DD288620A5 - Verfahren zur isolierung und reinigung von phaseolotoxin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrobiellen Kulturfiltraten in zeitsparenden, materiell wenig aufwendigen Teilschritten bei hoher Ausbeute und maximaler Reinheit des Phaseolotoxins im Endpraeparat. Grundlage der Erfindung ist ein Isolierungs- und Reinigungsverfahren, welches die Schritte Dialyse, Gelchromatografie und Papierchromatografie enthaelt. Der papierchromatografische Reinigungsschritt umfaszt zugleich eine Prinziploesung fuer die Maszstabsvergroeszerung mit einem chromatografischen Reinigungsschritt an einer Cellulose-Saeule. Auf Grund der enzyminhibitorischen Aktivitaet kann Phaseolotoxin als Biochemikalie in der Forschung, fuer medizinische und biotechnologische Zwecke, als Herbizid, als Wachstumsregulator, als Insektizid und als Algizid eingesetzt werden.{Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin; Hemmung der Ornithincarbamoyltransferase}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrobiellen Kulturfiltraten. Phaseolotoxin hemmt die Ornithincarbamoyltransferase in mikrobiellen, pflanzlichen und tierischen Zellen. Demzufolge kann Phaseolotoxin als Biochemikalie in der Forschung, zur Regulation medizinischer und biotechnologischer Prozesse, als Herbizid, als Wachstumsregulator, als Insektizid und als Algizid eingesetzt werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Bisher sind verschiedene Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin aus mikrobiellen Kulturfiltraten bekannt (PATIL et al. [1972], in; Phytotoxins in Plant Diseases, Academic Press, New York, 365; MITCHELL, R. E. [1976], Phytochemistry 15, 1941; RUDOLPH, K. und RASCHE, E. [1981], Phytopath.Z. 101,298). Diese Verfahren haben den Nachteil, daß die Isolierung und Reinigung in zeit-, material- und apparativ aufwendigen Teilschritten bei geringer Ausbeute erfolgt, wobei die Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat nicht größer als 90%, oft wesentlich niedriger ist.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrobiellen Kulturfiltraten in zeitsparenden, apparativ und materialmäßig wenig aufwendigen Teilschritten bei hoher Ausbeute und maximaler Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrobiellen Kulturfiltraten zu beschreiben, das bei zeitsparenden, apparativ und materialmäßig wenig aufwendigen Teilschritten bei hoher Ausbeute zu maximaler Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat führt. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Isolierung durch Dialyse gegen dest. Wasser erfolgt, dessen pH-Wert mitAmmoniakauf8 bis 10 eingestellt ist und der Dialyslerschlauch Verbindungen miteinemMolekulargewichtgrößer als 10000 ausschließt, daß ein danach gewonnenes Präparat durch Gelchromatographie an Sephadex G15 gereinigt wird, indem mit dest. Wasser, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8 bis 10 eingestellt Ist, eluiert wird und daß eine zusätzliche Reinigung des Präparates durch absteigende Papierchromatographie mitÄthanol-Ammoniak-dest. Wasser als Laufmittel oder durch Übe; tragen der Trennparameter auf eine mit Cellulosepulver gefüllte Säule erfolgt.
Ausführungsbeispiel 1 Liter eines mikrobiellen Kulturfiltrates, welches U-HC-markiertes Phaseolotoxin enthält, wird am Vakuumrotationsverdampfer bei 40’C bis auf zirka 10 ml eingeengt. Das konzentrierte Kulturfiltrat wird in einen Dialyslerschlauch, welcher Substanzen mit einem Molekulargewicht größer als 10000 ausschließt, überführt und 8h gegen 2I dost. H2O, dessen pH-Wert mit Ammoniakauf 9 eingestellt ist, dialysiert. Anschließend wird das phaseolotoxinhaltige Dialysemdium am Vakuumrotationsverdampfer bei 40°C auf zirka 10ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird auf eine Säule, gefüllt mit Sephadex G15 Gelbett 4,0 x 200,0cm, aufgetragen. Die Elution erfolgt bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 12 ml/h mit de st. HjO dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 9 eingestellt ist. Die phaseolotoxinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und am Vakuumrotationsverdampfer bei 40’C auf zirka 1 ml aufkonzentriert. Die so erhaltene phaseolotoxinhaltige Lösung wird strichförmig auf Chromatographiepapier FN11 aufgetragen und das so vorbereitete Papierchromatogramm 14 h absteigend mit dem basischen Laufmittelsystem Äthanol- . Ammoniak-H2Q/6:3:1 entwickelt. Nach der Trennung wird der phaseolotoxinpositive Bereich mit 10ml dest. H2O, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 9 eingestellt Ist, 4 h bei 4°C extrahiert. Nach erfolgter Zentrifugation zur Entfernung des Papiermaterials wird der phaseolotoxinhaltige Überstand auf zirka 1 ml am Vakuumrotationsverdampfer bei 40°C eingeengt und mit 1 ml Methanol versetzt. In diesem Präparat liegt das U-MC-markierte Phaseolotoxin mit einer chemischen und radiochemischen Reinheit von 99% vor, wobei die Ausbeute 80% beträgt.
