DD285994A5 - Verfahren zur herstellung eines hbv-impfstoffes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Prophylaxe von HBV-Infektionen, wobei rekombinante Oberflaechenproteine bzw. Hybridpartikel von HBV verwendet werden, die durch ein gentechnologisches Verfahren gewonnen werden, bei dem man ein HBV-Gen, das fuer das entsprechende Oberflaechenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so grosz ist, dasz er fuer ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekuel an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekuel in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium zuechtet und aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das Protein bzw. das Hybridpartikel isoliert.{HBV; Oberflaechenprotein-Gen; Oberflaechenprotein; Hybridpartikel; Expressionsvektor; DNA-Rekombinationstechnik; Nachweis von induzierten Antikoerpern; Prophylaxe; Impfstoff gegen HBV-Infektionen}

Description

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn He AIa Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His He Ser Ser Ser Ser AIa Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro VaI Thr Asn

Hierzu 20 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin zur Prophylaxe von HBV-Infektionen des Menschen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik A. Hepatitis B Impfstoffe

Die Infektion mit Hepatitis B Virus (HBV) ist ein ernstes, weit verbreitetes Gesundheitsproblem. Die Infektion kann akut oder chronisch sein. In den Vereinigten Staaten wird die Zahl der akuten Hepatitisfälle auf mindestens 100000 pro Jahr mit einer Todesrate von 1-2% geschätzt. Als chronische Überträger von HBV werden unter gesunden Erwachsenen abhängig vom Alter und sozialer Schicht 0,1 bis 1 % eingestuft. In Südamerika gelten etwa 1 bis 3%, in der UdSSR und Südeuropa etwa 3 bis 6% und in Asien und Afrika mehr als 10% als chronische HBV-Überträger.

In entwickelten Ländern benötigt man einen Impfstoff für Menschen, die einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind Patienten und Personal in medizinischen Einrichtungen, wo man mit Blut in kontakt kommt, militärisches Personal, Enepartner von chronischen HBV-Überträgern, Reisende in HBV-endemische Gebiete, Neugeborene von chronischen HSV-Überträgern, Homosexuelle, Prostituierte und Drogenabhängige. In Ländern der Dritten Welt benötigt man einen billigen Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen. Eine solche Immunisierung kann schließlich nicht nur die Zahl akuter Hepatitisfälle und chronischer HBV-Überträger verringern, sondern auch die Erkrankungsziffer und Sterblichkeitsrate bei chronischer aktiver Hepatitis und Leberzellkaizinom reduzieren.

Dane-Partikel, die man für Hepatitis B Virionen hält und die man aus infizierten Patienten isolieren kann, haben einen Durchmesser von etwa 42 nm. Jedes Partikel besteht aus einer Hülle, die das Hepatitis B-Oberf lächenantigen (HBsAg) enthält, einem Capsid (HBcAg), einer endogenen Polymerase und einem DNA-Genom. Das Genom ist zirkulär und doppelsträngig mit einer.-· Einzelstrangbereich von etwa 200 Basen. Der Einzelstrangbereich kann in vitro durch die endogene Polymerase zum Doppelstrang gemacht werden. Das DNA-Genom enthält etwa 3200 Basen.

Die Herstellung von HBV-Impfstoffon stellte sich seit langem als schwierig heraus, da das Virus nur schwer in Gewebekultur vermehrbar ist und nur der Mensch als Wirt bekannt ist. Im Labor ist es jedoch möglich, auch Schimpansen mit dem Virus zu infizieren.

Aus Valenzuela et al.. Nature 298 (1982), 347-350, ist die Expression von HBsAg in Hefe bekannt. Die codierende Sequenz von HBsAg, ein 835 Basenpaar großes Taq ι -Hpa1 -Fragment, wird unter die Kontrolle des H'jfe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotcn gestellt. Dieser Arbelt gingen mehrere kurze Berichte über Forschungsaktivitäten auf diesem Gebiet voraus. Dazu gehört die Arbeit von Valenzuela et al., Arch.Biol.Med.Exp. (Chile), 14 (1) (1981), 21-22, aus der die Expression eines DNA-Fragments in Hefe bekannt ist, das für ein Protein codiert, das ähnlich zu HBsAg ist. Dieses DNA-Fragment wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotors gestellt. Ferner ist aus einer Arbeit in Scrip Nr.61 β, S. 14 (12. Aug. 1981) bekannt, daß ein Team von US-Wissenschaftlern, dem P. Valenzuela und W. J.Rutter angehören, die Herstellung des Hüllproteins von Hepatitis B Virus in Hefe angekündigt haben. Aus Zuckerman, Nature, 295, (1982), 98-99, ist bekannt, daß W. J. Rutter über die Expression von glykosyliertem HBsAg in Hefezellen berichtet hat.

Antigene Komponenten von HBV, wie HBsAg, sind laut Berichten in Bakterien hergestellt worden, in die ein rekombinantes DNA-Molekül eingeschleust wurde, das ein Gen enthält, das für das Antigen codiert. Aus Burrell et al., Nature, 279, Nr. 5708 (1979), 43-47, ist die Expression von HBV-DNA-Sequenzen in E.coli, Stamm HB101 bekannt. Diese DNA-Sequenzen lagen Moniert In dem Plasmid pBR322 vor.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 13828 ist die Herstellung eines rekombinanten Vektors bekannt, der für HBV-Antigene, wie HBeAg, codiert. Der Vektor wird aus der DNA von Dane-Partikeln und des Plasmids pBR322 hergestellt und eignet sich zur Transformation des E.coll Stammes ΗΒ10Ί. Die Autoren geben an, daß als geeignete Wirte auch endere bakterielle Zellen, Hefe und Pilze, animalische und pflanzliche Zellen und andere Wirte zu verstehen sind, obwohl in dieser Anmeldung nur E.coli als Wirtssystem verwendet wird.

Aus Charnay et al., Nature, 288(1980), 893-895, ist die Konstruktion eines Bacteriophagen bekannt, der ein Fusionsgen aus dem ß-Galactosidase-Gen und dem Strukturgen HBsAg enthalt. Der Bacteriophage führt zur Expression eines Fusionsproteins, das die antlgenen Determinanten von HBsAg und ß-Galactosidase enthält.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr.2034323 ist die Herstellung eines Phagen, der HBV-DNA enthält, bekannt. Der E.coli Stamna C600 wird durch diesen rekombinanten Phagen transformiert.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 070621 ist ein Plasmid bekannt, das einen Teil des HQsA^-Gens, den Promotor und das Z-Gen des Lacto3e-Operons besitzt, und das in E.coli kloniert wurde.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 20 251 sind rekombinante Vektoren aus dem Piasmid pB322 und BamHI-Fragmenten von HBV-DNA bekannt, die zur Transformation von E. coil verwendet werden können. Andere Vektoren, die ein BamHI-Fragment von HCV-DNA und einen Teil des Tryptophan-Üperons enthalten, wurden verwendet, um Expression in E. coli, Stamm HB101 ,zu erhalten.

Aus Edman et al., Nalure, 291, Nr. 5815 (1981), 503-506, ist die Konstruktion von Plasmiden bekannt, die zur Expression von HBcAg und binem Fusionsprotein aus ß-Lactamase-HBsAg in E.coli führen. Die Expression findet unter Kontrolle des regulatorischen Bereiches des Tryptophan-Operons statt.

Aus Pumpen et al., Gene, 30, (1984), 202-210, ist bekannt, daß geringe Mengen des HBsAg-Monomers und Fusionsproteine in E.coli synthetisiert werden. Die Expression wird durch Antikörper nachgewiesen, die mit dem denaturierten HBsAg-Monomer reagieren.

Andere Literaturzitate, in denen die Insertion von HBV-DNA in Bakterien offenbart wird, sind folgende: Charnay et al., Progr. Mod. Viral., 27 (18S1), 88-92; MacKay et al., Proc. Natl. Acad. ScI. U. S.78, Nr.7 (1981), 4510-4514; Fritsch et al., C.R.Acad.Sci.,287, Nr. 16 (1978), 1435; GB-Patentanmeldung 2034323 (Derwent Nr.46874C) und Pasek et al.. Nature, 282, N.. 6 (19791,575.

HBV-DNA wurde auch in Säugetierzellen kloniert, nämlich in Zellen des Menschen, der Maus und in Zellen eines menschlichen Lebertumors. Aus Dubois et al., Proc.Na'.I.Acad.Sci.U.S., 77, Nr.8 (1980), 4549-4553, ist beispielsweise die Transformation von Mauszellen mit einem Plasmid bekannt, das dac HBV-Genom enthält. Die Expression von HBsAg wird offenbart; aus Hirschman et al., Proc. Natl. Acad.Sd. U.S., 77, Nr.9 (1980), 5507-5511, ist die Herstellung von HBV-ähnlichen Partikeln durch HeLa-Zellen bekannt, die mit HBV-DNA transformiert wurden.

Aus Funakoshi et al., Progr. Med. Viral., 27 !1981), 163-167, und Maupas et al., Progr. Med. Viral., 27 (1981), 185-201, sind Verfahren bekannt, um durch Verwendung von HBsAg aus menschlichem Blut HBV-Impfstoffe herzustellen. Der Impfstoff von Funakoshi et al. onthält 40pg gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg, Phosphat, Natriumchlorid, 20mg Mannit und als Adjuvans 0,1 % Aluminiumhydroxid. Aus der Arbeit von Maupas et al. ist bekannt, daß eine Dosis des Impfstoffes 1 ml war, der 2 bis 10μς gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg (bestimmt nach der Methode von Lowry) und 0,1 % Aluminiumhydroxid enthält. Das von Maupas et al. verwendete Protokoll forderte drei Injektionen im Abstand von je einem Monat mit einer Auffrischimpfung nach einem Jahr; die Autoren schlagen zwei Injektionen von konzentriertem HBsAg im Abstand von drei Monaten vor. Ergänzende Literaturzitate zur Herstellung von HBV-Impfstoffen sind Maupas et al., Adamowicz et al. und Funakoshi et al. bzw. auf den Seiten 3,37 und 57 von Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium No. 18, herausgegeben durch Maupas und Guesry, 1981, Elsevler/North-Holland Biomedical Press.

Hefen sind als Wirtsorganismen zur Expression von besf'.nmten DNA-Sequenzen verwendet worden. Diese Sequenzen sind jedoch keine HBV DNA-Sequenzen. Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2068969 ist die Herstellung von Hühner-Ovalbumin in Hefe bekannt; aus einer Arbeit in Scrip Nr. 640, S. 11 (4. Nov. 1981) ist bekannt, daß ein Interferon-Typ in Hefe hergestellt wird. Aus dem Europäischen Patent 11562 (Derwen: Nr.38762C) sind hybride Hefeplasmide bekannt, die das uraj Hefe-Gen in dem 2μ Plasmid enthalten.

Das natürliche Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) kann aus Plasma von infizierten Individuen als ein 22 nm großes Partikel isoliert werden. Dieses Partikel besteht aus den zwei Proteinen, P24 und seinem glykosyliertem Derivat GP28. Beide Proteine besitzen 226 Aminosäuren und werden von dem Gen S des HBV-Ienoms codiert. Eine für 163 Aminosäuren codierende DNA-Sequenz, die unmittelbar vor der codierenden Soquenz des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, wird als Pre-S-codierende Sequenz bezeichnet. Ein für 55 Aminosäuren codierender DNA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz, der unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proti ns liegt, wird als Pre S2-codierende Sequenz bezeichnet. Die ?re S-codierende Sequenz, oder irgendein kleiner Teil davon, wird auch als die DNA-Sequenz bezeichnet, die für das HBsAg Vorläuferprotein codiert.

Die Pre S-codierende Sequenz von einigen HBV-Subtyptn (z.B. ayw) umfaßt 163 Codons, während sie bei anderen HBV-Subtypen (z. B. adwj) 174 Codons besitzt. In jedem Fall besitzt die Pre S2-Region 55 Codons und liegt unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins.

In der Pre S2-codierenc'en S jquenz liegt die Bindungs- oder Rezeptorsteile für Polyalbumin, die auf der Oberfläche von Dane-Partikeln und auf der Oberfläche von einigen HBsAg-Partikeln gefunden wird, welche aus dem Serum von HBV-infizierten Patienten isoliert werden. Obwohl die Pre S2-Region unmittelbar vor der codierenden Region des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, ist die Pre S2-Region nicht an der Zusammensetzung von HBsAg-Partikeln beteiligt; vgl. z. B. Persing et al., Prac. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985), 3440-3444.

Aus Valenzuela et al., Nature, 298 (1982), 347-350, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von Hefezellen gefunden wurden, welche mit einem Vektor transformiert wurden, der die codierende Sequenz des Proteins enthält. Daraus wurde geschlossen, daß HBsAg-Partikel in Hefe synthetisiert werden.

Aus Harford et al., Developments in Biological Stadardization,54 (1983), 125-139, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von transformierten Hefezellen gefunden wurden. Diese Zellen wurden mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für 18 Aminosäuren der Ornithin-Carbamoyltransferase codiert. Dieser Sequenz folgten unmittelbar

im 3'-Ende ein DNA-Bereich der Pre S2-codierenden Sequenz, der für 42 N-terminale Aminosäuren codiert und anschließend der codierende Bereich des S-Proteins.

Aus Laub et al., J. Virology, 48 i1) (1983), 271-280, ist die Konstruktion eines Simian Virus 40 Vektors bekannt, in dem die frühe Region durch einen großen Teil des HBV-Genoms, der die Pie S2-S-proteincodierende Sequenz enthält, ersetzt ist. Diese HBV DNA wurde in SV40 transfoi mierten CV-1 Zellen (COS-Zellen) exprimiort.

Aus Stibbe et al., J. Virology, 46 (2) (1983), 626-628, ist bekannt, daß GP33 und GP36 in geringen Mengen vorliegende HBsAg Glykoproteine durch die Pre S2-S-proteincodierende Sequenz codiert werden. Aus Stibbe et al., Dev. Biol. Stand., 54 (1983), 33-34,1st bekannt, daß HBsAg-Partikel, die große Mengen von GP33 und GP36 enthalten, keine höheren Antikörpertiter gegen das Anti S Protein enthalten, als jene HBsAg-Partikel, die fast frei von GP33 und GP36 sind.

Aus Heerman et al., J.Virol, 52 (2) (1984), 396-402, ist bekannt, daß die codierende Sequenz des Proteins S die Pre S-codierende Sequenz, die für 389 Aminosäuren codieren, für das Polypeptid P39 codieren. Dieses Polypeptid wird zusammen mit der giykosylierten Form GP42 und den anderen HBV Cberflächenantigen-assoziierten Polypeptiden P24, GP27, GP33 und GP36 in HBV-Partikeln und viralen Antigenfilamenten gefunden.

Aus Neurath et al., Science, 224 (1984), 392-39-1, ist bekannt, daß Polypeptide mit den 26 aminotorminaten Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz irnmunogen sind. Es wird darauf hingewiesen, daß Antikörper gegen diese Polypeptide füi diagnostische Tests verwendet werden können.

Aus Michel et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81 (1984), 7708-7712, ist die Expression von HBsAg, das Rezeptoren für das menschliche Serum Polyalbumin trägt, in chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) bekannt. Diese Zellen wurden mit einem Plasmid trensfiziert, des die Pro S2-S-proteincodierende Sequenz enthält.

Aus Persing et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, (1985), 3440-3444, ist bekennt, daß Maus L-Zellen, die mit einer Pro S2-S-proteincodierenden Sequenz transformiert wurden, drei HBsAg-verwandte Polypeptide (24,27 und 35 kd) exprimieren.

Diese Polypeptide können zu komplexen immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden, die poiymerisiertes menschliches Serumalbumin (HSA) binden; Maus L-Zellen dagegen, die mit einer Pre S2-S-codierenden Sequenz, die am 3'-E η de der Pre Sü-Region eine Leserahmenmutation besitzt, transformiert wurden, können nur noch 24 und 27 ltd große Polypeptide exprimieren, die zu immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einnem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden können und nicht mehr HSA binden können. Persing et al. folgern daraus, daß die Pre S2-S-proteincodierende Sequenz für ein 35 kd großes Polypeptid codiert und daß das Pre S2-Protein für die HSA Bindungsaktivität von HBsAg verantwortlich ist, nicht aber für die Zusammensetzung und Sekretion von HBsAg-Partikeln benötigt wird; es wird ferner geschlossen, daß das in großen Mengen vorliegende 24 kd große Polypeptid vnn HBsAg nicht in erster Linie durch Spaltung von größeren Vo'ISuferproteinen (nämlich den 27 oder 35kd groß- otidon) erhalten wird.

Aus Milich et al., Science, 228 (1985), 1195-1199, ist bekennt, pfstoffe, die HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg enthalten,

in bestimmten Mäusen eine Unempfindlichkeit verhindern köi,. ,on, die auftritt, wen., der Impfstoff nur HBsAg enthält; die verwendeten HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg wurden aus chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) erhalten, die mit einem Plasmid transfiziert worden woren, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthielt. Es ist ferner bekannt, daß die 26 Aminosäuren am Aminoterminus des 33 kd großen Polypeptide, das durch die Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, eine dominante Antikörperbindungsstelle in der Pre S2-Region repräsentieren.

In Michel et al., .Vaccines 86", Brown et al., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1986), 359-363, ist die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikel, die das Expressionsprodukt der Pre 52-Region enthalten, beschrieben.

Aus Neurath et al., Nature, 315 (1985), 154-156, ist bekannt, daß die Pre S-Region Proteine der HBV-Hülle codiert, die Domänen besitzen, die spezifisch durch Leberzellen erkannt werden; die Pre S2-S proteincodierende Sequenz für ein Protein codiert, das in HBV-Partikeln vorhanden ist; synthetische Peptide, die dem Gen entsprechen, das für Pre S-Proteine codiert, Immunogen sind.

Neurath et al. schließen daraus, daß HBV-Impfstoffe Pre S-Determinanten enthalten sollten.

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 3, (1985), 317-320, ist die Expression der gesamten Pro S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe bekannt; es ist ferner bekannt, daß diese Hefezellen ein Partikel mit HBsAg und Pre S synthetisieren, das im Elektronenmikroskop und in den Sedimentationseigenschaften sehr ähnlich jenen Partikeln ist, die nur HBsAg enthalten, und daß die Pre S2-Region nicht die Fähigkeit beeinträchtigt, Partikel auszubilden, die den 22 nm großen HBsAg Partikeln sehr ähnlich sind. Aus Valenzuela et al. ist ferner die Hypothese bekannt, daß HBV in die Leber gelangt, indem der HBV-Polyalbumin-Rezeptor durch Polyalbumin an Leberzellen gebunden wird und somit das Virus aufgenommen wird, und daß der Polyalbumin-Rezeptor von HBV durch die Pre S2-Region codiert wird. Valenzuela schließt daraus, daß ein Impfstoff, der Pre S2 enthält, zur Bildung von Antikörpern führt, die nicht nur HBV über einen normalen Mechanismus inaktivieren, sondern auch die Aufnahme des Virus durch Leberzellen stören könnten.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 171008-A beansprucht die Herstellung von nicht-glykosvliertem Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen P31 Protein in Hefe.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 174 444-A 2 beansprucht ein Verfahren zur Herstellung in Hefe von HBsAg-Partikel, die das P31 Protein enthalten.

Die folgende Tnbelle I vergleicht die bekannten Aminosäuresequenzen der Pre S2-Region mit der HBV Pre S2-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung:

Tabeil«!

Vergleich der Aminosäuresequenz der Pre S2-Reglon von verschiedenen HBV Serotypen

HBV Subtyp

Pre S2 codierende Region

adw	H	L	- T	Amlnotaure-Abkürzungen	D	L	K
adw				Asp	T	L
odw			Thr	S
adw	T		Ser	E
adr	T	L	GIu	P
adr	T	L	Pro	G
ayw	T	T	GIy	A	Aspartat
adyw	T	AIa	C	Threonin
	Cys	V	Serin
	VaI	M	Glutaminsäure
	Met		Prolin
		Glycin
		Alanin
		Cystein
		Valin
	Methionin

	HISS!	3SAR	-10	Literatur-	I	1
-20			ITGDPVTr	0 zitat		2
NIAS						3
					AP	4
			I	i Gegenstand	AP	5
			I	Pre S2 co	AL	6
			I		AL	7
	TT	P	I	dierende Region	Isoleucin	8
	TT	P	IFS		Leucin
V	TT	PL	IS	Tyrosin
V	TTT	P	IFSI	Phenylalanin
VL			IFSI	Histidin
V			I	Lysin
He			L	Arginin
Leu			Y	Tryptophan
Tyr			F	Glutamin
Phe			H	Asparagin
HIs			K
Lys			R
Arg			W
Trp			Q
GIn			N
Asn

Zitierte Literatur

1. Valenzuela ot al., In Animal Virus Genetics (Field, Jaenisch and Fox eds), 57-70, Academic Press, New York (1980).

2. Chowet al., Fourth Annual Congress for Recombinant DNA Research, San Diego, USA, 1984.

3. Fujisawaetal.,Nucl.AcldsRes.,11 (1983), 4601-4610.

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8. Pasek et al., Nature, 282 (1979), 575-579. B. Polyvalente Impfstoffe

Aus Valenzuela et al.. Biotechnology, 3 (1985), 323-327, ist bekannt, daß der HBsAg Polyalbuminrezeptor, der durch die Pre S2-codierende Sequenz codiert wird, zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen verwendet werden kann. Aus Valenzuela et al. Is*. ferner bekannt, daß durch Expression der hybriden HSV-1gD-Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz in Hefe die Herstellung eines hybriden HBsAg-Herpes simplex 1-Virus Glykoprotein D (HSV-IgD) Partikels ermöglicht wird.

Aus Valenzuela, .Hepatitis B subunit vaccines using recombinant DNA Techniques", 15.Mai 1985, Bio-Expo-5-Meeting, Boston Massachusetts, ist bekannt, daß bei einem Hybrid, wie dem vorstehend beschriebenen HBsAg-HSV-igD-Pnrtikel, die immunologische Dominanz von HBsAg gegenüber dem fremden immunogenen Polypeptid, das auf der Oberfläche des Partikels

präsentiert wird, gefährdet wird.

Aus der Europäischen Patentanmeldung 0175 261 ist ein neues hybrides Polypeptid bekannt, das zumindest einen großen Teil des Hepatitis B Oberflächen-Antigens fusioniert mit einem oder mehreren Oligopeptiden enthält. Das hybride Polypeptid ist in der Lage, In einem zellulären Wirt oin Partikel zu bilden, das zumindest ein Epitop von zumindest einem Oligopeptid präsentiert.

