DD291777A5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humaneErythrozyten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humaneErythrozytenInfo
- Publication number
- DD291777A5 DD291777A5 DD291777A5 DD 291777 A5 DD291777 A5 DD 291777A5 DD 291777 A5 DD291777 A5 DD 291777A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- human
- lymphocytes
- cell line
- ebv
- serum
- Prior art date
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 4
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940116540 protein supplement Drugs 0.000 claims description 3
- 235000005974 protein supplement Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 claims description 2
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CTNPHHZPAJYPFO-PDXBGNJTSA-N (3s,5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3-[(2r,4s,5r,6r)-5-[(2r,3s,4s,5r,6s)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-4-methoxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5,14-dihydroxy-13-methyl-17-(5-oxo-2h-furan Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C=O)CC[C@@H](C[C@@]5(O)CC[C@H]4[C@@]3(O)CC2)O[C@H]2C[C@@H]([C@@H]([C@@H](C)O2)O[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](CO)O2)O)OC)=CC(=O)OC1 CTNPHHZPAJYPFO-PDXBGNJTSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- FHIREUBIEIPPMC-UHFFFAOYSA-N K-Strophanthin-beta Natural products O1C(C)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(OC)CC1OC(CC1(O)CCC2C3(O)CC4)CCC1(C=O)C2CCC3(C)C4C1=CC(=O)OC1 FHIREUBIEIPPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 description 1
- 101150108812 proC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikoerper (hmAK) der Klasse IgG gegen humane Erythrozyten. Der hmAK CB-hahE wird aus der Hybridomzellinie H-CB-hahE durch Kultivierung in serumfreiem Medium gewonnen. Die Zellinie ihrerseits wird durch Fusion EBV-transformierter humaner Lymphozyten mit der Human-Maus-Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) erhalten. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{monoklonale Antikoerper (mAK); humane mAK; humane Erythrozyten; Hybridomzellinien; EBV-Transformation; Lymphozyten; Heteromyelomzellinie CB-Fu2; Medizin; Diagnostik}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monokloialer Antikörper (mAK) gegen humane Erythrozyten, insbesondere zur Herstellung panagglutinierender humaner mAK (hmAK) der Klasse IgG gegen menschliche Erythrozyten. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik von Antikörper-ir duzierenden Infektionskrankheiten durch indirekte Agglutinationstests.
Die Produktion hmAK stellt eine Quelle von Antikörper für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie verschiedener Erkrankungen des Menschen dar. Es werden international Anstrengungen zur Erzeugung von hmAK gegen bakterielle und virale Antigene, Tumor- und Zeil- bzw. Gewebeantigene unternommen (James, K., u. Bell, G.T.: Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J.of Immunol. Meth. 100 [1987), 5-40). Dabei werden hauptsächlich zwei Herstellungsmethoden angewandt:
1. die somatische Fusion von humanen B-Lymphozyten mit murinen, heterologen (Mensch χ Maus) oder humanen Myelomlinlen
2. die Immortalisierung humaner B-Lymphozyten durch Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus,
Zusätzlich findet auch die Kombination von Transformation und anschließender somatischer Fusion Anwendung, so z. B. bei der Herstellung hmAK gegen das Blutgruppenmerkmal Rho(D) (Bron, D.; Feinberg, M. B.; Teng, N. N. H., u. Kaplan, H. S.: Production of human monoclonal IgG antibodies against Rhesus (D) antigen. Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.81 [1984] 3214-3217). HmAK wurden auch gegen eine Reihe anderer blutgruppenspezifischer Oberflächenantigene auf humanen Erythrozyten entwickelt (Goossens, D.; Champomier F.; Rouger, Ph., u. Salmon, Ch.: Human monoclonal antibodies against blood group antigens. J.of Immunol. Meth., 101 (1987) 193-200). Blutgruppenunabhängige hmAK gegen menschliche Erythrozyten allgemein sind bislang allerdings noch nicht beschrieben worden.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, der medv-ir ischen Diagnostik hmAK zur Verfugung zu stellen, die zum Aufbau von indirekten Agglutinationstestsystemen bei Infektionskrankheiten geeignet sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst Hybridomzellinien erzeugt werden können, aus denen sich in anschließenden Verfahrensschritten mAK gegen humane Erythrozyten herstellen lassen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß EBV-transformierte periphere Lymphozyten, die nach Boosterung von rh-Negativen mit Orh-positiven Erythrozyten gewonnen werden, kultiviert und danach mit der Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314; DD-WP274446) fusionier! werden, daraus die monoklonale Hybridomzellinie H-CB-hahE (ZIM-0497) etabliert, an serumfreies Kulturmedium adaptiert und aus dem zellfreien Kulturüberstand der humane monoklonale Antikörper CB-hahE
isoliert wird. Die Lymphozyten werden am 7.Tag nach Booeterung gewonnen und die EBV-transformierten Lymphozyten über eine Dauer von 5 Monaten kultiviert. Die Kultivierung der EBV-tranformierten Lymphozyten erfolgt mit einem Fütterungsinterval von 4 bis 6 Tagen mit einem Medienaustausch von jeweils 30%. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß
a) die Primärhybridome sich nach der Fusion mit der Heteromyelomzellinie CB-Fu 2 in einem serumfreien Selektionsmedium mit Rinderserumalbumin, Humantransferrin und Rinderinsulin als Prpteinzusätze kultivieren lassen,
b) die etablierte Hybridomzellinie H-CB-hahE sich in einem Kulturmedium mit einem Proteinzusatz von 2 g/l Humanserumalbumin kultivieren läßt. Grundlage für das eingesetzte Kulturmedium ist das Basismedium RPM11640 (Moore, G.E. et al; J.Am.Assoc. 199,519-52411967]; Moore, HJ.; In vitro 6,99-10011970]).
