DD290658A5 - Mittel und verfahren zur schnellen peptidkupplung - Google Patents

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DD290658A5
DD290658A5 DD89336264A DD33626489A DD290658A5 DD 290658 A5 DD290658 A5 DD 290658A5 DD 89336264 A DD89336264 A DD 89336264A DD 33626489 A DD33626489 A DD 33626489A DD 290658 A5 DD290658 A5 DD 290658A5
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peptide
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Michael Beyermann
Louis A Carpino
Guang Huang
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur schnellen Peptidkupplung. Ziel der Erfindung ist die wesentliche Beschleunigung der Formierung der Peptidbindung im Rahmen der Peptidsynthese. Die Aufgabe der Erfindung wurde dadurch geloest, dasz bei Verwendung von bekannten, aktivierten Carboxylkomponenten, dem Acylierungsschritt der Aminkomponente eine basische, katalytisch aktive Mischung aus einem tertiaeren Amin und einem N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus bzw. ein entsprechendes quartaeres Ammoniumsalz zugesetzt wird. Dadurch wird die Acylierungsgeschwindigkeit wesentlich erhoeht, was zu einer deutlichen Verringerung der Synthesezeiten fuer die Peptidsynthese fuehrt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Peptidchemie.{Peptidsynthese; schnelle Peptidkupplung; tertiaeres Amin; N-Hydroxy-Stickstoff enthaltender Heterocyclus; quartaeres Ammoniumsalz}

Description

L-AA-X
darstellt, worin Leine basenlabile, eine nucleophil-labile, eine säurelabile oder eine durch Hydrierung entfernbare N°-Aminoschutzgruppe, AA einen Aminosäurerest und X Hydroxyl, Halogen oder einen Rest der Formel
O —
(Rl2>n
darstellt, worin jeder Rest R12 unabhängig Halogen, Nitro oder Cyano bedeuten kann und η eine ganze Zahl von 0 bis 5.
31. Verfahren nach Anspruch 30, gekennzeichnet dadurch, daß L (9-Fluorenylmethyl)-oxycarbonyl, 2-(t-Butylsulfonyl)-2-propenyloxycarbonyl, Benzothiophensulfon-2-methyloxycarbonyl, t-Butyloxycärbonyl oder Benzyloxycarbonyl ist.
32. Verfahren nach den Ansprüchen 15 und 30, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite Aminosäure Fmoc-AA-Chlorid oder Fmoc-AA-Pentafluorophenylester ist, wobei AA eine der 20 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren ist.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein neues Mittel und ein Verfahren zur Acylierung in der Peptidsynthese. Speziell bezieht sich die Erfindung auf eine neue Mischung eines N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus und eines tertiären Amins oder eines entsprechenden quartären Ammo.iiumealzes als basischer Katalysator im Acylierungsschritt In der Peptidsynthese.. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Peptidchemie.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Da mehr und mehr Polypeptide medizinsich bedeutsam werden, besteht eine erhöhte Motivation zur Verbesserung der Methoden, mit denen sie synthetisiert werden. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Peptiden synthetisiert, die pharmakologisch bedeutsam sind, z. B. solche, die wirksam gegen Krebs, Diabetes, Pflanzentoxine usw. sind. Andere Peptide zeigen eine spezifische Aktivität, wie z. B. Wachstumsförderer oder -hemmer. Antibiotika, Insektizide, Kontrazepti.* Antihypertensiva. Schlaf-Induzierer, Antidepressiva, Analgetika usw.
Bekannte Methoden zur Peptidsynthese sind gegenwärtig die Synthese in Lösung durch klassische oder repetitive Methoden oder die Synthese am festem Träger (Merrifield). Verfahren in Lösung haben den Vorteil des einfachen Monitorings und erlauben die Reinigung vor Zwischenprodukten, wenn nötig auf jeder Stufe. Ein hauptsächlicher Nachteil ist der relativ langsame Gang der Synthese, weil jeder Schritt manuell ausgeführt wird. Der Hauptvorteil der Merrifield-Methode ist ihre einfache Automatisiorbarkeit, so daß unbeaufsichtigte, computerkontrollierte maschinelle Synthesen möglich sind. Nachteilig ist jedoch, daß jeder Acylierungsschritt quantitativ ablaufen muß, da sonst Produktgemische am Polymer aufgebaut werden. Je länger die Kette iüt, desto größer wird die Anzahl unerwünschter Nebenreaktionen. Die so erhaltenen Nebenprodukte verunreinigen das jeweilige Endprodukt. Für Peptide bis zu ca. 20-30 Aminosäureresten ist eine Trennung noch gut möglich, für sehr lange Segmente (50 oder mehr Aminosäuren) jedoch sind die gegenwärtigen Methoden nicht befriedigend. Oft werden Mischungen von solch einer Komplexität erhalten, daß es schwierig oder unmöglich sein kann, das gewünschte Peptid zu isolieren. Um Nebenreaktionen zu minimieren, werden bekannterweise N°-Schutzgruppen wie (9-FluorenylmethyU-oxycarbonyl (Fmoc) eingesetzt. Zusätzlich müssen jedoch auch andere Aspekte der Kupplungsreaktion in Erwägung gezogen werden, wie z. B. der Acylierungsteil der N-geschützten Aminosäure, sowie die Reaktionsbedingungen für die durchzuführende Kupplung. In der auf Fmoc basierenden Festphasen-Peptidsynthese werden Fmoc-Aminosäure-pentafluorophenylester (Fmoc-AA-OPfp), die τ'. lalogen N-Hydroxybenzotriazinester und symmetrische Anhydride benutzt. Noch sind diese Ester teuer, und L>dim Gebrauch der symmetrischen Anhydride vorliort man die Hälfte des reaktiven Agens.
Als Kupplungsreagens wurden die Fmoc-Aminosäure-chloride von CARPINO et al. (J. org. Chem. 51, [1986] 3732) beschrieben und isoliert, ihre einfache Darstellbarkeit ι nd ihre hohe Reaktivität favorisieren sie gegenüber den bekannten Aminosäurederivaten zur Knüpfung von Peptidbindungen. CARPINO et al. benutzten besagtes Reagens bei der Synthese eines Peptide in Lösung, wobei als notwendige Base zum Neutralisieren der während der Reaktion entstehenden HCI neben der mit Wasser nicht mischbaren organischen Reaktionsphase eine wäßrige Phase mit einer anorganischen Base, wie z. B. Natriumcarbonat verwendet wird. Die Verwendung dieses Systems gewährleistet neben einer schnellen Kupplung eine racemisierungsfreie Synthese. Zur Peptidsynthese in homogener organischer Lösung - so auch in der Festphasenpeptidsynthese- scheidet der Einsatz anorganischer Basen aus und es werden in der Regel tertiäre Amine als Basen zugesetzt. Diese f.ertiären Amine können mit Säurechloriden weniger reaktive Zwischenprodukte (Acylammoniumchloride, Oxazolone) bilden, wodurch jedoch der Effekt der hohen Reaktivität der Säurechloride reduziert wird.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein Mittel und ein Verfahren zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Peptidsynthese- insbesondere der Festphasenpeptidsynthese - unter Verwendung allgemein bekannter Aktivierungsmöglichkeiten zur Verfügung zu stellen.
Darstellung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel und ein Verfahren zur schnellen Knüpfung einer Peptidbindung zwischen einer ersten Aminosäure, welche eine freie N-terminale Aminogruppe enthält und einer acylierenden zweiten Aminosäure, welche eine Aminoschutzgruppe enthält, zu entwickeln.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß die Kupplung in Gegenwart eines Mittels erfolgt, welches eine Mischung aus einem tertiären Amin der Formel
Ri
und einem N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus oder das entsprechende quartäre Ammoniumsalz enthält, worin R1, R2 und R3 voneinander unabhängig niederes Alkyl bedeuten oder R1 und R2 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring bilden.
Die Anwesenheit deo tertiären Amins und des Heterocyclus führt über einen synergistischen Effekt zur Beschleunigung der Bildung einer Peptidbindung zwischen einer ersten Aminosäure mit einer freien N-terminalen Aminogruppe und einer acylierenden N-terminal geschützten zweiten Aminosäure.
Der hier verwendete Ausdruck Stickstoff enthaltender Heterocyclus schließt solche heterocyclischen Ringe ein, die mindestens ein Ringstickstoffatom haben. Jedoch können auch andere Heteroatome, wie Sauerstoff oder Schwefel, zusätzlich im Ring sein. Bevorzugt wird ein heterocyclischer Ring mit mindestens einem Ring-Stickstoffatom. Besonders bevorzugt sind jedoch zwei Ring-Stickstoffatome. Der heterocyclische Teil kann gesättigt, partiell ungesättigt oder heteroaromatisch sein. Der heterocyclische Ring enthält 5-14 Ringatome und bis maximal 13 Ring-C-Atome und insgesamt 18 C-Atome. Der heterocyclische Ring kann mono-, bi- oder tricyclisch sein. Ebenfalls einbezogen sind die sogenannten »benzo* Heterocyclen. Beispiele sind Benzotriazol, Pyrrol, Imidazol, Indazol, Pyrazol, Pyrazine, Piperidin, Pyrimidin, Pyridazin, Indol, Purin, Isochinolin, Chinolin, Chinoxalin, Chinazolin, Carbazol, Furazan, Phthalimid usw.