Proteine können posttranslationale Modifikationen erfahren und einige von diesen können die Konformation und Funktion des Proteins grundlegend beeinflussen. Oligosaccarid-Kstten an dem aus Menschen stammenden Pre SI-Pre S2-S und Pre S2-S-Protein (Heerman et al., J. Virol., 52 (1984), 396-402; Stibbe and Gerlich, Virology, 123 (1982), 436-442; Stibbe and Gerlich,

J. Virol., 46 (1983), 626-628, und vermutlich die Myristinssufe an dem Pre SI- Pre S2-S-Protein (Persing et al., Abstracts of papers presonted at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 20.31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory) könnten die Partikelbildung, die Konformation der Proteine in den Partikeln und die Antigenität und Immunogenität dieser

Partikel beeinflussen.

Hefe (Saccharomyces cerevisiae) besitzt die nötigen Enzyme, um Proteine zu glykosylieren (Baüou «The Molecular Biology of the.

Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression"; Strathern, Jones and Broach Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 335-360) und Fettsäuren zu acylieren (Towler and Glasler, Proc. Natl. Acad. Sei., 83 [1986], 2812-2816, ähnlich wie dies

höhere eukaryontische Zellen vermögen.

Virale Oberflächenglykoptroteine, die in Hefe exprimiert wurden, liegen glykosyliert vor. Aus Jabbar et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 82 (1985), 2019-2023, ist bekannt, daß die Expression des Hämagglutinin-Gens von Influenza in Hefen zu einem glykosylierten Hämagglutinin-Protein führte. Aus Wen and Schleshqer, Proc. Natl. Acad. Sei.. 83 (1986), 3639-3643, ist bekannt, daß die Expression von Glykoprotainen des Sindbis und vesiculären Stomatitis Virus in Hefe zu glykosylierten Viral-Proteinen führte.

Aus Fujisawa et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31 .Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S.62) ist bekannt, daß die Expression des Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei glykosylierten Formen des Pre S2-S Proteins führte. Aus Kniskern et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, 9.-14. Sept. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 89) ist bekannt, daß die Expression des Pre S1- Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei Pre S1 - Pre S2-S Proteinen mit einer Größe von 45kd bzw. 39kd führte. Aus Persing et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31 .Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 19) isl bekannt, daß die Zugabe von ³H-markierter Myristinsäure zu COS7-Zellen, die Pre SI- Pre S2-S, Pre S2-S und S-Proteine exprimieren, zu radioaktiv markierten Pre S1- Pre S2-S Protein führte.

Fusionsproteine, die in Hefe exprimiert und in ein Partikel verpackt werden, werden nach dem allgemeinen Schema gereinigt: Aerosile Adsorption und Desorption (1) -> Calciumchlorid-Präzipitation (2)-> Phenylagarose oder Phenylboronatagarose-Adsorption und Desorption (3) -» Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation oder DEAE-Ionenaustauschchromatographie. Schritt 1 ist aus der EP-A 0204 680 und Schritt 3 aus der EP-A 0199698, soweit es Phenylagarose betrifft, bekannt. Die spezifische Kombination von Schritt 1 und Schritt 3 ermöglicht es, kontaminierendes Material stark abzutrennen (Eliminierung von 90% Protein, Kohlenhydraten und 50% Lipide). Diese neue Kombination ermöglicht ein gutes Funktionieren der nächsten chromatographischen Schritte.

Im Falle von Fusionsproteinen, die glykosyliert sind, wird Phenylboronat (PBA) als Affinitätsadsorbens verwendet. Bei pH 9 bildet die Boronatgruppe kovalente Komplexe mit möglichen cis-Diolgruppen an den glykosylierten Seitenketten aus. PBA-GeIe sind gegebenenfalls zur Reinigung von löslichen Glykoproteinen nicht aber zur Reinigung von Partikeln, die GIy koprotoine in der Lipid-Doppelschicht eingebettet haben, verwendet worden (vgl. Cook et al., Analyticyl Biochemistry, 149 (1985), 349-535; Middle et al., Biochemical Journal, 209 [1983], 771-779; Cook et al., Biochimica et Biophysica Acta, 828 (1985), 205-212; Maestasane et al., Journal of Chromatography, 189 (1980), 225-231). Da das Partikel viele Liganden-Bindungsstellen enthält, müssen PBA-GeIe mit einer sehr niedrigen PB-Ligandendic ite verwendet werden, z.B. PBA-GeIe mit einem Boronatgehalt von < ΙΟμυ/ml Gel, vorzugsweise 5pg Boronat pro ml Gel. die Verwendung von Phenylboronatgelen mit sehr niedrigem Boronatgehalt erlaubt die Affinitätschromatographie von Partikeln, die Glykoproteine eingebettet enthalten.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eirvts HBV-Impfstoffes zur Prophylaxe von HBV-Infektionen des Menschen zur Verfügung gestellt.

Darlegung ries Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen HBV-Impfstoff herzustellen für Menschen, die einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind.

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines HBV-Impfstoffes, bei dem ein rekombinantes DNA-Molekül verwendet wird, das eine funktioneile codierende DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer Hepatitis B Virus (HBV) Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Der Ausdruck .codierende Sequenz" oder .codierende Region*, wie hier gebraucht, schließt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon ein. Mit dem Ausdruck .funktionelles Derivat" Ist eine codierende Sequenz mit Aminosäure-Modifikationen gemeint, die, wo es angebracht ist, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität, wenn dies gewünscht ist, beibehält. Ein solches funktionelles Derivat kann durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie durch Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschrieben, hergestellt werden. Im allgemeinen enthält ein solches DNA-Molekül eine regulatorische Region, die vorzugsweise vom Hefe arg'-Gen stammt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter Vektor verwendet wird, der ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktioneile codierende DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-p oteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Mit dem Ausdruck .regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die eine F'romotor-Region und andere notwendige Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine eukajyontische Wirtszelle verwendet wird, die durch einen rekombinanten Vektor transformiert wird, welcher ein DNA-Molekül enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktionell, codierende DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine solche transformierte Wirtszelle hergestellt wird. Dazu gehört auch die Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit solch einem rekombinanten Vektor.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein hybrides HBsAg enthaltendes Partikel hergestellt wird, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktioneile codierende DNA-Sequenz codiert wird. Das Verfahren umfaßt die Kultivierung einer durch einen rekombinanten Vektor transformierten eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Lysat oder Extrakt dieser Wirtszelle. Der verwendete Vektor enthält ein mit einer regulatorischen Region funktionell verbundenes DNA-Molekül, in dem die funktioneile codierende DNA-Sequenz in Ablösephase mit einem Teil der Pre S2-Reg;on aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein Impfstoff hergestellt wird, der ein Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) enthaltendes hybrides immunogenes Partikel enthält, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktioneile codierende DNA-Sequenz c }diert wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herste lung eines Impfstoffs, der eine zu/n Immunschutz notwendige Menge an solchen hybriden Partikeln enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der Mizellen enthält, die ein solches hybrides Partikel

und Polysorbat enthalten und einen Impfstoff, der eine zum !«nmunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Mit dem Ausdruck .funktioneile codierende DNA-Sequenz* ist eine codierende DNA-Sequenz gemeint, die nach Fusion in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pro S2-S-proteincodierenden Sequenz an der Zusammensetzung

des HBsAg Partikels nicht beteiligt ist und auch nicht dabei stört.

Bevorzugte funktioneile codierende DNA-Sequenzen umfassen die gesamte HBV Pro S-proteincodierende Sequenz oder ein Immunogenes Derivat davon, wie die Pre S2-, Pre S1- oder Pre S1- PYe S2-proteincodierende Sequenz, sind aber nicht beschränkt

darauf.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine HBV »'re Si-proteincodierende Region verwendet wird, die für die

folgende Aminosäuresequenz codiert:

ATG üGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn P>o Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lye Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy Ne Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

oder bei dem eine HBV Pre S2-proteincodierende Region oder eine HBV Pre S2-S-proteincodierende Region verwendet wird, in der der Pre S2-Anteil für die folgende Aminsäuresequenz codiert:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

-20 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-

-10 Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine solche Pre S1-, Pre S2- oder Pre S2-S-proteincodierende Region mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine transformierte Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält; ein Verfahren zur Herstellung einer solchen transformierten Zelle, das die Transform.]tion einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt;das Protein, das durch eine solche codierende Region codiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins; ein Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Protein enthält, das Partikel, das durch eine solche Pre S2-S-proteincodierende Region codiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Partikels, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Partikel enthält und eine Mizelle, die solch ein Partikel und Polysorbat enthält, und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekomblnanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine vollständige Pro S1- Pro S2-S-proteincodierende Sequenz oder Pre S1-funktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz oder ein immunogenes Derivat davon mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine Hefe-Wirtszolle, die mit solch einem Vektor transformiert wird; ein Verfahren zur "'Erstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Hefe-Wirt&celle mit solch einem Vektor umfaßt; ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pre S1- Pre S2-S-protelncodierende Sequenz oder Pre Sffunktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert Ist, oder eines Immunogenen Derivats davon; das Protein, das durch solch eine Methode hergestellt wird; einer. Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Protein enthält; ein Partikel, das ein Polypeptid enthalt, welches durch die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder Pre S1-funktioneile DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Partikeln enthält, eine Mizeile, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine Pre S1- Pro S 2 proteincodierende Sequenz oder Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz verwendet wird, von denen der Pre SI- Pre S2 Bereich die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

PRE-S1-REGION ATQ GGQ ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GQA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGQ GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro He Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VoI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy !Ie Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy Ue Leu Thr Thr VaI Ser Thr Ue Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

PRE-S2-REGION ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGU GGT CTG AIa Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Scr GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn He AIa Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His lie Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro VaI Thr Asn

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter Vektor verwendet wird, in dem eine solche neue Pre S1 - Pre S2 oder Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist; eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt; ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine solche Pre S1- Pre S2 oder Pre S1 - Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist oder eines immunogenen Derivats davon; das Protein, das durch eine solche Methode hergestellt wird; einen Impfstoff, der eine zum Immunschub notwendige Menge an einem solchen Protein enthSIt; ein Partikel, das ein Polypeptid enthälv, das durch eine solche Pre S1- Pre S2-S proteincodiorende Sequenz codiert ist, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Partikeln enthält und eine rViizelle, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält.

Folgende Aminosäure-Abkürzungen werden verwendet:

Asp	Aspartat	He	Isoleucin
Thr	Threonin	Leu	Leucin
Ser	Serin	Tyr	Tyrosin
GIu	Glutaminsäure	Phe	Phenylalanin
Pro	Prolin	His	Histidin
GIy	Glycin	Lys	Lysin
AIa	Alanin	Arg	Arginin
Cys	Cystein	Trp	Tryptophan
VaI	Valin	GIn	Glutamin
Met	Methionin	Asn	Asparagin

Kurze Beschreibung der Figuren: Fig. 1: ist eine Restriktionskarte von pRIT10601. Fig. 2: ist eine Restriktionskarte von pRIT 10616. Fig.3: ist eine Restriktionskarte von pMC 200. Fig.4: ist die Nucleotid-Sequenzeines Bereiches des 3300 Basenpaar großen Hofe Hindlll-Fragments, das in pMC200 integriert

ist und das die Restriktionsstellen Hindi, BgI Il und EcoRI besitzt

Fig. 5: zeigt die Herstellung von pRIT10871 undpRlT10673

Fig. 6: zeigt die Herstellung von pRIT 10749

Fig. 7: zeigt die Herstellung von pRIT 10761 undpRIT10674

Fig.8: zeigt die Herstellung von pRIT10167 (Beispiel 1), pRIT10158 und pRlt 10162 (Beispiel 3); pRIT10158, pRIT 10677 und

PRIT10909 (Beispiel 4); pRIT10911 (Beispiel 5); pRIT10679,pRIT10903,pRIT10914 (Beispiel 6); pRIT 12211, pRIT12209

und pRIT 12230 (Beispiel 7); und pRIT 12288 und pRIT 12322 (Beispiel 8). Fig. 9: zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 10172

Fig. 10: zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12290.

Fig. 11: zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12322, die die DNA-Bereiche zeigt, die von pRIT 12230 und pRIT 12288 stammen. Fig. 12: zeigt die Herstellung von pRIT 12571; pRIT12573; pRIT 12572 und pRITi2574. Fig. 13: ist eine Restriktionskarte von pRIT12309

Fig. 14: zeigt die Herstellung von pRIT 12314 und pRIT 12544

Fig. 15: ist eine Restriktionskarte von pRIT 12662

Fig. 16: zeigt die Herstellung von pRIT 12660

Fig. 17: zeigt die Herstellung von pRIT12845 (a, b, c, d, e, f)

Fig. 1A: zeigt die Herstellung von pRIT 12662.

Fig.4A: zeigt die in pRIT 12792 enthaltene Pre SI Pre S2 DNA-codierende Sequenz. Fig.5B: zeigt die Konstruktion von pRITX.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Expression von HBsAg in Hefe

Mit dem Ausdruck .regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die notwendige oder wünschenswerte Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält. Solche regulatorischen Regionen werden in der Regel angrenzend an das 5'-Ende der codierenden Sequenz, die exprimiert werden soll, gesetzt. Vorzugsweise wird eine weitere Region der Hefe DNA, die ein Terminationssignal für die Transkription enthält, unmittelbar an das 3'-Ende der codierenden Region, die exprimiert werden soll, gesetzt, um die Termination der Transkription zu bawirken. Mit dem Ausdruck .HBsAg", wie hier gebraucht, ist ein Antigen gemeint, das Proteine umfaßt, die durch die S-proteincodierende Sequenz des HBV-Genoms codiert werden. Ein solches HBsAg ist strukturell ähnlich zu natürlichem HBsAg oder hat im wesentlichen die gleichen antigenen Determinanten wie das natürliche HBsAg, die durch die S-proteincodierende Sequenz codiert werden. Ein solches HBsAg kann eine Immunantwort stimulieren, die spezifisch erkennt und mit natürlichem HBsAg reagiert. Ein solches HBsAg wird auch spezifisch durch Anti-HBsAg-Antikörper erkannt.

Ljiö HBsAg codierende Sequenz kann aus der DNA von Dane-Partikeln aus dem Serum von infizierten Menschen isoliert werden, indem der Einzelstrangbereich der DNA mit einer DNA-Polymerase, vorzugsweise der endogenen Polymerase, zum Doppelstrang gemacht wird und dieser anschließend mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten wird. Die Wahl der Ertdonuclease hängt teilweise von den einzelnen Dane-Partikeln ab. Beispielsweise kann die HBeAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikeln des adw Serotyps durch ein einzelnes BamHI-Fragment isoliert werden; die HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des ayw Serotyps kann durch ein Hhal-Fragment isoliert werden. HBV DNA von Dane-Partikel des gleichen Serotyps können auch unterschiedliche Restriktionsmuster aufweisen.

Die Spaltung von DNA

Die Herstellung von DNA-Fragmenten, die im erfindungsge-näßan Verfahren verwandet werden, die Ligierung von solchen Fragmenten zu rtkombiranlen DNA-Molekülen und die Insertion solcher rekombinanter DNA-Molekü!e in Mikroorganismen wird in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. die vorstehenden oder nachfolgenden Literaturzitate. Bedingungen r/erden gewählt, um die Denaturierung der DNA und der Enzyme zu verhindern. Beispielsweise wird der pH-Wert auf einen Beroich von 7 bis 11 eingestellt und die Temperatur unter 60 °C gehalten. Vorzugsweise wird die Restriktion der DNA bei einer Teaiperatur von 30 bis 4O⁰C und die Legierung bei 0 bis 1O⁰C durchgeführt. Verwendete Restriktic.isenzyme und Ligasen sind handelsüblich und werden nach Vorschrift verwendet. Die T4 DNA-Ligase ist die bevorzugte Ligase.

Die verschiedenen Fragmente und die endgültigen Konstruktionen können in üblicher Weise miteinander verbunden werden. In vielen Fällen wurden Cene isoliert, durch Restriktionsenzyme kartiert und auch sequenziert. Zu diesem Zweck kann man die interessierende Sequenz, wie die HBsAg-Sequenz, durch Restriktion des Gens selGktioniuren und, wenn nötig, weiter manipulieren, wie durch Bal31 Verdauung, In-vitro-Mutagenese, Primer-vermittelte Reparatur oder ähnliches, um ein Fragment gewünschter Größe Herzustellen, das die gewünschte Sequenz enthält und geeignete Enden besitzt. Linker und Anschlußfragmente können benutzt werden, um Sequi nzen miteinander zu verbinden und auch verloren gegangene Sequenzen zu ersetzen, wenn Innerhalb der interessierenden Region oine Restriktionsstelle verwendet wurde. Die verschiedenen Fragmente, die Isoliert werden, können durch Elektrophorese gereinigt werden, elektroek'idrt, mit anderen Sequenzen ligiert, kloniert, wieder isoliert und weiter manipuliert werden.

Die Verwendung von regulatorischen Regionen zur Kontrolle der Transkription des i. l· >ressierondon Struktur-Gens, wie der HBsAg-Sequenz, erlaubt es, nachdem die Wirtszellen zu einer hohen Dichte gewadisei. sind, währenddessen das Strukturgen gar nicht oder nur wenig exprimiert wurde, durch Änderung der umgebenden Bodingungen z. B. c*es Nährstoffes, der Temperatur usw., die Expression des Strukturgens zu Induzieren.

Beispielsweise kann man mit der GAL4 regulatorischen R /lon die Hefezellen in einem Vollmedium mit einer Kombination aus Glycerin und Milchsäure zu einer hohen Dichte, nämlich ü ; mittleren oder späten log-Phase, wachsen lassen und dann die Kohlenstoffquelle ändern und Galactose anbieten. Mit der PHO5 regulatorischen Region kann man die Zellen in einem Medium mit einer hohen Phosphatkonzentration von etwa 7mM KH₂PO₄ wachsen lassen, sie dann ernten und in einem Medium, das phoBphntfrel Ist, resuspendieren, um eine Derepression und Fxpression zu bewirken. Bei Tdmperatiirsensitivität könnte man die Zellen bei 25 bis 37"C wachsen lassen und dann die Temperatur passend um 5 b 5 20⁰C ändern. Die Wirtszellen weisen dann das mit der regulatorischen Region verbundene Regulationssystem auf.

Die Fusion der HBsAG-Sequenz mit der regulatorischen Region kann durch Verwendung eines Zwischenvektors erreicht werden. Alternativ kann die HBsAjj-Sequenz aber euch direkt in einen Vektor integriert werden, der die regulatorische Region enthält. Hin Vektor ist eine DNA, die das DNA-Fragment der Erfindung tragen und beibehalten kann, beispielsweise ein Phage oder ein Plasmid. Techniken zur Klonierung von DNA-Fragmenten in Phagen sini beispielsweise aus Charnay et al., Nature, Bd. 286 (1980), 893-895, und der GB-Patentanmeldung 2034323 bekannt. Die H5sAg-Sequenz wird vorzugsweise so mit der regulatorischen Region verbunden, daß nach Expression der HBsAg-Sequonz ein HBsAg entsteht, das frei von fremdon Aminosäureresten ist.

In einer Ausführungeform der Erfindung wurde die HBsAg-codierende Sequenz zusammen mit 42Codons der für das HBsAg Vorläufer (PreS-5) Protein codierenden DNA in Ablesephase mit dem 18.Codon der für das Hefe OCT-Protein codierenden Sequenz ligiert, die unter der Kontrolle des arg'-Promoters steht. Dieses Konstrukt ergibt ein hybrides Partikel, das ein HBsAg-Protein enthält, das neben den 226Am!nosäuren des S Proteins zusätzlich 60 N-terminale Aminosäuren besitzt. Ein Beispiel für eine regulatorische Region stammt von dem Hefe arg'-Gen, das für die Ornithin-Carbamoyl-Transferaso (OCT) codiert. Die arg⁹ regulatorische Region ist verantwortlich für spezifische und allgemeine Kontrollmochdnismen. Aus Crabeel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 78 (1981), 6026, ist die Klonierung dieser regulatorischen Region in dem Plasmid pYeura'arg³ in E. coil bekannt. Bevorzugte Wirte sind Stämme von S.cerivisiae, in denen die Argininbiosynthese derepremiert ist, beispielsweise der Stamm 1 c1697d.

Die Verwendung solcher Stämme führt durch den arg³-Promoter zu einer erhöhten Expression im Vergleich zu dem Stamm DC 5. Andere nützliche regulatorische Regionen stammen von Hefe-Genen, deren Frodukte an der Glycose beteiligt sind, beispielsweise von Genen, die für Enolase, Aldolase, Phosphoglyceratkinaso und Glycerinaldehyd-3-phosphat'Dehydrogenase codieren; von dem Hefe-Alkohol-Dehydi ogenase-Gen; und im allgemeinen von Genen, die am katabolischen Stoffwechsel beteiligt sind, wie das Arginase-Gen.

Ein bevorzugter Vektor zur Klonierung des fusionieren DNA-Fragmer>M in Hefe isc das Plasmid YEp 13, das in E.coli und S.cerevisiae repliziert und stabil ist und daher als Shuttle-Vektor bezeichnet wird. Mehrere andere Hefe-Vektoren sind bekannt und erhältlich. Die HBsAg-Sequenz und die regulatorische Region können in einem Hefe-Vektor nacheinander oder gi :ichzoitig inseriert werden. Die Transformation von Hefen mit Plasmid-Vektoren, die hefespezifische autonom replizierende Sequenzen enthalten, führt normalerweise dazu, daß das DNA-Mol»!»"'' der Erfindung wie ein Plasmid extrachromosomal repliziert wird. Solche Replikons sind aus dem Stand der Technik bek.innt. Die Transformation mit ι, "Tiid-Vektoren, die keii'e funktioneilen Hefe-Replikons enthalten, führt zur In.^gration des DN;>-Moleküls in das Hefe-Genom.

Impfstoffe für den Menschen zum Schutz vor HBV-Infektion, die HBsAg enthalten, das gemäß der Erfindung in Hefe produziert wurde und einen geeigneten Carrier besitzen, können nach bekannten Methoden hergestellt werden. Die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphate ist wünschenswert. Das so produzierte HBsAg kann auch mit anderen immunogenen Substanzen kombiniert werden, um Kombinations-Impfstoffe herzustellen. Der HBV-Impfstoff oder der Kombinations-Impfstoff kann beispielsweise subrutan, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Das DNA-Fragment der Erfindung und das davon produzierte HBsAg können auch als Sondenmolekül bzw. Probe verwendet werden, um HBV in biologischen Proben durch DNA-Hybridisierungstechniken bzw. in verschiedenen Immunotests nachzuweisen.

Expiesslon eines DNA-MciakCls, das eine funktionale DNA-Sequenz enthalt, die In Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pro S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist Diese Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Moiekül, (Jf $ eine funktioneile DNA-Sequenz enthält, uie in /Liesephase

mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S prcteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Bezeichnung.codierende Sequenz" oder .codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionell* Derivatdavon.

Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die die Partikefbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden. Aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, sind orfsspezifische Mutagenese-Techniken bekannt. Eine solche Fusion kann am N-Terminus der Pre S2-Region oder an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre S2-Region stattfinden. Es gibt vier Arten von Fusionen, nämlich am 5'-Terminus der gesamten Pre S2-Region, an irgende^:nem Punkt innerhalb der Pre S2-Region, so daß die Pre S2-0NA die funktioneile DNA-Sequenz an beiden Seiten flankiert, an dem S'-termiiialen Ende einer verkürzten Pre S2-Region oder am 5'-Terminus der S-proteincodierenden Region, so daß die Fusion keine Pre S2-DNA enthält. Verschiedene Pre S2-S proteincodierende Sequenzen sind bekannt und können nach bekannten Methoden hergestellt und isoliert werden (vgl. die oben zitierte Literatur). In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die ARG 3 regulatorische Region zusammen mit 18 Codons der für das Hefe-OCT-Protein codierenden DNA in Ablese'phase mit einor verkürzten Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert, die dann 12 Codons der Pre S2 S proteincodierenden Sequenz zusammen mit der kompletten S-proteincodierenden Sequenz enthält. Bevorzugte funktionell DNA-Sequenzen sind die Pre S2-, Pre S1 - oder gesamte Pre S1 - Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon. Eine bevorzugte funktionell DNA-Sequenz sind die ersten 13 N-terminalen Codons der Pro S2-codierend3n Sequenz, die dann mit den 42 C-terminaleii Codons einer verkürzten Pre S2-Region aus einer Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert werden. Mit dem Ausdruck .immunogenes Derivat" ist eine Sequenz gemeint, die ein Derivat oder eine modifizierte Version einer natürlich vorkommenden Sequenz ist, und die die schützende immunogene Aktivität der natürlichen Sequenz beibehält oder verstärkt. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Der Ausdruck .Pre S2-, Pro S1 - oder die gesamte Pre S1 - Pre S2-S proteincodierende Sequenz", wie hier verwendet, umfaßt uin beliebiges immunogenes Derivat davon.

Ein DNA-Molekül, in dem eine funktionclle DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pro S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist., kann nach bekannten Methoden hergestellt werden, wie durch Ligierung der funktioneilen DNA-Sequenz in Ablesephaiva mit einem beliebigen Codon der für 55 Aminosäure codierenden Pre S2-codierenden Region aus einer Pre S2-S proteincodierenaen Sequenz.

Vorzugsweise verbleibt nach Ligierung mit der funktionellen DNA-Sequenz ein genügend großer Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, um das funktioneile Protein auf der Ht sAg-Partikel-Oberfläche optimal zu präsentieren. Ein genügend großer Teil der Pre S2-Region sollte nämlich verbleiben, so daß das durch die Pre S2-Region codierte Polypeptid als Brücke zwischen dem durch die funktionell DNA-Sequenz codierten Produkt und der HBsAg-Partikel-Oberfläche fungieren kann. Beispielsweise ist aus Milich et al., Science, 228 (1985), 1195-1199, bekannt, daß die 26 aminoterminalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz eine dominante Antikörperbindungsstelle auf der Pre S2-Region darstellen. Wenn es gewünscht ist, ein hybrides Partikel herzustellen, das die Epitope der Pro S 2 und einer anderen funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert, sollte man vorzugsweise die andere beliebige funktioneile DNA-Sequenz an einem Punkt innerhalb der Pre S2-codierenden Region insnrieren, der die Herstellung eines hybriden Partikels erlaubt, das die Epitope der Pre S2 und einer anderen funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete rekombinante Vektor enthält das rekombinante DNA-Molekül (nämlich eine funktioneile DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist), funktionell verbunden mit einer regulatorischen Region. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein funktionelles Hefe-Replikon besitzen. Mit dem Ausdruck»Repliken" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die zur extrachromosomalen Stabilität eines solchen rekombinanten Vektors in einem Hefe-Wirtsorganismus beiträgt. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck .regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Region gemeint, die die Transkription und Translation der zu exprimierenden DNA-Sequenz reguliert. Solche regulatorischen Regionen sind ebenfalls bekannt. Solch ein Vektor kann nach üblichen Methoden hergestellt werden, wie durch die Inserierung des DNA-Moleküls der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon einer regulatorischen Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit solch einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der zur Expression in der Hefegattung Saccharomyces befähigt ist. Die Erfindung betrifft auch eine durch einen solchen rekombin, ten Vektor transformierte Hefe-Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformierung einer Hefe-Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfaßt. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Geeignete Hefezellen sind jene der Gattung Saccharomyces, wobei din Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis besonders geeignet sind.

Die Erfindung betrifft euch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikels, das das Produkt der funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Zell-Lysat oder Extrakt dieser Wirtszellen. Mit dem Ausdruck .präsentiert oder enthält" ist gemeint, daß das durch die funktionell DNA-Sequenz codierte Protein in dem hybriden HBsAg-Protein enthaltendem Partikel so enthalten ist, daß es eine Immunantwort stimulieren kann. Gewünschtenfalls wird die Präsentation des durch die funktioneile DNA-Sequenz codierten Proteir - vcht die immunogene Aktivität der HBsAg-Epitope stören, wodurch ein bivalenter Impfstoff erhalten wird. Besonders bevorzugt wird das durch die funktioneile DNA-Sequenz codierte Protein auf einem HBsAg-Partikel In solcher Weise präsentiert, daß entweder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins oder die maximale Anzahl von epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins und des HBsAg-Proteins wie angemessen exponiert wird. Mit dem Ausdruck .geeignetes Kulturmedium" ist ein Medium gemeint, das das Wachstum des transformierten Wirts ermöglicht und es einem solchen Wirt ermöglicht, das Produkt des hybriden DNA-Fragments, das in dem zur Transformation verwendeten Vektors enthalten ist, in wiederholbarer Menge zu exprimieren. Dieses hybride DNA-Fragment ist ein Fusionsprodukt aus der funktionellen DNA-Sequenz und der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das geeignete Kulturmedium abhängig von der verwendeten Wirtszelle ist. Die Isolierung des hybriden Partikels der Erfindung aus einem Zell-Lyeat oder Extrakt einer solchen Wirtszelle kann durch übliche Protein-Isolierungstechniken durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel dieser Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zum Immunschuu notwendige Menge an hybriden Partikeln der Erfindung enthalten und ist nach üblichen Methoden herstellbar. Mit dem Ausdruck .Immunschutz* ist gemeint, daß die hybriden Partikel dieser Erfindung in ausreichender Menge verabreicht werden, si· daß eine ausreichende Antikörperantwort gegen das Agens erzielt wird, die zum Schutz beiträgt und keine ernsten Nebenwirkungen hat. Vorzugsweise enthält der Impfstoff der Erfindung die Mizellen der Erfindung, nämlich Mizellen, die das

Partikel der Erfindung und Polysorbat enthalten. Die bevorzugte Menge an Polysorbat in solch einer Mizelle ist 5 bis 50pg Polysorbat pro 100 Mg Protein. Die Mizelle kann nach dem Verfahren hergestellt werden, das in der EP-A 0199698 beschrieben

In dem Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung der hybriden Partikel der Erfindung vorzugsweise mit einem physiologischen pH direkt verwendet werden. Alternativ kann das Partikel mit einen: beliebigen der bekannten Adjuvantien aufgenommen werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt.

Die Menge des hybriden Partikels der Erfindung ist in jeder Impfstoffdosis auf eine Menge beschränkt, die in typischen Impfstoffen eine zum Immunschutz notwendige Antwort induziert, ohne bedenkliche Nebeneffekte zu haben. Eine solche Menge hängt davon ab, welches spezifische Immunogen verwendet wird und ob ein Adjuvans beigegeben ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000pg Protein, vorzugsweise 1 bis 200Mg Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, zu denen die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen im Patienten gehört. Nach einer ersten Impfung erhalten die Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfstoffverabreichung, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort auf das hybride Partikel der Erfindung kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht werden.

Neue Pre S 2 und Pre S2-S proteincodierende Sequenzen

Die neuen HBV Pre S 2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen der Erfindung stammen von dem HBV adwSubtyp und wurden aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Der Ausdruck »codierende Sequenz" oder .codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn dienlich, die Partikelbildung nicht stören und/oder die Immunogenität beibehalter, wenn es gewünscht ist. Solche funktlonellen Derivate können durch ortsspezifische Mutagenese, wie z. B. von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschrieben, erhalten werden. Solche Pro S 2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen können durch übliche rekombinante DNA-Verfahren aus dem Plasmid pRIT 10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coll K12 Stamm C600) gemäß des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2.Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pro S2-Region einer solchen neuen proteincodierenden Sequenz enthält die folgenden Aminosäuren:

-55 . -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

-20 Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-

-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Vg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.

Eine solche Region kann auch durch synthetische Oligonucleotide in üblicher Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes funktionelles Derivat der Pre S2-S-codierenden Sequenz der Erfindung ist eines, in dem die Aminosäure -Alanin(GCT) an der Position -45 durch die ortsspezifische Mutagenese durch die Aminosäure Threonin (ACT) ausgetauscht wurde. Ein solches funktionelles Derivat wird in Saccharomyces cerevisiae zweimal stärker exprimiert als die unmodifizierte codierende Sequenz der Erfindung.

In einem rekombinanten Vektor der Erfindung liegt die Pre S2 oder Pre S2-S proteincodierende Sequenz der Erfindung funktionell gebunden an eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein Replikon enthalten, das von dem Wirt r bhängig Ist, In dem es verwendet wird. Mit dem Ausdruck .Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor In einem eukaryontlschen oder prokaryontischen Organismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck .regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotorregion und andere Sequenzen enthält, die notwendig sind für die Transkription einer codierenden Sequenz. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Solch ein Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie Inserierung der Pre S 2 oder Pre S2-S proteincodierenden Sequenz der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Diese Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül an eine solche regulatorischc Region funktionell verbunden ist. Vorzugsweise wird das DNA-Molekül in einen Vektor inseriert, der in Hefe, wie Saccharomyves, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die durch diesen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Welse ausgeführt. Die Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, hauptsachlich Hefezellen der Gattung Saccharomyces, besonders jene, die den Arten Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis angehören.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pre S 2 und Pre S2-S DNA-Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Isolierungsart hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S 2 oder Pre S2-S proteincodierende Sequenz in wiederholbaren Mengen exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die Kulturmedien von der verwc ndeten Wirtszelle abhängen. Das Pre S2-S Protein wird durch übliche Protein-Isolierungstechniken aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirts isoliert. Das nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellte Protein kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle dazu in der Lage ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, so wird das Protein in einer Wirtszelle hergestellt, die zur Glykosylierung nicht befähigt ist. Alternativ könnte auch die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische

Mutagenese, wie aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge des Pre S 2 oder Pre S 2-S Proteins der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff kann durch übliche Techniken hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAG-Protein enthaltenden Partikels, das ein Protein enthält, das durch die Pro S2-S Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten eukaryontischen Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Isolierungsart ist abhängig davon, ob die transformierten Wirtszellen solche Partikel sekretieren können. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S2-S proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann Ist es bekannt, daß geeignete Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Das hybride Partikel wird durch übliche Isolierungstechniken aus dem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes isoliert.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zum Immunschutz notwendige Menge an den hybriden Partikeln enthalten und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine Mizelle, die das Partikel und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat solch einer Mizelle ist 5 bis 50 pg Polysorbat pro 100pg Protein. Die Mizelle kann nachdem Verfahren der EP-A0199698 hergestellt werden.

In dem Impfstoff kann eine wäßrige Lösung des Pre S2-S Proteins oder des hybriden Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert hat, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Protein oder Partikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt. Aus der US-Patentschrift 4235877 ist beispielsweise die Einkapselung in Llposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4372 945 und 4474757 ist die Zusammenfassung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S 2-S Protein oder das hybride Partikel liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum Immunschuü notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge wird von dem spezifischen immunogenen Stoff abhängen und auch davon, ob dem Impfstoff ein Adjuvans beigemengt ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1-1000 pg Protein, vorzugsweise 1 bis 200 Mg Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen beim Patienten einschließen. Nach einer ersten Impfung wird der Patient vorzugsweise eine erneute Verabreichung des Impfstoffes nach etwa vier Wochen erhalten, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange Infektionsgefahr besteht.

Die Immunantwort auf das Pre S2-S Protein und das hybride Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Neu· Pre S1 proteincodierende Sequenz

Die neue HBV Pre S1 proteincodierende Sequenz stammt von einem HBV adw Subtyp und kann aus dem Plasmid pRIT 10616 isoliert werden. Die Bezeichnung .codierende Seq cnz" oder .codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck .funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn gewünscht, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche .funktioneile Derviate" können durch übliche ortsspezifische Mutagonese, wie aus Botstein et al., Science, (1985), 1193-1201, bekannt, hergestellt werden. Eine solche Pre S1 proteincodierende Sequenz kann durch übliche rekombinante DNA-Techniken aus dem Plasmid pRIT 10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coli K12 Stamm C 600) gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC38131 hinterlegt. Die Pre Se 1 -Region codiert für die folgende Aminosäuresequenz:

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG

Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lye Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa-

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy Ue Leu Thr Thr VaI Ser Thr Ue Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT COG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro lie Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser Hie Pro Gin Ala

Eine solche Region kann auch durch die übliche Synthese von Oligonucleotiden erhalten werden.

In einem rekombinanten Vektor liegt die P/e S1 proteincodierende Sequenz funktionell gebunden an eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann auch zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt abhängig ist, in dem es verwendet wird. Mit dem Ausdruck .Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck .regulatorische Region" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthSlt, die notwendig sind für die Transkription einer codierenden Sequenz. Solche regulatorische Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung dor Pre S1 proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt In solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit dieser regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor inseriert, der In Hefe, wie Saccharomyces, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit solch einem rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung einer solch transformierten Wirtszelle. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontlsche Zellen, hauptsächlich Hefezellen und von denen die der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pro S1 proteincodierende Sequenz codiert wird. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszelle in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtskulturen. Die Isolierungsart hängt davon ab, ob der transformierte Wirt solche Proteine sekretieren kann. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1 proteincodierende Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Pro S1 Proteins aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle zur Glykosylierung befähigt ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht wird, sollte das Protein durch Verwendung einer Wirtszelle hergestellt werden, die nicht zur Glykosylierung befähigt ist. Alternativ kann die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese verändert werden, bevor das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird. Die ortspezifische Mutagenese wird wird beispielsweise wie aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, durchgeführt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der das Pre S1 Protein der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zu einem Immunschutz notwendige Menge des Pre S1 Proteins der Erfindung enthalten und durch konventionelle Techniken hergestellt. Für den Impfstoff kann eine wäßrige Lösung des Pre S1 Proteins, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Pre S1 Protein ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al.. University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt. Aus der US-Patentschrift 4235877 ist die Einkapselung in Llposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4372945 und 4474757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S1 Protein liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum Impfschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff abhängig und auch davon, ob der Stoff ein Adjuvans enthält. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 1000pg Protein, vorzugsweise 1 bis 200pg, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtungen von Antikörpertiter und anderen Reaktionen im Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach etwa vier Wochen eine erneute Impfstoffdosis verabreicht, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht. Die Immunantwort auf das Pre S1 Protein wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht.

Neue Pre S1· Pr* S2-S proteincodierende Sequenz Die Erfindung betrifft auch eine HBV Pre S1 - Pro S 2-S proteincodierende Sequenz, von der der Pre S1 - Pre S 2-TeM die folgende Aminosäuresequenz enthält: PRE-S1 REGION ATG QGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC OAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro .sp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC ΑΛΤ CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGQ GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gh VaI GIy VaI GIy Ala

ITC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Scr Pro Gin Ala Gin

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr lie Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Ala

PRE-S2 REGION ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT *CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy

ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr VaI Asn Pro AIa Pro Asn He AIa Ser

CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His He Ser Ser Ser Ser AIa Arg Thr GIy

GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro VaI Thr Asn

Die neue HBV Pro S1- Pro S2-S proteincodierende Sequenz der Erfindung stammt von einem HBV adw Subtyp und wurde aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert. Dieses Plasmid ist wie oben anpegeben bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATCC 38131 hinterlegt. Der Ausdruck .codierende Sequenz* oder .codierende Region*, wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck .funktionelles Derivat* ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn es gewünscht ist, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehalt. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, hergestellt werden.In einem rekombinanten Vektor liegt die Pro S1 - Pre S 2-S proteincodierende Sequenz funktionell gebunden an eine regulatorische Region vor. Ein solcher Vektor kann auch zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Mit dem Ausdruck .Replikon* ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck .regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, die für die Regulierung der Transkription einer codierenden Sequenz notwendig sind. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Welso hergestellt werden, wie durch Inserierung der Pre S1 · Pre S 2-S proteir.codierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthSlt. Die Inserierung erfolgt in einer solchen Weise, daß das DNA-Molekül an eine solche regulatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird bevorzugt irveinen Vektor inseriert, der in Hefe, wie Saccharomyces, exprimiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, hauptsächlich Hefezellen und von denen die Zellen der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis.Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pro S1· Pre S2-S-Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Wirtszell-Überstand oder dem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszellen ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien* sind Medien gemeint,

!π denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt der Pre S1 - Pre S 2-S proteincodierenden Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Pre S1- Pre S 2-S Proteins aus einem Kulturlysat odor dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird, kann glykosy liert sein, sofern die Wirtszelle zur Glykosylierung befähigt ist. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung fähig ist, hergestellt werden. Alternativ kann die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1202, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird. Die Pre S1- Pro S 2-S codierende Sequenz wird in Hefe oder Säugerzellen als glykosyliertes Protein exprimiert. Die Pre S1- Pre S 2-S codierende Sequenz wird In Hefe als Protein exprimiert, das am N-Terminus eine Myristinsäure als Substituenten besitzt. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der das Pre S1- Pro S 2-S Protein in einer zum Immunschutz notwendigen Menge enthält. Ein solcher Impfstoff kann durch übliche Techniken hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikels, das ein Protein enthält, das durch die Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten eukaryontischen Wirtszellen η geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels auc dem Wlrtszellüberstand oder einem Zel'.-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von dor Fähigkeit der transformierten Wirtszellen ab, solche Proteine zu sekretioren. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1- Pre S 2-S proteincodierende Sequenz in Partikelforn und in wiederholbaren Mengen exprimieren kann. Dem Fachmann ist es bekannt, daß geeignete Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus Kulturlysat oder Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel enthält. Ein solcher Impfstoff enthält die hybriden Partikel in einerzum Immunschutz notwendigen Menge und wird nach üblichen Methoden hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mbelle, nämlich eine Mizelle, die das Partikel und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat in einer solchen Mizolle ist 5 bis 50 pg Polysorbat pro 100pg Protein. Die Mizelle kann nach dem in der EP-A 0199698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Eine wäßrige Lösung des Pre S1- Pre S 2-S-Proteins oder des hybriden Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, kann direkt für den Impfstoff verwendet werden. Alternativ kann dem Protein oder dom Partikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Votieret al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt, aus der US-Patentschrift 4235877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4372945 und 4474757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pro S1- Pre S2-S-Protein oder das hybride Partikel liegt in jeder Impfstoffdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen zu einer zum Immunschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebeneffekte führt. Eine solche Menge ist von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff abhängig und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis 10ΟΟμρ Protein, vorzugsweise 1 bis 200 pg Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen bestimmten Impfstoff kann man durch Standarduntersuchungen ermitteln, die die Beobachtungen von Antikörpertiter und anderen Reaktionen mit Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach etwa vier Wochen eine weitere Impfdosis verabreicht, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht. Die Immunantwort auf das Pre S1- Pre S2-S-Protein oder auf das hybride Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Expression des Pre S1* Pr* S2-S-Protelns in Hefe

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem die gesamte Pre S1- Pre S 2-S proteincodierende Sequenz an eine Expressions-Kontrollsequenzfunktionell gebunden ist. Der Ausdruck .codierende Sequenz" oder .codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionell Derivat davon. Mit dem Ausdruck .funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikation gemeint, die, wenn gewünscht, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, hergestellf werden. Ein solcher Vektor kann zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Vorzugsweise wird die Pre S1 - Pre S 2-S proteincodierende Sequenz verwendet.

Mit dem Ausdruck .Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem Hefe-Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck „regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, dia wichtig für die Regulierung derTranskription einer codierenden Sequenz sind. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Inserierung einer Pie S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Ablosephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekk' an die regulatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der in Hefen der Gattung Saccharomyces exprimiert wird.

Vorzugsweise ist die in dem Vektor enthaltene Pre S1 - Pre S 2-S prcteincodierende Sequenz die Pre S1 - Pro S 2-S proteincodierende Sequeni. Solche Vektoren sind auch nützlich für die Insertion von funktioneilen DNA-Sequenzen, um die resultierende Pre S1 -funktionell« DNA-Sequenz Pre S ?-S proteincodierende Sequenz zu exprimieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch ein rekombinantes DNA-Molekül, in de.η eine funktionell DNA-Sequenz in Ablesephase mit der Pro S 1-Region aus der Pre S1 · Pre S 2-0 proteincodierenden Sequenz fusioniert ist und einen ein solches rekombinantes DNA-Molekül enthaltenden Vektor. Die Fusion kann so erfolgen, daß die funktioneile DNA-Sequenz entweder eine Insertion in der Pre S1-Region bildet, oder einen Teil der Pro S 2-Region ersetzt; vgl. unten, Beispiel 21A.

Mit dem Ausdruck .funktioneile DNA-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die, wenn sie in Ablejephase mit der Pre S1 -Region aus der Pre S1 · Pre S 2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, nicht an der Zusammensetzung des HBsAg-Partikel beteiligt ist noch die Partikelbildung stört. Bevorzugte funktioneile DNA-Sequenzen umfassen die codierenden

Sequenzen von interessierenden Peptiden anderer Viren, besonders jene von Hüllproteinen oder Oberflächenproteinen anderer Parasiten.

