DD288316A5 - Verfahren zur regenerierung von gelagerten erythrozytenkonzentraten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regenerierung von gelagerten Erythrozytenkonzentraten von Vertebraten. Das Verfahren kann insbesondere bei Massivtransfusionen, bei Austauschtransfusionen, bei autologen Transfusionen und bei Sauerstoffmangelzustaenden in der klinischen Praxis angewendet werden. Erfindungsgemaesz werden 1-8 Wochen konservierte Erythrozytenkonzentrate (EK) regeneriert, indem man zu einem beliebigen Volumen EK 20-40 Volumenanteile in % einer Inkubationsloesung zusetzt, die 20-40 mmol/l Inosin, 20-40 mmol/l Pyruvat, 20-60 mmol/l Phosphat und 20-40 mmol/l NaCl sowie 40-80 mmol/l NaOH enthaelt (IPP/NaCl/NaOH-Loesung). Durch Zugabe der erfindungsgemaeszen Loesung werden innerhalb von 60-90 min sowohl physiologische 2,3 P2G- als auch physiologische ATP-Werte erreicht, ohne die Erythrozytenmorphologie zu beeintraechtigen.{Erythrozytenkonzentrat; Regenerierung; Sauerstoffmangelzustaende; Inkubationsloesung; 2,3 P2G-Werte; ATP-Werte; Erythrozytenmorphologie}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regenerierung gelagerter Erythrozytenkonzentrate für Transfusionszwecke. Das Verfahren kann insbesondere bei Massivtransfusionen, bei Austauschtransfusionen, bei autologen Transfusionen, bei Sauerstoffmangelzuständen und im Zusammenhang mit der Kryokonservierung angewendet werden.
Die Lagerung von Erythrozytenkonzentraten (EK) führt zu einer 2,3 P2G (2,3-Diphosphoglycerat)-Verarmung und einer teilweisen ATP (Adenosintriphosphat)-Verarmung. Das ATP ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Konzentrationsunterschiede der Kationen zwischen Erythrozyt und Plasma, für die Aufrechterhaltung der spezifischen Zusammensetzung der organischen Bestandteile, für die Erhaltung des Hämoglobins im Funktionszustand und für die Aufrechterhaltung der Zellstruktur. Die Hauptfunktion des 2,3P2G besteht in der Regulation der Sauerstoffabgabe. Die Affinität des Hämoglobins zum Sauerstoff verringert sich durch die Bindung von 2,3P2G, wodurch die Sauerstoffabgabe an das Gewebe erleichtert wird. Um die physiologischen Funktionen des ATP und des 2,3 P2G zu gewährleisten, müssen die für den klinischen Einsatz vorgesehenen EK's auch physiologische Werte, was den ATP- und 2,3P2G-Gehalt anbetrifft, aufweisen. Der physiologische ATP-Gehalt beträgt 60mmol/mol Hb · Fe und der des 2,3P2G 250mmol/mol Hb Fe.
An 2,3P2G und ATP verarmte EK's sind bei Indikationen wie Massivtransfusionen, besonders bei Kindern, Transfusionen bei alten Patienten und Transfusionen bei Patienten mit kardiovaskulären und pulmonalen Erkrankungen nicht einsetzbar. So stellten R. C. Dennis et al. (Surgery 77 [1975] 741-747) fest, daß ein 150% 2,3P2G enthaltendes EK zu einer signifikant höheren Sauerstoffausnutzung des Gewebes und zu einer verbesserten myocardialen Funktion nach einer Operation führt im Vergleich zu einem nur 70% 2,3P2G enthaltenden EK. E. Beutler (Vox Saug. 34 [1978] 113-115) weist darauf hin, daß bei schwerkranken Patienten die Kompensationsmechanismen der 2,3 P2G-Regeneration erliegen und für diese Patienten maximal 1 Woche gelagerte EK verwendet werden sollten.
Seit Anfang der 70er Jahre ist bekannt, daß sich gelagerte Erythrozytenkonzentrate durch Inkubation mit inosin-, pyruvat- und phosphathaltigen Lösungen (IPP-Lösungen) regenerieren lassen. Oski et al. (Blood 37 [1971] 52-58) inkubieren in einer IPP-haltigen Lösung, benötigen aber eine 2- bzw. 4stündige Inkubation bei +37°C, um 70 bzw. 150% des normalen 2,3P2G-Gehaltes zu erreichen. C. Leber (Prom. A, 1987) und R. Bräutigam und R. Giese (Diplomarbeit 1987) verwenden IPP-Lösungen, mit denen bereits nach 2stündiger Inkubation normale 2,3P2G-Werte erreicht werden können. Von Nachteil ist hier die hohe Osmolabität, vor allem auf Grund des hohen NaCI-Gehaltes dieser Lösungen (700 mosmol/kg). Das führt zur Zellschrumpfung, wodurch die Erythrozyten schlechter deformierbar sind und damit eine geringere Überlebensrate besitzen. Klinisch führt der Deformierbarkeitsverlustzu Lungenödemen und zu cardiogenen Schockzuständen.
