DD290212A5 - Verfahren zur herstellung eines glukose-minimalmediums fuer escherichia coli-massenkulturfermentation - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Glukose-Minimalmediums fuer Escherichia-coli-Massenkulturfermentation zur Gewinnung rekombinierter DNA-Produkte, das sich dadurch auszeichnet, dasz{Glukose-Minimalmedium; fed-batch-Kultivierung; Massenkulturfermentation; Escherichia-coli-Zellen; rekombinante Escherichia-coli-Zellen; rekombinante DNA-Produkte; Biotrockenmassekonzentration; p H-Wert-Regelung; geringe Truebung}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Glukose-Minimalmediums für Fermentationen von Escherichia coli-Zellen, insbesondere von solchen, die Plasmide mit Genen, die für rekombinante DNA-Produkte kodieren, tragen, bis zu sehr hohen Konzentrationen an Biotrockenmasse. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die mikrobiologische bzw. pharmazeutische Forschung und Industrie.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Escherichia coli wird als bakterieller Wirt zur Herstellung verschiedener rekombinanter DNA-Produkte (z. B. Hormone, Virostatika, Immunmodulatoren, Enzyme u.a.) verwendet. Zur Erzielung hoher Konzentrationen an den gewünschten rekombinanten DNA-Produkten ist es neben einem geeigneten zellulären Expressionssystem erforderlich, die Escherichia coli-Kultur bis zu hohen Konzentrationen an Biotrockenmasse (X) zu kultivieren. Durch entsprechende Kultivierungsverfahren, nämlich durch fed-batch-Fermentationen, konnten mit E.coli X-Werte von mehr als 40g · Γ'erzielt werden (PAN, J. G„ RHEE, J. S. und LEBEAULT, J.M., 1987, Biotechnol. Letters, vol.9, No.2,89-94; MORI, H., YANO, T., KOBAYASHI, T. und SHIMIZU, S., 1979, J.Chem.Engineering, vol.12,No.4,313-319; FIESCHKO1J. und RITCH,T., 1986, Chem.Eng.Commun.,vol.45,229-240; SHILOACH, J. und BAUER, S., 1975, Biotechn. and Bioeng., vol. 17,227-239). Bei diesen fed-batch-Fermentationen erfolgt die Kultivierung von E.coli-Zellen meist in sogenannten Glukose-Mineralsalzmedien, die häufig noch mit komplexen Substraten, wie Hefeextrakt oder Peptonen, supplementieit sind. Bei der Herstellung dieser Glukose-Mineralsalzmedien treten starke Präzipitationen auf.
Diese Ausfällungen von Nährlösungskomponenten sind oft Ursache für Stufenlimitationen und machen eine optische Wachstumsmessung im on-line-ßetrieb, als Voraussetzung für gezielte Steuerungsverfahren unmöglich. Außerdem sind etliche Substratkomponenten stark überdimensioniert, wie eine Abschätzung mit den aus der' iteratur bekannten Ertragskoeffizienten (I IRT, S. J. 1975, Principles of microbe and cell cultivation, Blackwell Scientific Publ./Oxford-London-Edinburgh-Melbourne) ergibt. Deshalb sind die Konversionsgrade derartiger Substratkomponenten gering und die Nährmedien insgesamt nicht ökonomisch vorteilhaft ausgelegt. Während der o.g. Fed-batch-Fermentationen wird der pH-Wert der Kulturlösung durch alkalische Lösungen, wie z. B. durch ammoniakalische Lösung, die gleichzeitig als Stickstoffquelle dient, bzw. durch NaOH, aufrechterhalten. In der Zufütterungsphase wird Glukose vorrangig als Feeding-Substrat verwendet.