Der Erfindung lagen zwei theoretische Hypothesen zugrunde:
1. im periphoren Blut von geboosterten anti-D-Spendern befinden sich B-Lymphozyten, die im Falle einer Differenzierung zur Plasmazelle in der Lage sind, multireaktive Antikörper unter anderem gegen die eigenen Erythrozyten zu bilden.
2. diese B-Lymphozyten lassen sich durch EBV-Transformation in vitro immortalisieren und zur Sekretion der Antikörper anregen, wobei ein Klassenswitch von IgM zu IgG nach längerer Kultivierung möglich ist.
Das aus der Fusion mit der Linie CB-Fu 2 (ZIM 0314) gewonnene Hybridom wird als H-CB-hahE bezeichnet. Es ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstitutes für Molekularbiologie der ADW der DDR, Berlin-Buch unter der Nummer ZIM 0497 hinterlegt worden. Tabelle 1 zeigt die Resultate des Primärscreenings 10 Tage nach der Fusion der EBV-transformierten Lymphozyten. Dor Pi 'märklon H-CB-hahE wurde mehrfach Moniert, an serumfreies Medium adaptiert und in größerem Maßstab in vitro kultiviert. Aus dem produzierten Zellkulturüberstand wurde der hmAK mittels Protein-A-Sepharose isoliert. Mit Hilfe der ELISA-Technik wurde gezeigt, daß der hmAK zur Klasse IgG gehört und leichte Ketten des Types Lambda besitzt. Auf allen Etappen der Herstellung der hmAK wurden verschiedene Testmethoden zum Nachweis ihrer Spezifität eingesetzt.
Ergebnisse der Fusion zwischen der Parentalzellinie CB-Fu 2 und EBV-transformierten periphoren Blutlymphozyten eines anti-D-Spenders
| Zell kulturen | angelegt | mit Wachstum | Ig+ | IgM+ | IgG+ | anti-Human- erythrozyten+ |
| η % | 176 100 | 176 100 | 159 90,3 | 16 9,1 | 143 81,2 | 42 23,9 |
1. Zellprftparatlon, EBV-Traneformatlon und Zellkulturbedingungen:
Mittels Dichtezentrifugation werden die mononukleären Zellen gewonnen. 2x10' mononukleäre Zellen werden In 10ml RPMI-1640-Basismedium resuspsndiert und sedimentiert. Der Überstand wird dekantiert und das Sediment wird in 3ml zellfreien Kulturüberstandes der EBV infizierten Zellinie B95/8 resuspendiert. Nach einer Inkubation von 3 h be! 370C wird die Suspension mit RPMI-1640, einem Anteil von 10% fetalem Kälberserum und einem Zusatz von 0,001 mg/ml Cyclosporin A auf eine Konzentration von 105 Zellen/ml verdünnt. Die Zellen werden dann zu je 1 ml/Well auf die Kavitäten einer 24-Well-Platte verteilt. Die Zellen werden kultiviert, indem alle 2-3 Tage 50% des Mediums gewechselt werden. Nach Expansion der EBV-transformierten mononukleären Zellen werden die zellfreien Überstände der Kavitäten auf anti-erythrozytäre Antikörper getestet, und die Zellen aus den positiven Kavitäten in 25cm*-Zollkulturflaschen übernommen. Im Verlauf von 4 Monaten wird alle 4-5 Tage ein Medienaustausch von 30% vorgenommen, wobei auf den Zusatz von Cyclosporin A verzichtet wird.