Die Bezeichnung „N-Hydroxy-Stickstoff enthaltender Heterocyclus" bezieht sich auf den Stickstoff enthaltenden Heterocyclus (oben definiert), der durch Hydroxyl an einem der Ring-Stickstoffatome substituiert ist. Die bevorzugten N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclen haben die Formel
-OH
10.
worin Re und R8 unabhängig Wasserstoff oder niederes Alkyl sind, oder R6 und R9 zusammen mit den C-Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden, der unsubstituiert oder monosubstituiert ist mit niederem Alkyl oder einer elektronenziehenden Gruppe.
A ist N oder CR7, Z ist N oder CR8, und A ist N, wenn Z gleich N ist, und R7 und R8 sind unabhängig niederes Alkyl, Wasserstoff oder eine elektronenziehende Gruppe; R10 und R11 sind Wasserstoff oder niederes Alkyl oder eine elektronenziehende Gruppe, oder Rio und R11 bilden zusammen eine Bindung, oder R10 und R11 sind nicht vorhanden, · venn Rs und Rg zusammen einen aromatischen Ring, wie z. B. Benzo, bilden. Bilden R)0 und R11 eine Bindung, ist im genannten Heterocyclus eine Doppelblndung an den entsprachanden Positionen, wie z. B. in folgenden Heterocyclen
R-OH ,
OH I N
OH
,V
J
worin Z und A cie oben angegebene Bedeutung haben und R6 und R6 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder eineelektronenziehende Gruppe sind.
Die am meisten bevorzugten N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclen haben die Formel
N-OH
worin Z, A, R7 und Rg wie oben definiert sind und Rg gleich Wasserstoff, niederes Alkyl oder eine elektronenziehende Gruppe darstellt. Besonders bevorzugte N-Hydroxy-Stickstoff enthaltende Heterocyclen haben die Formel
OH
I-OH
Ii-OiI
I)-OM
Der am meisten bevorzugte N-Hydroxy-Stickstoff enthaltende Hetrrocyclus ist Hydroxy-benzotriazol (HOBt). Wie hier definiert, bezieht sich der Terminus niederes Alkyl, wenn allein oder in Kombination verwendet, auf Alkylgruppen, die
1-6 C-Atome enthalten. Sie können geradkettig oder vorzweigt sein und beinhalten solche Gruppen wie Methyl, Ethyl, Propyl,
Isopropyl, Butyl, sec-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl usw. Die bevorzugten Alkylgruppen enthalten
1-4 C-Atome.
Die Terminus „aromatischer Ring", allein oder in Kombination benutzt, bezieht sich auf einen Arylring, der 6 bis 10 Ring-C-Atome
enthält. Diese Gruppen schließen Phenyl, α-Naphthyl, ß-Naphthyl usw. ein, wobei Phenyl bevorzugt ist. Eine bevorzugte Strukturliegt ebenfalls vor, wenn R6 und R8 mit den C-Atomen, an die sie gebunden sind, zusammen einen „Benzo'ring bilden.
Der Terminus „elektronenziehende Gruppe", wie er hier definiert ist, soll eine Gruppe bezeichnen, welche Elektronen zu sich
heranzieht, mehr als dies ein Η-Atom tun würde, wenn es dieselbe Position im Molekül innehätte (Vgl. J. MARCH, Advanced
Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, p. 17,1985). Weiterhin sollen elektronenziehende Gruppen, wie hier benutzt,
keine labilen oder leicht ionisierbaren H-Atome enthalten, weil diese Typen von Gruppen die Kupplungsreaktion beeinflussenwürden.
Der Typ, auf den sich diese elektronenziehenden Gruppen, wie hier definiert, beziehen, sind dem Fachmann gut bekannt. Sie
schließen solche Gruppen, wie Nitro, Monohalogenalkyl, Dihalogenalkyl, TrihalogenalkyI (z. B. Trifluprmethyl), Halogen, Formyl,niederes Alkanoyl, niederes Alkylsulfonyl, niederes Alkylsulfinyl, Oxo usw. ein. Die bevorzugten elektronenziehenden Gruppensind Nitro und Trifluormethyl.
Halogen, wie hier gebraucht, schließt Chloro, Bromo, lodo und hauptsächlich Fluoro ein. Das in der erfindungsgemäßen Mischung verwendete tertiäre Amin ist durch folgende Struktur definiert
Ka IVr;
worin Ri, R2 und R3 die oben genannte Bedeutung haben. So kann das tertiäre Amin eine Acyclische Diaminoverbindung sein, wie z. B. DABCO. Die bevorzugten tertiären Amine schließen Diisopropylethylamin, Triethylamin und N-Methylmorpholln, DMAP und DABCO ein.
Statt dem N-Hydroxy-Stickstof f enthaltenden Heterocyclus und dem tertiären Amin können erfindungsgomäß auch die quartären AmmoniumsaUe dieser Mischung eingesetzt werden. Die quartären Ammonii msalze der angegebenen Formel beziehen sich auf Salze, die das N-Oxid des Stickstoff enthaltenden Heterocyclus und das quartäre Amin einschließen
IV 3 Hs
und worin R)( R2 und R3 die oben genannte Bedeutung haben und R4 gleich Wasserstoff oder C1- bis C20-AIkVl, wie z. B. Decyl,
Dodecyl, Cetyl usw. bedeuten. Bevorzugte quartäre Ammoniumsalze haben die Formel
R.
η ti
?)1
"ίο
j . Il —
n,
10
11
worin R1, R2, R3, R4, R6, R6, A, Z, R7 ur 1R8 die oben genannte Bedeutung haben.
Die besonders bevorzugten Salze der Mischung sind jene Ammoniumsalze, wo R6 und R8 mit den C-Atomen, an welche sie
gebunden sind, einen PhenyMng bilden, sowie das N-Oxid von Succinimid. Die quartären Salze haben die Formel
' . -0I
A'
worin R|, Rj, R3 R4, R;, Rg, Rg, Rio, Rn, A7 und Z die oben genannte Bedeutung haben.
Das am meisten bevorzugt* Salz der Mischung ist das Tetraalkylammoniumsalz des HOBt (ET4N+-OBt), oder ein Salz von DMAP und HOBt, DMAP und HOOBt, DABCO' md HOBt, DIEA und HOBt oder Triethylamin und HOBt.
Sowohl das tertiäre Amin als auch drr N-Hydroxy-Stickstoff enthaltende Heterocyclic, die hierbei benutzt werden, sind bekannte Reagenzien, welche handelsüblich sind oder entsprechend den laut Stand der Technik bekannten Prozeduren synthetisiert werden können.
Die hier beschriebenen Mischungen können bei der Bildung jeglicher Amidbindungen benuUt werden - der Kupplung eines Amins und einer Carbonsäure oder eines seiner acylierenden Derivate. Besonders vorteilhaft jedoch ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels für die Synthese bioo'rganischer Moleküle, wie z. B. Peptide, Polypeptide, Nukleotide und Polynukleotide. Eine vorzugsweise Anwendung des Mittels und des Verfahrens ist die Peptidsynthese. So wird die oben beschriebene Mischung zur Unterstützung der Kupplung einer ersten Aminosäure, die eine freie terminale Aminogruppe enthält, mit einer acylierenden, N-geschützten zweiten Aminosäure benutzt. Das erfindungsgemäße Mittel sowie das Verfahren sind universell anwendbar. Mittel und Verfahren dienen dazu, die Kupplung zweier Aminosäuren effektiver zu gestalten, aber auch die Kupplung eines Dipeptide mit einer Aminosäure, eines Tripeptide und einer Aminosäure, eines Tetrapeptide und einer Aminosäure, von Tetrapeptide^ Pentapeptiden, höheren Peptiden, Polypeptiden und Proteinen. Der Terminus „Aminosäure" wird erfindungsgemäß allgemein benutzt und kann sich auf eine Ami osäure, ein Dipeptid, Tripeptid,Tetrapeptid, oder höheres Peptid, Polypeptid oder Protein beziehen. Die bevorzugte zweite Ami. osäure ist eine α-Aminosäure, wie oben definiert. Der Terminus Aminosäure bezieht sich auf c- oder ß-Aminosäuren und seht eßt die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ein. Er schließt solche Aminosäuren ein, wie Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin. Ebenfalls eingeschlossen sind Cystin, ß-Alanin, sowie synthetische Aminosäuren wie 3-(2-Naphthyl)alanin. Die bevorzugten Aminosäuren tind die α-Aminosäuren.