Die Erfindung betrifft auch eine Hefe-Wirtezelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Bevorzugte Hefezellen gehören der Gattung Saccharomyces und besonders bevorzugte Zeüön der Art Saccharomyces cerevisiae an.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine Pro S1 - Pro S 2-S-proteincodierende Sequenz oder eine Pro S1 -funktioneile DNA-Sequanz-Pre S 2-proteincodierende Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder aus einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszelle ab, solche Proteine zu sokretieren. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt einer Pre S1 · Pro S 2-S-proteincodierenden Sequenz oder einer Pre S1 -funktioneilen DNA-Sequenz· Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Die Isolierung des Pro S1- Pro S2-S-Protelns oder des Pre S 1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins aus einem Zell-Lysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das nach dem Verfahren dieser Erfindung isoliert wird, kann glykolysiert sein, sofern die Wirtszelle die Fähigkeit zur Glykosylierung besitzt. Wenn ein nicht glykosyiiertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung befähigt ist, hergestellt werden. Alternativ könnte die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge des Pre S1- Pre S2-S-Proteins oder des Pre S 1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins enthält, die beide nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden. Ein solcher Impfstoff kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden Partikels, das ein Protein enthält, das durch eine Pre S1 -Pro S 2-S-proteincodierende Sequenz oder eine Prs S1 -funktionell DNA-Sequenz- Pre S 2-S-proteincodierende Sequenz codiert ist. Eine solche Methode umfaßt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturüberstand oder aus einem Zeil-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Partikel zu selektieren. Mit dem Ausdruck .geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, In denen der transformierte Wirt wachsen und die Pre S1 - Pre S 2-S-proteincodierende Sequenz oder die Pre S1 -funktioneile DNA-Sequenz- Pre S 2-S-proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Einem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand solcher Wirtszellen wird nach üblichen Methoden ausgeführt. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die Partikel der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff enthält eine zum Immunschutz notwendige Menge der Partikel und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine Mizelle, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat in einer solchen Mizelle ist 5 bis 50 Mg Polysorbat pro 100 \ig Protein. Die Mizelle kann nach dem in der EP-A 0199698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Für den Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Pre S1- Pre S2-S-Proteins oder des Pre S1-funkt ioneile DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins oder des Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Proteinpartikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen bekannt. Aus der US-Patentschrift 4235877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4372945 und 4474757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S1 · Pre S 2-S-Protain oder das Pre S1 -fur ktionelle DNA-Sequenz- Pro S 2-S-Protein oder das Partikel liegt in jeder Impfdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen einer zum Immunschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist abhängig von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Generell wird erwartet, daß jede Impfdosis 1 bis 1000 pg Protein, vorzugsweise 1 bis 200Mg, enthält. Ein« optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen Reaktionen in Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfdosis verabreicht, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange eine Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort gegen das Pre S1 - Pre S 2-S-Protein oder das Pre S1 -funktioneile DNA-Sequenz- Pre S2-3-Protein oder das Partikel wird durch dia Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Ausfuhrungsbelsplele

- Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Temperaturen werden in °C angegeben.

- Die Enzyme, die für die DNA-Manipulation verwendet werden, wurden von Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs, und/oder Boehringer, bezogen und entsprechend der Vorschrift des Herstellers angewendet.

- Hefe-Wachstumsmedien: Selektivmedium: YNB (Hefestickstoffbase ohne Aminosäure (Difco Labs) 0,675% [w/v| mit 2% (w/v) Glucose).

- YEPD Medium: 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton und 2% (w/v) Glucose.

- Methoden zur Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen sind aus .Molecular Cloning", T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab. (1982) bekannt.

- PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid.

Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pro Liter): (pH 7,4)

8,0g NaCI

0,2g KCI

1,1SgNa₂HPO₄

0,2g KH₂PO₄

0,1g MgCI₂-6H₂O

BSA: Rinderserumalbumin (Au_n, Sigma) X-gal: B-Brom^-chloroindoyl-ß-D-galactopyranosid, erhältlich bei Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. L-BROTH (pro Liter):

lOgTrypton

SgNaCI

Sg Hefeextrakt

1 ml 0,1 M MgSO₄

Nach Autoklavlerung Zugabe von SmI einer sterilen Thiaminlösung (1 mg/ml). Für feste Medien Zugabe von 15g Agar pro

Liter.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids pRIT10167

Das Ausgangsmaterial wardas Plasmid p6y, das in pBR322 ein 2,1 kb großes Hindlll-Fragment de: Hefe-DNA enthält, das für das TDH3-Gen codiert. pBR322 Ist aus Bolivar et al., Gene, 2 (1977), 95-113, bekannt. Das p6y Plssmid wurde konstruiert und charakterisiert von Must! et al., Gene, 25 (1983), 133, und von Dr. M. Rosenberg des National Institute of Health erhalten. Das Hindlll-Fragment wurde in ein pBR322 Derivat ohne EcoRI-Stelle umkloniert und es entstand das Plasmid pRIT10164 (ein nicht wesentlicher Schritt). Die folgenden Manipulationen wurden ausgeführt, um eine BamHI-Stelle an dem G-Rest des ATG-Codons derTDH3-codierenden Sequenz einzuführen und ein Hindlll-BamHI DNA-Fragment mit TDH3 Promotoraktivität zu erhalten, in dem die TDH3-Sequenzen Intakt und nicht durch die Manipulation verändert sind. Die wie oben beschrieben hergestellten DNA von pRIT10164 wurde durch zweimalige Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation, wie im wesentlichen aus Kahn et al. (Methods in Enzymology, 68,268,1979) bekannt, gereinigt. 150 pg der pRIT10164 DNA wurden vollständig mit 75 Einheiten der Endonuclease Xbal verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und die DNA in 0,01 M Tromethamin-HCI-Puffer zu einer Konzentration von 1 pg pro μΙ aufgenommen. Proben von 20 pg dieser Xbal-gespaltenen DNA wurden mit der Nuclease Bal31 verdaut, um die 61 Basenpaare der DNA zwischen dem ATG-Codon und der Xbal-Stelle zu entfernen. Verdauungen mit Bal31 wurden bei 30°C für 1 bis 3 Minuten in einem Puffer mit pH 3,1, der 60OmM NaCI, 12mM CaCI₂,12mM MgCI₂,1 mM EDTA, 2OmM Tromethamin-HCI enthält, durchgeführt, wobei eine Einheit der Bal31-Nuclease pro 20pg DNA in einem Reaktionsvolumen von 20μΙ verwendet wurde.

Die Enzymreaktionen wurden gestoppt durch Zugabe von Äthylenbis(oxyäthylennitrilo)-te\-aessigsäure(EGTA) bis zu einer Endkonzentration von 2OmM. Die Proben wurden mit gleichen Volumina Phenol und Äther exvshiert und mit Äthanol präzipitiert. Jede DNA-Probe wurde in 20pi 1OmM Tromethamin-HCI-Puffer pH 7,5 resuspendieit. Das Ausmaß der BaI 31-Verdauung wurde gemessen. Indem etwa 2,5pg einer jeden DNA-Probe mit der Endonuclease Hpal verdaut wurden und indem die Größe der Hpal-Xbal-Fragmente mit dem 335 Basenpaar großen Hpal-Xbal-Fragment von ,jRIT 10164 verglichen wurde. Nach 2 Minuten Verdauung mit BaI 31 waren etwa 41 bis 88 Nucleotide von dem Xbal-Hpal-t-ragment von pRIT 10164 entfernt. Dieses Ergebnis zeigt an, daß eine ähnliche Anzahl von Basenpaaren von der ändert... Ybal-Stelle zu dem ATG-Codon hin entfernt worden sind. 5pg der nach der 2minütigen BaI 31 -Verdauung erhaltenen DNA wurden mit der Endonuclease BamHI gespalten, mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. Diese DNA wurde mit 5 Einheiten der T4 Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotid-triphosphaten behandelt, um Einzelstrangbereiche an den BamHI- und BaI 31-Stellen aufzufüllen. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. 2,3 μg dieser DNA wurden mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase behandelt. Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes K12 MM 294, die nach dem Verfahren von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 69 (1972), 2110, hergestellt wurden, zu transformieren. 1 ml der transformierten E. coil Population wurde in 350ml L-Broth mit 200pg/ml Ampicillin verdünnt und die gesamte Plasmid-DNA aus der resultierenden Kultur gereinigt.

80pg dieser Plasmid-DNA, die eine Population von Plasmidmolekülen mit BaI 31 induzierten Deletionen von etwa 40 bis 80 Basenpaaren enthält, wurde nacheinander mit 75 Einheiten der Endonuclease Hindill und 96 Einheiten der Endonuclease BamHI verdaut, um DNA-Fragmente freizusetzen, in denen eine BamHI-Stelle nach den oben beschriebenen Behandlungen eingeführt wurde. Dies ist der Fall, wo die BaI 31 Verdauung an einem G-Rest gestoppt hat. Diese geschnittene DNA wurde auf einem präparation 1%igen Agarose-Gel aufgetrennt. Die gewünschten Hindlll-BamHI-Fragmente mit einer Größe von 1000 bis 1100 Basenpaaren wurden in zwei Stückchen aus dem Gel ausgeschnitten, wobei das eine eine DNA mit etwa 1070 Baser.paa_:en und das andere Gelstückchen eine DNA mit etwa 1030 Basenpaaren enthielt. Die DNA wurde aus den Agarose-Gelstückchen durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen und einer anschließenden Zentrifugation, bei der die Agarose sedimentiert wurde, erhalten. Der flüssige Überstand wurde durch eine Millipore GV Millex Filter gedrückt und die DNA durch zweimalige Athanolpräzipitationen gesammelt und schließlich in 20μΙ eines 0,01 M Tromethamin-HCI-Puffers mit pH 7,5 resuspendiert. Die Analyse der Agarosegelelektrophorese und der Vergleich mit einer Hindill, Xbal-verdauten pRIT 1064 DNA und mit den Fragmenten einer Hindlll EcoRI-gespalteten XPhagen-DNA zeigten, daß zwei getrennte Hindlll-BamHI-Fragmentpopulationen erhalten wurden. Die eine Fragmentpopulation entsprach einer Größe von etwa 1070 Basenpaaren und die andere einer Größe von evwa 1030 Basenpaaren im Vergleich mit dem 1120 Basenpaar großen Hindlll-Xbal-Ausgangsfragment aus pRIT 10164. Etwa 100 ng der 1030 Basenpaare großen Hindlll BamHI-Fragmentpopulation wurde mit 200 ng des Plasmides puC 9 !igten, das mit Hindlll und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatate behandelt worden war (vgl. US-PS 4264731). Die Lioatlonimlschung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes JM 103 zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionleren. Die Transformation des E. coli Stammes JM 103 wurde nach dem von Cohen et al., a. a. O., beschriebenen Verfahren durchgeführt

Der Vektor pUC9 und der E. coli Stamm JM 103 sind aus Vieira and Messing, Gene, 19 (1982), 259, bekannt und wurden von

J.Messing (Universität von Minnesota) erhalten. Der pUC9 Vektor ist erhältlich von Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) und Pharmacia (Uppsala, Schweden). Der E. coli Stamm JM 103 ist erhältlich von J. Messing (Universität von Minnesota). Ein anderer E. coli Stamm mit den Eigenschaften des E. coli Stammes JM 103, nämlich der Stamm JM 101, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATTC 33876 hinterlegt und kann als Wirt ebenfalls verwendet werden. Etwa 400 ampicillinresistente Kolonien wurden pro ml erhalten und 98 Kolonien davon auf einem Medium, das X-gal enthielt, getestet. 95 davon waren weiß und zeigten die erfolgreiche Insertion eines fremden DNA-Fragments zwischen den Hindill· und BamHI-Stellen des Vektors an.

Plasmide einzelner transformierter Kolonien wurden nach Amplification der Plasmide durch Zugabe von Spectinomycin (160pg/ml) in das Kulturmedium im Labormaßstab präpariert (Birnboim and DoIy, Nucl. Acid Res., 7 (1979), 1513. Die retomblnanten Plasmide wurden auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel nach einer Doppelverdauung mit Avail und BamHI analysiert und mit dem 450 Basenpaare großen Avail Xbal-Fragment, das den Promotor und die N-terminale codierende Region von pRIT 10164 enthält, und mit den Hpall-Fragmenten der pBR 322 DNA verglichen. In 35 von 36 Plasmiden wurde ein Avall-BamHI-Fragment gefunden, das Deletionen von 20 bis 90 Basenpaaren im Vergleich mit pRIT 10164 besitzt. Drei Plasmide, die Dotationen von etwa 80 Basenpaaren (pRIT 10166), 50 Basenpaaren (pRIT 10167 - Fig. 8) und 45 Basenpaaren (pRIT 10165) enthalten, wurden für weitere Tests ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCI-Äthidium-Bromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25 μρ jeweils mit EcoRI verdaut. Die EcoRI-Enden wurden mit y"-P-ATP in einer Kinasereaktion markiert und die Nucleotidsequenz der Hindlll-EcoRI-Fragmente eines jeden Plasmids nach Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 [1980], 499), bestimmt. Die Markierung und Sequenzierung von der EcoRI-Stelle aus im pUC9-Vektoranteil eines jeden rekombinanten Plasmids Ist ein passendes Mittel, um die Sequenz an der angrenzenden BamHI-Stelle zu bestimmen, die das Ende der Deletion in dem TDH 3 DNA-Fragment angibt. Diese Sequenzierungsanalyse zeigte, daß in dem Plasmld pRIT 10166 die BamHI-Stelle an einem G-Rest in der B'-nichttranslatierten Region 25 Basenpaare upstream des ATG-Codons wiederentstanden ist; In pRIT 10165 ist die BamH I-Stelle an der zweiten Base des dritten Codons und in pRIT 10167 an dem G des ATG-Codons lokalisiert.

Das Hindlli-BamHI-Fragment der TDH3 DNA in pRIT 10167 enthält alle notwendigen Sequenzen in unveränderter Form für die TDH 3-Promotoraktivität.

Beispiel 2 Konstruktion des Vektors pRIT 10172

Das 1050 Basenpaare große Hindlll-BamHI TDH 3 DNA-Fragment aus pRIT 10167, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde in den aus Broach et al., Gene, 8 (1979), 121, bekannten Shuttle-Vektor YEp 13 umkloniert. Das Hindlll-BamHI TDH3 DNA-Fragment wurde zwischen die Hindlll-Stelle der zwei Mikron DNA des Vektors und der BamHI-Stelle ligiert und es entstand das rekombinante Plasmid pRIT 12159. Die DNA von pRIT 12159 wurde mit Xbal und BamHI gespalten und das erhaltene 1650 Basenpaare große Fragment anstelle eines ähnlichen Xbal-BamHI-Fragmentes, das den arg'-Promotor enthält, in das Plasmid pRIT 10774 ligiert. Das Plasmid pRIT 10774 ist aus Cabezon et al., (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 81 H 986), 6594-6598), bekannt. Dieses Plasmid, in dem die BamHI und Xhol-Stellen des Vektoranteils durch In-vitro- Manipulation deletiert sind, enthält das YEp 13-Replikon, ein 1470 Basenpaare großes Hindlll-BamHI-Fragment, das die arg'-Promotorregion besitzt, und ein 1150 Basenpaaro großes BamHI-Hindlll-Fragment, das die arg'-Transkriptions-Tetminationsregion besitzt. Die Substitution des arg'-Promotorinserts von pRIT 10774 durch das TDH3-Promotorinsert ergibt das Plasmid pRIT 10172. Dieses Plasmid besitzt daher neben dem Signal für die Transkrlptions-Termination auf dem 1150 Basenpaare großen BamHI-Hindlll arg¹ DNA-Fragment eine einzolno BamHI-Stelle, die an dem ATG des TDH3-Promotorinserts liegt.

Fremde DNA kann daher in diese Stelle Moniert werden. Ferner können die zwei DNA-Inserts, die über Hindlll-Stellen miteinander verbunden sind, als eine Expressionseinheit auf einem 2 200 Basenpaare großen Hindlll-Fragment entnommen werden und in andere Vektoren inseriert werden. Fig.9 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 10172.

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pRIT 12290

Ein 1050 Basenpaare großes Hindlll-EcoRI-Fragment von pRIT 10167 (Flg. 8), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, das das Hindlll-BamHI TDH3-Promotorfragment und den BamHI-Smal-EcoRI-Teil des pUC9-PoIylinkers besitzt, wurde zwischen die Hindill- und EcoRI-Stellen eines pBR 322-Derivates ligiert. Es entstand das rekombinante Plasmid pRIT 12176. Das verwendete pBR 322-Derivat besitzt eien Deletion der BamHI-Stelle, nachdem diese Stelle durch die T4 DNA-Polymerase aufgefüllt worden war.

Die Plasmid-DNA von pRIT 10158 (Fig. 8), hergestellt gemäß Beispiel 4 (b), wurde mit EcoRI gespalten und mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um den EcoRI Einzelstrangbereich aufzufüllen. Diese Präparation wurde ferner mit der Endonucleare CIaI verdaut. Eine weitere Probe der pRIT 10158 DNA wurde mit den Endonucleasen CIaI und Haelll verdaut und ein 1150 Sasenpaare großes Clal-Haelll-Fragment, das die Transkriptions-Terminationsregion des arg'-Gens besitzt, durch p'äparativc Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution erhalten. Dieses Fragment wurde mit EcoRI gespaltener, T4 DNA-Polymere Je behandelter und CIaI nachgespaltener pRIT 10158 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde verwendet, um kompetente Zellen des E. coli Stammes MM 294, die nach Cohen et al., a.a.O., hergestellt wurden, zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz zu «olektioniei n. Von den transformierenden Kolonien wurde ein Plasmid isoliert, das als pRIT 10162 identifiziert wurde, in dem das Clal-Hae.ll arg' Transkriptions-Terminationsfrayment in pRIT 10158 zwischen die CIaI und die aufgefüllte EcoRI-Stelle inseriert wurde, und in dem die EcoRI-Stelle wieder hergestellt wurde. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 10162, Die Plasmid-DNA pRIT 10162 wurde mit EcoRI und Psti gespalten, mit ebenfalls EcoRI und Pstl gespaltener DNA von pRIT 12176 gemischt und ligiert. Die Ligasemischung wurde verwendet, um Zellen des E. coli K12 Stammes MM 294 nach dem Verfahren von Cohen et al., a.a.O., zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Ein Plasmid, pRIT 12208, wurde aus einer transformierten Kolonie erhalten, in dem das 4630 Basenpaare große EcoRI-Petl-Fragment von pRIT12176 mit dem 1930 Basenpaare großen EcoRI-PsTI-Fragment von pRIT 10162 ligiert worden war, und in dem die arg'-Transkriptions-Terminationsregion an der TDH 3-Promotorregion angelagert ist. Die arg¹ und TDH 3-DNA-Regionen können durch Spaltung mit Hlndlll in einem 2200 Basenpaare großen Fragment aus pRIT 12208 erhalten werden. Zum Erhalt der anderen Orientierung dieses Fragments hinsichtlich der Vektorsequenzen wurde das 2 200 Basenpaare große Hindlll-Fragment von pRIT 12208 in der Hindlll-Stelle eines pBR 322-Derivates umkloniert. In diesem Plasmid-Derivat waren die EcoRI· und BamHI-Stellen in

Auffüllreaktionen durch die T4 DNA-Polymerase nacheinander deletiert worden. Das resultierende rekombinante Plasmid, in dem das 2 200 Basenpaare große Hindlll-Fragment hinsichtlich der Vektorsequenz in anderer Orientierung vorliegt, im Vergleich zu pRIT 12208, wird alspRIT 12290 identifiziert. Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12290. In den Plasmiden pRIT 12208 und pRIT 12290 liegen zwischen den TDH3-Promotor und arg'-Transkriptions-Terminationsfrag nenten die einzig vorhandenen BamHI, Smal und Ecol-Restriktionsstellen, die sich gut zur Kloniery ng von DNA-Fragmenten, did codierende Sequenzen enthalten, eignen. Die Promotor· und Transkriptions-Terminationsregionen können zusammen in einem 2200 Basenpaare großen Hindlll-Fragment als eine Expressionseinheit erhalten werden und in andere Vektoren transferiert werden. Die BamHI-Stelle ist besonders gut geeignet, da sie am ATG-Codon des TDH 3-Gens liegt und somit tür die Fusion anderer Gene mit dem TDH3-Promotor verwendet werden kann, um diese in Hefe nachfolgend veranschaulicht zu exprimieren. Solche f-isionierten Sequenzen können aus pRIT 12208 oder pRIT 12290 durch Spaltung mit der Endonuclease Hindill oder anderei Endonucleasen an den flankierenden Restriktionsstellen als eine Expressionseinheit erhalten und in Hefe-Shuttle-Vektoren inseriert werden.

Beispiel 4

Konstruktion der Plasmide pRIT 10677, pRIT 10909 und pRIT 10158 a) pRIT 10677

Ein 1372 Basenpaare großes BamHI-Fragment von Monierter HBV-DNA wurde aus pRIT 10616 (Herford et al., Dev. Biol. Standard, 54 (1983), 125-130), ausgeschnitten und mit BamHI gespaltener pBR 327 DNA gemischt und ligiert. Dieses BamHI-Fragment enthält einen Teil der HBsAg-Vorl3uferregion, die HBsAg-codierende Sequenz und 3'-nichtcodierende Sequenzen. Aus der Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT 10677 ausgewählt, daß das HBV BamHI-Fragment in der Orientierung enthalt, daß die Xbal-Stelle der HBV DNA benachbart zur Sall-Stelle der pBR 327-Vektor-DNA ist. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 10677

bJpRIT 10909

Das 3300 Basenpaare große Hindlll-Fragment des aus Crabeel M. et al., IMBO J., 2 (1983), 205-212, bekennten Plasmides pMC 200 (ohne Beschränkung erhältlich bei American Type Culture Collection, Rockville, Marylrnd, USA, unter ATCC 39131) wurde in oln pBR 322-Derivat umkloniert, in dem die EcoRI-Stelle in einer Auffüllreaktion durch die T4 DNA-Polymerase deletiert wurde. Ein resultierendes rekombinantes Plasmid, pRIT 10158, (Fig.8), wurde ausgewählt, in dem die 3'-Region des arg³-Gens des Hindlll-Fragments benachbart zu der Clal-Stelle des modifizierten pBR 322-Vektore liegt. Aus pRIT 10158 wurde ein 1150 Basenpaare großes Clal-Haelll-Fragment erhalten, das die Transkriptions-Terminationsregion des arg'-Gens enthält. Dieses 1150 Basenpaare große Fragment wurde mit der CIa I· und Hpa I gespaltenen DNA des Plasmids pRIT 10677 (wie vorstehend in Teil a) beschrieben) ligier·, um die arg'-Terminations-Region an der Hpal-Stelle, die downstream von der HBsAg-codierenden Region liegt, einzuführen. Das resultierende Plasmid ist pRIT 10909. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10909. Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von pMC 200.

