DD289561A5 - Verfahren zur herstellung neuer plasmide mit effektiven promotoren fuer die heterologe genexpression in grammnegativen bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Plasmide mit effektiven Promotoren fuer die heterologe Genexpression in Staemmen grammnegativen Bakterien, vorzugsweise in Produzentenstaemmen des E. coli- oder des A. methanolicus-Systems. Es wurden promotortragende Fragmente aus der DNS des Phagen Acm 1 von A. methanolicus in ein Basisplasmid &pRS 201! derart eingefuegt, so dasz die gesuchten promotorenthaltenden rekombinanten Plasmide durch Selektion auf das aktivierte Strukturgen &Streptomycin-Resistenz! des Basisplasmids ermoeglicht wurde. Durch das erfindungsgemaesze Verfahren werden die Plasmide der pRSAC-Serie, die ein breites Wirtsspektrum besitzen, zur Verfuegung gestellt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Gentechnik und andere Bereiche der Biotechnologie.{gramnegative Bakterien; Gentechnik; Plasmide; Phagen; Promotoren}

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Dio Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Plasmide, deren Komponenten vorteilhaft zur Konstruktion von Expressionsvektoren für gramnegative Bakterien, vorzugsweise für E. coli bzw. A. methanolicus, eingesetzt werden können. Diese Vektoren werden benötigt, um Gene, an deren starker Expression man interessiert ist, in bakteriellen Wirten effizient zur Expression zu bringen. Mögliche Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Gentechnik und andere Bereiche der Biotechnologie, deren Ziel die Herstellung hochwertiger Produkte auf mikrobiologisch-technischem Wege für die Human- und Veterinärmedizin, Pflanzen- und Tierproduktion sowie der Nahrungsgüterindustrie ist.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Eines der wichtigsten Ziele der angewandten Gentechnik ist die Proteinproduktion aus rekombinanter DNS in Mikroorganismen. Hierzu benötigt man eine besondere Klasse von Vektoren, sogenannte Expressionsvektoren, die die strukturellen Voraussetzungen für eine effektive Expression von Fremdgenen in einem ausgewählten Wirt besitzen. Für die Konstruktion solcher Vektoren benötigt man unter anderem starke Promotoren, die die Transkription eines Fremdgens effektiv initiieren, also die Bildung eines hohen Spiegels an m-RNS in der Wirtszelle bewirken. Dies ist die erste Voraussetzung für die starke Expression eines Fremdgens in einem bakteriellen Wirt. Bisher sind solche Expressionsvektoren vorwiegend für Escherichia coli (gramnegativ) konstruiert worden (z.B. Amann et al., 1985, Gene 40,183-190; Sethetal., 1986, Gene 42,49-57; Itohetal., 1986, Agric. Biol. Chem. 50,1295-1302; Stark, 1987, DNA 6,583-591). Die in diesen Arbeiten beschriebenen Vektoren enthalten Promotoren, die in Echerichia coli effizient sind.

Auch für grampositive Bakterien ist die Isolation von Expressionsvektoren beschrieben worden. So wurde von Behnke et al. (DD, 228564) die Isolation von promotortragenden chromosomalen Fragmenten aus Streptokokken-DNS mit Hilfe eines Promotorsuchplasmids und deren potentieller Einsatz für die Konstruktion von multifunktionellen Expressionsvektoren beschrieben. Eine Charakterisierung der klonierten Promotoren hinsichtlich ihrer Promotorstärke erfolgte jedoch nicht, so daß ein Vergleich mit anderen Promotoren nicht möglich ist.

In der Biotechnologie besteht zunehmend der Trend zur Nutzung bakterieller Wirte mit ökonomisch relevanten Eigenschaften. So wird durch Nutzung methylotropher Bakterien für die Bio- und Gentechnologie das einheimische Substrat Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle für die Proteinproduktion aus rekombinanter DNS erschlossen. Für eine solche Proteinproduktion in methylotrophen Bakterien, wie z. B. Acetobacter methanolicus (gramnegativ), benötigt man geeignete Vektoren für die Ankopplung von Fremdgenen an effiziente Expressionssignale.

