DD292977A5 - Verfahren und Testbesteck zur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen(RT) - Google Patents
Verfahren und Testbesteck zur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen(RT)Info
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testbesteck zur Aktivitaetsbestimmung reverser Transkriptasen (RT) in Retroviren, z. B. die des die Immunschwaeche AIDS verursachenden HIV-1. Mit Hilfe Hapten-markierter oder substituierter Nukleotidtriphosphate gelingt die RT-Bestimmung im Festphasenimmunoassay und damit der Nachweis von Retroviren unter Verwendung monoklonaler Antikoerper und unter Umgehung radioaktiver Nukleotide. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik (Virologie) und die pharmazeutische Industrie.{Virologie; Retroviren; reverse Transkriptase; RT; Aktivitaet; RT-Bestimmung; Nukleotide; Nukleotidtriphosphate; HIV-1; AIDS; Festphasenimmunoassay; Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Medizin; Diagnostik; Pharmazie}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testbesteckzur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen (RT) unter Umgehung der bekannten Isotopentechniken und findet vorrangig Anwendung in der molekularbiologischen Grundlagenforschung und angewandten Medizin und Veterinärmedizin auf dem Gebiet der Virologie zur Charakterisierung und zum Nachweis von Retroviren, darüber hinaus in der Pharr. .akologie und pharmazeutischen Industrie zur Überprüfung der Wirksamkeit von Hemmsubstanzen der reversen Transkriptase.
Der Nachweis der Aktivität reverser Transkriptasen erfolgt ausschließlich durch die Polymerisation Tritium-markierter oder "Phosphor-markierter Deoxynukleotid-Triphosphate an einer Einzelstrangmatritze (Template, meist Poly(rA) der Kettenlänge 100) mit Startersequenzen (Primer, meist Oligo [dT] der Kettenlänge 10-20) (D. Baltimore und D.Smoler: Proc. Natl. Acad. Sei. 68 (1971 ], 1507-1511). Der Einsatz der mit radioaktiven Isotopen markierten Nukleotide begrenzt diese Methode auf wenige Labore und ist mit allen Nachteilen, die aus dem Umgang mit radioaktivem Material herrühren, behaftet, wie z. B. der Substanzlagerung, den erforderlichen Genehmigungen zum Umgang mit diesen Substanzen, der Versuchsdurchführung in Speziallaboratorien sowie der Abfallbeseitigung. Darüber hinaus eignet sich diese Methode nur bedingt zur Automatisierung, verursacht durch die notwendige Präzipitation des Reaktionsproduktes auf eine Matrix, in der dann die radioaktiven Zerfälle gemessen werden.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, den Einsatz von radioaktiven Isotopen bei der Bestimmung der RT zu umgehen, die RT-Bestimmung weitgehend zu automatisieren und die jeweilige RT spezifisch zu erfassen.
-2- 292 977 Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren undTestbestecke zu entwickeln, die einerseits den Einsatz von Nukleotiden, die mit radioaktiven Isotopen markiert sind, umgehen und andererseits durch Umgehung der Abtrennung nicht polymerisierter Nukleotide einen hohen Automatisierungsgrad bei der RT-Bestimmung ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß z. B. Tritium-markiertes Thymidintriphosphat (3HTTP) gegen anders markierte Nukleotidtriphosphate, die der RT ebenfalls als Substrat dienen, ausgetauscht wird. Die an der Matritze polymerisierten markierten Nukleotide werden durch eine Bindungsreaktion nachgewiesen, wobei die gegen die Marker (Ugandan) gerichteten Binder selbst markiert sind und die Signalintensitut dieser Marker in Beziehung zur Aktivität der zu messenden RT steht.