Beispiel 5 Konstruktion der Plasmide pRIT10911 und pRIT10912

Die BemHI-Stelle in pRIT10167 (Beispiel 1) und die natürlich vorkommende BamHI-Stelle in der Vorläuferregion des HBsAg-Genseir.es in pRIT10616 (Herford et al., Dev. Biol. Standard, 54 (1983), 125-130), Monierten HBV-Vims des adw-Seroptyps, liegen im gleichen Leserahmen vor. Dies ermöglicht die Fusion mit dem TDH3-Promotorfragment, so daß eine fusionierte DNA-Sequenz entsteht, die ein ATG-Condon, 42 Condons der KQsAg-Precursor-Seqijenz und dieser folgend 226 Codons der HBsAg-codierenden Sequenz besitzt. Das Ausgangsmaterial für das in dieser Fusion verwendete HBV DNA-Fragment war das Plasmid pRIT10909 (vgl. vorstehend, Beispiel 4, Teil b)). Dieses Plasmid enthält ein 935 Basenpaare großes BamHI-Hpa l-lnsert, das einen Teil der codierenden Region der HBsAg-Vorläuferreglon, die vollständige HDsAgcodierende Sequenz und 128 Basenpaare der 3'· nichttranslatierten DNA enthält, und an das downstream von seiner Hpa I-Stelle ein 1150 Basenpaare großes Hae IH-CIa Ill-DNA-Fragment aus pRIT 10158, das die arg'-Transkriptions-Terminationsregion enthält, ligiert worden war. pRIT 10158 ist vorstehend in Beispiel 4, Teil b) beschrieben. Das 2085 Baienpaare große Ecol-BamH I-Fragment wurde aus pDIT 10909 ausgeschnitten und zwischen die EcoR I- und BamH I-Stellen von pRll 10167, das wie vorstehend in Beispiel a) beschrieben, hergestellt wurde, ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT 1Q911. Das 3135p<> große Hind Ill-Fragment von pRIT 10911, das Hefe-DNA-Transkrlptionssignale und die HBsAg-codierende Sequenz enthS'·, wurde in den Shuttle-Vektor YEp 13 inseriert. Es entstand das Plasmid pRIT 10912. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 10911.

Beispiel β

Konstruktion der Plasmide pRIT 10903 und pRIT10914 Das Ziel der nachfolgend beschriebenen Konstruktionen war, überschüssige Nucleotide am 5'-Ende eines DNA-Fragmor.tes, das

zumindest für den N-terminalen Bereich des reifen HBsAg codiert, zu entfernen, so daß eine aus 6bp bestehende

Restriktionsstelle an der ersten Base des zweiten Codons geschaffen wird. Das resultiorende Fragment kann dann mit Promotorfragmenten fusioniert werden, die eine aus β Basenpaare bestehende Restriktionsstelle an dem Ini'iationscodon

besitzen, wobei Mungo-Bohnen-Nuciease oder S1 -Nuclease verwendet werden, um Einzelstrangbereiche zu entfernen und fürdie Llgierung stumpfe Enden zu schaffen, wie dies Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101C, 123 (198::, beschrieben

Ein 1225 bp großes FnuD Η-Fragment von HBV DNA aus pRIT 10616 (vgl. Harford et al., [ 1983), Devel. BiH. Standard, 54,125-130),

das das HBsAg-Gen enthaJ'., wurde isoliert, mit synthetischen Octomer EcoR I-Linkern versehen und in die EcoR I-Stelle des

Vektors pACYC 184 ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT 10679 (Fig.8). Der Vektor pACYC 184 wurde von S. Cohen erhalten und

ist aus Chang A.C. Y. und Cohen S. ;¹978), J. Bacteriol., 134,1141-1156, bekannt. pACYC 184 ist auch von r'sr American Type

Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter Al CC 37033 erhältlich. Von diesem EcoR I (FnuDII)-Fragment wurde ein

125bp großf/s EcoRI-Xbal-Fragment erhalten, das die C-terminale Region der HBsAg-Vorläufer-DNA, das HBsAg ATG-Codonund 90bp der HBsAg-codierenden Sequenz enthält. Dieses 125bp große EcoRI-Xba I-Fragment wurde zwischen die EcoRI- und

Xbal-Stellon von pRIT10158 (vgl. Beispiel 4b) eingeführt. Das resultierende Plasmid pRIT 10903 enthält daher 'line einzige EcoRI-Stello an der Verbindung zwischen arg'-DNA und HBV-ONA und eine einzige Xhol-Stelle in der arg'-Piomotorregion. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10903.

150pg der pRIT 10903 Plasmid-DNA, die durch CsCI-Äthidiumbromid-Dlchtegradientenzentrifugation gereinigt wurde, wurden mit 80 Einheiten der EcoRI-Endonuclease gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in 1OmM Tromethamin-HCI-Puffsr (pH 7,5) zu einer Konzentration von 1 \ig pro μΙ aufgenommen. Die DNA wurde in drei Proben von jeweils 50pg aufgeteilt und bei 30⁰C SO, 75 und 90 Sekunden mit der Nuclease BaI 31 inkubiert. Jede Reaktionsmischung enthielt den gleichen In Beispie! 1 beschriebenen Reaktionspuffer, 50pg EcoRI-verdaute pRIT10903-DNA und 2,5 Einheiten der Nuclease Bal31 in einem Endvolumen von 500μΙ. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EGTA bis zu einer Fndkonzentration von 2OmM gestoppt. Die Reaktionsmischungen wurden auf Eis gestellt, mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Die Bal31-behandelten DNA-Proben wurden jeweils in 50μΙ 1OmM Tromethamin-HCI-Puffer aufgenommen. 2,5 pg der DNA wurden mit der Endonuclease BstE Il verdaut und auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit dem EcoR l-BstE Il-Verdau von pRIT 10903, der ein 285 bp großes Fragment freisetzt, verglichen. Die Behandlung mit der Nuclease BaI 31 wird 75 Sekunden bei 30°C reduziert die Größe dieses EccRI-BstEII-Fragments um 10 bis 60bp. Es entsieht eine Serie von einzelnen DNA-Fragmenten, bei denen schätzungsweise 10,30,45 und 60 bp entfernt sind. Die Entfernung von 29 bp, ausgehend von der ursprünglichen

FnuDII-Stelle, wurde zur Entfernung der gesamten HBsAg-Vorläufer-ONA und des HBsAg ATG-Codons führen. 5 \ig der pRIT 10903 DNA, die 75 Sekunden mit BaI 31 behandelt worden war, wurden mit 8 Einheiten der Nuclease Xho I verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Diese DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten inkubiert, um Einzelstrangbereiche an den Xho I- und Bal31-Enden aufzufüllen mit Phenol behandelt und mit Äthanol präzipitiert. Die DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 16'C inkubiert. Die Ligationsmischung wurde schließlich verwendet, um kompetente Zellen des E. coli K12 Stammes MM 294 zu transformieren und diese dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren, wie aus dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cohen et al. bekannt ist. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml wurden nach dem Ausplattieren erhalten. Aus 47 einzelnen Kolonien wurden Plasmide im Labormaßstab (vgl. Birnboim et al., a. a. O.) präpariert, von denen 23 eine Xho I-Stelle besitzen. Dies deutet daraufhin, daß die Auffüllreakton an der ursprünglichen Xho I-Stelle und die Ligierung an ein 3'-Ende, das mit einem G-Rest endet, erfolgreich verlaufen ist. Diese 23 Plasmide wurden weiter mit Xhol und Xba I verdaut, um die Größe des kleinen Restriktionsfragmentes im Vergleich mit don ursprünglichen EcoRI-Xbal-Fragmenten aus pRIT 10903 zu vergleichen. Mehrere Plasmide wurden identifiziert, die schätzungsweise Deletionen von 25 bis 40 bp besitzen. Ein Plasmid, pRIT 10914, dessen Xhol-Xbal-Fragment schätzungsweise eine Größe von 95 bis 100bp besitzt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10914. DNA dieses Plasmides wurde durch CsCI-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25pg einer solchen DNa wurden mit 140 Einheiten der Xba I-Endonuclease gespalten.

Die Xbal-Enden wurden mit Y-³²P-ATP markiert, und die markierte DNA wurde mit 15 Einheiten dor Hind Ill-Endonuclease gespalten. Das kleine 765bp Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylam'dgel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert und nachfolgend durch Äthanol präzipitiert. Die Nucleotid-Sequenz an und im Bereich der Xho I-Stelle wurde bestimmt, indem dieses Fragment von dem markierten Xba I-Ende aus nach Maxam und Gilbert sequenziert wurde. Die Sequenzdaten zeigten, daß die Xho I-Stelle an der ersten Base des zweiten Codons der HBsAg-codierenden Sequenz liegt.

Xhol CTCGAGAAC

HBsAg Nucleotide

Nach Entfernung von Einzelstrangbereichen ist dieses Fragment daher zur Fusion mit der BamH !-Verlängerung des TDH3-Promotor-Fragmentes von pRIT10167 (Beispiel 1) geeignet.

Beispiel 7 Konstruktion der Plasmide pRIT 12211, pRIT 12209, pRIT 12230 und pRIT 12265

Das Plasmid pRIT10911, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde als Ausgangsmaterial für weitere Manipulationen verwendet. Um gewünschte Restriktionsstellen einzuführen, wurde das Plasmid mit den Endonucleasen BamH I und Xba I gespalten und das ausgeschnittene Fragment durch ein 2275bp großes BamHI-Xbal-Fragment aus pRIT10158 (Beispiel 4) ersetzt. Diese Manipulation führt zu dem Plasmid pRIT 12211, in dem das Hind IH-BamHI TDH 3-Promotor-Fragment neben einem BamHI-Xbal-Fragment liegt, das eine Xho I-Stelle enthält. Ferner enthält dieses Plasmid ein Xba I-Hind Ill-Fragment, in dem die C-terminale Region der HBsAg-codierenden Sequenz und 128bp der 3'-nichtcodierenden Sequenz mit der 1150bp arg'-Transkriptlons-Termlnationsregion fusioniert ist. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 12211. Das Plasmid pRIT 12211 wurde mit den Endonucleasen Xhol und XbaI gespalten. Hierdurch wurde ein 1600bp großes Fragment entfernt, das durch ein 94bp großec Xho I-Xba I-Fragment der modifizierten HBsAg DNA aus pRIT 10914, hergestellt gemäß Beispiel 5, ersetzt wurde. Dieses 94bp große Fragment wurde nach der Doppelverdauung der pRIT 10914 DNA mit Xhol und Xba I durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließende Elektroelution aus dem entsprechenden Gelstückchen gereinigt und durch Äthanol präzipitiert. Das durch die Insertion des 94bp gr< ssen Fragments entstandene Plasmid pRIT 12209 (vgl. Fig.8) wurde durch CsCI-Äthidiumbromid-DichtegradientenzentrifugoMon gereinigt. 60 pg dieser DNA wurden mit 90 Einheiten der BamH I-Endonuclease und 60 Einheiten der Xho l-En'-'^'Hease verdaut, um die 990 bp große υ wesentliche DNA zwischen dem TDH3-Promotor und der HBsAg-codierenden Region zu tntlernen. Die DNA wurde dann mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. 16pg dieser DNA wurden 30 Minuten bei 30"C mit 20 Einheiten der Mungo-Bohnen-Nuclease (PL Biochemicals) in einem Volumen von 125μΙ inkubiert. Der verwendete Inkubationspuffer enthielt 3OmM Natriumacetat (pH 4,6), 25OmM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid und 5% Glycerin. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,2% gestoppt und die DNA mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. Eine Teilmenge von 0^g dieser mit Mungo-Bohnen-Nuclease behandelten Probe wurde mit 2 Einheiten der T4 DNA-Ligase 1 β Stunden bei 16'C inkubiert und dann mit 2 Einheiten der BamH I-Endonuclease gespalten, um jegliche

Vektormoleküle zu zerstören, die bisher unbehandelt geblieben sind. Diese Mischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli K12 Stammes MM294zu transformieren und anschließer.d iuf Ampicillinresistenz gemäß Cohen et al., a.a.O., zu selektionieren. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml Tram formationsmischung wurden erhalten. Von

24 amplifizierten Kolonien wurden die Plasmide im Labormaßstab (gemäß dem Verfahren von ßirnboim et al., a. a. 0.) präpariert.

1 β der 24 Plasmide ergaben nach Verdauung mit der Endonuclease Hind III zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von 2 700 bp ' (pUC9-Vektor) und 3000bp. Das 3000bp große Fragment besitzt die für ein DNA-Fragment erwartete Größe, in dem die HBsAg-codierende Sequenz und die arg'-Terminationsregion an das TDH3-Promotor-Fragment ligiert ist. Vier Plasmid-Kandidaten wurden für die weitere Untersuchung hergenommen. Die DNA eines jeden Plasmides wurde mit der Endonuclease Xba I gespalten, in einer Kinase-Reaktion mit Y-³²P-ATP markiert, mit der Endonuclease Hind III gespalten und durch Polyacrylamidgel-F.lektrophoresa aufgetrennt. Das 1190 bp große markierte Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Elektroclution isoliert und durch Äthanol prizipitiert. Die Sequenz eines jeden isolierten Fragments wurde nach Maxam und Gilbert,*a.a.O., bestimmt. Zwei Plasmide wurden gefunden, die die korrekte Sequenz ATGGAGAAC für eine perfekte Fusion zwischen der TDH3-Promotor-Region und dem HBsAg-Gen besitzen. Eines dieser Plasmide, pRIT 12230, wurde für weitere Manipulationen verwendet. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 12230. Die DNA dieses Plasmids (pRIT 12230) wurde mit der Endonuclease Hindill gespalten und das 3000bp große Fragment, in dem die HBsAg-codierende Sequenz fusioniert mit dem TOH 3-Promotor vorliegt, in den Shuttle-Vektor XEp 13 ligiert. Das resultierende Plasmid, pRIT 12265, wurde nach dem von Ito et al., J. Bact. 153 (1983), 163, beschriebenen Verfahren in den Hefestamm DC5 (MATa, leu2-3, Ieu2-112, his3, can 1-11) (erhalten von J. Broach [State University of N. Y., Stony Brook]) eingeschleust. Dieser Hefestamm ist auch ohne Beschränkung von der American Type Culture Collection unter ATCC20630 erhältlich.

Beispiel 8 Konstruktion der Plasmide pRIT 12288 und pRIT 12322

Das Plasmid pRIT 12230 (Beispiel 7) enthält 3'-downs"eam vom Stop-Codon des HBsAg-Strukturgens 128bp, die nicht tür HBV codieren.

Zur Entfernung diener 128 bp wurden 25 pg von pRIT 12230, hergestellt gemäß P»^!3piel 7, mit Acc I und EcoR I verdaut. pRIT 12230 enthält eine einzige Accl-Stelle, die in der codierenden Sequenz des S-Gens 7 Nucleotide vor dem TAA Stop-Codon liegt. Die verdaute DNA wurde auf einem 1%lgen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und das größere 4200bp große Vektor-Fragment aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und durch Äthanol präzipitiert.

Künstliche 12mer und 14mer Einzelstrang-DNA-Linker-Moleküle mit den folgenden Sequenzen wurden für die Insertion zwischen der Acc I- und EcoR I-Stelle von pRIT 12330 hergestellt:

5'ATACATTTAACGS'

12mer

3' TGTAAATTGCTTAA 5'

14mer

Dies stellt die korrekten C-terminalen HBsAg-Codons und das TAA-Stop-Codon wieder her u:id liefert für den Zusatz von Transkriptions-Terminations-Fragmenten eine EcoR I-Stelle, die sonst nirgendwo in dem TDH3-Promotor oder den HBsAg-codierenden Sequenzen vorliegt.

10OpMoI der synthetischen 12msr und 10OpMoI der synthetischen 14mer-Einzelstränge werden in einem Eiidvolumen von 10 bis 20μΙ zusammengemischt, 15 Minuten bei 70'C erhitzt und dann innerhalb von 3 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, un. Jas Aneinanderlagern beider Stränge entlang ihrer kompelementären Sequenzen zu erreichen. Zu diesor „annealing'-Mifchung werden 0,15pMol(400ng) des 4200bp langen Accl-EcoRI-Fragments von pRIT12230,10f ach konzentrierter Ugationspuffer und 2 Einheiten der 4 DNA-Ligase gegeben.

Diese Mischung wird 4 Stunden bei 16°C inkubiert, sodann werden weitere 2 Einheiten der T4 TNA-Ligaso zugesetzt. Hierauf wird die Mischung über Nacht auf Eis gestellt. Die ligierte Mischung wird verwendet, um kompetente Zellen des Stammes MM294 zu transformieren und danti auf Ampicillin-Resistenz gemäß Cohen et al., Proc. Nat!. Acad. Sei., USA, 69 (1972), 2110,. ι selektionieren. Plssmide werden von 12 oder mehr Einzelkolonien im Labormaßstab gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res., 7 (1979), 1513, präpariert und durch Restriktions-Endonucleasen analysiert. PlasTiide mit de/ Insertion des Linkers zwischen der Acc I und EcoR I-Stelle zeigen nach Verdauung mit Accl oder EcoR I eine einzelne 4 2COb ρ große DNA-Bande. Die Richtigkeit der Linkerinsertion in einem solchen Plasmid kann durch die DNA-Sequenzierung ausgehen von de'f EcoR I-Stelle oder der Accl-Stelle nach dem chemischen Modifikationsverfahren von Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 [1960], 499), nachgewiesen werden.

Um ein Transkriptions-Terminatione-Fragment zu beschaffen, wurde ein Plasmid mit dem Acc l-EcoRI-Linker-lnsert, e.-dalten wie vorstehend boschrieben, mit der Endonuclease EcoR I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt (US-Pfltent 4264732). Das 2650bp große Hindlli-Fragment von pRIT10162, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde in die Hindlll-Stelle des Vektors pBR 327 umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT 12288. pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt, und kann wie in Beispiel 10, Teil (b) beschrieben, aus dem Plasmid pRIT12309, das bei American Type Culture Collection unter ATCC67187 erhältlich ist, hergestellt werden. Fig.8 zeigt die Konstruktion von pRIT1228. Das Hind HI-Fragment ist in pRIT 12288 so orientiert, daß die arg'-Transkriptions-Terminationsregion neben den EcoR I- und Clal-Restriktionsstellen auf der pBR327-Hälfte liegt. Von pRIT 12288 wird oin 1180bp großes EcoRI-Fragment erhalten, das o'io arg'-Transkriptions-Terminationsregion enthält. Dieses Fragment wird an das beschriebene EcoRI-ge&paltene und mit alkalischer Phosphatase behandelte pRIT12230-Derivat ligiert. Plasmide, die aus der Ligationsmischung hervorgehen, werden hinsichtlich der Insertion und der Orientierung des 1180bp großen EcoRI-Fraoments untersucht. Die Orientierung des Inserts kann durch Spaltung mit der Endonuclease Hind III bestimmt werden, die Fragmente einer Größe von 2 880 und 2 720 bp freisetzt, sofern das Insef JIe gewünschte Orientierung hat.

Ein Plasmid, pRIT 12322, wurde konstruiert, in dem der Accl-EcoRI-Linker die 128bp lange unerwünschte HBV-DNA ersetzt und in dem das 1180bp lange EcoRI-Fragment von pRIT 12288 in der richtigen Orientierung vorliegt, nämlich downstream der HBsAg-codiarenden Sequenz. Ein 2900bp großes Hindlll-Fragment kann aus pRIT 12322 ausgeschnitten werden, das die HBsAg-Expressionseinheit enthält, zu der der TDH3-Promotor, die HBsAg-codierende Sequenz und die arg'-Transkriptions-Terminationsregion gehört. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pRIT 12322; vgl. auch Fig. 11, die eine Restriktionskarte von pRIT 12232 zeigt und angibt, welche Teile davon von pRIT 12288 und pRIT 12230 stammen.

Beispiel 9 Konstruktion des Plasmids pRIT 12329 Wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält pRIT 12322 ein 2900bp großes Hind Ill-Fragment, das alle notwendigen Signalsequenzen

für die Expression von HBsAg unter der Kontrolle des TDH3-Promotors unthält. Diese Expressionseinheit wurde in einen

Hefe-Shuttle-Vektor ligiert. Die DNA des Shuttle-Vektors YEp 13 wurde mit der Endonuclease Hind III gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und

als Empfänger für das Hind Ill-Fragment aus pRIT 12322, hergestellt gemäß Beispiel 8, verwendet. Ein Plasmid, pRIT 12329,wurde isoliert, das neben dem YEp 13-Replikon auch das 2 900 bp große Hind Ill-Fragment mit der Expressionseinheit, wie in

Beispiel 8 beschrieben, enthält. Beispiel 10 Konstruktion von pRIT 12309, pRIT12314 und dem Expressions-Shuttle-Vektor pRIT12S44, der die komplette 2 Mikron Hefe-DNA enthalt

Das Plasmid pRIT 12309 umfaßt die komplette 6318bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz, die in die EcoRI-Stelle des Plasmid-Vektors pBR327 Moniert ist. Die β318 bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz wurde aus dem Plasmid pCV19 erhalten, das von J. Broach, Princeton University, überlassen wurde. Das Plasmid pRIT 12309 wurde in dem E.coli Stamm K12 MM 924 gemäß Budapester Vertrag in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 67187 hinterlegt. Fig. 13 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12309. Die Insertion der 2 Mikron DNA-Sequenz in eine der zwei EcoR I-Stellen von pBR327 unterbricht die 2 Mikron A codierende Region und führt dazu, daß das resultierende hybride Molekül pRIT 13309 keine Α-Gen bzw. FLP-Funktion aufweist. Eine Beschreibung der 2 Mikron-Struktur und Funktion ist aus Broach J., .The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and Inheritance*, 445-470, Strathern J. N., Jones E. W. und Broach J. R. (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981), bekannt.

pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt und wurde von F. Bolivar (Department of Molecular Biology, National University of Mexico, Mexico 20DF) erhalten. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das Plasmid pBR327 aus dem Plasmid pRIT 12309 erhalten werden kann. Die pRIT 12309 PlasmidONA wird aus dem E. coli Stamm, der in der American Type Culture Collection unter ATCC67187 hinterlegt ist, durch eine der zahlreichen üblichen Verfahren isoliert, mit EcoR I gespalten und wieder ligiert. Die Ligationsmischung wird verwendet, um kompetente E.coli K12-Zellen zu transformieren und auf Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz zu selektionieren. Eine beträchtliche Anzahl der transformierten Kolonien wird Plasmide enthalten, in denen nur die pBR327 Hälfte von pRIT12309 vorhanden ist, ohne eines der 2 Mikron DNA-Fragmento. Das 2850bp große CIaI-SaI I-Fragment, das die TDH3-arg'-Expressionseinheit und flankierende pBR322-Sequenzen aus pRiT12290 (beschrieben in Beispiel 3) enthält, wurde in den Vektor pRIT 12309 zwischen der CIa I· und SaI I-Stelle umkloniert. Das resultierende Plasmid pRIT12314 wurde mit der Endonuclease Sal I gospalten und mit dem 2218bp großen Sall-Xhol-Fragment aus YEp 13, das das Hefe LEU 2-Gen enthält, ligiert. Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT 12314. YEp 13 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC37115 erhältlich. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des Stammes JA221, die nach Cohen et al., a.a.O., präpariert wurden, zu transformieren und auf Leucin-Unebhängigkeit und Ampicillin-Resistenz zu selektionieren.