Die Synthese von Peptiden folgt normalerweise den für synthetische Sequenzen erforderlichen 5 Schritte für die Bildung einer Pe,itidbindung. Diese sind:
1. Schutz der Aminogruppe einer Aminosäure;
2. Schutz der Carboxylgruppe an einer anderen Aminosäure;
3. Aktivierung der Carboxylgruppe an der 1 .Aminosäure;
4. Bildung der Peptidbindung und
5. Entfernung der die Aminogruppe schützenden Gruppe von der I.Aminosäure.
Eine Vielzahl der bekannten Schutzgruppen können benutzt werden. Beispiele dieser Gruppen sind zu finden in „Schutzgruppen in der organischen Synthese" von T. W. Green. John Wiley & Sons, 1981. Eine Anzahl von blockierenden Reagenzien für Aminosäuren werden bei der Peptidsynthese genutzt. Diese blockierenden Gruppen werden in den U.S.-Patenten Nr. 3835175, 4508657,3839396 und 4108846 diskutiert. Außerdem werden andere Aminoschutzgruppe»i in zusammengefaßter Form Im U. S.-Patent Nr. 364662 angeführt. Weitere Aminoschutzgruppen sind beschrieben in einem Artikel „Festphasenpeptidsynthese" von G. Parany und R. B. Marrifield in "The Peptides", Vol.2, herausgegeben von E. Gross und S. Meienhofer; Academic Press, New York, N. Y., p. 100-118 (1980). Einige Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl oder t-Butyloxycarbonyl, werden durch Acidolyse entfernt; andere, wie Emoc, durch Basen wieder andere, wie 2-(t-Butylsulfonyl)-2-propenyloxycarbonyl (BSPOC) oder Benzo-thiophen-sulfon^-methyloxycarbonyl, werden durch Nukleophile abgetrennt, während andere durch katalytische Hydrierung entfernt werden, wie Benzyloxycarbonyl. Geschützte Aminosäuren, die Schutzgruppen am Aminoteil haben, werden von vorliegender Erfindung umfaßt. Um die Kupplung zu ermöglichen, ist die N-geschützte Aminosäure ein acylierendes Derivat davon. Acylierung bedeutet, daß die Aminosäure eine freie Carboxylgruppe hat, oder daß sie ein Säurehalogenid oder ein Ester, wie z.B. ein niederer Alkylester, Rhenoxyester (unsubstituiert oder substituiert mit 1-5 elektrononziehenden Gruppen wie oben bereits definiert) oder ein Anhydrid usw. ist. Das bevorzugte Acylierungsderivat ist das Aminosäurechlorid oder der Pentäfluorphenylester.
Die bevorzugte acylierende N-geschützto zweite Aminosäure ist eine Aminosäure der Formel L-AA-X
worin L eine Aminoschutzgruppe (baaenlabil, nucleophll-labil, säurelabil; wie oben beschrieben), AA der Aminosäure-Teil laut Definition ohne den Aminowasserstoff und ohne Acyl-OH Ist und X Hydroxyl, Halogen oder
O —
(Rl2>n
ist, worin jedes R12 unabhängig Halogen, niederes Alkyl, Nitro, Cyano oder eine andere elektronenziehende Gruppe (wie bereits definiert) ist und η eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt. Ist n=O, dann ist der Phenoxyester unsubstituiert. Die bevorzugte zweite Aminosäure ist Fmoc-AA-chlorid oder Fmoc-AA-pentafluorophenylester, worin AA. eine der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren ist.
Die acylierende, N-geschützte zweite Aminosäure kann einfach mit bekannten Techniken hergestellt werden. Obwohl die Reihenfolge nicht wichtig ist, wird, wenn die Aminosäure das Ausgangsmaterial ist, die Amine schutzgruppe i. a. über bekannte Verfahren eingeführt. Die Aktivierung der Carboxylgruppe erfolgt über bekannte Prozeduren. Um z.B. das Säurechlorid zu bilden, läßt man die amlnogoschützte Aminosäure mit Thionylchlorid oder PCI3 oder PCI6 mit bekannten Techniken zur Bildung der Säurechloride reagieren; um das Säurebromidzu bilden, erfolgt die Reaktion mit PBr3 oder PBr6 und mit Cyanharnstotffluorld zur Bildung des Säurefluorids.
Der Aminosäureester wiederum kann gebildet werden durch die Reaktion eines Säurechlorids mit einem Alkohol. Alternativ kann der Ester unter Fischer-Veresterungsbedingungen durch Reaktion der geschützten Aminosäure mit dem Alkohol in Gegenwart einer Säure, wie p-Toluensulfonsäure gebildet werden. Bei dieser Methode sollte dia benutzio Schutzgruppe nicht säureempfindlich sein. Die Kupplung einer Aminosäure mit einer froion Aminogruppe und der acylierenden N°-geschützten zweiten Aminosäure findet in Gegenwart des erfindungsgemäßen Mittels, einer basischen und katalytisch wirksamen Menge der Mischung eines N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus und eines tertiären Amins oder des entsprechenden quartären Amrroniumsalzes statt. Der Heterocyclus und das tertiäre Amin sollten in wirksamen Mengen anwesend sein, d. h. im Bereich eines molaren Verhältnisses von Heterocyclus:Amin von 1:3 bis 3:1. Vorzugswelse sollten der Heterocyclus und das Amin in etwa äquimolaren Mengen vorliegen.
Hinsichtlich der Aminosäuren sollte die Mischung In basisch und katalytisch wirksamen Mengen vorliegen. Ohne als Begrenzung zu gelten, wird angenommen, daß sich die Mischung sowohl wie ein Katalysator als auch wie eine Base verhält. Es wird angenommen, daß die Reaktion durch die Bildung der hier definierten quartiären Ammoniumsalze vor sich geht. Wenn man HOBt als Vertreter für den N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus bonutzt, stellt man sich den Reaktionsmechanismus wie folgt vor:
N,
O - C - AA„ - L
N/
R1R2R3N
+ AA1 N -
- L
protecting group
AA1
H I
- C
- AA,
Ri. R2, R3, X und L haben die oben genannte Bedeutung, AA1 ist die erste Aminosäure ohne die Amlnogruppe; AA2, wie hier definiert, ist die acylierende N&geschütztei zweite Aminosäure ohne die Acylgruppe. Der N-Heterocyclus bildet ein Salz mit dem tertiären Amin (2). Nukleophile Substitution an der Acylgruppe der zweiten Aminosäure (3) führt zu Produkt 4. Der Wasserstoff der ersten Aminosäure bindet an die N-Atome des Heterocyclic, welcher als Anker dient und die Kupplung der Aminosäure ermöglicht, wobei der Heterocyclus (1) und das tertiäre Amin regeneriert und das Dipeptid gebildet wird. Wie durch obiges Schema gezeigt wird, werden diese quartären Ammoniumsalze durch eine Säure-Base-Reaktion zwischen dem N-Hydroxy-Heterocyclus und einem tertiären Amin gebildet. Diese Reaktion kann in einem inerten Lösungsmittel stattfinden, wie Methylenchlorid, Methanol, Ether, DMF usw. Die Reaktion kann alternativ auch in situ erfolgen. Vorzugsweise werden die erste und die zwoite Aminosäure, das tertiäre Amin und der N-Hydroxy-Heterocyclus in etwa äquimolaren Mengen verwendet, obwohl ein bis zu 3mol Überschuß eines der Reagenzein eingesetzt w 'den kann. Die bevorzugte zweite Aminosäure in diesem Prozeß ist Frnoc-AA-chlorid oder Fmoc-AA-pentafluorophenylester. Die bevorzugte Mischung ist eine äquimolare Mischung von N-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylethylamin. Anstelle dieser Mischung sind die bevorzugten Salze Et4N+-OBt, das Salz aus DMAP und HOBt, DMAP und HOBT, DABCO und HOOBT, DIEA und HOBt oder Triethylamin und HOBt. Ein anderer bevorzugter N-Hydroxy-Heterocyclus ist das N-Hydroxy-Indazol der Formel
welches ebenfalls wirksam ist. Das entsprechende quartäre Ammoniumsalz des N-Hydroxy-Indazols (s.o.) kann folgende Kationen haben: (DMAP)+, (DIEA)+, (DABCO)+, NEt4+ oder NEt3H+.