2. Zellfusion: Die EBV-transformierten mononukleären Zellen sowie die CB-Fu 2-Zellen werden in RPMI-1640 zweimal sedimentiert und anschließend in einem 1:5 Verhältnis von Heteromyelomzellen zu mononukleären Zellen gemischt und erneut sedimentiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes und der Resuspendierung des Sediments in der Restflüssigkeit wird langsam unter ständiger Bewegung des Sedimentes autoklaviertes, noch flüssiges Polyethylenglykol 1 500 zugegeben. Nach einer Wirkzeit von 120see. wird das Polyethylenglykol durch Zugabe von RPMI-1640 langsam verdünnt. Anschließend werden die Zellen nochmals gewaschen. Das Sediment wird in einem Medium folgender Zusammensetzung aufgenommen: Basismedium - IMEM:HamsF12imVerhältnis1:1,
Proteinzusätze - ölsäurekomplexiertes Rinderserumalbumin - 1 g/t
- Humanserumtransferrin, eisengesättigt - 10mg/l
— Rinderinsulin - 10mg/l,
sowie 2 mM L-Glutamin und 2 mM Na-Pyruvat. Die Zelldichte der Suspension wird auf 10e Zellen/ml eingestellt, und je 0,150ml dieser Suspension pro Kavität einer 96-Well-Platte einpipettiert. Nach 24h wird pro Kavität eine vierfach konzentrierte HAT/Strophanthin-Lösung zugesetzt. Nach 10 Tagen Kultivierung in feuchter, 5% CO2-haltiger Atmosphäre werden die Zellkulturüberstände gesammelt und hinsichtlich einer spezifischen Antikörperproduktion getestet. Positive Kulturen werden in RPMI-1640-Basismedium mit einem Anteil von 10% fetalem Kälberserum sowohl kloniert, als auch vergrößert und konserviert.
3. Erythrozytenblndungsassay: Zum spezifischen Nachweis anti-erythrozytärer Antikörper werden je 0,0BmI Kulturüberstand aus den Kavitäten mit Zellwachstum entnommen und in die Kavitäten einer 96-Well-Rundbodenplatte übertragen. Dann werden je 0,1 ml 0,5%iger Erythrozytensuspension in isotoner Kochsalzlösung pro Kavität zupipettiert. Die Testplatten werden 20 min bei 370C und danach 20min bei 4°C inkubiert. Bei Zimmertemperatur wird die vollständige Sedimentation der Erythrozyten auf den Rundboden der Kav'.~* abgewartet. Aus den Kavitäten werden je 0,08ml Überstand abgesaugt und je 0,05ml Antiserum gegen Humanimmunoglobulin (Coombsserum) zugesetzt, wobei die Erythrozyten vollständig resuspendiert werden. Nach einer
Inkubation von 20min bei 370C wird die Sedimentation der Erythrozyten bei Zimmertemperatur abgewartet, und das Reaktionsergebnis visuell abgelesen.-Der Test wird mit Erythrozyten der Blutgruppenspezifitäten Orh-positiv, Orh-negativ, Arh-negativ, Brh-negativ, ABrh-negativ, sowie mit allen Varianten von Pannelerythrozyten durchgeführt.
4. Adaptation an serumfreiet Medium: Eine spezifische Antikörper produzierende Zellinie wird innerhalb von 6 Tagen in 0,51 RPMI-1640-Kulturmedium mit einem Anteil von 10% fetalem Kälberserum bis zu einer Zelldichte von 2,2 χ 10s Zellen/ml in einer Rollerzellkulturflasche angezüchtet. Die Zellen werden in den extrakapillaren Raum eines Kapiilar-Dialysators mit einer effektiven Dialyseoberfläche von 1,2 m2 eingeimpft. Sie worden über einen Zeitraum von 5 Tagen im Dialysator kultiviert, indem im intrakapillaren Raum ein Basismediendurchsatz von 3 l/Tag, und am 3. Tag der Kultivierung Im extrakapillarem Raum eine Erneuerung von Basismedium mit einem Zusatz von 2 g/l Humanserumalbumin erfolgt. Am 5.Tag werden die Zellen aus dem Dialysator geerntet, in RPMI-1640-Basismedium mit einem Zusatz von 2g/l Humanserumalbumin auf 1,6 x 106 Zellen/ml verdünnt, in Rollerflaschen aufgenommen und zur Antikörperproduktion weiter kultiviert.