Gewöhnlicherweise handelt es sich bei dem Liganden um ein Hapten, bei dem Binder um einen Antikörper gegen dieses Hapten, wie zum Beispiel Brom oder Digoxigenin in 5-Bromo-2-deoxy-uridin-5-triphosphat (BrdUTP) oder Digoxigenin-11-dUTP und markierten anti-BrdUTP- bzw. anti-Digoxigenin-Antikörpern. Als Marker für die Antikörper werden Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase bzw. Fluorochrome, verwendet. Neben der Hapten-Antikörperreaktion können bei anderen Ligand-Binder-Wechselwirkungen zum Nachweis der Nukleotidpolymerisation Biotin-markierte Nukleotide, wie z. B. Biotinmarkiertes 11 -dUTP und Streptavidin-markierte Peroxidase (Biotin-Streptavidin-System), zum Nachweis der RT-Aktivität eingesetzt werden. Da die frei verbliebenen markierten, mit den durch die RT polymerisierten Nukleotiden um dieAntikörperbindung konkurrieren, ist die Konzentration der markierten Nukleotide so gering wie möglich zu halten, ohne jedoch einen Substratmangel für die RT zu erzeugen. Das ist in jedem Fall erforderlich, wenn die Menge eingebauter markierter Nucleotide im Anschluß an die RT-Reaktion in einem Ein-Schritt-Zwei-Seiten-Immunoassay nachgewiesen wird. Erfolgt der Nachweis im Zwei-Schritt-Immunoassay, so besteht die Möglichkeit, nach Bindung dos Stranges mit den markierten Nukleotiden die r jch frei verbliebenen nicht-polymerisierten Nukleotide durch Spülen (Bound/Free[BFj-Trennung) vor der Inkubation dor enzym- oder (luorochrom-markierten Antikörper zu entfernen. Die Entfernung der markierten nicht-polymerisierten Nukleotide erfolgt dadurch, daß die Bindung entweder des Doppelstranges mit inkorporiertem Digoxigenin-11 -dUTP oder des Einzelstranges nach alkalischer Hydrolyse oder thermischer Schmelzung (T. Porstmann, T.Ternynck und S. Avrameas: J. Immunol. Methods 82 (1985), 169-179), im Falle des Nachweises von inkorporiertem BrdUTP nach einem anderen Prinzip realisiert wird, z. B. immunologisch über einen Festphaseinsolubilisierten monoklonalen anti-DNA-Antikörper oder über insolubilisiertes methyliertes Rinderserumalbumin bzw. kovalent über Epoxysilan.
Um eine spezifische RT (z. B. die des die menschliche Immunschwäche AIDS verursachenden Retrovirus HIV-1) nachzuweisen, wird vor der eigentlichen RT-Reaktion die reverse Transkriptase aus dem Viruslysat durch einen insolubilisierten anti-HIV-1 -RT-Antikörper isoliert. Nach einer Inkubationszeit des Viruslysats in mit monoklonalen anti-HI V-1 -RT-Antikörpern beschichteten Kavitäten einer Mikrotiterplatte oder Röhrchen bzw. Kugeln zwischen 60 und 240min (vorzugsweise 90min) bei 20 bis 250C werden alle nicht gebundenen Bestandteile durch Absaugen der Flüssigkeit und mehrmaliges Spülen der Kavitäten, Röhrchen bzw. Kugeln mit Pufferlösungen bekannter Zusammensetzung entfernt. Anschließend wird die RT-Reaktion mit BrdUTP bzw. mit Digoxigenin-11-dUTP in Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,05mmol/l (vorzugsweise 0,01 mmol/l) und PoIy(A)IdT)10 in Konzentrationen zwischen 0,007 und 0,25mmol/l (vorzugsweise 0,015mmol/l) über 60-240min (vorzugsweise 90min) bei 370C in Pufferlösungen bekannter Zusammensetzung (A. Hoffmann, B. Banapour und A. J. Levy: Virology 147 [1985], 326-335) durchgeführt. Der Reaktionsabbruch erfolgt im Falle des Einbaus von BrdUTP durch Zugabe von 0,4mol/l NaOH. Die Inkubationszeit zur Poly(rA)-Degradation beträgt dabei 5-30min (vorzugsweise 10min). Nach anschließender Neutralisation durch Zugabe eines 0,5 mol/l Citrat-Phosphatpuffers pH 7,0 erfolgt der Probentransfer in die Immunoassayplatte oder -röhrchen.