Die oben beschriebene Kupplungsreaktion kann unter zusätzlicher Anwesenheit eines dehydratisierenden Agens stattfinden, wiez. B. DCC. Die Kupplungsreaktion findet normalerweise in oinem inerten polaren Lösungsmittel wie DMFstatt. Tatsächlich ist DMF das bevorzugte Lösungsmittel in der Festphasensynthese wegen seiner hervorragenden Lösungseigenschaften. Erfindungsgemäß wurde im Gegensatz zu anderen Systemen keine Razemisierung beobachtet. Die Reaktion findet untSr milden Temperaturbedingungen statt, normalerweise zwischen 15 und 3O0C. Deshalb ist die vorliegende Erfindung besonders zur Herstellung eines Peptide geeignet, was einschließt:
a) die Reaktion einer ersten Aminosäure, welche eine freie N-terminale Aminogruppe enthält, und einer acylierenden N-geschützten zweiten Aminosäure unter amidbildenden Bedingungen in Gegenwart einer basischen und katalytisch wirksamen Mange eines tertiären Amins ν
Ri
Ra Rk
unc' eines N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus oder des entsprechenden quartären Ammoniumsalzes, worin Ri, R2 und R3 unabhängig niedere Alkyle sind oder R1 und R2 zusammen mit dem N, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Riny bilden,
b) dii Entfernung des Na-aminoschützenden Gruppen vom zweiten Aminosäure-Rest,
c) die Wiederholung der Schritte a) und b), bis das gewünschte Peptid erhalten wurde.
Die voi liegende Erfindung kann vorteilhaft bei der Festphasenpeptidsynthese benutzt werden. Die Fostphasenpeptidsynthesn basiert auf der stufenweisen Bildung einer Peptidkette, während sie an einem Ende am festen Träger gebunden ist. Es sind 2 prinzipielle Methoden bekannt. Die eine, die Merrifield-Methode, benutzt den festen Träger für die Bindung der Aminosäureoder Peptidreste. Diese Methode benutzt N-geschützte Aminosäuren als Bausteine, die an einen Aminosäure- oder Peptidrest addiert werden, welche an dem festen Träger mit dem Carboxylende des Moleküls gebunden ist. Nachdem die Peptidbindung ausgebildet wurde, wird die N°-Schutzgruppe entfernt und der Cyclus wiederholt. Wenn ein Peptid mit der gewünschten Sequenz synthetisiert ist, wird es vom Träger entfernt. Die zweite Methot . Hie umgekehrte Merrifield-Methode, benutzt Reagenzien, die an festen Trägern in einer Reihe von Säulen gebunden sind. Der Aminosäure- oder Peptidrest passiert die Säule in Serien, um die gewünschte Aminosäuresequenz zu bilden. Diese Methoden sind gut bekannt und erläutert in folgenden U. S. Patenten: 4108846, 3839396,3835175,4508657,4623484,4575 541,4581167,4394 519 und in „Fortschritte der Enzymologie" 32, S. 221 (1969) und in „Peptides", herausgegeben von E. Gross und J. Meienhofer, Bd. 2, Academic Press, S.3-255 (1980). Erfindungswesentlich ist der Gebrauch von Fmoc-Aminosäure-Chloriden (Fmoc-AA-CI) als Kupplungsreagenzien. Diese Verbindungen wären die billigsten verfügbaren Kupplungsreagenzien, weil sie schnell in großem Umfang durch Reaktion der Säure mit Thionylchlorid synthetisiert werden können. Die Säurecl iloride sind stabile, kristalline Feststoffe, die einfach gereinigt und.in Kapseln oder Patronen für den direkten Gebrauch in Peptidsyntheseautomaten aufbewahrt werden können. Selbst sind diese Säurechloride aber nicht besser als Pfp-Ester, weil die Kupplung an harzgebundene Aminosäureester überraschend langsam unter klassischen Acylierungsbedingungen vor sich geht, z. B. in Anwesenheit einer organischen Base (Pyridin, Triethylamin, N-Methlymorpholin, Diisopropylethylamin usw.) sowohl als Katalysator als auch als HCI-Akzeptor. Wenn aber eine äquimolare Mischung von N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und Diiosoprpylethylamin (DIEA) als HCI-Akzeptor und Katalysator eingesetzt wird, findet dio Reaktion mit bemerkenswerter Schnelligkeit statt
EinBeipiel:
Bei Behandlung von 200mg Sheppard-Leucin-Harz (0,2 mmol/g) unter üblichen Batch-Bedingungen mit einer Lösung von Fmoc-Phe-Cl (4 Äquivalente) in Anwesenheit einer 1:1 Mischung von HOBt und DIEA (4 Äquivalente jeweils) in DMF (Endkonzentration 0,1 M) wird nach 3 min komplette Acylierung beobachtet (Kaiser-Test).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungsgemäße Mittel und das Verfahren zur schnellen Peptldkupplung eine Mischung bestehend aus einem N-Hydroxy-Stickstoff enthaltendem Heterocyclus und einem tertiären Amin bzw. dem quartären Ammoniumsalz daraus beinhaltet, wobei die Poptidbildung unter wesentlicher Beschleunigung ohne Razemisierung abläuft und damit zu Produkten höherer Qualität führt. Die Reaktionsbedingungen sind sehr mild und die benutzten Reagenzien handelsüblich und/oder einfach zu bereiten. Das Verfahren ist besonders auch für die Peptidsynthese an fester Phase geeignet. Im folgenden wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.ohne diese jedoch einzuschränken.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1
Allgemeines Protokoll für die Test-Kupplung von Fmoc-Aminosäure-Chloriden mit einem Leucin-beladenen Harz. Das Fmoc-Leucin-Harc war eine Probe von Sheppard-KA-Harz (0,1 Milliäquivalente/g), zur Verfügung gestellt von Milligen Div., Millipore Corp. Die Fmoc-Aminosäure-Chloride wurden alle durch die beschriebenen Techniken synthetisiert (CARPINO et al., J. Org. Chem. 51,373,': (1986]). Testreaktionen wurden per Hand in kleinen Spritzen durchgeführt, wobei das Mischen durch kurzes Schütteln (manuell) ausgeführt wurde. Die Spritze wurde an ein Millipore-Vakuumrohr angeschlossen, um eine schnelle Entfernung von Reagenzien und Lösungsmittel zu gewährleisten. Das Fmoc-Leucin-Harz wurde zuerst mit DMF gewaschen mit Piperidin deblockiert und dann entsprechend einem D-Stufen-Standard-Protokoll, welches unten angegeben ist, aeyliert. In jedem Fall wurden für 200mg Fmoc-Leu-Harz 4 Äquivalente einer 1:1 Mischung aus HOBt/Amin, (0,16M; 0,5ml) in DMF benutzt. Das Säurechlorid wurde in 0,3 ml DMF gelöst zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,1 M. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Das Fmoc-Leucin-Harz enthielt 1,1-1,4 % des D-Isomeren (basierend auf GC-Analyse). Wenn ein Valin-Harz ähnlich über Fmoc-Val-CI/HOBt/DIEA4min lang aeyliert wird, zeigt der Kaiser-Test fast vollständige Acylierung an (Spur von blauur Farbe).
9-Stufen-Protokoll
1. waschen mit 3ml DMF (1min) x 2
2. waschen mit 2ml 20% Piperidin (5min) x 2
3. waschen mit 3ml DMF (1 min) χ 3
4. waschen mit 2ml DMF HOBt/DIEA (1min) x 1
5. Acylierung (3min)
6. waschen mit 3ml DMF (1 min) x 5
7. waschen mit 3ml Methylenchlorid (1 min) x 2
8. waschen mit 3ml MeOH (1min) χ 1
9. wasphen mit3ml Ether (1 min) x 3.
Tabelle 1 Acylierung und Razemisierung während der Festphasenkupplungsreaktion Fmoc-AA-CI Base Acylierungszeit Kaiser-Test Raz.(%)*
Phe Pyridine 5min +
Phe Di-t-Bu-Pyridine 5min +
Phe Di-t-Bu-Pyridine 10min +
Phe HOBt 5min +
Phe DIEA 5min +
Phe DIEA/SuOH 5min +
Phe DIEA/PhtOH 5min +
Phe NEt3/HOBt 5min -
Phe NEt3/HOBt 3min -
Phe DIEA/HOBt 3min -
Phe Pyr/HOBt 3min +
Phe NMP/HOBt 3min -
Phe DMAP/HOBt 3min +
Phe NMM/HOBt 3min -
Phe DBN/HOBt 3min sb
Phe Pemp/HOBt 3min sb
Phe DIEA/HOBtd 3min +
Phe DIEA/HOBtd 5min +
VaI DIEA/HOBt 3 min _
1,17" 1,18" 1,21"
1,40"
a) Nicht getestet, außer wo angezolgt
b) Razemisierung durch HPLC-Analyse bestimmt. Die angegebenen Zahlen sind Durchschnittswerte für 2 unabhängige Läufe. Diese Ergebnisse stimmen überein mit der Menge an DL-Leu, die schon für das Ausgangsharz gefunden wurde.
c) 8b: leicht blau. Unvollständige Kupplungsbedingungen können wegen nicht ausreichendem Mischen existieren.
d) Reaktionsablauf in Methylench!ür:4.