Promotoren, die in einem bestimmten Bakterium effektiv sind, können in einem anderen Bakterium relativ uneffektiv sein. Aus dieser Speziesspezifität ergibt sich die Notwendigkeit zur Isolation von effektiv wirksamen Promotoren für den jeweiligen Wirt, in dem eine Proteinproduktion aus rekombinanter DNS erfolgen soll. Insgesamt betrachtet ist der Wissensstand über die Struktur und Funktion von Promotoren gramnegativer Bakterien, wenn man einmal von Escherichia coli absieht, relativ gering (Frey et al., 1988, Gene 62, 237-247). Die Suche nach effektiven Initiationssequenzen erstreckt sich auch auf die Phagen der Wirtsorganismen. Phagen besitzen keine eigene DNS-abhängige RNS-Polymerase, sondern benutzen die RNS-Polymerase ihres Wirtes. Um mit den Promotoren des Wirtes konkurrieren zu können, benötigen sie besonders starke Initiationssequenzen für die effektive Transkription ihrer DNS. Promotoren von Phagen methylotropher Bakterien sind bisher noch nicht für die Proteinproduktion aus rekombinanter DNS eingesetzt worden. Auch gibt es bisher noch keine detaillierten Aussagen über die Promotorstärke der Promotoren von Phagen methylotropher Bakterien. Die Isolation von promotortragenden DNS-Sequenzen aus Acetobacter methanolicus bzw. aus der DNS des Phagen Acm 1 ist bisher noch nicht bekannt geworden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel neue Plasmide mit effektiven Promotoren für die Konstruktion von Expressionsvektoren für Acetobacter methanolicus und/oder anderer gramnegativer Bakterien bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein gentechnisches Verfahren zur Bereitstellung von neuen Plasmiden mit starken Promotoren des Phagen Acm 1 zu entwickeln, durch deren Nutzung eine effektive Initiation der Transkription eines stromabwärts eingebauten Gens in E. coli oder A. methanolicus oder in anderen gramnegativen Bakterien erreicht wird. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst: In einem ersten Schritt werden parallel

a) ein neu konstruiertes mit einer Restriktase linearisiertes Basisplasmid, das sich durch ein breites Wirtsspektrum für gramnegative Bakterien auszeichnet und ein inaktives Strukturgen enthält,

b) ein bzw. mehrere promotortragende Fragmente aus der DNS des Phagen Acm 1 für die Ligation vorbereitet.

Nach Zusammenführung beider Komponenten im Verhältnis a:b = 1:5 erfolgt die Ligation mit DNS-Ligase und anschließend eine Transformation des Ligationsgemisches in E. coli, wobei eine Identifikation der rekombinanten, promotorenthaltenden Plasmide durch Selektion auf das aktivierte Strukturgen erfolgt. Im nächsten Schritt werden die rekombinanten Plasmide selektiert, bei denen die Aktivität des Strukturgens besonders effizient ist. In diese Plasmide (pRSAC-Serie) wird zur besseren Beurteilung der Promotorstärke ein weiteres promotorloses Strukturgen, dessen Expression relativ leicht mittels eines spektrophotometrischen Tests verfolgt werden kann, stromabwärts von den klonierten Phagenpromotoren inseriert. Die spezifische Aktivität dieses Genproduktes wird mit denen der durch den Pr- und tac-Promotor in analoger Plasmidkonstruktion verursachten spezifischen Aktivität in E. coli und A. methanolicus verglichen.

Für die Umsetzung dieses Grundverfahrens wird als Basisplasmid der Promotor-Test-Vektor pRS 201, der durch gerichtete Insertion des Kanamycin-Resistenzgens aus dem Plasmid pUC 4K (Vieira und Messing, 1982, Gene 19,259-268) in mit Pstl vollständig gespaltene pRS 3-DNS (Schröder et al., 1989, Acta Biotechnol. 9,219-225) gewonnen wird, verwendet. Dieses Plasmid enthält 8 verschiedene Erkennungsorte für Restriktasen vor dem (stromaufwärts) stummen, promotorlosen Strukturgen aph (Streptomycin-Resistenzgen), wobei der BamHI-Erkennungsort fürdie anschließende Promotorklonierung genutzt wird. Das Plasmid pRS 201 wird in an sich bekannten molekularbiologischen Schritten aus der Übernachtkultur eines E. coli-Stammes isoliert, gereinigt und mit der Restriktase BamHI linearisiert. Parallel wird durch Standardmethoden (Maniatis et al., 1982, „Molecular cloning. A laboratory manual.", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 17-85) die DNS des Phagen Acm 1, der im Felix d' Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Quebec, QC, G1K7P4, Canada hinterlegt wurde, isoliert, gereinigt und mit der Restriktase Sau3A partiell geschnitten. Da dieses Enzym DNS-Fragmente erzeugt, die mit BamHI-gespaltener DNS kompatibel sind, können nach Inaktivierung der Restriktasen beide Ansätze im obengenannten Verhältnis gemischt und mit DNS-Ligase behandelt werden. Anschließend erfolgt die Transformation dieses Ligationsgemisches in E. coli C6000 (Chistoserdov et al., 1987, Mol. Genet. Microbiol. Virol. 8,36-41), wobei die Selektionsplatten Streptomycin enthalten und somit eine Selektion auf das aktivierte Strukturgen des Basisplasmids pRS 201 erfolgt. Die auf diesen Agarplatten wachsenden E. coli-Transformanten enthalten die neuen rekombinanten Plasmide, die im BamHI/Sau3A-Erkennungsort Acm 1-DNS-Fragmente mit Promotoren in der richtigen Orientierung zum Streptomycin-Resistenzgen enthalten. Diese neuen Plasmide werden mit pRSAC und einer Seriennummer bezeichnet. Die Streptomycinresistenten Transformanten werden auf LA-Medium mit 2000мд · ml"¹ Streptomycin überstempelt. Dabei werden vier Bakterienkolonien identifiziert, die besonders gut unter diesen Bedingungen wachsen können. Es handelt sich hierbei um die Transformanton, die die Plasmide pRSAC 109, pRSAC 115, pRSAC 117 und pRSAC 119 enthalten. Von diesen Transformanten wird mit den an sich bekannten Standardmethoden die Plasmid-DNS isoliert, gereinigt und somit für weitere molekularbiologische Untersuchungen zur Verfügung gestellt.

