DD286815A5

DD286815A5 - Verfahren zur fermentationstechnischen gewinnung pektinolytischer enzyme unter verwendung traegerfixierter kulturen von aspergillus niger

Info

Publication number: DD286815A5
Application number: DD33140089A
Authority: DD
Inventors: Rainer Radosta; Dieter Koerner; Andreas Musche; Erhard Holbe
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1989-08-02
Publication date: 1991-02-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentationstechnischen Gewinnung pektinolytischer Enzyme unter Verwendung traegerfixierter Kulturen von A. niger. Sie ist geeignet, die im Aufarbeitungsprozesz der enzymhaltigen Kulturloesungen anfallenden Ultrafiltrations-Permeate erneut als Naehrloesungen im Fermentationsprozesz einzusetzen. Dadurch koennen Naehrstoffkomponenten eingespart werden, und der Anfall an organisch und anorganisch belastetem Abwasser reduziert sich erheblich. Erfindungsgemaesz werden die bei der Reinigung und Konzentrierung pektinasehaltiger Kulturloesungen als Abwasser anfallende Permeate der Ultrafiltrationsstufe mit Naehrstoffen ergaenzt, sterilisiert und fuer weitere Fermentationen wieder in den Reaktor eingefuellt. Auf diese Weise lassen sich sowohl Neuansaetze traegerfixierter Kulturen als auch mehrere Ansaetze innerhalb von Fermentationszyklen durchfuehren.{Kultivation; Mikroorganismen; Schimmelpilz; Traegerfixierung; Enzymgewinnung; Naehrmedium; Ultrafiltrations-Permeat; Rohrreaktor; Pektinasen; Substratausnutzung; Abwasserreduzierung; Substratwiederverwendung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentationstechnischen Gewinnung pektinolytischer Enzymo unter Verwendung trägerfixierter Kulturen von Aspergillus niger, bei dem die während der Aufarbeitung der Kulturmedien anfallenden nährstoffiialtigen Abprodukte erneut im Fermentationsprozeß eingesetzt warden.

Charakteristik des bekannten Standee der Technik

Vorfahren zur submersen Gewinnung pektinolytischer Enzymgemirche mittels trägerfixierter Schimmelpilzkultur6n sind bekannt. Sie beruhen auf dem Prinzip der Erzeugung kompakter Biomassestrukturen, die gegenüber diffusen Wuchsformen im herkömmlichen Hührferrnentor oine wesentlich größere Enzymbildungsleistung besitzen. So wird von F. BAUM et al. (DWP 145027) eine Form der Kultivation für A. niger vorgeschlagen, bei der eine auf dar Medienoberfläche angewachsene Myceldecke durch Erhöhung des Medienstandes im Fermentor unter einer perforierten Plane fixiert wird. Ch. WARDSACK et al. (DD-PS 235310) verdichten diffus angezogenes Mycel von A. niger in einem durchlässigen Behälter und erreichen auf diese Wc !so hohe Ausbeuten an pektinolytischen Enzymen. Nach D. KÖRNER et al. (DD-WP 251999 A1) erzeugt man kompakte BiomassesUukt'jroM von A. niger auf flächenförmigcn Trägern, die in einem Reaktorrohr vom Nährmedium umströmt werden. Spezielle Trägersysteme für diese Art dor Kultivierung werden von E. HOLBE et al. (DD-WP 258998 A1) vorgeschlagen. Mit der Steigerung der Enzymnusbeute durch die Wahl dor Fermentationsparamoter befassen sich E. MAREK ot al. (DD-WP 251994 A1). Bei den genannten Fermentationsprinzipien wird als Kohlenstoffquelle im Nährmedium Glucose oder Saccharose in Konzentrationen von 5 bis 8% verwendet. Wio bei KÖRNER et al. (DD-WP 251999 A1) beschrieben, worden die enzymhaltigen Nährlösungen im Aufarboitungsprozeß zur Konzentrierung und Reinigung einer Ultra- und Diafiltration unterzogen, bei der mehr als 90% der geerntoton Substratmenge als Abfallprodukt für die Entsorgung anfallen. Nachteilig ist bei dieser Verfahrensweise, daß dio hohen Anfangskonzentrationen der Zucker für eine effektive Enzymsynthese zwar notwendig sind, daß aber davon und auch von den übrigen Substratbestandteilen am Endo der Kultivation noch beträchtliche Anteile vorliegen. Dieso werden bei der Ultrafiltration abgetrenn' und gehen ungenutzt mit dem Abwasser verloren. Nachteilig sind ferner der hohe Wasserverbrauch und die dementsprechend großen Aufwendungen für die Entsorgung der mit den restlichen Nährstoffen organisch und anorganisch stark belasteten Abwässer. Insgesamt wird dadu/ch die Ökonomie der Verfahren ungünstig beeinflußt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren für die trägerfixierte submerse Gewinnung von pektinolytischen Enzymen aus A. niger zu entwickeln, das die Nachtelle der bekannten technischen Lösungen vermeidet und zu einer verbesserten Ausnutzung der Nehrstoffbestandteile sowie zur Verringerung des Abwasseranfalls führt, um damit zu einer Erhöhung der Verfahrensökonomie zu gelangen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Fermentations- und Aufarbeitungsprozeß so 7 j führen, daß dem obigen Ziel in einfacher Weise entsprochen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur submersen Gewinnung pektinolytischer Enzyme durch die trägerfixierte Kultivation von Aspergillus nlger, Stamm R 1/214- hinterlegt in der Zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZIMET 43692 -, bei dem die Biomasse in einem Reaktor auf einem Trägersystem zum Anwachsen gebracht, die Kultivation unter bekannten Fermentationsbedingungen unter Herausbildung einer kompakten Mycelschicht auf dem Trögersystem fortgesetzt, das Nährmedium nach der Synthese der gewünschten Enzyrnmenge abgelassen und mehrfach neues Substrat in den Reaktor eingefüllt und dor Kultivationsvorgang foitgesetzt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die geerntete onzymhaltige Kulturlösung zur Reinigung und Konzentrierung nach einer Klär- und Sterilfiltration einer Ultrafiltration unterzogen wird und daß die dabei anfallenden Filtrate aufgefangen, mit Leitungswasser und Nährstoffen ergänzt, sterilisiert und für eine weitere Kultivationsphase erneut in den Fonnentor eingefüllt werden. Eine Variante der Erfindung besteht darin, daß der Neuansatz der Fermentation mit frischem Nährmedium beginnt und daß im nachfolgenden zweiten Ansatz das mit Nährstoffbestandteilen ergänzte und sterilisierte Ultrafiltrat aus der ersten Ernte vorwendet wird. Ohne nachteilige Auswirkungen auf die Enzymsynthese ist es auch möglich, das bereits in einer zweiten Fermentationsphase wieder eingesetzte Medium nach erneuter Ultrafiltration, Ergänzung mit Nährstoffen und Sterilisation wiederum für einen dritten Kultivatior.sschritt zu nutzen und danach erneut mehrmals nach der genannten Behandlung für weitere Kultivationsschritte einzusetzen.

