DD290913A5

DD290913A5 - Verfahren zur immobilisierung biologisch aktiver materialien

Info

Publication number: DD290913A5
Application number: DD88319230A
Authority: DD
Inventors: Rainer Hintsche; Guenter Heinrich; Gerit Kampfrath; Bernd Hoffmann; Frieder Scheller; Juergen Nentwig; Dorothea Pfeiffer; Gert Neumann
Original assignee: Akad Wissenschaften
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1991-06-13
Also published as: DE3927056A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Materialien. Sie beschreibt Biosensoren zur Bestimmung von Substanzen in Loesung und ist fuer den Einsatz in der analytischen Chemie und in der medizinischen Diagnostik geeignet. Des weiteren betrifft sie in der Biotechnologie eingesetzte Biokatalysatoren fuer die Stoffwandlung. Die Merkmale der Erfindung bestehen darin, einen filmartigen, poroesen, polymeren Traeger, in den biologisch aktive Materialien eingeschlossen sind, auf chemischem Wege durch Zugabe von bi- oder polyfunktionellen Stoffen an seiner Oberflaeche so zu verschlieszen, dasz die Retention der Biomakromolekuele und gleichzeitig die rasche Permeation von Analyten und Reaktionsprodukten gewaehrleistet wird. Es werden kuerzere Ansprechzeiten der Biosensoren bzw. effektivere Stoffwandlungen erreicht.{Biotechnologie; Biosensoren; Biokatalysator; Immobilisierung; Oberflaeche; Polymere; bi- oder polyfunktionelle Stoffe}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biochemisch aktiver Materialien. Es betrifft insbesondere substratspezifische Biosensoren zur Bestimmung von Substanzen in Lösung und kann in der analytischen Chemie sowie der medizinischen Diagnostik angewendet werden. Weiterhin betrifft die Erfindung die Stoffwandlung mit immobilisierten biologisch aktiven Komponenten und kann in der Biotechnologie eingesetzt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Als Biosensoren sind Enzymelektroden mit vorgelagerten Membranen bekannt, bei denen die Biokomponente in einem

homogenen polymeren Träger, gegebenenfalls zwischen Dialysemembranen eingeschlossen ist (DD-Patent GO1N 2778884 [1985]; Anal. Chem. Acta 184 [1986] 287; J. Chem. Soc. Faraday Trans. 182 [1986] 1259; Analyst [London] 111 [1986] 1235; Anal.

Chem. 58 [1986] 1042; Anal. Chim. Acta 186 [1986] 287; Anal. Chim. Acta 187 [1986] 47). Die bioaktive Komponente kann auch auf der Oberfläche von Elektroden kovalent gebunden (Anal. Chim. Acta 142 [1982] 277,158

[1984] 137; Anal. Chem. 48 [1976] 1679,52 [1980] 1198,53 [1981] 2090,54 [1982] 1098,56 [1984] 667) oder adsorbiert sein (Bioelectrochem. Bioenerg. 12 [1984] 297,13 [1984] 163; Anal. Chim. Acta 169 [1985] 237; Agric. Biol. Chem. 48 [1984] 1969; J.

Electroanal. Chem. 48 [1984] 289). Beim Enzymfeldeffekttransistor werden die Biokomponenten entweder kovalent gebunden (Anal. Chem. 52 [1980] 1935; Anal. Chem. 57 [1985] 1924; Chem. Pharm. Bull. 33 [1985] 2556) oder in einer polymeren Trägerschicht, die in ihrer Gesamtheit eine

geeignete Semipermeabilität aufweist, eingeschlossen (Sensors and Actuators 7 [1985] 1; Anal. Chem. 57 [1985] 1920; J. Mol.

Catalysat 37 [1986] 133; J. Biotechnology 4 [1986] 135; Anal. Lett. 19 [1986] 85; Anal. Chem. 58 [1986] 1042). Für die biotechnologische Stoffwandlung sind polymere Schichten mit eingeschlossenen, biologisch aktiven Komponenten auf

festen Trägern bekannt (DE-AS 2642 232, DE-OS 2638193). Alle bekannten Lösungen mit polymeren Trägerschichten haben den

Nachteil, daß auf Grund der gleichmäßigen Semipermeabilität der gesamten Schicht, große Diffusionsbarrieren entstehen, die

entsprechend lange Ansprechzeiten der Sensoren, bzw. lange Reaktionszeiten bei Stoffwandlungen bedingen.

Bei kovalent gebundenen Biokomponenten in Biosensoren und Biokatalysatoren mit optimal kleinen Diffusionsbarrieren

besteht der Nachteil, daß die weitgehend ungeschützten Biokomponenten störenden und inaktivierenden Einflüssen ausgesetzt

ZIoI der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, substratspezifische Biosensoren mit kurzen Ansprechzeiten sowio Biokatalysatoren mit optimalen Diffusionsbedingungen zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, polymere Trägerschichten für Biosensoren und Biokatalysatoren zu entwickeln, die hohe Kozentrationen von biologisch aktiven Materialien einschließen, dabei aber relativ kleine Diffusionsbarrieren für niedermolekulare Stoffe aufweisen.

