zellen in Membrankontakt gebracht werden, die Zellpärchen durch ein hochfrequentes elektrisches Wechselfeld und einen anschließenden hohen Gleichspannungsimpuls in an sich bekannter Weise fusioniert werden, der Flächenträger durch eine Spülung von den überflüssigen, nicht fusionierten Myelomzellen befreit wird, ohne die gebundenen Fusionsprodukte abzulösen und diese Fusionsprodukte mit dem Flächenträger außerhalb der Fusionsvorrichtung zur Kultivierung im Wachstumsmedium überführt werden.

2. Zellfusionsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Flächenträger eine Zellulosemembran verwendet wird die durch vollständige alkalische Hydrolyse aus konventioneller Acetat-(2V2-)Memb/an hergestellt wird, einen Restacetylgehalt von weniger als 1 % besitzt und deren Dicke zwischen 100 und 500pm, vorzugsweise 150 bis 250pm beträgt.

3. Zellfusionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Flächenträger verwendet wird, der porös ist, die Poren kleiner als 100nm sind und der Porenabstand klein gegenüber dem Durchmesser der stimulierten Zellen ist.

4. Zellfusionsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Flächenträger, auf dessen Oberfläche die zur Zellstimulierung verwendeten Antigenmoleküle kovalont gebunden sind, vor der kovalenten Bind· ,ng durch solche chemischen Mittel aktiviert wurde, die keine zusätzlichen positiven Festladungen an der Oberfläche des Flächenträgers erzeugen.

5. Zellfusionsverfahren nach Ansprüchen 2 und 4 oder 2,3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als chemische Mittel zur Aktivierung des Flächenträgers Natriumperjodat oder Chlorameisensäurenorbonylester verwendet werden.

6. Zellfusionsverfahren nach Ansprüchen 2 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als im Zellgemisch befindliche stimulierende Zellen B-Lymphozyten verwendet werden, die mit Antigenmolekülen stimuliert wurden und über Wechselwirkungen zwischen den Membranrezeptoren der stimulierten Zellen und den kovalent an den Flächenträgergebundenen Antigenmolekülen an den Flächenträger fixiert wurden.