Biologisch reine Kulturen von E. coli-Stämmen, die die in dieser technischen Lehre beschriebenen neuen Plasmide enthalten, sind in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, Beutenbergstraße 11, Jena, 6900, unter den Registriernummern

IMET 11336 für E. coli C6000 (pRSAC 109), IMET 11337 für E. coli C6000 (pRSAC 115), IMET 11338 für E. coli C6000 (pRSAC 117) und IMET 11339 für E. coli C6000 (pRSAC 119)

hinterlegt worden.

Die elektrophoretisch ermittelten Phagen-Insertgrößen sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Für die bessere Beurteilung der Promotorstärke der klonierten Phagenpromotoren wird ein weiteres promotorloses Strukturgen, das für Chloramphenicol-Acetyltransferase (E.C.2.3.1.28.) kodierende cat-Gen (ca. 780bp), stromabwärts von den Acm 1-Promotoren der pRSAC-Plasmide inseriert. Ausgangspunkt hierfür ist das Plasmid pCM 1 (Close und Rodriguez, 1982, Gene 20,

kiert enthält. In den weiteren molekularbiologischen Schritten wird dieses cat-Gen so modifiziert, daß es von 6 verschiedenen Erkennungsorten für Restriktasen symmetrisch flankiert wird und anschließend mit einer Restriktase aus dem resultierenden Plasmid herausgelöst werden kann, die das cat-DNS-Fragment mit solchen Enden ausstattet, die einen Einbau dieses modifizierten Gens in einen stromabwärts von den Acm 1-Promotoren der pRSAC-Plasmide eines im Polylinker befindlichen Erkennungsortes für Restriktasen erlaubt. Hierzu wird das Plasmid pRS3A CAT konstruiert. Aus diesem Plasmid wird das cat-Gen

durch Kpnl-Restriktion gewonnen und nacheinander in vier getrennten Ansätzen mit Kpnl linearisierten pRSAC-Plasmiden ligiert.

Bei der steh anschließenden Transformation des Ligationsgemisches in E.coli-Bakterien können die gesuchten Bakterien-Klone mit den rekombinanten Plasmiden durch Ausspateln des Transformationsgemisches auf Chloramphenicol-haltigenLA-Medium identifiziert werden. Die gesuchten, mit pRSAC 109 CAT, pRSAC 115 CAT, pRSAC 117 CAT und pRSAC 119 CAT bezeichneten, Plasmide enthalten stromabwärts von den klonierten Acm 1-Promotoren das promotorlose cat-Gen in gewünschter Orientierung.

In Analogie zur Konstruktion der zuletzt genannten Plasmide werden die Plasmide pRS 201 prCAT und pRS 201_tac CAT konstruiert, die den p_R- bzw. den tac-Promotor stromaufwärts von dem promotorlosen cat-Gen in Verbindung mit dem RSF1010 Replikon enthalten. Die Plasmide pRS201 p_R CAT und pRS 201,« CAT sowie die das cat-Gen enthaltenden pRSAC-Plasmide werden mit Hilfe des Plasmids pRK2013 (Figurski und Helinski, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,1648-1652) konjugativ in Acetobacter methanolicus (IMET B 346) übertragen. Im Fall des Plasmids pRS201 p_n CAT wird hierbei eine Variante verwendet, bei der der thermolabile Repressor des el 857-Gens bereits bei 30"C inaktiv ist, d. h. die Expression des cat-Gens konstitutiv erfolgt.