Eine weitere Variante der Erfindung geht davon aus, daß Ultranitrate aus dem Neuansatz mit frischem Medium oder aus nachfolgenden Kultivationen mit bereits wiederverwendeten Substraten auch für den Neuansatz von Fermentationszyklen verwendet werden.

Weitere abgeänderte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhalten beliebige Kombinationen zwischen dem Einsatz von frischen und mehrmals wiederverwendeten Nährlösungen in den einzelnen Ansätzen von Fermenle'ionszyklen. Ef fiiidungißernäß ist es auch möglich, die wiederverwendeten Substrate in andere parallel laufende Formentoron einzufüllen und auf diese Weise einen rhythmischen Durchlauf durch eine Fermentorbattorie aus mehreren Apparaten zu schaffen. Für dio Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wesentlich, daß die zur Wiederverwendung gelangenden Ultrafiltrate geernteter Kulnrlösungen nur in den Substratbestandteilen bis zur Höhe der Ausgangskonzentration des bekannten frischen Mediums ergänzt werden müssen, die sich während der vorangegangenen Kultivation und Aufbereitung wesentlich verringert haben. In der Regel betrifft dies die Flüssigkeitsmenge insgesamt, die mit Leitungswasser aufgefüllt wird, und die Kohlensioffquelle, weiche durch Zugabe von Saccharose oder Glucose vor der Sterilisation auf den bekannten Ausgangswert eingestellt wird. Die im bekannten Substrat vorliegenden Stickstoff- und Salzkoiuentrationon sind moist für eine mehrfache Wiederverwendung des Mediums ausreichend. Gegebenenfalls kann aber auch bei diesen Stoffen eine Zuführung vo' genommen werden. Die Erfindung wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiolo näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

6 Laborfermentoren (21 Nettovolumen), vorsehen mit zylindrischen Trägersystemon, worden mit storilisie rtom Nährmedium (5% Saccharose; 0,1 % Pektin; 0,75% (NH₄IjSO₄; 0,5% KH₂PO₄; 0,03% FeSO₄ · 7 H₂O; 0,03% MgSO₄ · 7 H₂O; 0,03% CoCOj; 0,03% NaCI) und einem Ausgangs-pH-Wcrt von 4,5 mit einer solchun Sporonmenge des Stammes Aspergillus niger beimpft, daß eine Konzentration von 10' Sporen/ml Kulturmediuni vorliegt. Die Belüftungsraie beträgt in der Phase der Sporenkoimung und Mycelbildung (24 h) 2Ol · h'¹ und wird dann bis Fermentationsende (120h) auf 601 h~' erhöht. Die Fermentation erfolgt boi 30"C. Die Entnahme des enzymhaltigen Ndhrmediums beendet den I.Ansatz, dem sich eine Trocknungsphase von 24h für die tragorfixierten Schimmelpilze anschließt. Die Wfiitorformentiorung (2. Ansatz) von jeweils 3 Laborfermentoren erfolgt zur Kontrolle mit frischem Kulturmedium und erfindungsgemdU mit Ultrafiltrationsmedium (Permeat des Ultrafiltrationsprozessos) aus der Ernte des 1. Ansatzes, welches mit Saccharose auf 5% orgänzt und sterilisiert wurde.Beide Nährmedion besitzen einen Ausgangs-pH-Wert von 2,8. Nach 120h Fermentationsdauer (Bolüftungsrato 6Ol · h~\ Fcrmentaiionstempeiatur 30'C) werden die Kulturmedien getrennt geerntei, die PG-Aktivität (Polygalakturonase-Aktivität) und die Biomassotrockensubstanz boider Ansätze ermittelt. Mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Ultrofiltrationsmedium werden PG-Syntheseraton erreicht, die denen mit normalem Kultivierungsmedium entsprechen (4O0PG-H g"¹ · h"^:).