Claims (2)
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrowellen Kulturfiltraten, gekennzeichnet dadurch, daß die Isolierung durch Dialyse gegen dest. Wasser erfolgt, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8 bis 10 eingestellt ist und der Dialysierschlauch Verbindungen mit einem Molekulargewicht größer 10000 ausschließt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein danach gewonnenes Präparat durch Getehromatographie an Sephadex G15 gereinigt wird, indem mit dest. Wasser, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8 bis 10 eingestellt ist, eluiert wird und daß eine zusätzliche Reinigung des Präparates durch absteigende Papierchromatographie mit Äthanol-Ammoniak-dest. Wasser als Laufmittel oder durch übertragen der Trennparameter auf eine mit Cellulosepulver gefüllte Säule erfolgt.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrowellen Kulturfiltraten. Phaseolotoxin hemmt die Ornithincarbamoyltransferase in mikrowellen, pflanzlichen und tierischen Zellen. Demzufolge kann Hhaseolotoxin als Biochemikalie in der Forschung, zur Regulation medizinischer und biotechnologischer Prozesse,'als Herbizid, als Wachstumsregulator, als Insektizid und als Algizid eingesetzt werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Bisher sind verschiedene Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin aus mikrowellen Kulturfiltraten bekannt (PATIL et al. [1972], in: Phytotoxins in Plant Diseases, Academic Press, New York, 365; MITCHELL, R. E. (1976), Phytochemistry 15, 1941; RUDOLPH, K. und RASCHE, E. [1981], Phytopath.Z. 101,298). Diese Verfahren haben den Nachteil, daß die Isolierung und Reinigung in zeit-, material- und apparativ aufwendigen Teilschritten bei geringer Ausbeute erfolgt, wobei die Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat nicht größer als 90%, oft wesentlich niedriger ist.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikrowellen Kulturfiltraten in zeltsparenden, apparativ und materialmäßig wenig aufwendigen Teilschritten bei hoher Ausbeute und maximaler Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Phaseolotoxin, welches durch Isotope markiert oder unmarkiert sein kann, aus mikroWeilen Kulturfiltraten zu beschreiben, das bei zeitsparenden, apparativ und materialmäßig wenig aufwendigen Teilschritten bei hoher Ausbeute zu maximaler Reinheit des Phaseolotoxins im Endpräparat führt. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Isolierung durch Dialyse gegen dest. Wasser erfolgt, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8 bis 10 eingestellt ist und der Dialyslerschlauch Verbindungen mit einem Molekulargewicht größer als 10000 ausschließt, daß ein danach gewonnenes Präparat durch Gelchromatographie an Sephadex G15 gereinigt wird, indem mit dest. Wasser, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8 bis 10 eingestellt ist, eluiert wird und daß eine zusätzliche Reinigung des Präparates durch absteigende Papierchromatographie mit Äthanol-Ammoniak-dest. Wasser als Laufmittel oder durch Übertragen der Trennparameter auf eine mit Cellulosepulver gefüllte Säule erfolgt.
Ausföhrungsbeispiel
1 Liter eines mikrowellen Kulturfiltrates, welches U-"C-markiertes Phaseolotoxin enthält, wird am Vakuumrotationsverdampfer bei 40°C bis auf zirka 10 ml eingeengt. Das konzentrierte Kulturfiltrat wird in einen Dialysierschlauch, welcher Substanzen mit einem Molekulargewicht größer als 10000 ausschließt, überführt und 8h gegen 21 dost. H2O, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 9 eingestellt ist, dialysiert. Anschließend wird das phaseolotoxinhaltlge Dialysemdium am Vakuumrotationsverdampfer bei 40 0C auf zirka 10ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird auf eine Säule, gefüllt mit Sephadex G15 Gelbett 4,0 x 200,0cm, aufgetragen. Die Elution erfolgt bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 12 ml/h mit dc st. H2O dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 9 eingestellt ist. Die phaseolotoxinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und am Vakuumrotationsverdampfer bei 4O0C auf zirka 1 ml aufkonzentriert. Die so erhaltene phaseolotoxinhaltlge Lösung wird strichförmig auf Chromatographiepapier FN11 aufgetragen und das so vorbereitete Papierchromatogramm 14h absteigend mit dem basischen Laufmittelsystem Äthanol- . Ammoniak-H2O/6;3:1 entwickelt. Nach der Trennung wird der phaseolotoxinpositive Bereich mit 10ml dest. H2O, dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 9 eingestellt ist, 4 h bei 4°C extrahiert. Nach erfolgter Zentrifugation zur Entfernung des Papiermaterials wird der phaseolotoxinhaltige Überstand auf zirka 1 ml am Vakuumrotationsverdampfer bei 40°C eingeengt und mit 1 ml Methanol versetzt. In diesem Präparat Ii6gt das U-14C-markierte Phaseolotoxin mit einer chemischen und radiochemischen Reinheit von 99% vor, wobei die Ausbeute 80% beträgt.
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