Razemisierungsuntersuchung:
200 mg Fmoc-Phe-Leu-Harz, erhalten wie oben beschrieben, wurde in 5 ml trockenem MeOH suspendiert, der einige Tropfenkonz. H2SO4 erhielt.
Nach 4stündigem Rückflußkochen wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt. Der Rückstand wurde in 10ml EtOAc gelöst und mit 10% NaHCO3 (10ml, 3x) gewaschen, dann mit NaCI gesättigt.
Trocknen über MgSO4 und Entfernen des Lösungsmittels ergab das Fmoc-Phe-Leu-OMe als weißer Feststoff (85-90%) mit einem
kleinen Anteil nichtidentifizierter Verunreinigung (TLC). 2mg des Stoffes wurden in 5ml EtOAc gelöst und 5ml dieser Lösungwurden in eine Waters Radialpak ΙΟμ-Kieselgelsäure (0,8cm x 10cm) injiziert und mit 99,2/0,8% Hexan/i-Propanolelulert(f = 2,
WLL] = 17,53 + 1 min und t„[LD oder DL) 22,0 + 1 min). Die Ergebnisse stehen in Tabelle 1. Herstellung von Fmoc-Tyr(t-Bu)-Cl: Zu einer Lösung von 1 g Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH in 15ml THF bei O0C wurden 1,5 äquivalente SOCI2 und 0,2 Äquivalente Tetramethylharnstoff gegeben. Die resultierende Lösung wurde bei O0C 40min geschüttelt, das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt (Vakuum-Pumpe) und es wurde ein Feststoff erhalten. Durch Umkristallisation aus Methylenchlorid-Hexan wurden670mg (66,7%) des Säurechlorids als weißer Feststoff erhalten mit Fp = 78-820C, HPLC f = 2, Lösungsmittel MeOH/H2O 0,1 %
TFA 75:25, Fmoc-Tyr-Cl (Methylester) tR = 5,33 (0,53%), Fmoc-Tyr{t-Bu)-OHt„ = 11,40 (16%), Fmoc-Tyr(t-Bu)-Cl (Methylester)
t„ = 14,53 (80%).
Beispiel 2 Synthese von Leucin-Enkephalin A) Aus Säurechloriden über manuelle Synthese. Die Reaktionen wurden wie oben beschrieben, in Spritzen ausgeführt.
1 g Fmoc-Leu-Harz (0,1 Milliäquiv./g)
0,2MDIEA/HOBt-Lösung
4 Äquivalente Fmoc-Aminosäure-Chlorid
Fmoc-Tyr(t-Bu)-Cl 191 mj, Fmoc-Gly-Cl 126,2mg (2x» Fmoc-Phe-Cl 162,4 mg Theoretische Ausbeute 66,9 mg. Nach der Synthese wurde das Harz mit TFA behandelt (20ml, 2 h), filtriert, das Filtrat iur Trockne eingeengt und 50ml trockener Ether zugegeben, um das Peptid auszufällen. Nach Filtration, Waschen, Trocknen und Lyophilisation wurden 53 mg (79,2%) des Leucin-Enkephalins erhalten. GC 10,87(GIy), 12,66 (D-Leu, 1,42%), 13,69 (Leu), 22,66 (D-Phe, 1,1 %), 23,17 (Phe), 28,14 (Tyr). HPLC
f = 1 MeOH/HjO 0,1% TFA 50:50, t„ = 10,26 (75,4% rein). Aminosäure-Analyse (theoretisch) GIy 1,9 (2), Phe 0,8(1), Tyr 0,8(1),
Leu 0,9(1). · .
D-Phe4-Leucin-Enkephalin wurde bereitet aus 400 mg Fmoc-Leu-Harz nach analoger Verfahrensweise. Nach TFA-Behandlung
(10ml, 2h) und Fällung wurden 17mg (61,2%) des Pentapeptids erhalten. GC10,986 (GIy), 12,71 (D-Leu, 1,46%), 13,76 (Leu),22,80(D-Phe),23,32(Phe,0,67%),27,74(D-Tyr, 1,1%),28,15(Tyr). HPLCf = 1 (MeOH/H2O0,1%TFA50:50),t„ = 17,90(79,76%rein).
Aminosäure-Analyse (theoretisch) GIy 1,7 (2), Phe 0,9 (1), Tyr 0,9 (1), Leu 0,9 (1). B) Aus Säurechlorid mittels Pepsynthesizer (Milligen 9050)
Harzkapazität = 0,1 Milliäquivalente/g Fließgeschwindigkeit Dauer
Harzmenge = 1,0g (ml/min)
Fmoc-Phe-Cl 0,203 g 3,0 00:00:30
Fmoc-Gly-Cl 0,158g 9,2 00:04:00
Fmoc-Gly-Cl 0,158g 13,4 00:05:00
Fmoc-Tyr(t-Bu)-Cl 300 mg 0,0 0
DIEA/HOBt/DMF Lösung (0,33M) 1,0 0
Syntheseprotokoll 3,0 00:00:10
Stufentyp 0,0 0
0,0 0
01DMF 10,0 00:00:15
02 Piperidin 3,0 00:00:10
03 DMF 5,0 0
04 Aminosäure lösen 13,4 00:10:00
05 Pause 13,4 00:03:00
06 DMF 0,0 0
07 Spülen der Probe 0,0 0
08 Pause 10,0 00:01:00
09DMF + HOBt/DIEA 3,0 00:00:02
10 Umpumpen 0,0 20
11 Umpumpen mit Schleife 0,0 0
12 Umpumpen 0,0 0
13 DMF (Schleife) 1.0 0
14 Spülen der Probe
15 Pause
16DMF+HOBt/DIEA
17DMF
18 Spülen der Probe
19 Pause
20 Reinigen d. Probengebers
21 Pause
Nach der Synthese wurde das Harz mit TFA behandeil (20ml, 2h) und ergab 46mg (68,7%) des Rohpeptides mit einer Reinheit von 93% (HPLC); GC 10,67 (GIy), 12.C3 (D-Leu, 1,48%), 13,55 (Leu), 23,10 (Phe), 28,13 (Tyr).
DL-Phe4-Leucin-Enkephalin wurde ähnlich synthetisiert, außer daß razemisches Phenylalanin benutzt wurde und Tyrosinether als Pfp-Ester anstelle des Säurechlorids zugegeber, vvurde.
Harzkapazität 0,1 Milliäquivalente/g
Harzmenge 1,0g
Fmoc-DL-Phe-CI 0,203 g
Fmoc-Gly-Cl 0,158 g
Fmoc-Gly-Cl 0,158g
Fmoc-Tyr(t-Bu)-OPfp 0,313g
Nach TFA-Behandlung (20 ml, 2 h) wurden 50mg (74,7 %) Rohpeptid erhalten mit einer Reinheit von 98,7 % (HPLC). Die L-Phe- und D-Phe-Diastereomere waren im Verhältnis 45:53 präsent (HPLC)
C) Aus Pfp-Estern mit dem Pepsynthesizer (Milligen 9050).
D-Phe4-Leucin-Enkephalin wurde entsprechend dem SO-min-Standard-Acylierungs-Protokoll aus 1 g Fmoc-Leu-Harz synthetisiert. Nach TFA-Behandlung (20ml, 2 h) wurden 41 mg (59%) Rohpeptid erhalten. GC 10,922 (GIy), 12,69 (D-Leu, 1,62%), 13,72 (Leu), 22,74 (D-Phe), 23,24 (Phe, 1,06%), 27,77 (D-Tyr, 0,85%), 28,16 (Tyr). HPLC f = 1, MeOH/HjO 0,1 % TFA (50:50) t„ = 17,80 (95,3% rein). Aminosäureanalyse (theoretisch): GIy 2 (2), Phe 0,9 (1), Tyr 0,9 (1), Leu 0,8 (1). D-Tyr6-Leucin-Enkephalin wurde hergestellt entsprechend dem 30-min-Standard Acylierungsprotokoll aus 1 g FmocLeu-Harz. Nach TFA-Behandlung (20ml, 2h) wurden 36mg (53,8%) des Pentapeptids erhalten. HPLCf = 1, MeOH/H20,0,1 %TFA (50:50) tn = 9,70 (87,2% rein).