Anschließend werden in an sich bekannter Weise die das Plasmid pRSAC 109 CAT bzw. pRSAC 115 CAT bzw. pRSAC 117 CAT bzw. pRSAC119 CAT bzw. pRS201 p_R CAT bzw. pRS201_tac CAT enthaltenden E.coli- bzw. A. methanolicus-Bakterien bis zur späten log-Phase coli- bzw. A. methanolicus-Bakterien bis zur spaten log-Phase bei 30⁰C kultiviert, durch Zentrifugation geerntet gewaschen und durch Ultraschall-Behandlung lysiert. Nach Zentrifugation der lysierten Bakterienproben erfolgt die Bestimmung der spezifischen CAT-Aktivität (Shaw, 1975, Meth. Enzymol. 43,737-755) im Überstand der Proben. Die gemittelten spezifischen CAT-Aktivitäten von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten sind in Tab. 2 dargestellt.

Ausführungsbeispiel

A Konstruktion des Plasmids pRS 201

Die Konstruktion des Promotor-Test-Vektors pRS201 erfolgt auf der Basis der Plasmide pRS3 und pUC4K. Für die Isolation beider Plasmide werden der E.coli-Stamm C6000 (pRS3) und C 6000 (pUC4K) eingesetzt. Die Isolation der Plasmid-DNS erfolgt in an sich bekannter Weise (Maniatis et al., „Molecular cloning. A laboratory manual.". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 86-93) aus den Übernachtkulturen der genannten Stämme. Die isolierte Plasmid-DNS wird inTE-Puffer (1OmM Tris-HCL, pH7,4; 1 mM EDTA) bei 4°C aufbewahrt. Anschließend wird die DNS beider Plasmide in getrennten Ansätzen mit der Restriktionsendonuklease Pst I unter den vom Hersteller (Boehringer Mannheim) angegebenen Bedingungen vollständig gespalten. Die Korrektheit der Restriktion wird mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Nach anschließender 5minütiger Inkubation der Restriktionsgemische bei 65⁰C wird die gespaltene Plasmid-DNS durch Zugabe von 2 Volumenanteilen 96%igem Ethanol und 2stündiger Inkubation bei — 20⁰C ausgefällt, sedimentiert, getrocknet und in Ligationspuffer (5OmM Tris-HCL, pH7,4; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTE; 1 mM ATP, 1 mM Spermidin) aufgenommen.

Für die Ligation werden in an sich bekannter Weise 1 μg Pst l-behandelte pUC 4K-Plasmid-DNS vermischt und mit 2 Einheiten DNS-Ligase versetzt. Die Ligationsreaktion findet in einem Volumen von 20μΙ bei 14°C in einem Zeitraum von 15 Stunden statt. 10μΙ des Ligationsgemisches werden für die Transformation von E.coli C6000 eingesetzt. Die Transformation erfolgt in an sich bekannter Weise (Maniatis et al., 1982, „Molecular cloning. A laboratory manual.". Cold Spring Harbor, New York, 249-253). Die Selektion derTransformanten erfolgt auf Kanamycin-haltigen (50 pg · ml"¹) L-Agarplatten. Anschließend werden die erhaltenen Klone auf ihre Antibiotika-Resistenzen (Ampicillin-, Kanamycin-, Streptomycin- und Sulfonamidresistenz) untersucht. Im Ergebnis dieser Untersuchungen wird ein Klon identifiziert, der nur Resistenz gegen Kanamycin aufweist und ein Plasmid mit der erwarteten Molekülgröße von 9,1 kb enthält. Von diesem Klon wird die isolierte Plasmid-DNS mittels Restriktionsanalyse auf die Korrektheit der Konstruktion (Abb. 1) des gesuchten Plasmids untersucht. Dieses Plasmid wird mit pRS201 bezeichnet.

B Isolation von Acm 1-DNS

Zur Gewinnung von Acm 1-Phagen-DNS wird eine Submerskultur des Stammes A. methanolicus (IMET 10945) in der logarithmischen Wachstumsphase (nach 15 Stunden Kultivierung bei 30⁰C) mit dem Phagen Acm 1 mit einer Multiplizität von MOI = 0,1 infiziert und weitere 10 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Anschließend wird durch Zentrifugation und Filtration über eine Glasfritte G 5 das Rohlysat erhalten. Die DNS des Rohlysates wird analog zur Reinigung der Lambda-DNS in an sich bekannter Weise im Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten gereinigt (Maniatis et al., „Molecular cloning. A laboratory manual.", Cold Spring Harbor, New York, 80-85) und in TE-Puffer resuspendiert (Konzentration = 1 μg μΓ¹) zur Verfügung gestellt.