Bei allen o. g. Verfahren ist es weiterhin erforderlich, im Verlaufe der Fermentation zusätzlich mehrere Salze und z.T. auch andere Substrate, wie z.B. Vitamine, Aminosäuren bzw. Hefeextrakt, zu dosieren. Dies ist nachteilig, da zusätzliche Dosierungssysteme notwendig sind und da insbesondere eine ständige Überwachung der Fermentation mit den entsprechenden Dosierungen zu den adäquaten Zeiten erfolgen muß.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung verfolgt Gas Ziel, ein Glukose-Minimalmedium bereitzustellen, in dem Escherichia-coli-Zellen auf einfache Weise bis zu hohen Biotrockenmassekonzentrationen fermentiert werden können.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Dor Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Glukose-Minimal mediums zu beschreiben, in dem Escherichia-coli-Zellen in einem fed-batch-Verfahren auf einfache Weise bis zu sehr hohen Biotrockenmassekonzentrationen kultiviert werden können, ohne daß starke Präzipitationen bei der Zubereitung der Nährlösung auftreten, und ohne daß nach der Beimpfung der Nährlösung während der Fermentation stetige Dosierungen bzw. einmalige oder mehrmalige Zugaben weiterer Nährlösungskomponenten erforderlich sind.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bezogen auf einen Fermentationsansatz von ca. 141 wie folgt gelöst: Für einen Ansatz dieses Volumens für ein fed-batch-Verfahren zur Kultivierung von Escherichia coli mit üblicher Glukosedosierung und pH-Regelung werden 117,2g KH2PO4, > 15g Zitronensäure und 35g (NH4I2HPO4 getrennt in jeweils 11 Aqua dest. gelöst und anschließend mit öl Aqua dest. vermischt. Dann werden 20ml Eisenzitratlösung [2,7Gew.-%], sowie mit
20mlSpurengemischlösung (0,2GeW1-0ZoCoCI2 · 6H2O, 1,2Gew.-% MnCI2 · 4H20,0,113Gew.-% CuCI2 · H20,0,25Gew.-% H3BO3, 0,2Gew.-% N2MoO4 · 2 H20,0,5Gew.-% Zitronensäure) hinzugegeben und mit Aqua dest. bis zu einem Volumen von 8,51 aufgefüllt. Diese Lösung wird im Fermentor für 15 Minuten bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, dampfsterilisiert. Nach dem Abkühlen werden 1 I Glukoselösung [5Gew.-% bis 75Gew.-% Gluko n) und 20ml Zinkacetatlösung (0,63Gew.-% Zn(CH3COO)2,0,372Gew.-% EDTA] sowie nach Einstellung der Aciclität mit 25%igem NH3 auf pH6,9 11 Magnesiumsulfatlösung [0,33Gew.-%MgSO4 · H2O) hinzugegeben. Abschließend erfolgt die Neueinstellung der Acidität mit 25%igem NH3 auf pH6,5 bis pH 6,9, vorzugsweise pH 6,7.
Die Spurengemischlösung wird zubereitet, indem zunächst 2g CoCI2 6H20,12g MnCI2 Ί H20,1,13g CuCI2 H2O in 50OmI Aqua dest. unter Zusatz von 3g Zitronensäure durch Kochen in Lösung gebracht und parallel dazu 2,5g H3BO3 unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 10OmI Aqua dest. durch Kochen gelöst werden. Weiterhin werden parallel 2 g Na2MoO4 2 H2O unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 10OmI Aqua dest. gekocht und diese drei Parallelansätze nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur gemischt und mit Aqua dest. auf 11 aufgefüllt.
Die Eisenzitiatlösung wird zubereitet, indem 27g Eisenzitrat In 11 Aqua dest. gelöst werden.
Die Glukoselösung wird zubereitet, indem 75g bis 900g Glukose in 11 Aqua dest. gelöst werden und die erhaltene Lösung anschließend autoklaviert/sterilisiert wird.
Die Zinkacetatlösung wird zubereitet, indem 6,3g Zn(CH3COO)2 2 H2O unter Zusatz von 3,72 g EDTA in 100 ml Aqua dest. durch Kochen gelöst, anschließend mit Aqua dest. auf 11 aufgefüllt und die erhaltene Lösung steril filtriert wird. Die Magnesiumsulfatlösung wird zubereitet, indem 33g MgSO4 · H2O in 11 Aqua dest. gelöst und die erhaltene Lösung anschließend sterilisiert wird.
