DD287052A5 - Verfahren zur biokatalytischen gewinnung von stereoisomer reinen sekundaeren alkoholen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stereoisomer reinen sekundaeren Alkoholen der allgemeinen Formel I aus Isomeren-Gemischen, vorzugsweise Razematen, unter Ausnutzung der hohen Stereoselektivitaet von Fettalkoholoxidasen aus alkanverwertenden Hefen. Anwendungsgebiet ist die Biokatalyse.{stereoisomer reine Alkohole; Razemate; Stereoselektivitaet; Fettalkoholoxidasen; alkanverwertende Hefen}

Description

und das nicht umgesetzte Stereoisomer ggf. weiter gereinigt und isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Fettalkoholoxidase das Enzym aus Candida maltosa, Candida tropicalis, Pichia guilliermondii, Trichosporon adeninovorans oder Yarrowia lipolytica bzw. der jeweilige Mikroorganismus verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als Fettalkoholoxidase produzierender Organismus eine Hefe der Gattungen Candida, Debaryomyces, Pichia, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon oder Yarrowia verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe ein Wildstamm oder eine durch genetische Bearbeitung erhaltene Mutante ist.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stereoisomer reiner sekundärer Alkohole mit 4-28C-Atomon der allgemeinen Formel I (s. Anlage) aus den Isomeren-Gemischen der jeweiligen Alkohole.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biokatalyse. Die stereoisomer reinen sekundären Alkohole können zur Synthese von Naturstoffen, z. B. von Duftstoffen und Pheromonen sowie als terminate Liganden von smektisrhen Flüssigkristallen verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standet der Technik

Die chemische Synthese von sekundären Alkoholen z. B. durch katalytische Hydrierung von Ketonen, katalytische Hydratisierung von Olefinen oder Grignard-Reaktionen mit Aldehyden führt stets zu Razematen. Ihre chromatographische Trennung in die Isomeren als diastereomere Derivate, z. B. Camphansäure-Ester (Mosandl, A., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 185,379,1987) ist möglich, aber aufwendig. Seit längerem wird versucht, dieses Problem durch die Ausnutzung der mehr oder weniger ausgeprägten Stereoselektivität enzymatischer Reaktionen zu lösen. Benutzt wurden bisher NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen oder stereoselektive Esterase-Reaktionen, letztere auch für die Trennung von chlralen Hydroxyalkansäuren (z. B. Scileinati, A. et al., Tetrahedron Lett. 29,4927,1988; Feichter et al., Tetrahedron. Lett. 30,1989). Die bisher angewandten enzymatischen Reaktionen haben alle mindestens einen der nachstehend genannten Nachteile, oft auch mehrere; 1. niedrige, z. T. sehr niedrige spezifsiche Aktivität, 2. unvollständiger Substratumsatz, 3. nur mäßige ."'ereoselektivität (z.T. <<90%), 4. einsetzbar nur für einen begrenzten Kettenlängenbereich, 5. Notwendigkeit der Kofaktor-Rc^ werierung. Alle diese Nachteile können bei Anwendung von Fettalkoholoxidasen vermieden werden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Gewinnung von stereoisomer reinen sekundären Alkoholen der allgemeinen Formel I (s. Anlage) aus chemisch herstellbaren Razematformen dieser Verbindungen bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von stereoisomer reinen sekundären Alkoholen der allgemeinen Formel I (s. Anlage 1) gemäß der Zielstellung zu entwickeln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß dafür die sehr hohe Stereoselektivität von Fettalkoholoxidasen bei der Oxidation mittel- und langkettiger sekundärer Alkohole genutzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Isomerengemisch der Alkohole der allgemeinen Formel I

(s. Anlage) mit einer Fettalkoholoxidase bzw. mit Organismen, die Fettalkoholoxidasen produzieren, in Kontakt gebracht wird, wobbei ggf. Katalase zugesetzt wird. Dabei wird bevorzugt ein Stereoisomer nach der Reaktionsgleichung

sek. Alkohol + O₁-* Keton + H₂O₂ oxidiert.

Das nicht umgesetzte Stereoisomer wird, ggf. nach weiterer Reinigung, isoliert. Als Fettalkoholoxidasen kommen bevorzugt Enzyme aus Candida mattosa, Candida tropicalis, Pichia guilliermondii, Trichosporon adeninovorans oder Yarrowia lipolyt^!ca zum Einsatz. Das Verfahren läßt sich gleichermaßen mit dem jeweiligen Mikroorganismus durchführen. Als Fettalkoholoxidase produzierender Organismus sind weiterhin Hefen der Gattungen Candida, Debariomyces, Pichia, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon oder Yarrowia geeignet. Die eingesetzten Hefen können dabei Wildstämme oder durch genetische Bearbeitung erhaltene Mutanten sein. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden noch folgende ergänzenden Ausführungen gemacht: Die Umsetzung erfolgt in wäßrigen Systemen mit einem bevorzugten pH von 8,8. Das Substrat wird in mit Wasser mischbaren

organischen Lösungsmitteln, z.B. Aceton, Methanol oder Dimethylsulfoxid gelöst und in dieser Form dem Reaktionsansatz zugegeben.