C Insertion von Acm 1-DNS-Fragmenten in pRS201

Die pRS 201-Plasmid-DNS wird aus dem E.coli-Stamm C6000 (pRS201) in an sich bekannter Weise aus der Übernachtkultur des genannten Stammes isoliert. Zur Reinigung der Plasmid-DNS von kontaminierender chromosomaler DNS wird eine Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt (Maniatis et al., „Molecular cloning. A laboratory manual.". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 93-94). Die gereinigte DNS wird in TE-Puffer aufgenommen und bei 4°C aufbewahrt.

1 μg pRS201-DNS wird mit dem Restriktionsenzym BamHI unter den vom Hersteller (Boehringer Mannheim) angegebenen Bedingungen an der unikalen BamHI-Schnittstelle linearisiert. Parallel dazu werden in an sich bekannter Weise Βμ$ Acm 1-DNS mit Sau3A partiell verdaut. Zur Inaktivierung der Restriktionsenzyme werden die jeweiligen Ansätze 5 Minuten bei 65°C inkubiert. Anschließend wird jeweils durch Zugabe von 2 Volumenteilen 96%igem Ethanol und zweistündiger Inkubation bei —20⁰C die DNS ausgefällt, sedimentiert, getrocknet und im Originalvolumen mit Ligationspuffer aufgenommen. Linearisierte Plasmid-DNS und fragmentierte Acm 1-DNS werden im Verhältnis 1:5 gemischt und mit DNS-Ligase versetzt. Die Ligation erfolgt bei 14⁰C in einem Zeitraum von 16 Stunden. Das Ligationsgemisch wird zur Transformation von E.coli C6000 eingesetzt.

D Selektion Acm 1-promotorenthaltener Plasmide (pRSAC)

Transformanten mit rekombinanten Plasmiden, die promotortragende DNS-Fragmente aus der Acm 1-DNS enthalten, werden auf L-Agarplatten mit 50цд · ml"¹ Streptomycin selektiert. Streptomycinresistente E.coli СбООО-Transformanten werden isoliert und hinsichtlich der Höhe ihrer Streptomycinresistenz getestet. Nach Überstempeln der Transformanten auf L-Agarplatten mit 2 000 цд · тГ¹ Streptomycin werden vier Klone identifiziert, die besonders gut unter diesen Bedingungen wachsen können. Von diesen Klonen wird mit den oben genannten Standardmethoden die Plasmid-DNS isoliert gereinigt und in TE-Puffer bei 4°C aufbewahrt. Die Plasmide der vier genannten Klone werden mit pRSAC 109, pRSAC 115, pRSAC 117 und pRSAC 119 bezeichnet.

E Ermittlung der Größe der klonierten DNS-Fragmente

Aus den Zellen der Übernachtkulturen der betreffenden Transformanten werden die Plasmide mit den unter C genannten Standardmethoden isoliert, gereinigt und in TE-Puffer aufgenommen. In vier getrennten Ansätzen wird jeweils 1 цд der pRSAC 109- bzw. pRSAC 115- bzw. pRSAC 117- bzw. pRSAC 119-DNS mit Sma I unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen verdaut und auf 1%igen Agarosegelen in an sich bekannter Weise elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Ermittlung der Fragmentgrößen werden Pstl-Fragmente der DNS des Phagen Lambda als Molekulargewichtsstandards verwendet. Von den graphisch ermittelten Smal-promotorenthaltenden DNS-Fragmentgrößen (jeweils kleinere DNS-Bande im Agarosegel) wird jeweils der Anteil des Kanamycin-Gens subtrahiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

F Konstruktion des Plasmids pRS201 Pr

Die Plasmide pRS201 und pCQV2 (Queen, 1983, J. Mol. Appl. Genet. 2,1-10) werden wie im Abschnitt C aus den Übernachtkulturen der entsprechenden Stämme isoliert, gereinigt und in TE-Puffer resuspendiert. Anschließend werden jeweils 1 цд der pCQV2- bzw. der pRS201-DNS nacheinander mit jeweils 2 Einheiten BamHI und EcoRI vollständig verdaut und die Vollständigkeit der Restriktion mittels Gelelektrophorese nachgewiesen. Nach 5minütiger Inkubation der Restriktionsansätze bei 65°C wird die DNS jeweils durch Zugabe von zwei Volumenanteilen 96%igem Ethanol und zweistündiger Inkubation bei -20°C ausgefällt, sedimentiert, getrocknet und mit Ligationspuffer aufgenommen. Beide so behandelten DNS-Ansätze werden im Verhältnis 1:1 gemischt und in an sich bekannter Weise mit DNS-Ligase ligiert. Die im Ligationsgemisch enthaltene DNS wird mittels Transformation in den Stamm E.coli C6000 überführt. Die Herstellung kompetenter Zellen und die Transformation erfolgen in an sich bekannter Weise. Die Selektion plasmidhaltiger Klone erfolgt auf L-Agarplatten mit Kanamycin (50ug · ml"'] und Streptomycin (50 цд · тГ¹) bei 30°C. Anschließend werden die Kanamycin/Streptomycinresistenten Klone durch Überstempeln auf L-Agarplatten mit Ampicillin (100ug · mr'lauf die Abwesenheit der durch das Plasmid pCQV2 kodierten Ampicillinresistenz überprüft.