Beispiel 2

3 Laborfermentoren werdon Ms Kontrollversuch im 1. Ansatz (Neuansatz) und 2. Ansatz eines Fermentationszyklus jeweils mit frischem sterilisiertem Medium (Zusammensetzung nach Beispiel 1) rr.'t Ausgangs-pH-Werten von 4,5 bzw. 2,8 beschickt. Die für dio Befüllung von 3 weiteren Laborfermentoren erfindungsgemäß für den 1 .Ansatz notwendige, mit Saccharose auf 5% ergänzte, sterilisierte Ultiafiltratmonge (pH = 4,5) wird aus einem vorausgegangenen Kultiviorungs- und Ultrafiltrationsprozeß gewonnen. Die Beimpfung erfolgt mit einer solchen Spcrenmenge, daß eine Sporenkonzentration von 10³ Sporen/ml Kulturmedium vorliegt. Dio Parametoi und dar Fermeniaticnsver lauf entsprechendem Beispiel 1. Das betüits im 1. Ansatz a.us Ultrafiltrat hergestellte Nahrmedium wird einem weiteren Ultrafiltrationsprozeß unterzogen, bei dem das entstehende Permeat mit Wasser und Saccharose ergänzt und nach Sterilisation und pH-Einstellung auf 2,8 erfindungsgemäß für den 2. Fermentationsansatz eingesetzt wird. Der weitore Fermentationsverlauf erfolgt entsprechend Beispiel 1. Zum Vcig'öich dos erfindungsgemäßen Einsatzes von Ultrafiitratmediumi. η 1. und 2. Ansatz eines Fermentationszyklus werden die PG-Syntheseraten hernngezogen. die boi Einsatz von Kontrollmeciium 300 bis 470PG-E · g~' - h"' betragen.

Claims

1. Verfahren zur eubmersen Gewinnung pektinolytischer Enzyme durch trägerfixierte Kultivation von Aspergillus niger, bei dem die Biomasse in einem Reaktor auf einem Träger zum Anv /achsen gebracht, die Kultivation bei vorgegebenen Fermentationsbedingungen unter Herausbildung einer kompakten Mycelschicht auf dem Trägersystem fortgesetzt, das Nährmedium nach der Synthese der gewünschten Enzymmenge abgelassen und mehrfach neues Nährmedium in den Reaktor eingefüllt und der Kultivationsvorgang fortgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das geerntete enzymhaltige Nährmedium zur Reinigung und Konzentrierung nach einer Klär- und Sterilfiltration einer Ultrafiltration unterzogen wird und daß die dabei anfallenden Filtrate aufgefangen, mit Leitungswasser und Nährstoffen ergänzt, sterilisiert und für eine weitere Kultivierungsphase erneut in den Fermentor eingefüllt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den Neuansatz des Reaktors frische Nährmedien bekannter Zusammensetzung verwendet werden und daß die Ultrafiltrate nach Ergänzung von Nährstoff bestandteilen und Wasser und nach Sterilisation im zweiten Ansatz erneut in den Reaktor eingefüllt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß bereits in einer zweiten Fermentationsphase wiederverwendetes Nährmedium nach der Ultrafiltration, Ergänzung mit Nährstoffen und Wasser und nach Sterilisation erneut in den Reaktor eingefüllt und in einer dritten Fermentation verwendet wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Nährmedium aus den ersten, zweiten oder dritten Fermentationsansätzen nach der Ultrafiltration, Ergänzung mit Nährstoffen und Wasser und nsch Sterilisation für den Neuansatz von Fermentationszyklen verwendet werden.

5. Verfahren nach d jr Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Kombinationen des Einsatzes von frischen und mehrmalig wiederverwendeten Nährmedien innerhalb der Fermentationszyklen in einem Reaktor erfolgen oder daß die wiederverwendeten Nährmedien in andere Fermentoren einer Fermentorbatterie eingefüllt werden und auf diese Weise mehrere Reaktoren durchlaufen.