D) Aus Pfp-Estern unter Zusatz von DIEA/HOBt Fmoc-Phe-OPfp 0,277 g Fmoc-Gly-OPfp 0,232 g Fmoc-Gly-OPfp 0,232 g Fmoc-Tyr(t-Bu)-OPfp 0,313g
Nach TFA-Behandlung (20ml, 2h) wurden 50mg (74,4%) Rohpeptid 100% rain erhalten (HPLC). Stabilität des Fmoc-AA-Harzes in Anwesenheit von HOBt/t-Amin-MischungenDie Tests zur Stabilisierung wurden durchgeführt bis zur Deblockierung der Fmoc-AA-gebundenen Harze durch die HOBt/t-Amin-Mischungen. Sterisch ungehinderte Basen rufen Deblockierung hervor, abersterisch gehinderte wie Diisopropylethylamin (DIEA) zeigten bis zur 4 h keine Deblockierung. Das tat bedeutend mehr als die zur Acylierung erforderliche Zeit. Somit sollte dio Deblockierung während der Acylierung kein Problem darstellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Untersuchung zur Deblockierung durch Katalysator/Base-Mischungen
Fmoc-AA-Harz HOBt/Amin Zeit Kaiser-Test
Leu HOBt/TEA 30min +
Leu HOBt/DIEA 30 min -
He HOBt/DIEA 4h -
He HOBt/NMM 4h —
He HOBt/DMAP 4h +
Wie im Beispiel 1 gezeigt, wurde Fmoc-Phe-Cl mit einem Leucin-beladenen Harz wie folgt gekuppelt: Schema 2
υ, „ Fmoc-Phe-Cl _ „. , „ H-Leu-P — > Fmoc-Phe-Leu-P
1 2
Fmoc-Phe-Leu-OME
worin P einen polymeren Harzträger darstellt.
Das entstehende Dipeptidharz 2 wurde der Umesterung in MeOH zugeführt-in Anwesenheit einer geringen Menge H2SO4-Um
den geschützten Dipeptid-Methylester 3 zu erhalten (85-90%). Die HPLC-Überprüfung des Rohmaterials zeigte weniger als 0,1 %des DL-Diastereomeren.
Diese Methode ist auch auf die Synthese eines Peptids bei Verwendung des Milligen 9050. (kontinuierlicher Fluß) Peptidsynthesizers anwendbar. Als Beispiel wurde Leucin-Enkephalin 4 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gem. Beispiel 2 synthetisiert. H-Tyr-Phe-Gly-Gly-Leu-OH 4
Für die erste Synthese wurde eine Acylieru gszeit von 10min willkürlich gesetzt, um eine signifikante Sicherheitsgrenze zu gewährleisten, obwohl dies länger als notwendig sein kann. Dies führte zu einer kompletten Zykluszeit von 25 min im Vergleich zur 1-h-Zykluszeit, die für ein normales Protokoll empfohlen wird. 5 molare Äquivalente von Fmoc-AA-Chlorid wurden neben 1 Äquivalent-Anteil der Mischung der vorliegenden Erfindung benutzt. Die 4 Kupplungsschritte (Fmoc-Gly-Cl 2x, Fmoc-Phe-Cl, FmOC-TyC[CMe3I-CI) wurden automatisch vorgenommen und das Pentapeptid wurde mit 69% Ausbeute erhalten. Die HPLC-Analyse zeigte eine 93%ige Reinheit des Rohproduktes. So ist das Rohprodukt von höherer Reinheit als jenes mit normaler Technik mittels Pfp-Estern und 1-h-Zyklus erhaltene. Noch besser war eine „gemischte* Synthese mit Säurechloriden mit Ausnahme des Tyr-Pfp-Esters: Ausbeute 75%, Reinheit 99%. Es war kein DL-Phe'- oder D-Tyr6-Diastereomeres nachweisbar (< 0,1 %) - das zeigt klar, daß die Razemisierung bei Benutzung dieser Säurechloride unter entsprechenden Tieaktionsbedingungen kein Problem darstellt.
Weiterhin wurde festgestellt, daß Reaktionen von Pfp-Estern auch durch die erfindungsgemd.^o Mischung katalysiert wurden, und die Zykluszeiten waren so kurz, wie wenn Säurechloride benutzt worden wären.
Eine ähnliche Synthese von Leucin-Enkephalin wurde unter Nutzung von handelsüblichen Pfp-Estern anstatt von Säurechloriden durchgeführt. Auch in diesem Fall wurde eine 10-min-Acylierungszeit eingehalten und der einzige Unterschied war die etwas längere Zeit zum Lösen und Aufnehmen der Pfp-Ester, welche bedeutend schlechter löslich sind als Säurechloride. Bemerkenswerterweise wurde das Pentapeptid mit einer Ausbeute von 75% und einer Reinheit von 100%erhalten, sogar höher als mit Säurechloriden beobachtet. So ist die Mischung des vorliegenden Prozesses nicht nur vorteilhaft zur Synthese hochreiner Peptide über billige Säurechloride, sondern macht auch die Synthese von superreinen Peptiden über die bereits empfohlenen, aber teureren Pfp-Ester möglich. Für die Synthese von extra reinen Peptiden sollte man die höheren Kosten der Pfp-Ester gegenüber den Säurechloriden akzeptieren. Weil beide Substrate nur eine geringe Veränderung im Protokoll erfordern, ist es auch möglich, die Apparatur bequem für eine kontinuierliche, automatisierte gemischte Synthese zu programmieren. Zum Bsp. körnen in Fällen, wo die Fmoc-Aminosäuren Seitenkettenschutzgruppen vom t-Butyl-Typ tragen, Säurechloride wegen ihrer erwarteten Instabilität bei längerer Aufbewahrung kontraindiziert sein. Tatsächlich werden einige dieser Verbindungen, auch Fmoc-Tyr-(CMe3)-CI, langsam beim Stehenlassen unter Verlust des t-Butyl-Antsüs abgebaut. Li anderen Fällen sind diet-Buty!-. Derivate eher Öle (Thr, Ser) als kristalline Feststoffe. Solche Aminosäuren werden deshalb besser über Pfp-Ester eingeführt,
während die Mehrheit der einfachen Aminosäuren über Säurechloride eingeführt wird. Andere Säurechloride in dieser Kategorie sind jene aus GIu, Gin, Asp, Asn und Arg. Auf diese Welse sollte jedes beliebige Peptid mit der geeigneten Kombination von Pfp-Estern und Säurechloriden erhaltbar sein. Üblicherweise werden 75% der Aminosäuren in der Säurechloridform verfügbar. Es soll auch angemerkt werden, daß es eine Substitution des t-Butyl-Seitenkettenschutzes durch ein geeignetes alternatives Schutzsystem möglich machen sollte, Säurechloride für jede Aminosäure zu benützen. Die Pfp-Ester-Technik würde dann für die Fälle reserviert sein, wo entweder
a) hochreine Peptide gewünscht sind oder
b) längere Peptide synthetisiert werden, wo die höheren Kupplungsausbauten bei jedem Schritt sauberere Reaktionen für solch längere Sequenzen sichern.
Andere parstellungen werden in den folgenden Beispielen gegeben. Beispiel 3 Allgemeines Protokoll für die manuelle Synthese von H-Val-Gln-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-OH
Die hierunter beschriebenen Reaktionen wurden manuell in kleinen Spritzen ausgeführt, wobei das Mischen durch kurzes Schütteln per Hand erfolgte. Die Spritze wurde an ein Millipore-Vakuumrohr angeschlossen zum schnellen Entfernen von Reagenzien und Lösungsmitteln. Das Fmoc-Gly-PepSyn-KA-Harz wurde zuerst mit DMF gewaschen, mit Piperidin deblockiert und dann entsprechend dem 6-Stufen-Protokoll (s.u.) acyliert. In jedem Durchlauf wurden f Ur 1 g Fme j-Gly-PepSyn-KA (0,1 mmol) 4 Äquivalente Fmoc-Aminosäure-acylierendes Agens benutzt (wie unten angegeben) unci 5ml 0,08M HOBt/DIEA-Lösung.
6-Stufen-Protokoll
1. Waschen mit 10ml DMF (1min, 1X)
2. Waschen mit 20% Piperidin/DMF (5min, 2x)
3. Waschen mit 10ml DMF (2min, 5x)
4. Waschen mit 5 ml HOBt/DIEA (2 min, 1 x)
5. Acylierung
6. Waschen mit 10ml DMF (2 min, 3x)
Die Aminosäure-cyclisierenden Agenzein wurden wie folgt zugegeben: Fmoc-Asn(ONP) i'190mg, 30min), Fmoc-Ile-Cl (149mg, 15min), Fmoc-Tyr(t-Bu)-OPfp (250mg, 15min), Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OPfp
(230mg, 15min), Fmoc-Ile-Cl (149mg, 15min), Fmoc-Ala-Cl (132 mg, 15min), Fmoc-Gln-ONP (196mg, 1 h), Fmoc-Val-Cl(143,2mg, 15min, doppelte Acylierung) ergaben noch einen positiven Kaiser-Test.
