DD291579A5 - Verfahren zur herstellung von markiertem beta-cyano-l-alanin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von markiertem b-Cyano-L-alanin. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz die Verbindung durch eine enzymkatalysierte b-Substitutionsreaktion mittels Cyanoalaninsynthase vorzugsweise in immobilisierter Form aus Cystein und Cyanidion hergestellt wird, wobei diese Substrate wahlweise die Nuclide 12C, 13C, 14C und/oder 14N, 15N enthalten koennen. Markiertes b-Cyano-L-alanin wird als Biochemikalie in der Biochemie zur Aufklaerung des Aminosaeure- und Cyanidstoffwechsels, im Zusammenhang mit Problemen des Umweltschutzes, sowie als Vorstufe fuer markiertes L-Asparagin bzw. markierte L-Asparaginsaeure eingesetzt.{b-Cyano-L-alanin; Markierung, radioaktiv, stabilisotop; Enzym; Cyanoalaninsynthase; b-Substitutionsreaktion; enzymkatalysiert; Biochemikalie}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von markiertem ß-Cyano-L-alanin als markierte Bioshemikalie. Diese Biochemikalie wird angewendet zur Aufklärung des Cyanidstoffwechsels, dos Aminosäurestoffwechsel ? und im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Umweltschutz. Markiertes ß-Cyano-L-alanin ist chemische Vorstufe zu markierter L-Asparaginsäure und markierten L-Asparagin.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Es sind .'.wei Methoden zur Herstellung von markiertem ß-Cyano-L-alanin bekannt. Die gemischt chemisch-erzymatische Synthese von ß-Cyano-L-alanin-4-HC geht von a-Acetamido-a-dimothylaminomethylmalonsäurediethylester methiodid aus. Durc'i Kondensation mit KCN-14C wird der Ethylester von N-Aceiyl-ß-cyano-DL-alanin-4-"C erhalten, dessen Hydrolyse N-Acetyl-ß-cyano-DL-alanin-4-uC ergibt. Aus dieser Verbindung wird durch enzymatische Racematspaltung m'ttels Acylase ß-Cyano-L-alanin-4-'4C erhalten. Die Ausbeute dieser 3stufigen Synthese, bei der das radioaktive "C-Cyanid in der 1. Stufe eingesetzt wird, ist gering (Y.-H.Gizaand C.Ressler; J. Labelled Compounds 5,142 [1969]). Die gemischt chemisch-enzymatische Synthese von L-ß-Cyano-alanin-4-'3C geht von der Kondensation von Acetamidomalonsäurediethylester mit Bromacotonitril-1 -13C, welches selbst in einer 3stufigen Reaktionsfolge au;-, ti Jn Startprodukten Piperidin, Formaldehyd, Natriumhydrogensulfit und Natriumcyanid-13C erhalten wurde, aus. Der gebildete a-Acetamido-a-^C-cyanomethyl-malonsäurediethylester wird hydrolysiert und ducarboxyliert und dann das Acety !derivat von ß-Cyano-DL-alanin-4-'3C mit Acylase der enzymatischen Racematspaltung unterworfen (K. H. Rohm, R. L. van Etten; J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 22,909 [1985]). Nachteil dieser beschriebenen Herstellungsmethoden ist, daß auf den Einsatz des markierten Cyanids bezogen sehr geringe Ausbeuten erzielt warden. Dies ist insbesondere eine Folge de- arbeits- und zeitaufwendigen Vielstufensynthesen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, in einer einfachen Reaktion aus leicht zugänglichen Verbindungen markiertes ß-Cyano-L-aianin in hoher Reinheit und guter Ausbeute herzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von markiertem ß-Cyano-L-alanin zu entwickeln, das·, die Einführung verschiedener Nuclide in verschiedene Positionen des Moleküls erlaubt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Herstellung durch eine enzymkatalysierte, stereospezifische ß-Substitutionsreaktion gemäß nachstehender Gleichung
L-HS-Ch2-CH(NH2)COOH + CN L-CN-CH2-CH(NHj)COOH + SH-
erfolgt.