5. Antlkörperauf reinigung: 2 Liter zellfreien Kulturüberstandes einer spazifische Antikörper produzierende Zellinie werden über eine Tangentialflußdruckfilteranlage mit einer Filterfläche von 260cm2 und einer Ausschlußgrenze von 3OkD auf 50ml konzentriert. Mit einer 1M Tris-Lösung wird der pH-Wert des Konzentrates auf 8,6 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Protein-A-Sepharose-Säule mit einem Gelvolumen von 5ml aufgetragen und der Antikörper wird in einem pH-Gradienten bei einem pH-Wert von 3,8 eluiert. Das Antikörperpräparat wird mit Tris-Puffer auf einen neutralen pH-Wert eingestellt und elektrophoretisch auf Reinheit analysiert.
Claims (5)
- Patentanspruch:1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAK) gegen humane Erythrozyten durch EBV-Transformation der nach Boosterung von rh-Negativen mit Orh-positiven Erythrozyten gewonnenen peripheren Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß die derart transformierten Lymphozyten kultiviert und danach mit der Heteiomyelomzellinie CB-Fu 2 (ZIM-0314) fusioniert werden, daraus die monoklonale Hybridomzellinie H-CB-hahE (ZIM0497) etabliert, an serumfreies Kulturmedium adaptiert und aus dem zellfreien Kulturüberstand der humane monoklonale Antikörper (hmAK) CB-hahE isoliert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten am 7.Tag nach Boosterung gewonnen und die EBV-transformierten Lymphozyten über eine Dauer von 5 Monaten kultiviert werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der EBV-transformierten Lymphozyten mit einem Fütterungsinterval von 4-5 Tagen und einem Medienaustausch von jeweils 30% erfolgt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Primärhybridome nach der Fusion mit der Heteromyelomlinie CB-Fu 2 in einem serumfreien Selektionsmedium mit Rinderserumalbumin, Humantransferrin und Rinderinsulin als Proteinzusätze kultiviert werden.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellinie H-CB-hahE an ein serumfreies Kulturmedium aufderGrundlagevonRPMI-Rasismedium mit einem Proteinzusatzvon 2g/l Humanserumalbumin adaptiert wird.
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4472500A (en) | Rat myeloma cell lines | |
| US4350683A (en) | Antibody production from hybrid cell line | |
| DE3301249C2 (de) | ||
| Kawamoto et al. | Development of a serum-free medium for growth of NS-1 mouse myeloma cells and its application to the isolation of NS-1 hybridomas | |
| US4468346A (en) | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins | |
| FI91542B (fi) | Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä vastaan | |
| DE3786673T2 (de) | Verfahren zur entfernung unerwünschter zellen aus menschlichen lymphozytenpopulationen, anwendung des verfahrens zur herstellung monoklonaler antikörper und dafür geeigneter kit. | |
| DD291777A5 (de) | Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humaneErythrozyten | |
| DD291777B5 (de) | Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen humane Erythrozyten | |
| DD293134A5 (de) | Verfahren zur Herstellung monoklonaler anti-D-Antikörper und eines daraufbasierenden Testpräparates | |
| DD293134B5 (de) | Verfahren zur Herstellung monoklonaler anti-D-Antikoerper und eines darauf basierenden Testpraeparates | |
| EP0077571A2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Lymphokine | |
| Scharff et al. | Hybridomas as a source of antibodies | |
| GB2079313A (en) | Improvements in or relating to rat myeloma cell lines | |
| EP0295605B1 (de) | Von menschlichen B-lymphoblastoiden Zellen abstammender Faktor zur Stimulierung der Antikörperproduktion und Verfahren zur Antikörperherstellung unter Verwendung dieses stimulierenden Faktors | |
| US20030186335A1 (en) | Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method | |
| DE4109973C2 (de) | In ovo-Kultivierungssystem für Hybridomzellen | |
| DE68913793T2 (de) | Ein von einem Human-Human-Hybridom abgeleiteter monoklonaler Antikörper und dessen Verwendung. | |
| DD292021B5 (de) | Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikoerper gegen Alpha-Haemolysin von Staphylococcus aureus | |
| DD292021A5 (de) | Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper gegenAlpha-Hämolysin von Staphylococcus aureus | |
| JPS6152287A (ja) | 細胞融合方法 | |
| CH668775A5 (en) | Highly stable hybridomaoma cell line for antibody prodn. - made by fusing secreting cell with compatible xenogeneic hybrid as immortalising component | |
| JPS63152993A (ja) | γ―インターフェロンの製造方法 | |
| GB2145113A (en) | Production of human monoclonal antibodies | |
| CH670099A5 (en) | New hybridoma cell lines - obtd. by fusing mouse-human hybrid cells with human cells |