Dem Glukose-Minimalmedium werden zusätzlich Auxotrophiemarker-Substanzen sowie Selektionsmarker-Substanzen gemäß den Auxotrophien und Selektionsmarkern der in diesem Medium zu fermentierenden Stämme zugegeben. Zur Vermeidung von Schaumbildung während der Fermentation werden dem Ansatz des Glukose-Minialmediums in an sich bekannter Weise Antischaummittel zugegeben.
Für eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung werden dem Glukose-Minimalmedium bei Beimpfung mit den Escherichia coli-Stämmen TG1 bzw. SK1590 zusätzlich die Auxotrophiemarkersubstanz Thiamin, bei Beimpfung mit Escherichia coli-Stämmen, die Plasmide mit Resistenz-kodiertsn Genen tragen, die den Resistenzen entsprechenden Marker, wie Ampicillin, Tetracyclin oder Erythromycin und bei Beimpfung mit den rekombinanten E.coli-Stämmen, wie TG 1/pBB210 odr SK1590/ pHRW400, Thiamin sowie Ampicillin zugegeben.
Im beschriebenen Ansatz sind Fermentationen bis zu Biotrockenmassekonzentrationen von 70g Γ' möglich. Bei Verwendung des Glukose-Minimalmediums für Fermentationen bis zu Biotrockenmassekonzentrationen von 70g Γ1 bis 20g Γ1 sind die Anteile der Substrate nach dem angegebenen Herstellungsverfahren für das Glukose-Minimalmedium entsprechend prozentual zu den angegebenen Werten für Biotrockenmassekonzentrationen von 70g Γ' reduziert einzusetzen. Dadurch werden die üblicherweise auftretenden Präzipitatbildungen, die beim Ansatz von Nährmedien, in denen Biotrockenmassekonzentrationen ab ca. 20g Γ1 produziert werden sollen, auftreten, vermieden.
Dem Glukose-Minimalmedium wird nach Beimpfung in der fed-batch-Phase Glukose in einer Konzentration von 700g · Γ1 zudosiert. Zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes wird dem Glukose-Minimalmedium nach Be.mpfung ammoniakalische Lösung zugegeben.
Bei der Herstellung des Glukose-Minialmediums für andere Ansa'zvolumina sind die einzelnen Nährlösungskomponenten prozentual zu verändern. In dieser Weise lassen sich vorteilhaft insbesondere auch Glukose-Minimalmedia bis zu Ansatz-Volumina von 5001 herstellen
Das nach dem beschriebenen Herstellungsverfahren angesetzte Glukose-Minimalmedium hat vor dem Beimpfen einen
Extinktionswert von E f70 nm « 0,1 (gemessen in einer 1 cm-Küvette bei einer Wellenlänge voa470 nm). Dieser im Vergleich zu 1cm
Aqua dest. (E 470nm „ n,02) unter entsprechenden Bedingungen gemessene, geringfügig höhere Wert ist durch eine leichte 1cm
präzipitatbedingteTrübung verursacht. Nach Erreichen einer Biotrockenmassekonzentration von ca. 15g · Γ verden Meßwerte der Extinktion, aus denen über eine Eichkurve die Biotrockenmassekonzentrationen berechnet werden können, nur um £3% präzipitatbedingt zu groß ermittelt. Dieser geringe Fehler erlaubt, insbesondere bei Einbeziehung eines Korrekturfaktors, eine optische on-line-Messung und Berechnung der Biotrockenmassekonzentration als Basis' Jr gezielte Steuerungen von Fermentationen.