Hier reagiert der Poly(BrdU)-Strang entweder im sukzessiven Zwei-Schritt-Assay 60-120min (vorzugsweise 90min) bei 370C mit dem insolubilisierten anti-BrdU-Antikörper, gefolgt von einer 60-120minütigen (vorzugsweise 90minütigen) Konjugatinkubation (Peroxidase-markierter anti-BrdU-Antikörper) oder afcer im simultanten Ein-Schritt-Assay zusammen mit dem Konjugat und den insolubilisierten Antikörpern über 60 bis 120min (vorzugsweise 90min) bei 370C.
Nach gleichem Prinzip läuft der Nachweis des polymerisierten Digoxigenin-dUTP ab, nur daß aufgrund derZugängigkeit des Digoxigenins für den Peroxidase-markierten anti-Digoxigeninamikörper die alkalische Hydrolyse zur Strangtrennung und Degradation des PoIyVrA und anschließende Neutralisation entfällt. Nach Abtrennung der ungebundenen Komponenten erfolgt die Substratreaktion wahlweise mit den Chromogenen ABTS, oPD oder TMB und H2O2 nach bekannten Verfahren (B. Porstmann, T.Porstmann und E.Nugel: J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 19 [1981 ], 435-439; T.Porstmann, B.Porstmann, R.Wietschke, R. von Baehr und E. Egger: J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23 [1985], 41-44). Die Extinktionsbestimmung erfolgt durch Photometrie. Das erfindungsgemäße Testbesteck zur Bestimmung der RT-Aktivität ist ein Festphasenimmunoassay, der aus a) festen Phasen, z. B. Mikrotiterplatten oder Röhrchen mit immobilisierten Antikörpern zur Isolation der RT aus einem HIV-1 -Lysat und b) festen Phasen (s.o.) mit insolubilisierten Antikörpern zur Bindung des Stranges mit den inkorporierten markierten Nucleosiden, c) Enzym- oder Fluorochrom-markierten Antikörpern (anti-BrdU oder anti-Digoxigenin-Antikörper) zum Nachweis der im Immunokomplex gebundenen markierten polymerisierten Nucleosiden im Ein- bzw. Zwei-Schritt-Assay, d) einem RT-Puffet (Konzentrat mit einem markierten Nukleotid), e) Natronlauge für den Abbruch der Polymerisation und für die Strangtrennung, im Falle des Einsatzes von BrdUTP f) Citrat-Phosphatpuffer (Konzentrat) für die Vorbereitung des Enzymimmunoassays, im Falle des Einsatzes von BrdUTP g) einem Substratgemisch zum Nachweis von Peroxidase, h) einem Stoppreagens für die Peroxidase-Reaktion, i) Verdünnungsmedien für Proben und Konjugate (Konzentrat), j) Waschpuffer (Konzentrat) und k) Kontrollmaterialien, besteht.
Die verwendeten monoklonalen anti-BrdU-Antikörper werden durch Immunisioiung von Balb/c-Mäusen mit 5-Brom-2-uridin-Ovalbumin und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit Zellen der Mausmyolomzellinie P3X63 HG8/653 zu den Hybridomzellinien H-CB-Bru 1 und 2, deren Selektion, Züchtung und Aufarbeitung des zellfreien Überstandes gewonnen. Die verwendeten anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer, Mannheim, BRD) werden ivich Angaben des Herstellers eingesetzt.