Im Ergebnis wird mindestens ein Ampicillinsensitiver Klon identifiziert. Von diesem Klon wird DNS in der schon mehrfach dargestellten Weise gewonnen und mittels Restriktionsanalyse wird die Korrektheit der gentechnischen Konstruktion überprüft. Das rekombinante Plasmid, das nach elektrophoretischer Auftrennung das erwartete Spaltmuster aufweist, wird mit pRS201 p_R bezeichnet (Abb.2).

G Konstruktion des Plasmids pRS201_tac

Die Plasmide pRS201 und pDR 540 (Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden) werden aus den Übernachtkulturen der entsprechenden Bakterienstämme isoliert, gereinigt und in TE-Puffer resuspendiert.

Die DNS beider Plasmide wird analog der unter F beschriebenen Weise mit BamHI linearisiert, gemischt, ligiert und transformiert.

Die Selektion plasmidhaltiger Klone erfolgt jedoch auf L-Agarplatten mit Streptomycin (50 μg · ml"¹) bei 37 "C. Nach Überstempeln der erhaltenen Klone auf L-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika werden Klone, die gegen Ampicillin, Kanamycin und Streptomycin resistent sind, identifiziert. Von diesen Klonen wird analog zur Konstruktion von pRS201 p_R die Plasmid-DNS isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen. Im Ergebnis der Untersuchungen wird das Plasmid pRS 201 _t9C._galk (Abb. 2) isoliert. Die DNS dieses Plasmids wird mit Hindill gespalten, religiert und in E.coli C6000 transformiert. Bei der sich anschließenden Selektion werden nur Klone isoliert, die lediglich Streptomycinresistenz aufweisen. Ein Klon, derein Plasmid mit dem erwarteten Spaltmuster enthält, wird isoliert. Dieses Plasmid wird mit pRS201_tac bezeichnet (Abb. 2).

H Konstruktion des Plasmids pRS3C

Die Plasmide pCM1 und pUC4Kwerden analog wie für pRS 201 beschrieben isoliert, gereinigt und in TE-Puffer resuspendiert. Anschließend werden beide Plasmide mit Sail vollständig geschnitten und nach Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen erfolgt die elektrophoretisch^ Auftrennung der gespaltenen Plasmid-DNS in einem 1%igem Agarosegel. Von der gespaltenen pUC4K-DNS wird das 2,7 kb große Fragment und von der verdauten pCM 1-DNS das 0,78kb große Fragment per Elektroelution (Maniatis et al., 1982, „Molecular cloning. A laboratory manual.", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 164-166) isoliert. Die auf diese Weise isolierte DNS wird jeweils in 5 μΙ Ligationspuffer aufgenommen. Diese DNS wird anschließend im Verhältnis 1:1 gemischt und in an sich bekannter Weise mit DNS-Ligase behandelt. Bei der sich anschließenden Transformation des Ligationsgemisches in E.coli C6000 erfolgt die Selektion plasmidhaltiger Klone auf L-Agarplatten, die gleichzeitig Ampicillin (ЮОцд · тГ'| und Chloramphenicol (30цд · ml"¹) enthalten. Es wird mindestens ein Klon identifiziert, der ein Plasmid enthält, das nach durchgeführter Restriktionsanalyse das gewünschte Spaltmuster aufweist. Dieses Plasmid wird mit pRS3C bezeichnet (Abb.3).

I Konstruktion des Plasmids pRS3A CAT

Die DNS der Plasmide pRS3C und pRS3 A (enthält die pUC 19-DNS im Vergleich zu pRS3 in entgegengesetzter Orientierung) wird nach den oben beschriebenen Methoden aus den Übernachtkulturen der plasmidtragenden Bakterienstämme isoliert, gereinigt und in TE-Puffer aufgenommen. 2цд der pRS3C-DNS werden mit BamHI verdaut und nach Inaktivierung der Restriktase wird der Ansatz elektrophoretisch aufgetrennt. Das 0,78kb große cat-DNS-Fragment wird nach der im Abschnitt H angegebenen Methode aus dem Agarosegel eluiert. Parallel hierzu wird 1 цд der pRS3A-DNS mit BamHI vollständig gespalten.