Erfindungsgemäß wird auf einen festen Träger eine poröse, funktionell Gruppe enthaltende Polymerschicht zusammen mit eingeschlossenen biologisch aktiven Materialien aufgebracht und an ihrer Oberfläche mit einem niedermolekularen bi- oder polyfunktionellem Agenz teilweise verschlossen. Der Porendurchmesser an der Oberfläche muß etwas kleiner werden als der Moleküldurchmesser der biologisch aktiven Materialien, damit das Auswaschen der Biokomponente wirksam verhindert, das Aus- und Eindiffundieren von Substraten und Reaktionsprodukten der biochemischen Reaktion aber nur minimal behindert wird. Dazu muß das Trägerpolymer eine ausreichende Zahl funktioneller Reste enthalten, die mit einem niedermolekularem bifunktionellen Agenz oder einem multifunktionellen Präpolymer, sogenannten Vernetzern, in gezielter Weise so miteinander reagieren, daß eine zusätzliche Quervernetzung den Porendurchmesser verkleinert. Für die Vernetzung wird der Vernetzer in einem Lösungsmittel oder aus der Gasphase mit der Oberfläche der Polymerschicht in Kontakt gebracht.

Als feste Träger sind die Oberflächen von Sensorelementen, die beispielsweise aus Metallen oder Siliziumverbindungen

bestehen, sowie Stützelemente für Biokatalysatoren aus Glas, Metall, Keramik oder Kunststoffolien geeignet.

Für die Beschichtung sind alle filmbildenden, haftfähigen Polymere geeignet, deren Präpolymere die oben definierten Eigenschaften der Schichten zu realisieren gestatten. Die Struktureigenschaften des Polymeren werden so gewählt, daß mit

eingelagerter Biokomponente eine geringe Diffusionsbarriere für Substrate und Reaktionsprodukte besteht, die die

Voraussetzung für kurze Sensoransprechzeiten bzw. effektive Subtsratwandlung bildet. Vorzugsweise sind Polyurethane, Polymethacrylate u. a. zur Verwendung geeignet. Beispielsweise bei Polyurethanfilmen sind als Vernetzer vorzugsweise Diisocyanate mit unterschiedlich langen Molekülketten

sowie Präpolymere mit drei oder mehr Isocyanatgruppen pro Molekül geeignet. In 0,5- bis 5%iger Konzentration werden die

Vernetzer in Lösungsmitteln, die den Polymerfilm nicht auflösen, durch Tauchen oder Aufsprühen zeitlich bis zum gewünschten Porenverschluß appliziert. Gegebenenfalls wird bei der Vernetzung durch Sprühen durch die Verwendung von Masken, ein Verteilungsmuster der Biokomponenten in der Weise realisiert, daß aus flächigen nicht vernetzten Gebieten der Polymerschicht die Biokomponente im Gegensatz zu den vernetzten Gebieten ausgewaschen wird. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens bestehen darin, daß geforderte Eigenschaften wie Haftfestigkeit des erzeugten Films, die Retention biologisch aktiven Materialien und optimaler Durchlaßfähigkeit für kleine Moleküle durch einen einzigen Polymerfilm erreicht wird. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher

erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

10μΙ einer Lösung von 10% Polyurethan in Aceton mit 100 U/ml suspendierter Glucoseoxidase werden auf eine in Si-Technologie hergestellte Dünnschichtmetallelektrode aufgetropft und mit 1000U/min zu einem gleichmäßigen Film abgeschleudert. Nachdem während 30 min bei 295 K das Lösungsmittel weitgehend abgedampft ist, läßt man auf die polymere Schicht über dem aktiven Elektrodenareal eine 10%ige Lösung von isocyanathaltigem Polyurethanpräpolymer in Äthylacetat 30 Minuten einwirken. Nach anschließender 24stündiger Quellung im 0,001 mol/l Acetatpuffer pH 6,5 ist der Glucosesensor einsatzbereit.

Beispiel 2

2 μΙ einer 2%igen Lösung von Polyurethan in Chloroform/Aceton (90:10) mit 100U/ml suspendierter Urease werden in die durch die Verkappung eines pH-sensitiven Feldeffekttransistors gegebene Grube eingetropft und ca. 30 Minuten bei 295 K zur Abdunstung des Lösungsmittels gelagert. Die weitere Behandlung erfolgt analog Beispiel 1, jedoch mit einer Lösung von 5% Diphenyldiiosocyanat in Äthylacetat. Der resultierende Harnstoffsensor ist nach 24 Stunden Lagerung in Phosphatpuffer (0,001 mol/l; pH 7,0) einsatzfertig.

Beispiel 3

Auf flächigen Gebilden aus Glas, Keramik, Polyvinylchlorid oder Polyester wird eine Suspension von 80 U/mI Invertase und 100 U/ml GOD in einer 10%igen Lösung von Polyurethan in Aceton als 0,1 mm Film aufgegossen. Nach 1 Stunde abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur wird der gesamte Polymerfilm mit einer 2%igen Lösung von Phenyldiisocyanat in Äthylacetat homogen besprüht und nach 30min in 0,001 mol/l Phosphatpuffer pH 7,0 überführt. Nach weiteren 5 Stunden in Phosphatpuffer (0,1 mol/l; pH 7) werden die Biokatalysatoren zur Disaccharidspaltung eingesetzt. Alternativ können während des Besprühens Zonen abgedeckt werden, aus denen während des Quellvorganges bioaktive Komponenten ausgewaschen werden.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem festen Träger eine filmartige, poröse und funktionell Gruppen enthaltende Polymerschicht mit eingelagerten biologisch aktiven Materialien erzeugt und der Porendurchmesser an der Oberfläche nach Einwirkung eines bi- oder polyfunktionellen Vernetzers kleiner als der Durchmesser der eingelagerten biologisch aktiven Moleküle wird.

2. Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Systemen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Träger für die Polymerschicht die aktive Oberfläche eines Sensors oder flächige Gebilde aus Glas, Keramik oder Polymeren verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung durch Kontakt des Vernetzers mit der Oberfläche der Polymerschicht aus einem Lösungsmittel oder aus der Gasphase erfolgt und gegebenenfalls Zonen der Oberfläche vor dem Vernetzer geschützt werden.