Ebenfalls eine zu hohe Osmolabität hat die von Valeri et al. (Transfusion 22 [1982] 102-106) verwendete Inkubationslösung (500mosmol/kg). Auch der pH-Wert dieser Inkubationslösung war mit 7,2 zu gering, um das EK wirksam zu neutralisieren. Weitere Versuche zur Aufrechterhaltung des 2,3 P2G-Spiegels bestanden bisher auch darin, den pH-Wert zu Beginn der Lagerung zu erhöhen (D. Strauss et al. in: VII. Int. Symp., Strukt. u. Funkt, d. Erythr., Akademie-Verlag, Berlin, 1975,483-486), die Regenerierungslösungen mit entsprechenden Zusätzen, wie z.B. Dihydroxyaceton zu versehen (US-PS 3795581) und die Glycolyseenzyme zu beeinflussen (US-PS 4774088). Bei diesen Versuchen ist die Lagerdauer begrenzt, und der 2,3P2G-Erhalt geht mit einem ATP-Verlust einher, was zu einer geringen Überlebensrate der Erythrozyten führt.
In der GB-PS 20 00023 wird zur Aufrechterhaltung des 2,3 P2G-Gehaltes die Verwendung einer Resuspensionslösung (Zusatz direkt nach der Blutabnahme) in Kombination mit einer initialen Anhebung des pH-Wertes beschrieben. Hier wurden noch nach 28d Lagerung normale 2,3P2G-Werte gemessen, was allerdings einer kontinuierlichen Phosphatzufuhr, verbunden mit einem Ionenaustauscher, bedarf.
G.L. Moore et al. (Vox Saug. 53 [1987] 15-18) versahen bei -80"C gelagertes Citrat-Phosphat-Dextrose-Erythrozytenkonzentrat (CPD-EK) nach dem Auftauen mit einer Lösung, die Adenin, Ascorbat-2-phosphat, Natriumphosphat, Dextrose und Mannitol enthielt. Diese Lösung hatte einen pH-Wert von 11 und eine relativ hohe Osmolarität von 466mosmol/l. Der 2,3P2G-Gehalt konnte 21 d aufrechterhalten werden, wohingegen der ATP-Gehalt nur 62% betrug. Bei allen bisher bekannten Lösungen des Problems werden durch entsprechende Zusätze und/oder pH-Werterhöhungen entweder der 2,3P2G-Gehalt oder der ATP-Gehalt auf Kosten des anderen längere Zeit aufrechterhalten, oder durch eine zu hohe Osmolarität der Inkubationslösungen wird die Erythrozytenmorphologie und damit die Überlebensrate negativ beeinflußt.
Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur Regenerierung von gelagerten Erythrozytenkonzentraten bereitzustellen, mit dem innerhalb kurzer Zeit und ohne großen Aufwand sowohl normale 2,3 P2G-Werte als auch normale ATP-Werte erreicht werden können, dabei eine ausreichende Überlebensrate der Erythrozyten garantiert ist und die Erythrozytenmorphologie nicht beeinträchtigt wird. Mit diesem Verfahren sollen gelagerte EK's innerhalb kurzer Zeit zur wirksamen klinischen Anwendung, besonders zu Transfusionszwecken, bereit sein.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine inosin-, pyruvat- und phosphatenthaltende Inkubationslösung (IPP-Lösung) bereitzustellen, durch deren Zusatz die gewünschte schnelle Regenerierung der gelagerten Erythrozytenkonzentrate innerhalb von 60-90min erreicht wird, ohne andere wichtige Parameter zu beeinträchtigen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man zu einem beliebigen Volumen Erythrozytenkonzentrat bei +37°C 20-40 Volumenanteile in % einer Inkubationslösung zusetzt, die 20-40 mmol/l Inosin, 20-40 mmol/l Pyruvat, 20-60 mmol/l Phosphat, 20-40mmol/l NaCI und 40-80mmol/l NaOH enthält (IPP/NaCI/NaOH-Lösung).