Im folgenden wird nun die Vorgehensweise bei der Herstellung des Glukose-Minimalmedium noch ausführlicher beschrieben, wobei sich die quantitativen Angaben auf den Ansatz von 141 beziehen:
117,2g KH2PO4, > 15g Zitronensäure und 35g (NH4I2HPO4 werden einzeln in je 11 Aqua dest. gelöst, mit 51 Aqua dest. vermischt und nach Zusatz von 20ml Eisenzitratlösung(27g · Γ1) und 20 ml Spurengemischlösung (Herstellung: Zunächst werden in 500ml Aqua dest. 2g CoCI2 6H20,12g MnCI2 · 4H20,1,13g CuCI2 · H2O unter Zusatz von 3g Zitronensäure durch Kochen in Lösung gebracht. Parallel dazu werden 2,5g H3BO3 unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 100ml Aqua dest. durch Kochen gelöst. Weiterhin werden parallel 2g Na2MoO4 2 H2O unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 100ml Aqua dest. gekocht. Diese drei Parallelansätze werden nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur gemischt und ergeben, mit Aqua dest. auf 11 aufgefüllt, die Spurengemischlösung.) mit Aqua dest. auf 8,51 aufgefüllt. Diese Lösung wird anschließend mit Dampf bei einer Temperatur von 1210C, einem Überdruck von 105 kPa über einen Zeitraum von 30 Minuten sterilisiert. Das Volumen des Ansatzes steigt durch die Kondensatbildung während der Dampfsterilisation auf 111 bis 131 an. Nach dem Abkühlen der hitzesterilisierten Lösung auf eine Temperatur unter 500C werden nacheinander folgen ie Lösungen zugesetzt: 11 autoklavierte Glukoselösung (75g bis 900g Glukose in 11 Aqua dest.) und 20ml Zinkacetatlösu.^ (Herstellung: 6,3g Zn(CH3COO)2 · 2H2O werden unter Zusatz von 3,72g EDTA in 100 ml Aqua dest. gekocht, anschließend auf 11 mit Aqua dest. aufgefüllt und steril filtriert). Vor der Einstellung des pH-Wertes der so zubereiteten Nährlösung auf pH 6,9 mit 25%iger ammoniakalischer Lösung erfolgt noch bei Bedarf der Zusatz von sterilen Lösungen mit Auxotrophiemarker und Selektionsmarker. Soll später das Glukose-Minimalmerlium z. B. mit dem E.coli-Stamm TG1 oder SK1590 beimpft werden, dann wird als Auxotrophiemarker Thiamin zugesetzt, und zwar 40 mg in wäßriger Lösung. Erhalten die E.coli-Stämme Plasmide mit für Ampicillinresistenz kodierenden Genen, wie z.B. pBB210 oder pHRW400, dann wird außerdem Ampicillin in wäßriger Lösung hinzugefügt. Nach Einstellen des pH-Wertes der bis dahin
zubereiteten Nährlösung auf pH6,9 erfolgt der Zusatz von 11 Magnesiumsulfatlösung (33g MgSO4 H2O in 11 Aquadest.; autoklav!art). Dadurch sinkt der pH-Wert ab. Die Nährlösung wird dann im Fermentor regeltechnisch wieder auf pH 6,8 mit 25%iger ammoniakalischer Lösung eingestellt. Das so hergestellte Glukose-Minimalmedium von ca. 141 ist somit fertig vorbereitet für die Beimpfung mit E.coli.
Das Glukose-Minimalmedium hat somit quantitativ folgende Zusammensetzung:
KH2PO4 (7,8g · Γ1), (NH4)2HPO4 (2,3g · Γ'), MgSO4 · H2O (2,2g · Γ'), Zitronensäure (> 1,0g · I"'), Eisenzitrat (36mg Γ"), CoCI, · 6H2O (2,7mg · Γ1), MnCI2 4H2O (16mg · Γ1), CuCI2 · H2O H,5mg · I"1), H3BO3 (3,3mg · Γ1), Na2MoO4 · 2H2O (2,7 mg · I"1), Zn(CH3COO)2 · 2H2O (8,4 mg · Γ1), EDTA (5mg · I"1), Glukose (5g · I"1 bis 60 g · I"') und bei Bedarf z.B. Thiamin (2,7 mg Γ1) und Ampicillin (50 bis 100 mg · Γ1) bzw. andere Auxotrophiemarker oder Selektionsmarker.