In der Regel werden nur maximal 50% mit hoher Geschwindigkeit umgesetzt, die restlichen 50% überhaupt nicht oder nur mit

sehr geringer Geschwindigkeit. Dieser Reaktionverlauf ist darauf zurückzuführen, daß nur ein Enantiomers des sekundären

Alkohols ein gutes Enzymsubstrat für Fettalkohol-Oxidasen ist, das 2. Enantiomer aus steriscl an Gründen nicht oder nur langsam

oxidiert werden kann. Das nicht umgesetzte Enantiomer wird aus dem Reaktionsansatz nach bekannten Verfahren isoliert.

In Abhängigkeit von der Herkunft des Enzyms wird entweder die R- oder die S-Form zum Keton oxidiert und entsprechend wird

dann das S- oder das R-Enantiomer gewonnen.

Für dieses Verfahren sind sowohl eine Membranfraktion, die nach mechanischem Zellaufschluß von auf n-Alkanen als Kohlenstoffqnelle gewachsenen Hefen durch differentielle Zentrifuge gewonnenen wird (Fraktion zwischen 6000 und

100000 x g), als auch das gereinigte Enzym geeignet.

Die subzelluläre Fraktion bietet den Vorteil, daß sie gleichzeitig das Enzym Katalase enthält, wodurch das Zweitprodukt der Reaktion, das Wasserstoffperoxid, sofort zerstört wird. Das Enzym Fettalkoholoxidase aus der Hefe Candida maltosa erlaubt z. B. die Gewinnung des S-Enantiomeren, da die R-Form

oxidiert wird. Das pH-Optimum dieser Reaktion liegt bei 8,8, bei einer Temperatur von 3O⁰C mit Dodecan-2-ol als Substrat wird eine Umsatzgeschwindigkeit von 30nmol/min χ mg Protein erreicht. Durch Verwendung von Fettalkoholoxidasen, die mit O₂ als Elektronenakzeptor arbeiten, wird die aufwendige Kofaktor-Regenerierung, die bei der Verwendung von Dehydrogenasen notwendig ist, vermieden.

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Gewinnung von stereoisomer reinem Dodecan-2-ol Zu 100ml gepufferter (10OmM Tris-HCI pH8,8) wäßriger Lösung, die 270mg Protein einer Membranfraktion aus auf n-Alkanen

kultivierten Zellen von Candida maltosa (Mikrosomenfraktion nach mechanischem Zellaufschluß nach MAUERSBERGER et al. J.

Basic Microbiol. 1987) enthält, werden 2,5ml einer 5OmM Dodecan-2-ol-Lösung in Aceton (entspricht 23mg als Racemat der

stereoisomeren Formen R und S) zugesetzt und unter intensiver Rührung in einem Gefäß bei 25⁰C inkubiert. Der Abbruch der

Reaktion erfolgt nach etwa 35 Minuten durch Zusatz von 50 ml 8% H₂SO₄, wenn in einem Parallelansatz in einer geschlossenen

3-ml-Meßzelle, die mit einer Oj-Elektrode ausgerüstet ist, kein O₂-Verbrauch mehr festzustellen ist.

Der Reaktionsansatz wird mit 750ml lsopropanol-Hexan-1 N Schwefelsäure (40:10:1 Volumenanteile, nach V. P. DOLE, J. Clin. Invest. 35,150,1956) oder anderen geeigneten Lösungsmittelgemischen extrahiert. Die gewonnene organische Phase enthält das Reaktionsprodukt Dodecan-2-on und die nicht umgesetzte S-Form des Dodecan-2-

ol, da die Fettalkoholoxidase aus C. maltosa stereoselektiv die R-Form des sekundären Alkohols oxidiert. Die Bestimmung der

Isomerenreinheit wurde nach Überführung in das Isopropylcarbamatgaschromatographisch an einer chiralenValinamid-Phase

vorgenommen und ergab einen e.e.-Wert von >95%. Das stereoisomere S-Dodecan-2-ol läßt sich vom Reaktionsprodukt durch präparative Dünnschicht- oder Gaschromatographie bzw. Hochdruckflüssigkeitschromatograohie abtrennen.

Vergleichbare Ergebnisse werden bei der Inkubation von sekundären Alkoholen anderer Kettenlänge erhalten. Für die

längerkettigen Substrate wird die Inkubationszeit bzw. die eingesetzte Enzymmenge erhöht.

Anlage Formel I

R₁-CHOH-R_{2 f}

Ri = CH₃-, CH₃- -CH₂- oder CH₂=CH- bedeutet und

R₂ = eine Alkylgruppe mit 1-25 C-Atomen ist, in der 1 oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch -O- und/oder -CH=CH- und/oder C=O substituiert sein können und/oder die CH₃-Gruppe und/oder eine oder mehrere CH₂-Gruppen durch F", Cl", Br^-, J", CN", NO₂", einen aromatischen oder heterozyklischen Ring modifiziert sein können oder die terminal über einen Carboxylrest verfügt.

Claims (1)

1. Verfahren zur biokatalytischen Gewinnung von stereoisomer reinen sekundären Alkoholen der allgemeinen Formel I (s. Anlage), dadurch gekennzeichnet, daß aus einem Isomerengemisch der Alkohole der allgemeinen Formel I mit einer Fettalkoholoxidase bzw. mit Organismen, die Fettalkoholoxidasen produzieren, ggf. unter Zusatz von Katalase, bevorzugt ein Stereoisomer nach der Reaktionsgleichung

sek. Alkohol + O₂-> Keton + H₂O₂ oxidiert