-3- 292 977 Ausführungsbeispiele
1. Methodik
Ein monoklonaler Antikörper gegen RT von HIV-1 (IgG 1), gereinigt durch Ammoniumsulfatpräzipitation, lonenaustauschchromatographie an Mono Q-Sepharose und hydrophober Interaktionschromatographie an Phenyl-Superose wird mit 0,1 mol/l Karbonatpuffer, pH9,5, nach bekanntem Verfahren (K.Catt und G.W.Traeger, Science 158 [1967], 1570-1572) über Nacht bei 20-250C an die Oberfläche von Polyätyrenmikrotiterplatten (Kavitätenvolumen 400 μΙ; Flow Laboratories, Meckenheim, BRD) adsorbiert (Benetzungsvolumen 100μΙ pro Kavität).
Nach gleichem Verfahren wird ein monoklonaler anti-BrdU-Antikörper (IgG 1), gereinigt nach o. g. Fällungs- und Chromatographieschritten, an die Oberfläche von Polystyrenmikrotiterplatten (Typ: Maxisorb, Nunc, Dänemark) (Benetzungsvolumen ΙΟΟμΙ/Kavität) adsorbiert. Ein monoklonaler anti-DNA-Antikörper (Behringwerke, Marburg, BRD) und ein anti-Digoxigenin-Antikörper, jeweils eingestellt auf eine IgG-Konzentration von 10pg/ml wird an die Oberfläche von Polystyrenmikrotiterplatten (Benetzungsvolumen ΙΟμΙ/Kavität) adsorbiert.
Nach Absaugen der jeweiligen Antikörperlösungen und einmaliger Spülung der Kavitäten mit Aqua dest. erfolgt eine Nachbenetzung der mit anti-RT-Antikörpern beschichteten Polystyrenplatte mit nukleasefreiem Rinderserumalbumin (RSA) (Boehringer, Mannheim, BRD) (Beschichtungskonzentration 10g/l) und 5% (w/v) Saccharose, gelöst in 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH7,2 (Nachbeschichtungslösung) über 60min bei 2O-25"C. Die mit anti-BrdU-Antikörpern, mit anti-DNA-
wobei das nukleasefreie RSA gegen RSA reinst (Serva, Heidelberg, BRD) ausgetauscht wird.
2. Beispiele
2.1. Allgemeiner RT-Aktivitätstest zur Bectimmung der HIV-1-RT aus Viruslysat 50,0μΙ HIV-1-RT enthaltendes Viruslysat, gereinigt aus dem Kulturüberstand HIV-1 infizierten Lymphozyten durch Fällung über Nacht mit 30% (w/v) Polyethylenglycol 6000 (Serva, Heidelberg, BRD), finale Konzentration 10% (w/v), Zentrifugation bei 6000U/min über 10min bei 4°C und anschließender Pelletierung des Virus bei 25000U/min über 60min bei 40C, welches in 50mmol/l Tris-HCI, pH 7,8,2 mmol/l Dithiothreitol, 0,2% (v/v) Triton X-100 (Serva, Heidelberg, BRD) und 20% (v/v) bidestilliertem Glycerol aufgenommen wird, werden zusammen mit 50μΙ RT-Puffer folgender Zusammensetzung
| Substanz | finale Konzentration |
| RSA | 0,1 mg/ml |
| BrdUTP (bzw. Digoxigenin-11 -dUTP) | 0,015 mmol/l |
| PoIyIrA)IdT)18 | 0,02 mmol/l |
| Tris/HCI pH 8,1 (Serva) | 50 mmol/l |
| DTT | 5 mmol/l |
| MgCI2 | 5 mmol/l |
| KCI | 150 mmol/l |
| EGTA | 0,5 mmol/l |
| Gluthation | 0,3 mmol/l |
| Glycerol | 0,1 % |
| Triton X-100 | 0,05% |