Das cat-Gen enthaltende DNS-Fragment wird mit der BamHI-verdauten pRS 3 A-DNS vermischt und in an sich bekannter Weise mit DNS-Ligase behandelt. Das Ligat wird anschließend mit Xbal behandelt, wodurch die Selektion von Plasmidvarianten, die das Polylinkerfragment BamHI-Xbal-Sall-Xbal-BamHI des Plasmids pRS3 A enthalten, stark reduziert wird. Die Transformation erfolgt in E.coli C 6000, wobei Klone selektiert werden, die resistent gegen Kanamycin, Ampicillin und Sulfonamid sind. Von solchen Klonen wird die Plasmid-DNS isoliert und eine Restriktionsanalyse durchgeführt. Im Ergebnis wird ein Plasmid identifiziert, das das gewünschte Spaltmuster aufweist. Dieses Plasmid wird mit pRS3 A CAT bezeichnet (Abb.4).

J Insertion des cat-Gens stromabwärts von den Monierten Acm 1-Phagen-Promotoren Die nach den üblichen Methoden gewonnene pRS ЗА CAT-DNS wird mit Kpnl vollständig geschnitten und das cat-Gen enthaltende Fragment wird per Elektroelution isoliert. In vier getrennten Ansätzen wird jeweils 1 цд der auf diese Weise hergestellten cat-DNS mit 1 цд der durch Kpnl-Restriktion linearisierten pRSAC-DNS gemischt, ligiert und in E.coli C6000 transformiert. Die Selektion plasmidhaltiger Klone erfolgt auf L-Agarplatten mit Chloramphenicol (50pg · ml"¹). Im Ergebnis der anschließend in an sich bekannter Weise durchgeführten Untersuchungen werden die Plasmide mit gewünschtem Spaltmuster identifiziert und isoliert. Die Plasmide werden mit pRSAC 109 CAT, pRSAC 115 CAT, pRSAC 117 CAT und pRSAC 119 CAT bezeichnet (Abb. 5 a).

K Insertion des cat-Gens in die Plasmide pRS201p„ und pRS201_tM

Die Plasmide pRS201 p_R, pRS201_tac und pRS3C werden in der bereits mehrfach dargestellten Weise isoliert und in TE-Puffer aufgenommen. In beiden Fällen wird der BamHI-Erkennungsort zum Einbau des cat-Gens genutzt. Die DNS der drei Plasmide wird in der bereits dargestellten Weise mit BamHI vollständig gespalten. Nach Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen und Kontrolle der Vollständigkeit der Restriktion wird in zwei getrennten Ansätzen jeweils 1 μg linearisierte pRS 201 p_n-DNS mit 1 цд gespaltener pRS 3C-DNS bzw. 1 цд linearisierte pRS201_tac-DNS mit 1 цд pRS 3C-DNS in der schon dargestellten Weise miteinander ligiert. Beide Ligationsgemische werden in der üblichen Weise zur Transformation von E. coli C 6000 eingesetzt. Die Selektion von Transformanten mit rekombinanten Plasmiden, die das cat-Gen in gewünschter Orientierung stromabwärts vom PR-Promotor enthalten, erfolgt auf L-Agarplatten mit Kanamycin (100μg ml"¹). Durch nachfolgende Replicaplattierung werden Klone identifiziert, die schon bei 30°C resistent gegen Chloramphenicol sind, d. h. bei denen die vom p_R-Promotor verursachte Initiation der Transkription konstitutiv erfolgt. Die Selektion der Transformanten mit rekombinanten Plasmiden, die das cat-Gen in gewünschter Orientierung stromabwärts vom tac-Promotor enthalten, erfolgt auf L-Agarplatten mit Streptomycin (50pg · ml~¹) und Chloramphenicol (50μg ml"¹) bei 30⁰C. Die rekombinanten Plasmide, die nach Restriktion und elektrophoretischer Auftrennung das erwartete Spaltmuster aufwiesen, werden mit pRS201_R CAT bzw. mit pRS201,_3C CAT bezeichnet (Abb. 5 b, 5 c).

L Konjugativer Transfer der Plasmide pRSAC 109 CAT, pRSAC 115 CAT, pRSAC 117 CAT, pRSAC 119 CAT, pRS 201 p_R CAT und pRS201,_ac CAT in Acetobacter methanolicus (IMET B346)