Nach dieser erfindungsgemäßen Vorgehenswoise wird eine Präparation von Cyanolaninr.ynthase (EC 4.4.1.9), (S.M. Galoyan, E.A.Tolosa, I.Willhardt, E.V.Goryachonkova; Biokhimiya 46,1855 [1981)) zweckmäßigerweise in immobilisierter Form mit L-Cystein und Cyanidionen als Substrate im Temperaturbereich von 293-318K, im pH-Bareich von 7-9 und in einem Substratkonzentrationsbereich 0,1-0,001 mol/l zur Reaktion gebracht und ß-Cyano-L-alsnin aus dem Reaktionsgemisch in bekannter Weise isoliert. Als Substrate können entsprechend dor gewünschten Markierung 12C-, 13C-, 14C-, 14N- und/oder '5N-markiertes Cystein und/oder '2C-, 13C- oder '4C- bzw. HN- oder 15N-0yanid eingesetzt werden. Die Immobilisierung des Enzyms begünstigt die Trennoperation, stabilisiert die Enzymaktivität und erlaubt eine Wiederverwendung der Enzympräparation.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird nachfolgend an zwei Beispielen erläutert.
Beispiel 1: ß-Cyano-L-alanin-4-HC (radioaktiv markiert)
Cyanoalaninsynthase wird aus Lupinenkeimlingen nach S.M.Galoyan.E.A.Tolosa, I. Willhardt, E. V. Goryachenkova; Biokhimiya 48,1855 (1981) angereichert bis keine unerwünschte Fremdaktivität enthalten ist und an ein mit Epoxidgruppen modifiziertes Copolymerisat von Hydroxyethylmethacrylat und Ethylenbismethacrylat (EP 186347) immobilisiert.
Die Suspension des Immobilisatos wird in 0,1 M Pyrophosphatpuffer, pH 8,6, bei der Temperatur von 310K mit einer Lösung von jeweils 0,01 M L-Cystein und KCN-14C zur Reaktion gebracht und durch analytische Kontrolle, z. B. mittels HPLC oder Dünnschichtchromatographie, der UmsaUverlauf verfolgt. Nach Beendigung der Umsetzung wird filtriert, restliches Cystein durch Luftoxidation in schworlösliches Cystin umgewandelt und abgetrennt, danach die Cyanoalanin- und Cyanidionen-haltige Pufferlösung über einem stark sauren Ionenaustauscher filtriert. Nach dem Waschen mit Wasser kann von diesem das markierte Cyanoalanin mittels wäßrigen Ammoniaks eluiert werden. Aus dem Eluat wird durch Konzentrieren Cyanoalanin gewonnen, dessen radiochemische Reinheit durch chromatographische Methoden gesichert wird.
Beispiel 2: ß-Cyano-L-slanin-4-16C (stabilisotop markiert)
Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedjch NaCN-16N eingesetzt. Die Detektion bei der Umsatzkontrolle, Isolierung und Reinigung erfolgt in diesem Falle mittels der Ninhydrinreaktion.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von markierten ß-Cyano-L-alanin, gekennzeichnet dadurch, daß diese Verbindung durch eine enzymkatalysierte ß-Substitutionsreaktion mittels Cyanoalaninsynthase aus Cystein und Cyanidion, wobei Cystein und/oder Cyanidion radioaktiv und/oder Stabilisotop markiert sind, im pH-Bereich 7-10, im Temperaturbereich 293-318 K, und im Substratkonzentrationsbereich 0,1-0,001 mol/l hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der enzymatische Reaktionsschritt vorzugsweise mit einer immobilisierten Cyanoalaninsynthase erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß den Substraten Cystein und Cyanidion d.e Nuclide 12C, 13C, 14C, 14N und/oder 16N eingebaut sind.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0733374A3 (de) * | 1995-03-24 | 1999-06-02 | Research Development Corporation Of Japan | Cyano-alpha-amino Carboxylsäure, und deren Verwendung in der Herstellung von radiomarkierten Alpha-Aminosäuren |
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1990
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