Das verfahrensmäßig zubereitete Glukose-Minimalmedium zeichnet sich neben seiner geringen Präzipitatbildung insbesondere dadurch aus, daß nach der Beimpfung die eingesetzten Substrate durch das Wachstum von E.coli während der fed-batch-Fermentation mit Dosierung von Glukose (70Og Γ1) und pH-Regelung mit 25%iger ammoniakalischer Lösung bis zu hohen Zelldichten (X » 70g · Γ1) nahezu vollständig verstoffwechsolt werden.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung gegenüber den bisher bekannten technischen Lösungen bestehen zusammenfassend insbesondere darin, daß
1. das hergestellte Glukose-Minimalmedium bereits alle Nährsalze für fed-batch-Fermentationen mit E.coli bis zu hohen Biotrockenmassekonzentrationen (X » 70g · Γ') enthält, ohne daß nochmals Salzdosierungen in der fed-batch-Phase erfolgen müssen, so daß zusätzliche Kontaminationsrisiken ausgeschaltet werden.
2. die einzelnen Substrate im Glukose-Minimalmedium, die in der fed-batch-Phase dosierte Glukose und die zur pH-Aufrechterhaltung eingebrachte NH3-Menge nahezu vollständig verstoffwechselt werden, und
3. das Glukose-Minimalmedium durch die spezielle Zubereitungsprozedur nur eine geringe präzitatbedingte Trübung aufweist.
Ausführungsbeispiel
Im folgenden wird die Herstellung des Glukose-Minimallmediums beschrieben, in dem E.coli TG 1/pBB210 zur Gewinnung von rekombinanten Humaninterferon-alpha 1 bis zu hohen Biotrockenmassekonzentrationen (X = 70g Γ1) nach einem fed-batch-Verfahren mit Dosierung von Glukose und pH-Regelung mit 25%igem Ammoniak, ohne daß weitere Zugaben von Nährlösungskomponenten während der Fermentation erforderlich .sind, fermentiert werden kann. Herstellungsregime:
Folgende Komponenten werden getrennt in je 11 Aqua dest. gelöst und zu 5I Aqua dest. hinzugegeben: KH2PO4 (117,2 g), Zitronensäure (15g), (NH4)2HPO4 (35g). Nach Zusatz von 20ml Eisenzitratlösung (27g Eisenzitrat pro 11 Aqua dest.) und 20ml Spurengemischlösung erfolgt die Auffüllung mit Aqua dest. auf 8,51. Diese Nährlösung wird in einem Rührkesselfermentor des Typs Chemap 30 dampfsterilisiert (Zeitdauer: ca. 30min, Temperatur: 121 °C, Überdruck: ca. 105kPa). Durch Kondensatbildung während der Sterilisation erhöht sich das Volumen des Ansatzes auf 111 bis 131.
Die Spurengemischlösung wird folgendermaßen hergestellt: Zunächst werden in 500ml Aqua dest. 2g CoCI2 · 6H20,12g MnCI2 · 4H20,1,13g CuCI2 · H2O unter Zusatz von 3g Zitronensäure durch Kochen in Lösung gebracht. Parallel werden 2,5g H3BO3 unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 100 ml Aqua dest. durch Kochen gelöst. Weiterhin werden parallel 2g Na2MoO4 2 H2O unter Zusatz von 1 g Zitronensäure in 100ml Aqua dest. gekocht. Diese drei Parallelansätze werden nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur gemischt und auf 11 mit Aqua dest. aufgefüllt. Dio so hergestellte Lösung ist die Spurengemischlösung, von der 20 ml eingesetzt werden.
Zu der dampfsterilisierten Nährlösung im Chemap 30 werden nach dem Abkühlen in folgender Reihenfolge die nachstehenden einzeln hergestellten Komponenten unter Rührung hinzugegeben:
Erstens 1,11 Glukose-Thiaminlösung, zweitens 20ml Zinkacetatlösung und drittens 60ml des Selktionsmarkers Ampicillin. Die drei Lösungen werden getrennt wie folgt zubereitet: Glukose-Thiaminlösung:
375 Glukose werden in 11 Aqua dest. autoklaviert. Parallel werden .n einem anderen Gefäß 40mg Thiamin, die in 100ml Aqua dest. gelöst wurden, ebenfalls autoklaviert. Nach dem Abkühlen wird die Thiaminlösung in die Glukoselösung eingebracht. Zinkacetattösung:
6,3 ρ Zn(CH3COO)2- 2 H2O werden unter Zusatz von 3,72 g EDTA in lOOrnl Aqua dest. gekocht, anschließend auf 11 mit Aqua dest. aufgefüllt und steril filtriert
Ampicillinlösung:
1,5g Ampicillin werden in ca. 60 ml Aqua dest. gelöst und steril filtriert.