Der Stamm JA 221 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC33875 erhältlich.

Ein Plasmid, pRIT 12544, in dem das 2218bp große Sall-Xhol LEU2-Genfragment in die SaI I-Stelle von pRIT12314 inseriert wurde, wurde aus einem Klon dieser Transformation erhalten. Die Orientierung dieser Insertion ist so, daß die wieder entstandene SaI I-Stelle auf jener Seite liegt, die der TDH3-arg'-Expressionseinheit air nächsten ist. Das Plasmid pRIT 12544 ist ein E. coli Hefe-Shuttle-Vektor mit einer einzigen BamHI- und Sma I-Stelle, die zwischen den TDH3-Promotor und arg'-Transkrlptions-Terminationsregionen liegen. Diese Restriktionsstellen eignen sich zur insertion von DNA-Sequenzen, die unter der Kontrolle des TDH3-Pfomotors stehen sollen. Flg. 14 zeigt die Herstellung von pRIT 12544.

Beispiel« von Pr* S2-S Protein und Pro S 1-Pr· S2-S ProtelnhersteUung In Hif· Es wurde festgestellt, daß die Insertion der Pre S 2-S-protein:odierendd Sequenz in einon Hefe-Expressionsvektor in Hefe zur Synthese von Partikeln führt, die das glykosylierte Pre S 2 Protein auf ihrer Oberfläche zeigen und den natürlichen 22 nm großen HBsAg-Partikeln sehr ähnlich sind. Es war zuvor aber nicht korrekt beschrieben, daß Hefen, die mit irgendeinem Teil des HBV-Genoms transformiert sind, ein glykosyliertes Produkt exprimieren. Die folgenden Beispiele betroffen die Expression der glykosylierten Form eines Proteins in Hefe, das neben der Pre S2-Region

auch die S-Proteinregion des Hepatitis B-Oberflächenantigens enthält. Zur Verwendung als Humanimpfstoff kann das Proteinaus Hefezellen in Form von Partikeln isoliert und gereinigt werden. Das in Hefezellen exprimierte Pre S1 -Pre S 2-S Protein ist auchglykosyliert und kann zur Verwendung in einem Impfstoff gegen das Hepatitis B-Virus aim Hefezellen in Form von Partikelnisoliert und gereinigt werden. Hinsichtlich des Nachweises von Glykosylierung soll folgendes beachtet werden:

1. Die Beispiele 20,21 und 22 betreffen die Bindung von Concanavalin A, den Effekt von Tunicamycin und die Empfindlichkeit auf die Endoglykosidase H. Jedes Beispiel zeigt, daß die Pre S2-S-Proteinspezies von 33kd glykosyliert ist. Somit wurde dio Glykosylierung durch drei unabhängige Verfahren gezeigt.

2. Die Spezifität dieser Mittel ist:

a) Concanavalin A bindet vorzugsweise an Mannosereste;

b) Tunicamycin inhibiert alle Glyko.tylierungen, die N-glykosidisch an Aspargin gebunden sind;

c) die Endoglykosidase H spaltet an Asparagin gebundene Oligosaccharide mit hohem Mannose-Anteil, indem ein N-Acetylglucosaminrest am Asparagin haften bleibt.

3. Aus den kombinierten Ergebnissen der Beispiele 20,21 und 22 und dem vorstehend Beschriebenen wird geschlossen, daß die 33 kd Form des Pre S2S-Proteins (Tunicamycin-Inhibition, Empfindlichkeit für Endo H) eine N-gebundene Oligosaccharidkette mit hohem Mannose-Anteil (Sensitivität für Endo H) besitzt. Die beobachtete Änderung des Molekulargewichts (etwa 3000) nach der Behandlung mit Tunicamycin und der Verdauung mit Endo H zeigt an, daß die Oligosacchsridstruktur aus etwa 10 Zuckerresten besteht. Dies ist etwa die Größe einer Kernglykosylierung in Hefe. Somit ist wahrscheinlich nur eine der drei möglichen Glykosylierungsstellen in dem Pre S 2-S-Protein glykosyliert.

4. Die Reinigungsschemen, die in Beispiel 23 und 24 beschrieben sind, die hinsichtlich der Zuckerreste eines Glykoproteins autgerichtet sind, enthalten einen affinititschromatographischen Schritt.

6. Phenylboronat hat eine SpezifitSt fur 1,2-cis-Diolgruppen

β. Linsensepharose ist Glucose-Mannose-spezifisch.

Beispiel 11 Konstruktion von pRIT 12662 -ein E.coli Vektor, der die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält (Fig. 16) Das Plasmld pRIT 12290, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde modifiziert, indem das synthetische BamH l-EcoR I- Verlängerungsfragment, das für die N-terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region codiert, zwischen die TOH 3-Promotor- und

arg*-Terminator-Fragmente ligiert wird. Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Das Plqsmid pRIT 12290 wurde mit den Endonucleasen BamHI und EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase

dephosphoryliert. 20OpMoI des phosphorylierten synthetischen Verlängerungs-Fragments

GIn Trp

BamHI 5'GATC CAG TGG 3' EcoRI

3' GTC ACCTTAA 5'

wurden mit 0,1 pMol des BamH l-EcoR I geschnittenen und dephosphorylierten Plasmids pRIT 12290 ligiert, indem eine Einheit (U) der T4 DNA-Ligase verwendet wurde. Mit der Ligationsmischung wurde der E.coli Stamm MM 294 transformiert und auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine Transformante, die das gewünschte Plasmid mit dem synthetischen Verlängerungsfragment zwischen der BamHI- und EcoRI-Stelle besitzt, wurde identifiziert und isoliert. Das Plasmid wurde mit pRIT12621 bezeichnet. Im nächsten Schritt wurden die vier zusätzlichen Basenpaare (Kern der BamHI-Stelle) In pRIT12621 entfernt, um das ATG-Cod- η in Ablesephase mit dem zweiten Codon der Pre S2-Region zu bringen. Im nächsten Schritt wurde ein EcoRI-Fragment, das den Rest der Pre S2-codierenden Region und die komplette S-codierende Region enthält, in die EcoR I-Stelle von pRIT 12621 ligiert. Es wurde die komplette Pre S 2-S-codierende Sequenz erhalten. In diesem Stadium wurden dio DNA-Manipulationen, die nachfolgend das Linearisieren, das Herbeiführen von Deletion und das Rezirkularisieren des Plasmids

pRIT12621 umfassen, ohne Amplifikation durch Transformation der als Zwischenprodukt verwendeten Plasmide durchgeführt. Es wurde folgendermaßen verfahren:

3OpMoI (120pg) der 12621 DNA wurden mit 120 Einheiten von BamHI linearisiert. Nach der Abtrennung des Restriktionsenzyms durch Phenolextraktion wurde das Plasmid durch Äthanol präzipitiert und in den entsprechenden Puffer aufgenommen, um die Einzelstrangbereiche der BamH I-Stelle mit 280 Einheiten der Mungo-Bohnen-Nuclease zu verdauen. Die Nuclease wurde durch Phenolextraktion entfernt, der dann eine Äthanolpräzipitation folgte. Das so behandelte Plasmid wurde in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 10 Einheiten der T4 DNA-Ligase rezirkularisiert.

Der das ligierte Plasmid enthaltende Ansatz wurde mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in dem entsprechenden Puffer aufgenommen und mit dem Enzym EcoR I gespalten. Nach der Abtrennung der EcoR I-Endonuclease durch Phenolextraktion und Äthanol-Präzipitation wurden 0,05pMol (0,2pg der DNA) in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 0,4 pMol (0,2 Mg) eines 838 bp großen EcoR I-Fragments, das aus pRIT 12681 isoliert wurde und das die gesamte C-terminalo codierende Region des Pre S2-S-Proteins enthält, ligiert. '

Ein Plasmid, das im wesentlichen dem pRIT 12581 ähnlich ist, kann folgendermaßen konstruiert werden. Der Vektor pUC9 (erhältlich bei Amersham und Pharmacia) wird mit der Endonuclease EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase (US-PS 4264731) behandelt. Das Plasmid pRIT10616 (ATCC39131) wird mit EcoRI und Acc) gespalten und das 826bp große EcoRI-Accl-Fragment, das einen Teil der Pre S2-S-codierenden Region enthält, durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophoreso und Elektroelution erhalten. Etwa 0,4pMol (0,2Mg) von diesem Fragment werden mit etwa 1OpMoI eine? synthetischen Verlängerungsfragmentes, das die folgenden 12bp besitzt und das, wie in Beispiel 8 beschrieben, durch Aneinanderlagern der beiden Einzelstränge entstanden ist, gemischt.

He

Tyr Stop

5' ATACATTTAACG 3'

Accl EcoRI

3' TGTAAATTGCTTAA 5'

Die vorstehend erhaltene Mischung wird mit T4 DNA-Ligase behandelt und dann mit Restriktionsenzym EcoR I geschnitten. Zu dieser so behandelten Mischung werden 0,2Mg des EcoRI-gecpaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten pUC9-Vektors,der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, gegeben und die Mischung mit T4 DNA-Ligase behandelt. Mit dieser Mischung wurden kompetente Zellen des E.coli Stammes K12 transformiert und auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Kolonien dieser Transformanten wurden auf die Anwesenheit eines Plasmids untersucht, das neben dem 2 650 bp großen pUC9-Vektor-Fragments auch ein 838bp großes EcoRI-Fragment besitzt. Dieses EcoRI-Fragment umfaßt ein 826bp großes EcoR I-Acc I-Pre S 2-S-Fragment und den 12 bp großen synthetischen Acc l-EcoR I-Linker. Die Richtigkeit dieser so identifizierten Konstruktion kann durch DNA-Sequenzierung nach Maxam und Gilbert bewiesen werden. Vorzugsweise erfolgt die DNA-Sequenzierung, ausgehend vcn einer Restriktionsstelle, die nur im pUC9-Polylinker einmal vorkommt. Die Ligationsmischung, die die Plasmid-DNA von pRIT12621, behandelt wie vorstehend beschrieben, und das 838bp große EcoRI-Fragment von pRIT 12681 enthält, wurde verwendet, um den E.coli Stamm MM 294 nach Cohen et al., a. a. O., zu transformieren. Eine Transformante, die ein Plasmid mit dem EcoR I Fragment in richtiger Orientierung enthält, wurde Identifiziert und das Plasmid als pRIT 12662 bezeichnet (vgl. Fig. 1A und Fig. 16). Fig. 1A zeigt die Herstellung von pRIT 12662, Fig. 16 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12662. Die Pre S 2-Region von pRIT 12662 wurde nach Moxam und Gilbert sequenziert, um den Leserahmen am N-Terminuszu überprüfen, der wie folgt aussieht:

AAAC

	Met	GIn	Trp Asn Ser
AAAC AAA	ATG	CAG	TGG AAT TCC
pTDH3			PreS2-S
			modifizierte Region

Dem Fachmann ist es bekannt, daß der Vektor pRIT 12662 auch verwendet werden kann, um weitere funktioneile DNA-Sequenzen durch geeignete In-vitro-Manipulationen des Vektors in die Pre S 2-Region einzuführen. Die Pre S 2-codierende Sequenz enthält die Restriktionsstellen fur die EcoR I, Pst I und BamH I-Endonucleasen. Jede dieser Restriktionsstellen kann verwendet werden, um funktioneile DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, einzuführen und in Ablesephase Fusionen mit der Pro S 2-Region zu schaffen. Solche Fusionen werden von dem Pre S2-eingeführte Sequenz-Pre S2-S-Typ sein. Diese Restriktionsstellen können auch in vitro durch das beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschriebenen Verfi' en manipuliert werden, um andere Vektoren zu schaffen und andere Restriktionsstellen oder Leserahmen zur Insertion von fuiiiuionellen DNA-Sequenzen zu liefern.

Beispiel 12 Konstruktion von pRIT 12377 und pRIT 12660, einem Hefeplasmid, das das Pre S 2-S-Protein exprimiert DNA des Plasmids pRIT 12309, hergestellt gemäß Beispiel 10, wurde mit der Endonuclease Salt gespalten und mit einem 2 218 bp

großen Xhol-Sall-DNA-Fragment ligiert, das das Hefe LEU2-Gen enthält und das durch Verdauung von YEp 13 und durch

Reinigung aus einem Polyacrylamidgel erhalten wurde. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von Zellen des E.coli K12 Stammes JA221 verwendet und sodann auf Ampicillin-Resistenz und Leucln-Unabhängigkeit selektioniert. Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter 33875 erhältlich. Aus einer transformierten Kolonie wurde das Plasmid

pRIT 12377 identifiziert, das das 2218 bp große LEU 2 Xhol-Sall-Fragment in der Sall-Stelle von pRIT 12309 enthält.

Die Orientierung des Fragments ist derartig, daß die wiedererhaltene Sall-Stelle auf jener Seite der pBR327 DNA vorliegt, auf der

auch die Aval-Stelle liegt. Das Plasmid pRIT 12377 ist ein E.coli Hefe-Shuttle-Vektor, der cTe notwendigen Funktionen für die

Selektion, Replikmion und Stabilität in beiden Organismen besitzt. Das 3050 bp Hind Ill-Fragment von pRIT 12662 (Beispiel 11), das die Pre S 2-S-Expressionseinheit enthält, wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, mit T4-Polymerase behandelt und in pRIT 12377 ligiert. pRIT 12377 war zuvor durch BamH I geöffnet worden und durch die T4 DNA-Polymerase behandelt worden. Diese Ligationsmischung wurde zum Transformieren von Zellen des E.coli Stammes MM 294 verwendet. Die Zellen wurden sodann auf Ampicillin-Resistanz

selektioniert. Eine E.coli Transformante, die das Plasmid pRIT 12660 besitzt, wurde erhalten. Fig. 17 zeigt die Herstellung von

Dieses Plasmid, pRIT 12660, wurde verwendet, um zwei Stämme von Saccharomyces cerevisiae, nämlich Stamm DC4 cir° und Stamm 10S44Ccir* gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79 (1978), 2157-2161, zu transformieren. Beide Stämme, DC5 cir° und 10S44C clr", wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. Aug. 1986 unter ATCC20820 und ATCC20818 hinterlegt. Beispiel 13 Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12C62 Die Pre S 2-Region in dem Plasmid pRIT 126C2 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert. Es wurde gefunden, daß im Vergleich

zu einem anderen Virus des adw2-Serotyps (Valenzuela et al., a. a. O., 1980-Tabelle I, S. 11) vier Basenausvdusche vorliegen, diezu drei AminosSureaustauschen führen. An der Position -45 ein Alaninrest anstelle eines Threoninrestes, an der Position - 34 ein

Phenylalaninrest anstelle eines Leucinrestes an der Position -11 ein Serinrest anstelle eines Isoleucinrestes. Der letzte Austausch

betrifft einen Rest, der bisher in allen bekannten Serotypen nicht verändert war (Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2 [1986],

Beispiel 14

Synthese von Partikeln, die einen Rezeptor tragen für polymerisiertes human Serumalbumin (pHSA) Die Hefestämme (Saccharomyc«t cerevisiae) DCScIr* oder 10S44Ccir°, die entweder pRIT 12363 (Beispiel 11) enthalten, wurden im Selektivmedium (200ml YNB + 80Mg/ml Histidin [DC5 cir'l oder YNB (10S44C cir°))bis in die log-Phase kultiviert. pRIT 12363 ist mit pRIT 12660 identisch mit der Ausnahme daß pRIT 12363 nw das S-Qen aus HBV enthält. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 5OmM Natriumphosphat pH 8 resuspendiert, das 0,5% Tween 20 (Polyäthylensorbitanmonolaurat), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylflourid) und 2,5% Isopropanol enthält. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal durch eine French-Presse mit einem Druck von (1,38 χ 10*Pa) (20000 pst) geschickt wurden. Die Suspension wurden 30 Minuten bei 300O0xg zentrifugiert. Die Gesamtprotein-Konzentration in dem flüssigen Überstand (Rohzellextrakt) wurde nach Lowry et al., J. Biol. Chem., 193 (1951), 265-275, gemessen, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde. Die Anwesenheit von HBsAg-verwendetem Material wurde untersucht, indem ein Radioimmun-Test-Kit (AUSRIA II), der von Abbott Laboratories erhältlich ist, verwendet wurde. Die Ergebnisse (Tabelle II) zeigen, daß pRIT 12660 die Synthese eines antigenen Materials steuert, das mit den HBcAG-Partikeln verwandt ist. Die Expressionshöhe, die auf der AUSRIA-Aktivität basiert, ist etwa die gleiche, wie in den Hefestämmen DC5 cir" und 10S44C cir°.

In einem Radioimmun-Test zum Nachweis eines Rezeptors für polymerisiertes human Serumalbumin (pHSA) (Pontisso et al., J. Virol. Methods, 6 (1383), 151-159) ergab der Rohextrakt von Zellen, die pRIT 12660 enthalten, eine positive Reaktion im Gegensatz zu dem Rohextrakt aus Zellen, die pRIT 12363 enthalten. Keine Reaktion über den Background wurde mit polymerisiertem Rinderserumalbumin erhalten.

Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation der Rohextrakte von Zellen, die pRIT 12660 enthalten, zeigte das AUSRIA-positive Material in einer Bande mit der Schwimmdichte rho = 1,20g/crn³. Diese Bande entsprach jener, die man bei HBsAg-Partikeln aus Serum bzw. Hefe bekommt. Das Material aus diesem Teil des Gradienten ergibt im pHSA-Test ein positives Resultat. Die vorstehend erwähnten Ergebnisse zeigen, daß in Hefezellen, die pRIT 12660 enthalten, ein HBsAg-verwandtes Protein exprimiert wird, das einen Rezeptor für pHSA auf seiner Oberfläche besitzt und das in eine Struktur eingebaut wird, die ähnlich dem 22nm großen Partikeln aus dem Serum ist.

Tabellen AUSRIA-Aktlvlttt In Rohzellextrakten

Stamm	Plasmid	Protein	HBsAg-verwandte	HBsAg-verwandte
			Antigenität	Antigenität
		mg/ml	ng/ml	ng/mg Protein
DC 5 cir°	pRIT 12660	13,4	7	622
DC5cir"	pRIT 12660	12,6	7	555
. 10S44Cdr"	pRIT 12660	10,8	6	556
10S44Ccir°	pRIT 12660	9,5	6	631

Beltpiel 15

4S-verwandte Protein-Spezies, die in Hefen exprimiert werden, welche mit pRIT 12660 transformiert sind

Zur Analysierung von HBsAg-verwandten Protein-Monomeren, die in Zellen exprimiert werden, welche pRIT 12660 enthalten,

wurden dfe Zellen im Selektivmedium, entweder in Erlenmeyer-Kolben oder in Fermentern bis in die log-Phase kultiviert unddurch Zentrifugation gesammelt.

Zu den sedimentierten Zellen (0,1 g) wurden zuerst 20μΙ 4OmM PMSF in Isopropanol und dann 200μΙ Probenpuffer für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (0,125M Tris-HCI, pH 6,8 mit 20% Glycerin, 4% SDS, 6M Harnstoff und 10%

2-Mercaptofithanol) zugegeben. Die Proben wurden stark aufgewirbelt und Teilmengen von 2 bis 20 μΙ weiter in Probenpuffer biszu einem Endvolumen von 40μΙ verdünnt, 5 Minuten auf 100°C erhitzt und in einem 12,5%igen Trenn-5%igen Schicht-Gel gemäßnach einem aus Laemmli (Nature, 227 [1971], 680) bekannten Verfahren elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach dem Elektrotransfer (Towbln et al., Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 76 [1979], 4350-4354), der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter

(0,45μσι, BioRad) wurde das Filter 1 Stunde bei 37⁰C in PBS mit 3% Gelatine vorinkubiert. Das Filter wurde mit einemmonoklonalen Antikörper, der gegen ein Denaturierungs-Reduktions-resistentes Epitop des aus Menschen isolierten HBsAg(Monoklonal-Antikörper Nr.6, erhalten von H.Thomas, Royal Free Hospital, London, England) gerichtet ist, inkubiert. Die

Antikörperblndung wurde ermittelt durch die aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinyllertem Schaf-Antlmaus-

lmmunglobulin (RPN 1021, Amersham, Verdünnung 1:250 in PBS mit 1 % Gelatine), Streptavidin-biotinyliertem

Meerrettichperoxidase-Komplex (RPN 1051, Amersham, Verdünnung 1:400 in PBS mit 1 % Gelatine) und 30μΙ H₂O₂ und HRP Farbentwickler-Reagens, das 4-Chloronaphthalin-1-ol (BioRad), 30m; in lOml Methanol und 50ml PBS enthält. Zwischen den

einzelnen Inkubationen wurden das Filter mit PBS, das 0,1 % Twes;< 29 enthält, gewaschen.

Der Immunblot zeigte vier mit dem S-Protein (p 23) verwandte Proto.!nbanden, die ein geschätztes Molekulargewicht von 33kd,

309kd, 28kd und 25kd besitzen und durch den monoklonalen Antikörper ermittelt wurden. Die Mehrheit des mit dem S-Proteinverwandten Materials findet sich in der 33kd Proteinbande unnd wandert etwas schneller als das aus Stibbe und Gerlich(Virology, 123 [1982], 436-442) bekannte gp33-Protein. Die kleinste Proteinbande wandert langsamer als das in Hefesynthetisierte S-Protein (p23).

Beispiel 16

4S-verwandte Protein-Spezies (33kd, 30kd, 28kd und 25kd), die zu Partikeln zusammengesetzt werden

Rohextrakte aus Zellen, die pRIT 12660 (Beispiel 11) enthalten, werden wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt. Alternativ werden Hefezellen in einem Dynomil! (in Gegenwart desgleichen Gewichtes an Extraktionspuffer) (20OmM Tris, 3 M NaCI, 1OmM EDTA₁1OmM Äthylenglykol-bis-[beta-amino-äthyläther]-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA], 4mM PMSF, 10% Isopropanol) zerrieben und nachfolgend 45 Minuten bei 30000xg zentrifugiert. Die auf pRIT 12660 zurückzuführenden Partikel werden teilweise aus dem Rohzellextrakt durch Ultrafiltration, Cäsiumchlorid- Gleichgewichtszentrifugation und Hydroxyapatit-Chromatographie gereinigt. Diese Methoden sind bekannt. Die vier Proteinbanden des mit dem S-Protein verwandten Materials, die in der Western-blot-Analyse ermittelt wurden, werden durch

diese Schritte mitgereinigt. Eine Immunblot-Analyse (wie in Beispiel 15 beschrieben) der AUSRIA-positiven Cäsiumchlorid-

Fraktionen nach einer Glelchgewichtszentrifugation zeigte, daß die 4S-verwandten Banden In jeder Fraktion mit den gleichen

relativen Mengen vorliegen.