Durch die erfindungsgemäße Auswahl dieser Lösung wird es möglich, den 2,3P2G-und ATP-Gehalt 1-8 Wochen bei +40C gelagerter Erythrozytenkonzentrate nach 60-90minütiger Inkubation mindestens auf Normalwerte zu erhöhen (Abb. 1). Ohne Zugabe von NaOH ist eine 2stündige Inkubation nötig, um physiologische Werte zu erreichen. Mit der erfindungsgemäßen Inkubationslösung können durch längere Inkubation auch hypernormale Werte erreicht werden. Ein hypernormaler 2,3 P2G-Gehalt bewirkt eine noch günstigere Sauerstoffabgabe ans Gewebe, bei 300-400% des normalen 2,3 P2G-Gehaltes treten jedoch toxische Effekte auf.
In Abb. 2 wird die Veränderung desintra- und extrazellulären pH-Wertes 21 Tage konservierter Erythrozyten durch die erfindungsgemäße Inkubationslösung dargestellt. Der für den Regenerierungsprozeß wirksame intrazelluläre pH-Wert beläuft sich auf etwa 7,1. Wenn die Inkubationslösung nur IPP enthält, erfolgt die Regenerierung lediglich bei einem pH-Wert zwischen 6,7 und 6,8. Aus Abb. 3 erkennt man, daß sich die mittlere corpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) im oberen Bereich von Normwerttabellen bewegt (Frauen: 20,0-22,5mmol/l; Männer: 18,5-21 ,OTnmol/l). Damit wird eine wichtige Zielstellung erreicht, da jetzt die Voraussetzungen für ein optimale Deformierbarkeit und Überlebensrate der Erythrozyten erfüllt sind.
In Abb.4 ist die morphologische Regenerierung dargestellt. Der erreichte Werte des morphologischen Index von 0,88 ± 0,04 zeigt, daß die Erythrozyten eine gute Überlebensrate haben, und sie somit ihrer physiologischen Funktion gerecht werden können.
Die Osmolalität der extrazellulären Flüssigkeit beträgt nach der Inkubation 312 ± 19mosmol/kg, was dem physiologischen Wert von 300mosmol/kg nahe kommt. Damit wird eine weitere Forderung an die Inkubationslösung erfüllt.
Die erreichte Hämolyserate von 0,21 ± 0,07% erfüllt ebenfalls die Anforderung für Transfusionen (<1%).
Durch die Anwendung der erfindungsgemäßen NaOH-enthaltenden Inkubationslösung mit verringertem Phosphat- und NaCI-Gehalt wird somit eine schnelle Regenerierung der EK's erreicht, wobei die Erythrozytenmorphologie erhalten bleibt. Die Erythrozyten können nach der Transfusion ihrer physiologischen Aufgabe gerecht werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren regenerierten EK's sind noch mindestens 7 Tage bei +40C nachlagerbar, wobei alle wesentlichen Parameter annähernd erhalten bleiben.
Die Erfindung ist auch zur Regenerierung kryokonservierter EK anwendbar.
Ein CPD-stabilisiertes und SAGM-resuspendiertes Erythrozytenkonzentrat wird in einem 3fach Beutelsystem (FENWAL®) 3 Wochen bei +4°C gelagert. 40ml von diesem EK werden mit 30Vol.-% (17ml) der erfindungsgemäßen Inkubationslösung (30mmol/l Inosin, 30mmol/l Pyruvat, 45mmol/l Phosphat, 31 mmol/l NaCI, 62mmol/l NaOH) unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Box versetzt. Infolge der komplexen Wirkung der Inkubationslösung kann der ATP- und 2,3P2G-Gehalt, wie in Abb. 1 ersichtlich, regeneriert werden. Aufgrund des geradlinigen Anstieges des 2,3 P2G-Gehaltes werden nach etwa 90minütiger Inkubation physiologische 2,3 P2G-Werte erreicht (250 mmol/mol Hb Fe). Der physiologische ATP-Gehalt (60mmol/mol Hb Fe) wird bereits nach 30minütiger Inkubation erreicht. Ohne die Zugabe von NaOH ist eine 2stündige Inkubation nötig, um physiologische Werte zu erreichen.
Claims (1)
- Verfahren zur Regenerierung von gelagerten Erythrozytenkonzentraten (EK) durch Zugabe einer inosin-, pyruvat- und phosphathaltigen Inkubationslösung (IPP-Lösung), gekennzeichnet dadurch, daß man zu einem beliebigen Volumen Erythrozytenkonzentrat 20—40 Volumenanteile in % einer IPP-Lösung zusetzt, die 20-40 mmol/l Inosin, 20-40 mmol/l Pyruvat, 20-60 mmol/l Phosphat, 20-40mmol/l NaCI und 40-80mmol/l NaOH enthält (IPP/NaCI/NaOH-Lösung).Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
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