Nach Zusatz der o.g. drei Lösungen zum dampfsterilisierten Ansatz wird der pH-Wert mit 25%igerr. Ammoniak auf pH 6,9 eingestellt. Dann erfolgt der Zusatz von 11 Magnesiumsulfatlösung (33g MgSO4 H2O in 11 Aqua dest.; autoklaviert), was mit einer Abnahme des pH-Wertes verbunden ist. Der pH-Wert wird nun auf pH 6,8 eingestellt. Anschließend werden 250ml Impfsuspension E.coli TG1 'pBB 210 hinzugesetzt und die Fermentation begonnen. Das Kulturvolumen zu Fermentationsbeginn beträgt somit 131 bis 151. Das beimpfte Glukose-Minimalmedium hat bei einem Volumen von 151 folgende Zusammensetzung: KH2PO4 (7,8g · Γ1). (NH4J2HPO4 (2,3g · Γ1), MgSO4 · H2O (2,2g · Γ1), Zitronensäure (ca. 1,0g I"1), Eisenzitrat (36mg · Γ1), CoCI2 · 6H2O (2,7mg · Γ1), MnCI2 · 4H2O (16mg · I"1), CuCI2 · H2O (1,5mg · I"1), H3BO3 (3,3mg Γ1), Na2MoO4 · 2H2O (2,7mg · Γ'), Zn(CH3COO)2- 2H2O (8,4mg · r'),EDTA(5mg · Γ1), Glukose (25g l"')und Ampicillin (100mg · Γ'). Im Verlauf der Fermentation nimmt das Anfangsvolumen durch die geregelte Dosierung von 25%igem NH3 zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes und durch die Glukosedosierung zu, wobei das Endvolumen der Kulturlösung, mit der hohen Biotrockenmassekonzentration von X »70g !"',etwa 161 bis 2Ol beträgt.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung eines Glukose-Minimalmediums für Escherichia coli-Massenkulturfermentation bis zu hohen Biotrockenmassekonzentrationen nach einem fed-batch-Verfahren mit üblicher Glukosedosierung und pH-Regelung, gekennzeichnet dadurch, daß für einen Ansatz von ca. 141
- 117,2g KH2PO4, & 15g Zitronensäure und 35g (NH4I2HPO4, getrennt in jeweils 11 Aqua dest. gelöst, anschließend mit 51 Aqua dest. vermischt, mit 20 ml Eisenzitratlösung [2,7Gew.-%l,
" sowie mit 20ml Spurengemischlösung '0,2Gew.-% CoCI2 · 6H20,1,2Gew.-% MnCI2 · 4H2O, 0,113Gew.-% CuCI2 · H20,0,25Gew.-% F3BOa, 0,2Gew.-% N2MoO4 · 2H20,0,5Gew.-% Zitronensäure) versetzt und mit Aqua det.t. bis zu einem Volumen von 8,51 aufgefüllt werden,
- danach diese Lösung im Fermentor für 15 Minuten bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, dampfsterilisiert wird,
- nach dem Abkühlen 11 Glukoselösung [5 bis 75Gew.-% Glukose] und 2OmI Zinkacetatlösung [0,63Gew.-% Zn(CH3COO)2,0,372 Gew.-% EDTAl sowie nach Einstellung des pH-Wertes mit 25%igem NH3 auf pH 6,9 1I Magnesiumsulfatlösung [0,33Gew.% MgSO4 · H2O] hinzugegeben werden und
- abschießend Neueinstellung des pH-Wertes mit 25%igem NH3 auf pH 6,5 bis pH 6,9, vorzugsweise pH 6,8, vorgenommen
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Spurengemischiösung zubereitet wird, indem
- zunächst2gCoCI2-6H20,12g MnCI2-4H2OJ1ISg CuCI2- H2O in 500ml Aqua dest. unter Zusatz von 3g Zitronensäure durch Kochen in Lösung gebracht,
- parallel dazu 2,5g H3BO3 unter Zusatz von 1g Zitronensäure in 10OmI Aqua dest. durch Kochen gelöst,
- parallel weiterhin 2 g Na2MoO4- 2 H2O unter Zusatz von 1g Zitronensäure in 10OmI Aqua dest. gekocht und
diese drei Parallelansätze nach dem Abkühlen gemischt und mit Aqua dest. auf 11 aufgefüllt werden.
