DD288618A5 - Verfahren zur selektiven verringerung der produktion eines isoenzyms der glutamin-synthase von medicago sativa l. - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Verringerung der Produktion eines Isoenzyms der Glutamin-Synthetase von Medicago sativa L. Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhoehung der biologischen Stickstoffixierung und damit zur Steigerung der Trockenmasse von Medicago sativa L. Erfindungsgemaesz wird dies dadurch erreicht, dasz eine "Anti-sense"-DNA, die auf der Konstruktion eines Gens mit kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenzen beruht, dessen Transkription zu einer RNA-Sequenz fuehrt, mittels eines an sich bekannten Binaervektors stabil in das Genom von Luzerne integriert wird. Diese RNA-Sequenz ist der mRNA des zu eliminierenden Genes komplementaer. Die Erfindung kann in der Landwirtschaft zur Ertragssteigerung von Medicago sativa L. eingesetzt werden.{Verfahren; Hemmung; Isoenzym; RNA; Transkription; Glutamin - Synthetase; Binaervektor; DNA; Sequenz; Gen}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Verringerung der Produktion eines Isoenzyms der Glutamin-Synthetase von Medicago sativa L. ₀ Sie kann in der Landwirtschaft zur Ertragssteigerung von Medicago sativa L. eingesetzt werden. Charakteristik des bekannten Standes der Technik -

In einer Veröffentlichung von KNIGHT und LANGSTON-UNKEFER (1988) wird bewiesen, daß durch selektive, partielle Hemmung eines Isoenzyms der Glutamin-Synthetase Anzahl und Größe der Wurzelknöllchen bei Luzerne nach Beimpfen mit Rhizobium meliloti soweit erhöht wurden, daß assimilierter Stickstoff für den Trockenmassezuwachs nicht mehr begrenzend war. Bekannt ist die Hemmung durch ein mikrobiell permanent produziertes Toxin, dessen Wirkung aus biochemischen und physiologischen Gründen auf die in den Wurzeln gebildete Glutamin-Synthetase beschränkt bleibt.

Zu experimentellen Zwecken Ist auch die gezielte oder zufällige Mutagenese entwickelt worden. Beide Methoden sind jedoch nicht praktikabel. Außerdem hat die letztere Methode den Nachteil, daß entweder noch andere physiologische Funktionen betroffen werden und/oder daß die entsprechende Enzymproduktion vollständig verloren geht.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der biologischen Stickstoff bindung und damit zur Erhöhung der Trockenmasse von Medicsgo sativa L.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat ein Verfahren zum Gegenstand, mit dem selektiv ein bestimmtes Isoenzym der Glutamin-Synthetase von Medicago sativa L. verringert produziert wird.

Die Aufgabe wird so gelöst, daß eine »Anti-sense"-DNA, die auf der Konstruktion eines Gens mit kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenzen beruht, dessen Transkription zu einer RNA-Sequenz führt, mittels eines an sich bekannten Binärvektors stabil in das Genom von Luzerne integriert wird. Diese RNA-Sequenz ist der mRNA des zu eliminierenden Gens komplementär. Wird ein solches Genprodukt mindestens in der mit der Anzahl von mRNAKopien vergleichbaren Menge transkribiert, kommt es zu einem Vorgang, der in den Zellen sonst nicht vorkommt, zur Paarung von RNA-Molekülen zu einem Doppelstrang. Dieser „unphysiologische" Vorgang ist ausschließlich auf das „Zielgen" beschränkt und vermindert dessen Translation um ca. 80%, was zu der erforderlichen Verminderung der Glutamin-Synthetaseaktivität in der Wurzel führt. Bei der Konstruktion des Binärvektors muß beachtet werden, daß Neomycin als Selektionsmarker für Medicage sativa L. ungeeignet ist.

Das reduzierte Niveau der Glutamin-Synthetaseaktivität in der Wurzel führt dazu, daß bei Medicage sativa L. nach Beimpfung mit Rhizobium meliloti eine Erhöhung der biologischen Stickstoffixierung und der Trockenmasse 'im mindestens 60% möglich sind.

Ausführungsbeispiel Die Erfindung soll anhand eines Ausf ührunusbeispielas näher erläutert werden. Es wird ein Binärvektor vorgeschlagen, der sowohl in Agrobacterium tumefaciens (Infektion des Luzernegewebes) als auch in E.Coli (Ausführung der Klonierungsschritte) replizierbar ist. Dieser Eiinärvektor (10-20kb) hat folgende Eigenschaften:

1. er enthält zwei je 25 bp große „Border"-Sequenzen (notwendig für Integration ins Pflanzengenom),

2. er weist einen pflanzenselektierbaren Marker auf, z. B. für Methotrexatresistenz (Dihydrofolatreduktase) oder für Hygromycinreslstenz (Hygromycinphosphotransferase) (notwendig, um transformierte Pflanzen ^u selektieren),

3. er enthält ein DNA-Element, diis für die Organspenifität der Expression verantwortlich ist (Wurzelexpressionselement),

4. er besitzt den originalen Promoter des Luzerne-Glutamin-Synthetase-Genes für die zytosolische Untereinheit des Wurzelenzyms,

5. er beginnt mit einem frühen Kodon der nativen mRNA, die die dieser mRNA analoge cDNA in umgekehrter Orientierung beinhaltet,

6. er enthält den natürlichen Terminatorbereich zur Beendigung der Transkription in richtiger Orientierung. Mittels dieses Binärvektors wird die „Anti-sense"-DNA in das Genom von Medicago sativa L. integriert.

Die dadurch eintretende Reduktion der Wurzel-Glutamin-Synthetaseaktivität führt dazu, daß nach Beimpfung mit Rhizobium meliloti eine Erhöhung der biologischen Stickstoffixierung und der Trockenmasse möglich Ist.

Claims (3)

1. Verfahren zur selektiven Verringerung der Produktion eines Isoenyzms der Glutamin-Synthetase von Medicago sativa L, dadurch gekennzeichnet, daß eine „Anti-sense"-DNA mittels eines an sich bekannten Binärvektors in das Genom von Medicago sativa L übertragen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die „Anti-sense"-DNA auf der Konstruktion eines Gens mit kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenzen beruht, dessen Transkription zu einer RNA-Sequenz führt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkription in der mit der Anzahl von RNA-Kopien vergleichbaren Menge erfolgt.