Theoretische Ausbeute (als Mono-TFA-Safz): 120mg. Erhaltene Menge: 94,4mg (78,6%) Das gebildete Produkt war relativ rein. Beispiel 4 Die Prozedur von Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei das Säurechlorid durch den Pfp-Ester ersetzt wurde. Die Menge erhaltenen Produkte war 94,4mg (78,6%). Das gebildete Produkt war relativ rein. Beispiel 5 Synthese von H-Ala-Asn-Lys-Gly-Phe-Leu-Glu-Glu-Val-OH Die Prozedur war wie in Beispiel 4 A) 1,5g Fmoc-Val-PepSyn-KA(0,135mmol)
4 Äquivalente des entsprechenden Fmoc-Aminosäure-OPfp-Esters, 6ml von 0,1 M HOBt/DIEA-Lösung außer bei Fmoc-Asn-OPfp, wo HOBt allein benutzt wurde.
Fmoc-Glu(OtBu)-OPfp (319mg, 15min), Fmoc-Glu(OtBu)-OPfp (319 mg, 15 min), Fmoc-Leu-OPfp (281mg, 15 min), Fmoc-Phe-OPfp (299mg, 15min), Fmoc-Gly-OPfp (250mg, 15min), Fmoc-Lys(Boc)-OPfp (343 mg, 15 min), Fmoc-Asn-OPfp (281 mg, 30min), Fmoc-Ala-OPfp (253 mg, 15 min)
Theoretische Ausbeute (als Di-TFA-SaIz): 166,59mg; erhaltene Menge: 120mg (72%). Das gebildete Produkt war relativ rein.
B) 1 ,Og Fmoc-Val-SepSyn-KA (0,09mmol), 4Äquivalente acylierendes Agens (da, wo möglich Säurechloride, sonst Pfp oder ONp-Ester)
5 ml 0,08 M HOBt/DIEA-Lösung
Fmoc-Glu(OtBu)-OPfp (213mg, 10min), Fmoc-Glu (OtBu)-OPfp (213mg, 10min), Fmoc-Leu-Cl (134mg, 16min), Fmoc-Phe-Cl
(146mg, 10min), Fmoc-Gly-Cl (114mg, 10min), Fmoc-Lys(Boc)-OPfp (228 mg, 10min), Fmoc-Asn-ONp (179 mg, 30minnachgekuppelt), Fmoc-Ala-Cl (119mg, 10min)
Theoretische Ausbeute (als Di-TFA-SaIz): 111,06g. Erhaltene Menge: 74mg (66,75%). Das gebildete Produkt war relativ rein. Beispiele
Zersetzung von Asn-Pfp-Ester
O1Bg (0,956mmol) Fmoc-Asn-OPfp-Ester in 5ml DMF wurden mittels DC von Zeit zu Zeit kontrolliert. Nach 36 Stunden Schütteln bei Raumtemperatur war nur eine Spur des Ausgangsmaterials übrig. Die erhaltene Lösung wurde in 50ml H2O gegossen, das Präzipitat mit EtOAc extrahiert und die organische Phase mit gesättigter NaHCO3-Lösung und NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingeengt und ergab einen Rest, der aus EtOAc-Skelly-B umkristallisiert wurde und 70mg (22%) Fmoc-Asn ergab; IR(KBr) 3337,3200(NH), 1787,1717cm"1 (C=O). Die wäßrige Lösung wurde mit kon* -itrierter HCi auf pH 3 angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Nach Trocknen und der Entfernung des Lösungsmittels wurden IC-iirig (18%) des Fmoc-ß-(CN)-Ala-OH erhalten. IR(KBr) 3316 (NH), 2258 (CN), 1717cm'1 (C=O) mit einem kleinen Anteil Fmoc-Asn-OH. Wenn man Fmoc-Asn-OPfp in HOBt/DIEA-DMF-Lösung stehenläßt, wurde laut DC-Analyse nach 15min eine signifikante Menge Fmoc-Asn und Fmoc-ß-(CN)-Ala-OH gebildet.
Beispiel 7
Geschwindigkeit von Kupplungsreaktionen in Gegenwart verschiedener tert.-Amine und N-Hydroxy-Verbindungen 200mg von entsprechendem Fmoc-AA-PepSyn-KA (0,1 mmol/g), 4 äquivalente Acylierungsagens, 0,5ml 0,16M binäres Salz oder tert.-Amin allein. Das Acylierungsagens wurde in 0,3ml DMF-Lösung gelöst und die Endkonzentration war 0,1 M. Die quantitative Analyse erfolgte durch Bestimmung der UV-Absorption von abgespaltenem Dibenzofulven-Piperidin-Addukt.
Leu-PepSyn-KA
(A) Fmoc-Val-Cl Fmoc-Val-Leu-PepSyn-KA Base Zeit f. Kupplung (min) Umsatz (%) Pyridin 10 61,9 2,6-Di-tert.-butyl-pyridin 10 39,3
DIEA 10 89,9
HOSu/DIEA 3 14,8
Phthalimid-N-OH/DIEA 3 19,47
HOOBt/DIEA 1 74,1
2 93,7
3 neg. Kaiser-Test HOBt/DIEA 1 97,34
2 neg. Kaiser-Test
3 neg. Kaiser-Test
Leu-PepSyn-KA
(B) Fmoc-Val-OPfp Fmoc-Val-Leu-PepSyn-KA HOOBt/DIEA 1 89
2 96
3 neg. Kaiser-Test HOBt/DIEA 1 94
2 neg. Kaiser-Test
3 neg. Kaiser-Test
lle-PepSyn-KA
(C) Fmoc-lle-OPfp Fmoc-lle-lle-PepSyn-KA HOBt/DIEA 1 94,4
2 97,85
3 neg. Kaiser-Test β neg. Kaiser-Test
HOBt 3 36,9
7 58
10 71,54 15 79
HOOBt 3 55,4
7 83,25
10 92,5
15 96,2
lle-PepSyn-KA
(D) Fmoc-Leu-ONp Fmoc-Leu-lla-PepSyn-KA HOBt/DIEA 10 neg. Kaiser-Test Fmoc-Asn-ONp
HOBt/DIEA 10 neg. Kaiser-Test
30
NOH
NOH
phthalimide-N-OII
HODt:
HOOBt
Beispiel 8 Synthese von Tetraethylammonium-benzotriazol-1-oxid Zu einer Lösung von 1OmI 1,5M Tetraethylammoniumhydroxid wurden 2,3g HOBt H2O gegeben. Die resultierende Lösung
wurde bei Raumtemperatur 1 h geschüttelt, das Lösungsmittel eingedampft, der Rückstand mit Hilfe einer Vakuumpumpe über4 h getrocknet und dann aus Methylenchlorid/Hexan umkristallisiert. Ergebnis war 1 g (26%) des Produktes als weißer Feststoff,
Fp: 107-1150C, NMR (CDCI3) δ: 1,2 (t, CH3), 3,2 (q, CH2), 7,2-7,8 (m, Aryl). Beispiel 9 Synthese von DMAP · 2HOBt-SaIz
Zu einer Lösung aus 244mg (2mmol) DMAP in 2OmI Methylenchlorid wurden 306mg (2mmol) HOBt · H2O gegeben. Die resultierende Lösung wurde 15min geschüttelt und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde aus Aceton/Ether umkristallisiert und ergab 294mg (75%) des Produktes bis weiße Kristalle. Fp: 97-980C, NMR (CDCI3) δ: 3,1 (s, CH3), 6,6 (d, Aryl), 7,2-7,8 (m, Aryl), 8,2 (d, Aryl). Berechnet für C19H20N8O2: C, 58,15; H, 5,13; N, 28,55 gefunden: C, 57,88; H,4,98; N, 28,04
NMez
Beispiel 10 Synthese von DMAP · 2HOOBt-SaIz
Zu einer Lösung von 244mg (2mmol) DMAP in 20ml MeOH wurden 326mg (2mmol) HOOBt zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 30min geschüttelt, das Lösungsmittel eingeengt, der gelbe Rückstand aus Ether/MeOH umkristallisiert und es wurden 233 mg (52%) des Produktes als gelbe Kristalle erhalten. Fp: 199-2000C, NMR (DMSO) δ: 3,1 (s, CH3), 6,9 (d. Aryl), 7,7-8,2 (m. Aryl). Berechnet für C21H30N8O4: C, 56,24; H, 4,49; N, 24,98 gefunden: C,56,05; H,4,54; N,24,79.