3. Verfahret. nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Eisenzitratlösung zubereitet wird, indem 27g Eisenzitrat in 11 Aqua dest. gelöst werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Glukoselösung zubereitet wird, indem 75g bis 900g Glukose in 11 Aqua dest. gelöst werden und die erhaltene Lösung anschließend sterilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zinkacetatlösung zubereitet wird, indem 6,3g Zn(CH3COO)2 · 2H2O unter Zusatz von 3,72g EDTA in 10OmI Aqua dest. durch Kochen gelöst, anschließend mit Aqua dest. auf 11 aufgefüllt und die erhaltene Lösung steril filtriert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Magnesiumsulfatlösung zubereitet wird, indem 33g MgSO4 · H2O in 11 Aqua dest. gelöst und die erhaltene Lösung ansxhließend sterilisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium zusätzlich Auxotrophiemarker-Substanzen sowie Selektionsmarker-Substanzen gemäß den Auxotrophien und Selektionsmarkern der in diesem Medium zu fermentierenden Stämme zugegeben werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium bei Beimpfung mit den Escherichia coli-Stämmen TG1 bzw. SK1590 zusätzlich die Auxotrophiemarkersubstanz Thiamin zugegeben wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium bei Beimpf ung mit Escherichia coü-Stämmen, die Plasmide mit Resistenz-kodierten Genen tragen, die den Resistenzen entsprechenden Marker wie Ampicillin, Tetracyclin oder Erythromycin zugegeben werden.
10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium bei Beimpfung mit den rekombinanten Stämmen E.coli TG 1/pBB210 oder SK1590/pHRW400 Thiamin sowie Ampicillin zugegeben werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium nach Beimpfung in derfed-batch-Phase Glukose in einer Konzentration von 700g · Γ1 zudosiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß dem Glukose-Minimalmedium nach Beimpfung zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes ammoniakalische Lösung zugegeben wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß bei Herstellung des Glukose-Minimalmediums für beliebige Ansatzvolumina die einzelnen Nährlösungskomponenten prozentual verändert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß bei Verwendung des Glukose-Minimalmediums für Fermentationen bis zu Biotrockenmassekonzentrationen von 70g · I"1 bis 20g · Γ1 die Anteile der Substrate im Glukose-Minimalmedium entsprechend prozentual zu den angegebenen Werten für Biotrockenmassekonzentrationen von 70g · Γ1 reduziert werden.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31836988A DD290212A5 (de) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Verfahren zur herstellung eines glukose-minimalmediums fuer escherichia coli-massenkulturfermentation |
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| DD290212A5 true DD290212A5 (de) | 1991-05-23 |
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|---|---|
| DD (1) | DD290212A5 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714348A (en) * | 1993-11-05 | 1998-02-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oxygen-dependent fermentation of microorganisms |
| US7381545B2 (en) | 1994-04-28 | 2008-06-03 | Amgen Inc. | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations |
| CN113897272A (zh) * | 2021-09-26 | 2022-01-07 | 山东润德生物科技有限公司 | 氨基葡萄糖发酵过程补加诱导剂的过滤除菌装置及其应用 |
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1988
- 1988-07-28 DD DD31836988A patent/DD290212A5/de not_active IP Right Cessation
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| US5714348A (en) * | 1993-11-05 | 1998-02-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oxygen-dependent fermentation of microorganisms |
| US7381545B2 (en) | 1994-04-28 | 2008-06-03 | Amgen Inc. | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations |
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