Das Material ist somit in homogener Weise über die Peak-Fraktionen des Gradienten verteilt. Beispiel 17

33kd und 30kd Proteine, die einen Rezeptor für polymerisiertes humanes Serumalbumin haben

Human-Serumalbumln (Sigma, A8763) wurde durch eine Glutaraldehyd-Behandlung (Merck, A-12179) polymerisiert und nach

einem aus Pontisso et al. (J. Virol. Methode, β [1973], 151-159) bekannten Verfahren gereinigt. Die Reaktivität der 4 S verwandten

Proteine gegenüber pHSA wurde in einem Western blot getestet. Teilweise Gereinigte Präparationen von Partikel >, die auf

pRIT 12660 (Beispiel 16) zurückzuführen sind, wurden SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und ai:/ ei no

Nitrocellulosefilter gemäß Beispiel 15 transferiert. Das Nitrocellulosefilter wurde nacheinander mit pHSA (15μςΛηΙ in PBS mit

1 % Gelatine), Kaninchen-Antiserum gegen Human-Albumin (Behringwerke, ORCB 04/05,1/125 Verdünnung in PBS mit 1 %

Gelatine), biotinyliertem Esel-Antikanlnchen-Immunglobulin (Amersham RPN1004,1/250 Verdünnung in PBS mit 1 % Gt'ntine), Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxidase (Amersham RPN 10511/400 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine) und H₂O)

und 4-Chloro-naphthalin-1-ol gemäß Beispiel 20 inkubiert.

Die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (das 33 kd und 30 kd-Protein) reagierten mit pHSA, während die zwei kleinsten

(28 kd und 25kd-Proteine) keine Reaktion zeigten.

Beispiel 18

33kd und 30kd Proteine, die eine spezifische Sequenz für die Pre S2-Region des Pro S2-S-Proteins enthalten

Ein Peptid, dae 23 von 26 N-terminalen Aminosäuren des Pre S2-S-Proteins besitzt, wurde synthetisiert (NH₂-Met-Glu-Trp-Asn- Sor-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-COOH) und über das C-terminale Ende

an das Napfschnecken-Hlmocyanin (Peninsula Laboratories) gebunden. Kaninchen wurden subcutan mit 100ug des Konjugats(dies entspricht 20pg Peptid) in Freund's komplettem Adjuvans immunisiert. An den Tagen 8 und 15 wurden weitere 100 Mg

Konjugat in Freund's kompletten Adjuvans und an den Tagen 28,69 und 149 weitere 100 μς in PBS verabreicht. Die Entwicklung des Antikörpertiters wurde verfolgt, indem in regelmäßigen Abständen Blutproben entnommen und Serumverdünnungen durch Inkubation mit synthetischem Peptid, das in fester Phase vorlag, getestet wurden. Gebundene Antikörperwurden durch jodiertes Protein A ermittelt (New England Nuclear). Für die Anwendung im Immunblot wurden Seren ausgewählt, die einen Antipeptidtiter von größer oder gleich 1/5120 hatten. Das Serum wurde nach einer lOOfachen Verdünnung oder nach zum Teil erfolgter Reinigung des IgG verwendet. IgG wurde teilweise gereinigt durch Präzipitation mit Na₂SOi (120mg/ml Serum), Resuspendioren in PBS und wiederholter Präzipitation mit 14% Na₂SOi. Die resuspenciierte IgG-Lösung wurde an einer PD10-Saule (Pharmacia) entsalzt.

Die Bestimmung der Reaktivität dieser Antikörper gegenüber den S-verwandten Proteinen im Immunblot erfolgte gemäß Beispiel 17 durch Zugabe von biotinyliertem Esel-Antikaninchen-Immunglobulin, Streptavidin-biotinylierter Meerrett'chperoxidase und H₂O₂ und 4-Chloro-naphthalin-i-ol.

Proteine aus teilweise gereinigten Präparationen der Partikel, die auf pRIT 12660 zurückzuführen sind (Beispiel 16) wurden durch SDS-Pclyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und gemäß Beispiel 15 auf Nitrocellulose transferiert. Auf dem Gel wurden auch die S-Protein (p23) Partikel aufgetragen, die aus Hefen gereinigt wurden, welche pRIT 12363 enthalten. Der Immunblot zeigte, daß die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (33kd- und 30kd-Bande) mit den Antipeptid-Antikörper reagieren, während die zwei kleinsten (28kd- und 25kd-Bande) keine Reaktion zeigten. Das S-Protein (p23) zeigt keine Reaktion mit dem Antipeptid-Antikörper.

Beispiel 19

Human Anti-Hepatitis B-Antikörper aus natürlich infizierten Personen, die ein Epitop oder mehrere Epitope auf 33kd und 30kd Pro S 2-S-Proteinen erkennen, die nicht auf dem S-Protein vorhanden sind

Die Reaktivität von vereinigtem Gammaglobulin aus Anti-Hepatitis B-positiven Patienten (Belgisches Rotes Kreuz, 100-150IU/ml Lot 85 A08) gegen die vier S-verwandten Proteine wurden mit dem in Beispiel 15 beschriebenen Immunblot-Verfahren getestet. Eine teilweire gereinigte Präparation (Beispiel 16) von Partikeln, die auf pRIT 12660 zurückzuführen sind, wurde durch SDS dissoziiert und die freigesetzten Proteine durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf ein Nitrocellulose-Filter wurde das Filter mit einer 10fachen Verdünnung des Anti-Hepatitis B-Gammaglobu'in in PBS mit 1 % Gelatine inkubiert. Die Antikörper-Bindung wurde gemäß Beispiel 15 durch die aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinyliertem Schaf-Antihuman-Immunglobulin (Amersham RPN1003,1/250 Verdünnung in PBS mit 1 % Gelatine), Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxydase und H₂O₂ und 4-Chloro-naphthalin-1-ol bestimmt. Die zwei größten S-verwandten Proteinbanden (33kd- und 30kd-Bande) reagieren mit den Human-Antikörpern, während die zwei kleinsten (28 kd- und 25kd-Bande) keine Reaktion zeigen. Das S-Protein (p23), das aus Partikeln von Hefezellen stammt, die pRIT 12363 enthalten, reagiert nicht mit diesen Human-Antikörpern. Diese Ergebnisse zeigen, daß Gammaglobulin, welches aus infizierten Personen erhalten wird, Epitope auf denaturierten und reduzierten Pre S2-S-Proteinen spezifisch erkennt, die auf denaturiertem reduziertem S-Protein nicht vorhanden sind. Es ist bekannt, daß die Epitope auf dem S-Protein, das aus Humanserum oder Hefe stammt, überwiegend gleich sind.

Beispiel 20 Die 33 kd Protein-Spezies, die eine Mannose enthaltende Oligasacarid-Struktur besitzt

Das Pre S2-S-Protein aus teilweise gereinigten Präparationen von Partikeln aus 10S44C cir° Zellen, die pRIT 12660 enthalten, wurde elektrophoretisch aufgetrennt und gemäß Beispiel 15 auf ein Nitrocellulose-Filter transferiert. Auf dem Gel wurden auch das S-Protein von gereinigten Partikeln aus Hefen, die pRIT 12363 enthalten sowie HBsAg-Partikel aus infiziertem Humanserum, die von Dr.W.H.Gerlich, Institut für medizinische Mikrobiologie, Universität Göttingen, erhalten wurden, aufgetragen. Eine Hälfte des Nitroceüulose-Filters wurde mit 50Mg/ml Concanavalin A (Calbiochem A grade) in 1OmM tris pH 7,5,15OmM Natriumchlorid, 1 mM CaCI₂,1 mM MnCI₂ und 0,05% Iiween 20 inkubiert und nachfolgend mit 30Mg/ml Meerrettichperoxidase (SigmaTyp Vl P8375) in 1OmM tris pH 7,5,15OmM NaCI und 0,05%Tween 20 und mit H₂O₂ und 4-Chloronaphthalin-1-ol gemäß Beispiel 15 inkubiert.

Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurde das Filter mit 1OmM Tris pH 7,5,15OmM Natriumchlorid und 0,05% Tween 20 (Hawkes, Anal. Biochem., 123 (1982), 143-146; Clegg.Anal. Biochem., 127 {1982], 389-394) gewa.chon. Die andere Hälfte des Nitrocellulose-Filters wurde mit dem monoklonalen Antikörper β inkubiert und gemäß Beispiel 15 behandelt. Die 33K Proteinbande reagiert mit dem Concanavalin A-Peroxidase-Reagens, während keine der 30kd-, 28kd- und 25 kd-Proteinbanden oder das S-Protein, das aus Zellen stammt, die pRIT 12363 enthalten, reagieren. In Gegenwart von 0,1 M Methylalpha-D-mannopyranosid wird die Bindung von Concanavalin A an das 33 K Protein verhindert.

Beispiel 21 Eine Oligosaccharid-Struktur, die N-glykosidisch an Asparagin gebunden ist Zellen, die pRIT 12660 oder pRIT 12377 (Beispiel 12) enthalten, wurden im Selektivmedium [YNB + 80pg/ml Histidin (DC5 cir°)

oder YNB (10 S44 C cir") | bis zu einer OD₍₂onm von 0,2 kultiviert. Tunicamycin (Calbiochem) wurde bis zu einer Endkonzentrationvon 10pg/ml zugegeben und die Kultur 30 Minuten bei 30^cC inkubiert. Dann wurden 20μΏ ^KS-Methionin (1 OOCCi/mMol) (New

England Nuclear) pro ml zugegeben und die Kulturen weitere 15 Minuten inkubiert. 2 ml der markierten Zellkultur, die entweder

mit Tunicamycin behandelt wurde oder unbehandelt bleibt, wurden in einer (Mikrofuge) zentrifugiert und die Zellen dann in 40 μΙ1 % SDS aufgenommen und durch 2minütiges heftiges Aufwirbeln in Gegenwart von 0,3g Glasperlen (Durchmesser 0,45 bis0,50mm) aufgeschlossen.

Die Immunpräzipitation wurde im wesentlichen nach dem von Julius et al., Cell, 36 (1984), 309-318, beschriebenen Verfahren

durchgeführt. Das Lysat wurde 3 Minuten bei 100'C gekocht, mit 0,5ml PBS, das 1 % Triton X100,0,5% Natriumdeoxycholat und0,1 % SDS enthält, verdünnt und 1 Minute erneut bei 100°C gekocht.

25μΙ einer 10%igen Suspension von vorgewaschenem Immunopräzipitatin (Formalin, fixierte Staph Α-Zellen, Bethesda

Research Laboratories) wurden zu dem gekochten Extrakt zugegeben und dieser dann 30 Minuten bei 0"C inkubiert. Die Mischung wurde durch Eminütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge gereinigt. Zu dem flüssigen Überstand wurden 2,5μΙ

des monoklonalen Antikörpers 6, der spezifisch für das S-Protein ist (vgl. Beispiel 15) zugegeben und die Mischung wurde1 Stunde bei O'C inkubiert. Weitere 25μΙ des Immunopräzipitins wurden dann zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten

bei 0°C inkubiert. Die Immunkomplexe wurden durch Zentrifugation (5 Minuten in einer Milchzentrifuge) gesammelt und mit

PBS, das 2M Harnstoff enthält, mit PBS, das 1 % 2-Mercaptoäthanol enthält, und mit PBS ohne Zusatz gewaschen. Die zuletzt

erhaltenen Sedimente wurden in Probenpuffer für die Elektrophorese gemäß Beispiel 15 resuspendiert.

Proben, die 10'cpm enthalten, wurden in einem 12,5%igen SDS-Polyacrylomidgel (vgl. Beispiel 15) elektrophoretisch

aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 40% Methanol, 10% Essigsäure, fixiert, für die Autoradiographie mit

Verstärkerlösung (Amersham) behandelt und unter vermindertem Druck auf einem Filterpapier getrocknet. Die Autoradiographie wurde erstellt, indem ein Kodak X-Omat S-FiIm auf die Gele aufgelegt wurde und diese dann bei -70°C

eingeschlossen wurden.

Diese Ergebnisse zeigten, daß Zellen, die pRIT 12860 enthalten, in Abwesenheit von Tunicamycin ein 33 kd-Protein

synthetisieren, während sie in Anwesenheit von Tunicamycin ein 30 kd-Protein synthetisieren. Beide Banden sind in denentsprechenden Proben der Zellen, die pRIT 12377 enthalten, nicht vorhanden.

Dieses Ergebnis zeigt, daß das in dem Hefestamm DC 5 cir" exprimierte 33 kd Pre S 2-S-Protein einen Oligosaccharid-Anteil trägt,

der N-glykosidisch an den Asparaginrest gebunden ist. Höchstwahrscheinlich ist nur eine Oligosaccharidkette an die 33 kd-Formdes Pre S2-S-Proteins gebunden, die nicht viel größer als eine Kernglykosylierung ist.

Beispiel 22 Oligosaccharid-Struktur, die einen hohen Anteil an Mannose enthält

Rohextrakte von Zellen, die pVIIT 12660 enthalten, oder teilweise gereinigte Partikel aus diesen Extrakten, die Pre S2-S enthalten (Beispiel 16), wurden mit Endo-N-Acetylglucosaminidase (Endo H; EC.3.2.1.96) eus Streptomyces plicatus (New England Nuclear) behandelt.

Teilweise gereinigte Partikel (50μΙ, 450 Mg/mI Protein) wurden 3 Minuten bei 100⁰C in Gegenwart von 0,1 % Natriumdodecylsulfat gekocht und dann 10fach mit 10OmM Natriumeitrat pH 5 verdünnt. Zu 240μΙ dieser Mischung wurden 2,4 μΙ Endo H (74Mg/ml) zugesetzt. Proben mit und ohne zugesetzter Endo H wurden 4 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die Analyse der Endo H-bahandelten und unbehandelten Proben durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Immunblot, in dem zur Bestimmung der monoklonale Antikörper β gegen das S-Protein, wie in Beispiel 15 beschrieben, verwendet wurde, zeigte das Verschwinden der 33kd-Bande und das Auftreten einer 31 kd-Bande nach Behandlung mit Endo H. Die 31 kd-Bande reagiert nach wie vor mit dem Concanavalin A-Peroxidase-Reagentien, wie vorstehend beschrieben. Die anderen Banden (30 kd, 28 kd und 25kd) wurden durch Endo Η-Behandlung nicht beeinflußt. Längere Inkubationen oder höhere Endo Η-Konzentrationen ergaben identische Ergebnisse. Das Ergebnis zeigt, daß die Oligosaccharid-Struktur, die an das 33kd-Protein gebunden ist, einen hohen Anteil Mannose enthält und etwa die Größe einer Kernglykosylierung besitzt.

Beispiel 23 Reinigung von Partikeln, die das Pre S2-S-Protein enthalten Rohoxtrakte von Hefezellen, die Pre S2-S-Partikel enthalten, wurden hergestellt, indem die gewaschenen Hefezsllen in einem

„Dynomill" in Gegenwart eines gleichen Gewichtes an Extraktionspuffer, der entweder 5OmM Natriumphosphat pH 8,1,4 mM

EDTA, 1,0% Tween 20,4mM PMSF und 10% Isopropanol enthält oder 20OmM Tris-HCI pH 9,0,3,OM NaCI, 1OmM EDTA, 1OmM EGTA (Athylenglykol-bis-oeta-aminoäthyläther-N,N,N',N'-tetraessigsäure), 1 % Tween 20,4mM PMSF und 10% Isopropanol

enthält, zerrieben.

Die homogene Suspension wird auf den pH 8,0 oder 9,0 eingestellt und nachfolgend 45 Minuten bei 30000g zentrifugiert.

500ml des Rohhefezeilextraktes, eingestellt auf pH 7,2, werden mit 10g kolloidalem Kieselgel (Aerosil 380 Degussa) versetzt. Diekolloidale Suspension wird Ober Nacht bei 4'C gerührt und anschließend mit niedriger Geschwindigkeit abzentrifugiert. Das

Sediment wird dreimal mit 150ml 0,15m NaCI jeweils 15 Minuten gewaschen und dann rhargenweise mit 250ml 10M Pyrophosphatpuffer (pH 9,3), der 2% Tereen-20 enthält, 3 Stunden bei 37⁰C eluiert. Das Eluat, eine gelblich, leicht schillernde Lösung, wird über eine 50ml Säule aus Phenylboronat-Agarose (Amicon), die in 1OmM Pyrophosphatpuffer p!! 9 äquilibriert

wurde, gegeben. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 15ml/Std.

Die Säule wird ferner mit 2 Säulenvolumen des Äquilibrierungspuffers gewaschen und dann in umgekehrter Richtung mit

10OmM Sorbit in 5OmM Tris (pH 7,2) mit einer Fließgeschwindigkeit von 15ml/Std. eluiert. Eluierte Fiaktionen des Peaks wurdenvereinigt und nach dem Einstellen des pH auf 8,1 über eine (DEAE-Fractogel) TSK-Säule, die in 5OmM Tris pH 8,1 äquilibriertwurde, gegeben. Partikel werden in dem gleichen Puffer, der 75mM NaCI enthält, eluiert. Nach diesem Schritt werden restliche

Nucleinsäuren entfernt (< 1 pg/20pg Protein). Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Zwel-Stufen-Relnigung von Pr* S2-S-*ntheltenden Partikeln

	ml	mg S-verwandtes	mg	mg	mg
	500	Protein	Protein	Lipide	Poly
Fraktion		(RIA)	.14.600	5.286	saccharide
Rohextrakt	270	11.3			7.850
Eluat			385	554
(Aerosil)	315	5.96			249
Durchfluß			365	360
PBA-SSuIo	70	2.83·			267
Eluat		2.9	5
PBA-Säule	2.8		2.5

' nicht auiralehcnd glykoiyll«rt, um «n dar Siul« f«ttg«htlten iu w«fd«n

Material, das aus Zellen, die pRIT 12660 enthalten, gemäß Beispiel 23 gereinigt wurde und das ferner durch eine Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation gereinigt wurde, wurde nach Anfärben mit Uranylacetat elektronenmikroskopisch untersucht. Die Untersuchung zeigte einzelne Partikelstrukturen mit einem Durchmesser von etwa 19 Mikrometer und ferner, daß solche hybriden Partikel zwischen 5 bis 20 μς Tween 20 pro 100μg Protein enthielten.

Beispiel 24

Affinitätschromatographie an Linsensepharose

In diesem Beispiel wird die Chromatographie an Phenylboronat-Agarose durch die Affinitätschromatographie an Linsen-Sepharose (Pharmacia) ersetzt.

50ml des gemäß Beispiel 28 erhaltenen Aerosil-Eluats wurden auf eine 5-ml-Säule aus Linsen-Sepharose gegeben, die in einem Äquilibrierungepuffer, der 1OmM Tris (pH 7,2), 0,14 M NaCI und 0,3% Tween enthält, äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit

2 Säulenvolumen eines Äquilibrlerungspuffers, der 1OmM Tris (pH 7,2) enthält, gewaschen und dann mit diesem Äquilibriarungspuffer, der zusätzlich einen Zucker enthält, eluiert. Der verwendete Zucker besitzt eine Spezifität für Linsen und ist beispielsweise 0,SM alpha-Methylmannopyranosid. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt.

Tab·«· IV

Anwendung von Llnsen-Sepherose-AfflnltaUchromatogrephle zur Reinigung von Pro S2-S-enthaltenden Partikeln

	Volumen	pg S-verwandtes	Gesamt-
Fraktion	(ml)	Protein (RIA)	Protein
Rohextrakt	100	2170	3gr
Eluat(Aerosil)	SO	1700	138 mg
Durchfluß	50	428	_
Linsen-Sepharose
Eluat	12.5	925	1,26mg
Linsen-Sepharose

Die Untersuchung ergab, daß die wie beschrieben gereinigten hybriden Partikel 5 bis 50pg Tween 20 pro 100Mg Protein enthielten.

Beispiel 25

ImmunogenitSt des Pre S2-S-Partikels

Die ImmunogenitSt von Partikeln, die aus Extrakten von Zellen isoliert wurden, die pRIT 12660 (Beispiel 11) enthalten, wurde an 2 Mäusestämmen untersucht: Balb/c (H₂d) und NMR 1 (H₂Q). Vor der Injektion wurde den Partikeln AI(OH)₃ zugesetzt. Die Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden mit 0,3pg des RIA-reaktiven Materials intraperitoneal gespritzt. Einen Monat nach der Immunisierung wurden die Mäuse ausgeblutet und die Seren von Mäusen der gleichen Gruppe vereinigt. Der Titer der Anti-S-Antikörper der vereinigten Seren wurde mit dem AUSAB-Kit (Abbott Lcbs) und dem WHO-Standard bestimmt. Die Titer wurden in mlU/ml nach der Hollinger-Formel (Hollinger et al., in Szmuness et al.. Viral Hepatitis, Philadelphia: Franklin Institute Press, 1982,461-466) umgerechnet. Die Antl-Pre S 2-Antikörper wurden in einem Festphasen-Test (RIA) bestimmt, in dem das synthetische Pre S 2-Peptid aus Beispiel 18 an einem Kunstharz fixiert ist und die gebundenen Antikörper durch ein Ziegen-Anti-Mausimmunglobulln IgG, das mit Jod^IM markiert ist, bestimmt werden. Die in Tabelle VIII zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß die Partikel aus Zellen, die pRIT 12660 enthalten, in beiden Mäusestämmen Antikörper gegen das Anti-S- und Anti-Pre S2-Peptid induzieren. In dem Mausstnmm NMR 1 wird ein höherer Antikörpertiter gegen das Anti-Pre S2-Peptid induziert als in dem Stamm Balb/c. Der Anti-S-Titer, der in den Stämmen Balb/c oder NMR 1 erhalten wird, ist 2- bis 3mal höher als jener Titer, der durch eine höhere Dosis von Partikeln ohne Pro S 2-Sequenz aus Zellen erhalten wird, die pRIT 12363 enthalten.

Pre S-Determinsnten verstärken die Antwort auf S-Determinanten. Dieser Verstärkungseffekt ist nicht erkennbar, wenn das Pre S 2-synthetische Peptid zusammen mit Partikeln, denen die Pro S 2-Sequenz fehlt, injiziert wird. Überdies ist das synthetische Pre S2-Peptid allein nicht in der Lage, Anti-Pre S2-Antikörper hervorzurufen.

Dies zeigt, daß die Verknüpfung von Pre S2-Determinanten und S-Determinanten auf dem gleichen Partikel notwendig ist, um eine Anti-Pre S2-Antwort zu erhalten. Darüber hinaus führt diese Verknüpfung zu einer verbesserten Anti-S-Antwort.