Beispiel 11 Synthese von DABCO · 2 HOOBT-SaIz
Zu einer Lösung von 244mg (2mmol) DABCO in 2OmI trockenem Methylenchlorid wurden 326mg (2mmol) HOOBt gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 30min geschüttelt, das Lösungsmittel entfernt, der gelbe Rückstand aus Ether/Aceton umkristallisiert und es wurden 100mg (22,8%) des Produktes als lolber Feststoff erhalten. Fp: 172-1740C, NMR (CDCI3) δ: 3,25 (s, CH2), 7,6^8,4 (m, Aryl). Berechnet für C20H22N8O4: C, 54,79; H^ 5,05; N, 25,55 gefunden: C, 54,58; H, 5,04; N, 23,27.
DABCO
AbkQrzungiverzelchnls - 2-(t-Butylsiilfonyl)-2-propenyloxycarbonyl
BSPOC - 1,4-Diazabicyclo (2,2,2)oktan
DABCO - 1#5-Diazabicyclo(4,3,0)non-5-en
DBN - N.N-Dicyclohtxylcarbodiimid ' .
DCC - Diisopropylethylamin
DIEA - Ν,Ν-Dimethylaminopyridin
DMAP - Dimethylformamid
DMF - (9-FluorenylmethyD-oxycarbonyl
Fmoc - Fmoc-Aminosäure-pentafluorphenylester
Fmoc-AA-OPfp - Hydroxybenzotriazol
HOBt - 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
HOOBt - N-Methylmorpholin
NMM - N-Mothylpyrrolidon
NMP - 1,2,2,6,6-Pentamethylpiperidin
Pomp - Harzbezeichnung
PepSyn-KA - Pentafluorphenylester
Pfp-Ester - N-Hydroxysuccinimid
SuOH - Tetramethylharnstoff
TMU - Trifluoressigsäure
TFA

Claims (28)

  1. Patentansprüche:
    1. Mittel zur schnellen Peptidkupplung, gekennzeichnet dadurch, daß es eine Mischung aus einem tertiären Amin der Formel
    Ri
    und einem N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus oder ein entsprechendes quartäres Ammoniumsalz enthält, worin R1, R2 und R3 voneinander unabhängig niederes Alkyl bedeuten oder R1 und R2 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring bilden.
  2. 2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Mischung vorzugsweise aus äquimolaren Mengen des tertiären Amins und des N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus besteht.
  3. 3. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das N-Hydroxid eines Stickstoff enthaltenden Heterocyclus Verbindungen der Formeln
    -OH
    sind, worin R5 und R6 unabhängig Wasserstoff oder niederes Alkyl bedeuten oder R6 und R6 bilden zusammen mit den C-Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring, der unsubstituiert oder mit einem niederen Alkyl oder einer elektronenziehenden Gruppe monosubstituiert ist, R10 und Rn Wasserstoff bedeuten, zusammen einen Ring bilden oder fehlen, wenn R5 und R6 zusammen einen aromatischen Ring bilden und worin außerdem A gleich N oder CR7, Z gleich N oder CR8 und A gleich N ist, wenn Z gleich N und R7 und R8 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder eine elektronenziehende Grnnne bedeuten.
  4. 4. Mittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die elektronenziehende Gruppe eine NitrooderTrifluormethyl-Gruppe ist.
  5. 5. Mittel nach den Ansprüchen 1,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß das N-Hydroxid des Stickstoff enthaltenden Heterocyclus Verbindungen der Formel
    N-OH
    sind, worin A und Z die oben genannte Bedeutung haben und Rg gleich Wasserstoff, niederes Alkyl oder eine elektronenziehende Gruppe darstellt.
  6. 6. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß bevorzugte Verbindungen des N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus die Formel
    1/
    N-OII
    'n-oii
    haben.
  7. 7. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das tertiäre Amin Diisopropylethylamin, Triethylamin, N-Methylmorpholin, DMAP oder DABCO ist.
  8. 8. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Mischung als tertiäres Amin vorzugsweise Diisopropylethylamin und als N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus vorzugsweise Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy(oxo)benzotriazin oder eine Verbindung der Formel
    enthält.
    9. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Mischung äquimolare
    Mengen N-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylethylamin enthält. 10. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das quartäre Salz Verbindungen der Formel
    10
    «11 β
    F-3 I«
    sind, worin R1, R2 und R3 unabhängig niederes Alkyl sind, oder R1 und R2 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclic bilden; R6 und R6 unabhängig Wasserstoff oder niederes Alkyl bedeuten oder R6 und R6 zusammen mit den C-Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden, der unsubstituiert oder mit niederem Alkyl oder einer elektronenziehenden Gruppe monosubstituiert ist, R10 und R11 Wasserstoff bedeuten oder zusammen eine Bindung bilden oder R10 und R11 fehlen, wenn R5 und R6 zusammen einen aromatischen Ring bilden; worin weiterhin Agleich N oder CR7, Zgleich N oder CR8 und A gleich N, wenn Z gleich N ist; R7 und R8 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder eine elektronenziehende Gruppe und R4 Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen bedeuten.
  9. 11. Mittel nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß R6 und R6 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Phenylring bilden.
  10. 12. Mittel nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß R10 und R11 zusammen eine Bindung bilden.
  11. 13. Mittel nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß das Kation des quartären Ammoniumsalzes ein Diisopropylammoniumion, (DMAPH)+, Et4N+ oder Et3NH+ ist.
  12. 14. Mittel nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß das quartäre Ammoniumsalz Et4 +-OBt, ein Salz aus DMAP und HOBt, aus DMAP und HOOBt, aus DABCO und HOOBt, aus Diisopropylethylamin und HOBt oder aus Triethylamin und HOBt ist.
  13. 15. Verfahren zur schnellen Peptidkupplung zwischen einer ersten Aminosäure, die eine freie terminale Aminogruppe enthält, und einer acylierenden N-terminal geschützten zweiten Aminosäure, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion in Gegenwart eines Mittels nach Anspruch 1 erfolgt.
  14. 16. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß für eine Peptidkupplung
    a) eine erste Aminosäure, die eine freie terminale Aminogruppe enthält und eine acylierende N-geschützte Aminosäure in Gegenwart eines Mittels nach Anspruch 1 reagieren,
    b) die Na-Schutzgruppen von den Aminosäureresten entfernt werden und
    c) die Schritte a) und b) bis zum Erhalt des gewünschten Peptides wiederholt werden.
  15. 17. Verfahren nach den Ansprüchen 15 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß die erste Aminosäure kovalent an ein Syntheseharz gebunden ist und das gewünschte Peptid vom Harz abgespalten wird.
  16. 18. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß eine erste N-geschützte Aminosäure kovalent an ein Syntheseharz gebunden wird, die N°-Schutzgruppe abgespalten wird und mit einer zweiten N-geschützten Aminosäure in Gegenwart eines Mittels nach Anspruch 1 gekuppelt wird und dieser Zyklus wiederholt wird, bis das gewünschte Peptid vorliegt und anschließend das Peptid vom Harz abgespalten wird.
  17. 19. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplung in Gegenwart einer Mischung des tertiären Amins und des N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus oder des entsprechenden quartären Ammoniumsalzes erfolgt.
  18. 20. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplung in Gegenwart einer Mischung bestehend aus äquimolaren Mengen des tertiären Amins und des N-Hydroxy-Stickstoff enthaltenden Heterocyclus erfolgt.
  19. 21. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß das tertiäre Amin Diisopropylethylamin und der N-Hydroxy-Stickstoff enthaltende Heterocyclus Hydroxybenzotrialol, N-Hydroxy(oxo)benzotriazin oder eine Verbindung der Formel
    OH
    ist.
  20. 22. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 21, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplung in Gegenwart einer Mischung bestehend aus äquimolaren Mengen Diisopropylethylamin und Hydroxybenzotriazol erfolgt.
  21. 23. Verfahren nach den Ansprüchen 15 b;s 22, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplung in Gegenw^t von (EtU+ OBt" erfolgt.
  22. 24. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 22, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite Aminosäure, das tertiäre Amin und der N-Hydroxy-Stickstoff enthaltende Heterocyclus in äquimolaren Mengen vorliegen.
  23. 25. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 24, gekennzeichnet dadurch, daß zusätzlich ein dehydratisierendes Agens anwesend ist.
  24. 26. Verfahren nach Anspruch 25, gekennzeichnet dadurch, daß das dehydratisierende Agens Dicyclohexylcarbodiimid ist.
  25. 27. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 25, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion in Dimethylformamid durchgeführt wird.
  26. 28. Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 24, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite Aminosäure eine acylierende N-geschützte Aminosäure ist.
  27. 29. Verfahren nach Anspruch 28, gekennzeichnet dadurch, daß die Schutzgruppe eine basenlabile Na-Aminoschutzgruppe, eine nucleophil-labile N°-Aminoschutzgruppe, eine säurelabile Na-Aminoschutzgruppe oder eine durch Hydrierung entfernbare Na-Aminoschutzgruppe ist.
  28. 30. Verfahren nach Anspruch 28, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite Aminosäure eine Verbindung der Formel
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