Die konjugative Übertragung der Plasmide erfolgt auf der Oberfläche fester Nährmedien, vorzugsweise Vollnähragarplatten (Uhlig et al., 1986, Int. J. Syst. Bacteriol. 36,317-322) mit einem pH-Wert von 6,0. Exponentiell wachsende E.coli-Kulturen mit den zu übertragenden Plasmiden sowie eine E.coli-Kultur mit dem Helferplasmid pRK2013 und eine Bakterienkultur mit dem Rezipientenstamm A. methanolicus (IMET B346) werden sedimentiert und in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Anschließend werden in getrennten Ansätzen jeweils der entsprechende Donorstamm mit dem Helfer- und Rezipientenstamm im Verhältnis 1:1:6 gemischt, auf Vollnähragarplatten (pH 6,0) ausgespaltet und für 30 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Die gewachsenen Bakterienzellen werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und auf Selektionsplatten mit Standardagar (Uhlig et al., 1986, Int. J. Syst. Bacteriol. 36,317-322) unter Zusatz von Chloramphenicol (300 ug · ml"¹) ausgespatelt und für 5-7 Tage bei 3O⁰C inkubiert. Von diesen Agarplatten werden Einzelkolonien abgenommen, die anschließend in an sich bekannter Weise auf das Vorhandensein der zu übertragenden Plasmide überprüft werden.

M Bestimmung der spezifischen Aktivität der Chloramphenicol Acetyltransferase in Bakterienlysaten Bakterienkulturen mit den entsprechenden Plasmiden werden in der spaten logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugation geerntet, mit TDTT-Puffer (5OmM THs-HCL, pH7,8; 30 μΜ Dithiothreitol) gewaschen, mit Ultraschall lysiert, und durch Zentrifugation erfolgt die Abtrennung der Zellbruchstücke

Der Überstand (Rohextrakt) wird bis zur Enzymbestimmung im Eisbad gelagert.

In die Referenz- und Probenküvette eines geeigneten Spektrophotometers (z. B. SPECORD UV VIS, Carl Zeiss Jena) wird das Reaktionsgemisch (10OmM Tris-HCL, pH7,8; 0,4mg · ml"¹ DTNB, 0,1 mM Acetyl-CoA) einpipettiert. Zur Bestimmung der Extinktion bei 412 nm wird das Spektrophotometer entsprechend vorbereitet (justierung Ex₄₁₂ auf 0,0). Nachfolgend wird Rohextrakt in die Probenküvette einpipettiert und sofort gemischt. Nach 3 Minuten wird Chloramphenicol zum Start der Reaktion hinzugegeben (Endkonzentration 0,1 mM) und die Zunahme der Extinktion wird für 3-5 Minuten verfolgt. Anschließend erfolgt die Bestimmung des Proteingehaltes vom Rohextrakt der Probe nach einer der üblichen Standardmethoden (z. B. Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72,248-254). Aus den erhaltenen Werten wird die spezifische Aktivität der Chloramphenicol Acetyltransferase errechnet (Shaw, 1975, Methods Enzymol. 43,737-755).

Tabelle 1

Plasmid Größe der inserierten Phagen-DNS

PRSAC109 1,71 kb

pRSAC115 0,96 kb

pRSAC117 0,59 kb

pRSAC119 0,95 kb

Tabelle 2

Plasmid	Spezifische CAT-Aktivität in nmol · min"1 · mg"1	inA. methanolicus
	іпЕ.соІіСбООО	IMET B 346
		607,8
pRSAC109CAT	11504,5	751,9
PRSAC115CAT	13074,8	6418,6
PRSAC117CAT	6990,8	4436,2
pRSAC119CAT	19421,0	943,5
pRS201tacCAT	5123,8	4045,5
pRS201 PrCAT	6725,5

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Plasmide mit effektiven Promotoren für die heterologe Genexpression in Stämmen gramnegativer Bakterien, vorzugsweise Escherichia coli oder Acetobacter methanolicus, durch Insertion promotortragender Fragmente von Phagen-DNS in ein Basisplasmid, welches ein promotorloses und damit inaktives Strukturgen enthält, gekennzeichnet dadurch, daß

- SauSA-gespaltene DNS des Phagen Acm 1 von Acetobacter methanolicus mit BamHI-linearisierter Plasmid-DNS von pRS 201 ligiert,

- das Ligat zur Transformation von E. coli eingesetzt,

- durch Selektion auf das aktivierte Strukturgen (Streptomycin-Resistenzgen) die Plasmide der Serie pRSAC identifizert und anschließend

- die zu exprimierenden Gene stromabwärts von den Phagenpromotoren inseriert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß mittels Streptomycin-Resistenztest bei 2000цд · ml'¹ Streptomycin im Selektionsmedium die rekombinanten Plasmide pRSAC 109, pRSAC 115, pRSAC 117 und pRSAC 119 erhalten werden und durch Einbau des promotorlosen cat-Gens stromabwärts von den klonierten Phagenpromotoren der genannten Plasmide eine höhere Expression des cat-Gens in E. coli oder A. methanolicus erreicht wird, als durch den hybriden tac- bzw. pR-Promotor in analoger Plasmid-Konstruktion und gleichem genetischen Hintergrund.