Die Ergebnisse der Immunogenitäts-Untersuchungen, die das Pro S 2-S-Partikel betreffen, sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V Immunogenltät des Pre S2-S Partikel*

Injizierte	Dosis von S-ver-	Anti-S	Titer von	Antikörper	Anti-PreS2	NMR1
Präparation	wandtem Antigen	(mlU/ml) *	(2)	Antikörper (3)	2
	(Mg)(D	Balb/c	NMR1
		1404	719	Balb/c
Aus Hefe erhaltenes	1,7			0
S-Partrkel.dasauf					4
pRIT 12363
zurückzuführen ist		748	1163
Aus Hefe erhaltenes	1.55			0
S-Partikel, das auf
pRIT 12363 und das
synthetische
Pre S 2-Peptid					4
zurückzuführen ist
0,08Mg		2	1
Synthetisches	-			0	120
PreS2-Peptid:
0,08Mg		3344	2418
Aus Hefe erhaltenes	0,3			8
(Pre S 2-S) Partikel,
das auf pRIT 12660
zurückzuführen Ist

1 bestimmt mit dem AUSRIA-KIt (Abbott Lab») und dem .Proposed International Reference Preparation" von Dr. Schild, National Institute of Biological Standardization, London.

2 bestimmt mit dem AUSAB-KIt (Abbott Labs) und dem WHO-Standard

3 bestimmt mit einem Festphtsenradlolmmun-Test und dem an einem Kunsthan fixierten synthetischen Pro S 2-Peptid.

Der Titer hat die Verdünnung, die zu einer eindeutigen Bindung des Antikörpers führt (2,5mal stärket' als das negative Kontrollserum).

Beispiel« f Or dl· Expr··-! in der gesamten Pr* S1 · Pr* S 2-S-pt oteincodlerenden Sequenz In Hefe Beispiel 26 Konstruktion des i'lssmlds pRIT 12845, das in Hefe das Pre S1- Pre S2-S-Protein exprimiert

Im ersten Schritt wurde die TDH 3-Promotorrerjlon mit der Pre S1 -N-terminalen Region aus dem HBV-Genom fusioniert. Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pRIT 12792, das ein 495bp großes Ncol-Xbal-Fragment besitzt, das, die Pre S1 - Pre S2-S-codierende Sequenz mit Ausnahme des letzten Asparaglncodons enthält. Die Ncol-Stelle überlappt das ATG-Codon des Aminosäurerestes an der Stelle -163 der HBV-rre S1 -Sequenz. Die Sequenz des Ncol-Xbal-Fragmentes Ist in Fig.4A gezeigt. Ein im wesentlichen ähnliches Plasmid zu pRIT 12792 ist pRIT 12793 (5940bp), das bei der American Type Cultur Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 5.Sept. 1986 unter ATCC 67193 hinterlegt wurde. Aus dem Plasmid pRIT 12793 kann ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragment erhalten werden, das die vollständige Pre S1 - Pre S 2-codierende Sequenz enthält. Dieses Fragment, das at η 3'-Ende die Sequer.z ACGAACTAATAATCTAGA besitzt, unterscheidet sich von jenem in Fig.4 A gezeigten durch ein einziges Nucleotid. Dieses Nucleotid ist unterstrichen. In den folgenden Beispielen kann pRIT 12792 durch pRIT 12793 ersetzt werden. Die Ncol-Xbal-Fragmente, die in pRIT 12792 und pRIT 12793 enthalten sind, wurden durch In-vitro-Manipulation der Pre S1- Pre S2-DNA-Region des Hepatitis B-Vtrusstammes (Serotyp adw), dessen DNA in pRIT 10610 Moniert ist, erhalten. Das Plasmid pRIT 10616 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC 39131 erhältlich. 52Mg von pRIT 12792 wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und Xbal gespalten und mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt, um die 5'-überetehenden Enden zu entfernen. 600ng (2pMol) des behandelten und gereinigten 495bp großen Ncol-Xbal-Fragmentes wurden mit 170ng (0,02 pMol) des Vektors pRIT 12314 ligiert. pRIT 12314 war mit den Restriktionsenzymen BamHI und Smal geöffnet worden und ebenfalls mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelt worden. pRIT 12314 enthält das vollständige 2 Mikron DNA-Fragment von S. cerevisiae und eine Expressionseinheit, in der der TDH 3-Promotor durch einen BamHI-Smal-EcoRI-Llnker von der arg'-Terminationsreglon getrennt Ist.

BamHI EcoRI Smal

ATGGATCCCCGGGAATTC ....

Promotor TDH- Terminationsregion ARG^

Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von pRIT 12314 ist In Beispiel 10 zu finden. Die vorstehend beschriebene Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coil, Stamm MM 294, verwendet. Es wurde sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Sechs Transformanten, die ein Plasmid enthalten, In dem das Pre S1- Pre S 2-Fragment in richtiger Orientierung inseriert ist, wurden erhalten. Die Plasmide dieser Transformanten sind pRIT 12843 (a...f) (Fig. 18).

Der zweite Schritt war die Inserierung der S-codierenden Region in jedes der Plasmide pRIT 12843 (a... 0, um das vollständige Pre S1 -S 2-S-Gen zu erhalten

Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Die Plasmide pRIT 12843 (a... f) wurden jeweils mit den Enzymen BamHI und Sail geschnitten. Die BamHI-Stelle liegt am Beginn der Pre S2-Region, wahrend die Sall-Stelle hinter der arg*-Terminationsregion in der pBR 327 DNA liegt. 80ng(0,012pMol) des grüßten BamHI-Sall-Fragments (10400 bp), das aus jedem PlasmidpRIT 12843 (a...f) isoliert wurde, wurden mit 300 ng (0,11 pMol) des kleinen BamHI-Sall-Fragmentes von pRIT 12660 (Beispiel 11) ligiert. Das kleine (4 800 bp) BamHI-Sall-Fragment von pRIT 12660 enthalt einen Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz, die ARG-Terminationssequenzen und die LEU 2-Hefesequenz. Nach legierung und Transformation von E. coli, Stamm MM 294, mit jedem der Plasmide pRIT 12843 (a...f) gemäß Cohen et al., a.a.O., wurden eine Reihe ampicillinresistenter Klone erhalten, die die bezeichneten Plasmide pRIT 12845 (a... f) tragen. Fig. 18 zeigt die Herstellung von pRIT 12845 (a... f). Diese Plasmide wurden verwendet, um einzeln den Saccharomycescerevlsiae Stamm 10S44Ccir° gemSß Ito et al. zu transformieren. Kulturen von einzelnen transformierten Klonen wurden mit dem AUSRIA-Test (Abbott) getestet. Rohzellextrakte aus aufgeschlossenen Hefezellen wurden in PBS, das 0,5% Tween 20,2 mM PMSF und 5% Isopropanol enthält, resuspendiert. Aus jeder der sechs getrennten Transformationen (mit pRIT 12845 [a...f]) wurde eine Transformante ausgewählt und getestet. Fünf der sechs getesteten Transformanten ergaben einen positiven AUSRIA-Test.

Zur Feststellung, ob ein Protein, das im AUSRIA-Test eine S-verwandte Antigenität zeigte, die vollständige Größe hat, wurden Proben der oben beschriebenen Rohzellextrakte im Immunblot, wie in Beispiel 20 beschrieben, untersucht. Vier der fünf im AUSRIA-Test positiven Transformanten zeigten ein S-verwandtes Protein von etwa 39 K. Eine Transformante (Extrakt a) zeigte ein S-verwandtes Protein von 23 K. Das für die Expression des 39 K Proteins im Extrakt (e) verantwortliche Plasmid wird pRIT 12845 genannt; vgl. Fig. 18.

Beispiel 27 Partikel, die aus dem Pre S1 - Pre S 2-S-Protein zusammengesetzt sind und die einen Rezeptor für polymerisiertes Human- Serumalbumln und ein Pre S1 -Epitop auf ihrer Oberfläche tragen Rohextrakte aus Zellen des Stammes 10S44Ccir*, die entweder pRIT 12845, pRIT 12660 oder pRIT 12377 enthalten und Rohextrakte aus Zellen des Stammes DC5cir°, die pRIT 12363 enthalten, wurden gemäß Beispiel 14 hergestellt. Die Bestimmung der Protein-Gesamtkonzentration, der HBsAg-verwandten Antigenität und die Bestimmung eines Rezeptors für

polymerisiertes Humanserumalbumin wurden gemäß Beispie! 14 durchgeführt. Das Ergebnis zeigte eine starke

Bindungsaktivität für polymerisiertes Humanserumalbumin in Extrakten des Stammes 10S44Ccir°, die pRIT 12843 oder

pRIT 12660 (vgl. auch Beispiel 12) enthalten, dagegen keine Bindungsaktivität in Extrakten des Stammes 10S44Ccir°, diepRIT 12377 enthalten oder des Stammes DC 5cir*, die pRIT 12363 enthalten.

Das Cäsiumchlorid-Gleichgewichtszentrifugation von Rohextrakten aus Zellen des Stammes 10S44Ccir°, die pRIT 12845

(Beispiel 26) enthalten und die im AUSRIA-Test für einzelne Cäsiumchlorid-Fraktionen bestimmte HBsAg-verwandte Antigenitiitergaben für das Antigen eine Bande mit einer Schwimmdichte von etwa 1,2 g/cm¹. Dies wurdo durch die Immunblot-Analyse der

Cäsiumchlorid-Fraktionen bestätigt. Die Pro S1 -Antikörper-Bindungsaktivität in den Cäsiumchlorid-Fraktionen wurde mit einem ELISA-KIt (Enzygnost-HBsAg Mikro, Behrlngwerke, Marburg), untersucht. Geeignete Verdünnungen von Proben, die getestet

werden sollen (in PBS, das 0,2% BSA enthält), konnten über Nacht an die Anti-HBsAg-Festphase (Enzygnost Kit) binden.

Das gebundene Antigen wurde mit dem monoklonalen Antikörper MA18/7 (Beispiel 31) inkubiert, der dann durch biotinyliertern Meerrettichperoxidase-Komplex und Chromogen gemäß Beispiel 15 bestimmt wurde. Es wurde gefunden, daß die Pro S1-spezifische Antikörper-Bindungsaktivität und die HBsAg-verwandte Antigenität in dem Cäsiumchloridgradienten in gleicher Höhe laufen. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Pre S1 - Pre S2-S-Protein, das in Zellen des Stammes 10S44Ccir* produziert wird, die pRIT 12845 enthalten, in Partikel eingebaut wird, die ähnlich den 22 nm großen HBsAg-Partikeln aus dem Serum sind. Die Partikel zeigen auf ihrer Oberfläche Pre S1 -spezifische Sequenzen und einen Rezeptor

für polymerisiertes Humanserumalbumin. Aus der Höhe der Aktivität des Partikels im AUSRIA-Test und der Intensität der

Reaktion des Pre S1 Pre S 2-S-Proteins in einer Immunblot-Analyse, kann geschlossen werden, daß die S-Determinanten des Partikels durch die Pre S-Sequenzen In diesem Partikel teilweise blockiert oder defoi miert werden. Beispiel 28 Zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 38 und 45kd, die beide Pre S1 -, Pre S> 2- und S-Epitope tragen und die in Hefe

exprimiert werden, die pRIT 12845 enthält.

HBsAg-verwandte Proteinmonomere, die in Zellen exprimiert werden, welche pRIT 12845 enthalten, wurden, wie in Beispiel 20

beschrieben, analysiert.

Die Wanderung und Immunreaktivität von zellulären Proteinen wurden mit Proteinen aus HBsAg-Partikeln (Serotyp ad), die aus

menschlichem Serum gereinigt wurden (erhalten von Dr. W.H. Gerlich, Institut für medizinische Mikrobiologie, Universität

Göttingon) verglichen. Drei Immunreagentien wurden zur Analyse der Proteine verwendet:

- der monoklonal Antikörper, der ein S-Editop erkennt (erhalten von H.Thomas - Beispiel 15)

- ein polyvalentes Kaninchen-Antiserum gegen das synthetische Pro S 2-Peptid (beschrieben in Beispiel 18)

- der monoklonal« Antikörper MA18/7, der spezifisch für ein Pro S 1-Epitop ist; vgl. Heermanetal., J. Virol., C !1984), 396-402. Der Immunblot zeigte unter den zellulären Proteinen aus den Zellen des Stammes 10S44C, die pRIT 12845 enthalten, die Anwesenheit von zwei Proteinen, die spezifisch mit allen drei vorstehend beschriebenen Immunreagentien reagieren. Das Molekulargewicht dieser zwei Proteine wurde auf 38 und 45kd geschätzt. Die Molekulargewichtsbestimmung der Proteine basierte auf der Wanderung des aus dem 3«rjm stammenden HBsAg, wie von Heerman et al., J. Virol., 52 (1984), 396-402, deliniert. Das 38 kd große Pre S1 Pre S 2-S-Pi Mein, das durch pRIT 12845 codiert ist, wandert etwas schneller als das ρ 39 Pre S1 -Pre S2-S-Protein, das aus HBsAg-Partikeln st immt. Das p39-Protein von Partikeln des Serotyps ad aus menschlichem Serum hat vermutlich eine Pro S1 -Region von 119 Aminosäuren {Heerman et al., J. Virol. 52,396-402,1984). pRIT 12845 codiert für eine Pre S1 -Region von 108 Aminosäuren.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Hefezellen, die pRIT 12845 enthalten, zwei Proteine mit etwa 38 und 45kd exprimieren, die Pre S1, Pie S2 und S-Epitope tragen.

Beispiel 29 Die 45kd Pre S1- Pre S 2- Pre S2-S-Protein-Spezies, die eine N-glykosidisch gebundene Oligosaccharidkette mit einr.m h ;ien Anteil Mannose enthält Zellen, die pRIT 12845 enthalten, wurden mit einem gleichen Gewicht an Glasperlen (Durchmesser 0,45 bis 0,55 mm) in einem

mit gleichem Gewicht vorhandenen 1OmM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), der 2 % SDS und 8 mM EDTA enthält, durch starkes

Aufwirbeln mit einem (Vortex)-Mixer aufgeschlossen. Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand 4 Minuten bei 100°C gekocht.

10μΙ des gekochten flüssigen Überstandes wurden mit 40μΙ 25mM Natriumeitratpuffer (pH 5,0) und 2μΙ EndoH (74Mg/ml) (vgl.

Beispiel 22) versetzt. Proben mit und ohne zugesetzter EndoH wurden 2Vj Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die EndoH-behandelten und unbehandelten Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Immunblot

gemäß Beispiel 15 analysiert. Der Blot wurde mit den monoklonal«η Antikörpern β (S-spezifisch) und MA18/7 (Pre S1 -spezifisch)(vgl. Beispiel 28) analysiert.

Der Immunblot zeigte mit beiden monoklonalen Antikörpern das Verschwinden der 45kd Bande und das Auftreten einer 41 kd Bande nach EndoH-Behandlung. Das Wandern der 38 kd Bande wurde durch die EndoH-Behandlung nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die 45 kd Pre S1- Pre S2-S-Protein-Spezies eine N-glykosidisch gebundene Oligosaccharidkette

trügt, die einen hoher Mannoseanteil enthält.

Beispiel 30 Das 38kd Pre S1- Pre S2-S-Protein, das Myristinsäure Cber eine Amidbindung kovaient gebunden enthält Zellen des Hefestammes 10S44Ccir°, die entweder pRIT 12845, pRIT 12660 oder pRIT 12377 enthalten, wurden in YNB bis zu

einer optischen Dichte «_Nnn) von 0,4 kultiviert.

Zellen (20ml Kultur) wurden 60 Minuten mit 1 mCi 3H-markierter Myristins^ire (New England Nuclear) markiert und dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden mit kaltem Wasser gewaschen, in 100 μΙ 5 mM Tris-HCL (pH 7,4), das 3 mM (DTT),

1 % SDS und 1 mM PMSF enthält, resuspendiert und mit 100mg Glasperlen durch 6maliges, jeweils 30 Sekunden dauerndes

Aufwirbeln auf einem Vortex aufgebrochen, wobei zwischen den einzelnen Aufwirbelungsschritten mit Eis geküh 't wur de. Zelltrümmer wurden durch 1 minutige Zentrifugation In einer Eppendorff 5414-Zentrifuge (Towler und Glaser, Pro:. Nat. Acad., Sei., 83 [1986], 2812-2816) entfernt. 20,11 des Extraktes wurden 3Vz Stunden bei Raumtemperatur mit 7μΙ einer 'rioch

hergestellten Lösung aus 4M Hydroxylamin, 2OmM Glycin pH 10 behandelt.

Hydroxylaminbehandelte und -unbehandelte Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und

durch nachfolgende Autoradiographie gemäß Beispiel 21 dargestellt. Die Hydroxylamin unbehandelten Proben wurdenebenfalls einer Immunblot-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper gegen ein S-Epitop gemäß Beispiel 15 unterzog&n.

Der Immunblot zeigte Ergebnisse, die identisch mit jenen von Beispiel 15 und 28 sind. Die Autoradiographie zeigte eine markierte Bande von 38 kd nur in den Exakten aus Zellen, die pRIT 12845 enthalten. Die Bande war hydroxylaminstabil. Dies zeigt an, daß

der 3H-markierte Myristinsäureester Ober eine Amidbindung vorliegt. Keine markierten Banden, die spezifisch für die Extraktevon Zellen sind, die pRIT 12660 enthalten, wurden bestimmt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das 38 kd Pre S1 - Pre S 2-S-Protein eine über eine Amidbindung kovaient gebundene Myristinsäure

enthält. Im allgemeinen wird Myristinsäureester kovaient an Proteine Ober eine Amidbindung an ein aminoterminales Glycingebunden. Dies deutet darauf hin, daß der Rest Met am N-Terminus des Pre S1- Pre S2-S-Proteins entfernt wurde und daß der

Rest GIy an der Position 2 für die Acylierung mit Myristinsäure verfügbar wurde. Beispiel 31 Verwendung von Pro S1-Vektoren zur Insertion von funktioneilen DNA-Sequenzen Das Ausgangematerial ist das in Beispiel 26 beschriebene Plasmid pRIT 12793. Das Plasmid enthält die Pre S1 - Pre S 2-codierende Sequenz auf einem 485 bp großen Ncol-Xbal-Fragment. Das Plasmid pRIT 12793 wird mit der Restriktionsendonuclease Nc-jI

gespalten, mit T4 DNA-Polymerase zum Auffüllen der überhängenden Einzelstränge behandelt und mit Xbal Endonucleasenachgeschnitten. Das so behandelte Ncol-Xbal-Frcgment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroeluticngereinigt und in den Vektor p'JC 12 inseriert, der mit den Endonucleasen Smal und Xbal gospalten war. Der KlonierungsvektorpuC 12 ist erhältlich bei Ameroham (Little Chalfont, Bucks, United Kingdom) und Pharmacia (Piscataway, NJ). Das Plasmid pRITXwird gemäß Fig.5B erhalten. In der Pre S1- Pre S2-Region des Plasmids pRITX überlappt die einzige Ncol-Stelle das ATG-

Startcodon der Pro S1 -Region. Eine Xbal-Stelle ist direkt daneben und downstream des TAA-Stopcodons am C-Terminus der Pre S 2-codierenden Sequenz vorhanden. Die einzige BstX-Restriktionsstelle ist nahe des N-termlnalen Endes der Pre S1 -

codierenden Region.

Dem Fachmann ist bekennt, daß der Vektor pRITX oder ähnliche derivalisierte Vektoren, dio die Pre S1 -S 2-Sequenzen enthalten,

zur Inserierung an der BstXI-Stelle von weiteren funktioneilen DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren,verwendet werden können, um diese Sequenzen in Ablesephase mit der Pro S1 -Region zu fusionieren.

Darüber hinaus können funktioneile DNA-Sequenzen nach der Doppelverdauung von pRITX und Derivaten mit BstX und BamHI

oder EcoRI und Pstl und der Entfernung des größeren Teils der Pro S1 -codier/ ,iden Region und des N-terminalen Teils der Pre

S 2-Sequenz zwischen die entsprechenden Restriktionsstellen eingeführt werden. Solche Fusionen werden vom Typ Pie S1 -

eingeführte funktioneile DNA-Pre S2-Sequenzen sein. Sind einmal solche Fusionen gemacht, können sie in andere Plasmideeinrekombiniert werden, die den Rest der Pro S1 · Pre S 2-Sequenzen und jene Sequenzen enthalten, die für die Stabil! ät und

Replikation in E. coli und Saccharomyces cerevisiae (vgl. Beispiel 12) notwendig sind. Beispiel 32 Impfstoffherstellung Ein ImpfstoP wird folgendermcßen hergestellt: zu einer gepufferten wäßrigen Lösung von 3% Aluminiumhydroxid (1OmM Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 6,8; sterilisiert durch Filtration) werden erfindungsgemäß hergestellte Partikel in gleichem Puffer unter Rühren bis zu einer Endkonzentration des Polypeptide von 100pg/ml und des Aluminiums (Al¹*) von 0,5 mg/ml

zugegeben. Der pH wird auf 6,8 gehalten. Die Mischung wird über Nacht bei O'C stehengelassen. Thimersol wird bis zn einer

Endkonzentration von 0,005% zugegeben. Der pH wird überprüft und, wenn nötig, wieder auf 6,8 eingestellt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines HBV-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man ein HBV-Gen, das für das entsprechende Oberflächenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3'-Ende mindestens eines Teils der PreS2-Region des HBV-Genoms ligiert, woboi dieser Teil so groß ist, daß er für ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekül an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekül in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium züchtet, aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das rekombinante Oberflächenprotein bzw. das Hybridpartikel isoliert und mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.

-2- 285

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des rekombinanten HBV-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels entweder die PreS2-, PreSi- oder dio gesamte PreSi-PreS2-DNA-Sequenz verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionskontrollsequenz der TDH3-Promotor verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eukaryontischer Wirt eine Hefezelle verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Gattung Saccharomyces verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Art Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche des Stammes DC5, DC5cir°, 10S44Coder 10S44Ccir° verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PreSi-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Aaη Pro He Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA' GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg GIn Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PreS2-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

Thr

-55 -50 or

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Äla-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-

-20
Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-

-10
Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn

Ί0. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PreS1-PreS2-DNA-Sequenz verwendet, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

PreS1-Region

ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met GIy Thr Asn Leu Ser VaI Pro Asn Pro Leu

GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GIy Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro

GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT AIa Phe GIy AIa Asn Ser Asn Asn Pro Asp

TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro lie Lys Asp His Trp

CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin VaI GIy VaI GIy AIa

TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe GIy Pro GIy Leu Thr Pro Pro His GIy

GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GIy He Leu GIy Trp Ser Pro Gin Ala GIn

GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT GIy He Leu Thr Thr VaI Ser Thr He Pro

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro AIa Ser Thr Asn Arg Gin Ser GIy

AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Fro Thr Pro He Ser Pro Pro' Leu

AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin AIa

PreS2-Region

ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin

GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg VaI Arg GIy Leu

TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala GIy GIy Ser Ser Ser GIy