in den nur mit nukleasefreien RSA-beschichteten Platten 90min bei 37°C inkubiert. Im Paralleiansatz wird im RT-Puffer das BrdUTP durch Digoxigenin-11-dUTP ausgetauscht (Konzentration 0,015 mmol/l). Anschließend werden für den Nachweis des inkorporierten BrdU 50pl/Kavität0,4 mol/l NaOH zugegeben, und nach einer Hydrolysezeit von 15min bei 370C wird die Lösung durch Zugabe von ΙΟΟμΙ/Kavität 0,5 mol/l Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0 neutralisiert. 50μΙ dieser Lösung werden in die mit monoklonalem anti-BrdU-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten dosiert, in deren Kavitäten unmittelbar zuvor 50|.'l Peroxidasemarkierte monoklonal Antikörper, eingestellt auf eine Konzentration von 5g IgG/l, dosiert wurden. Für den Nachweis des inkorporierten Digoxigenin-dUTP werden 50μΙ aus dem Parallelansatz entnommen und in die mit anti-Digoxigenin-Antikörpern beschichteten Kavitäten der Enzymimmunoassayplatte dosiert, in die unmittelbar zuvor 50 μΙ der 1:2000verdünnten Stammlösung peroxidasemarkierter anti-Digoxigenin-Antikörper pipettiert wurden. Nach kurzem Schütteln werden die jeweiligen Reaktionsgemische 120min bei37°C inkubiert. Anschließend werden die Gemische abgesaugt, und die Kavitäten werden dreimal mit Waschpuffer (0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,2; 0,3 mol/l NaCI, 0,1 % (v/v) Tween 20) gewaschen. Nach Abtrennung der ungebundenen Reaktanten erfolgt die Substratreaktion mit o-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid (100 μΙ je Kavität) nach bekanntem Verfahren (T.Porstmann, B. Porstmann, R.Wietschke, R. von Baehr und ?.Egger: J. Clin. Chem. CHn. Biochem. 23 [198S], 41-44) durch Zugabe von ΙΟΟμΙ/Kavität. Nach einer Reaktionszeit von 30min wird die Enzym-Substratreaktion durch Zugabe von ΙΟΟμΙ/Kavität 2,0 mol/l Schwefelsäure gestoppt. Anschließe d werden die Kavitäten bichromatisch bei 492 und 690nm vermessen.
2.2. Allgemeiner RT-Aktivitätstest zur Bestimmung von hochgradig gereinigter AMV-RTHochgradig gereinigte AMV-RT (Boehringer, Mannheim, BRD) wurde mit dem BrdUTP- bzw. Digoxigenin-11-dUTP- und Template-Primer-freien RT-Reaktionspuffer (siehe Beispiel 1) auf eine Volumenaktivität von 0,20U/ml eingestellt und von hier bis zu einer Aktivität von 0,02 U/ml linear verdünnt.
50μΙ von den AMV-RT-Lösungen der unterschiedlichen Aktivität wurden zusammen mit 50μΙ doppelt konzentriertem RT-Reaktionspuffer mit BrdUTP bzw. mit Digoxigenin-11-dUTP- und Template-Primer in den mit nukleasefreiem RSA beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte inkubiert. Alle übrigen Reaktionsbedingungen gleichen denen von Beispiel 2.1. Von dem AMV-RT-freien RT-Reaktionspuffer wurden 21 Bestimmungen als Leerwertkontrolle durchgeführt. Die Summe aus dem Extinktionsmittelwert dieser Bestimmungen und dessen dreifachen Standardabweichung wurden als untere Nachweisgrenze definiert. Zur Einschätzung der analytischen Empfindlichkeit wurden verschiedene AMV-RT-Konzentrationen 1Ofach bestimmt und der Extinktionsbereich vom Extinktionsmittelwert χ E4Hnm ± 3 SD ermittelt.
2.3. HIV-1-spezifischer RT-Aktivitätstest
100μΙ des geometrisch mit BrdUTP- und Template-Primer-freien RT-Puffer verdünnten Viruslysats werden in die mit dem anti-HIV-1-RT-Antikörper beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte dosiert und 3C-90min bei 37"C inkubiert. Anschließend wird die Lösunj abgesaugt, und nicht gebundene Bestandteile werden durch dreimaliges Spülen der Kavitäten mit Waschpuffer entfernt. Für die nachfolgende enzymatische RT-Reaktion werden 100μΙ RT-Puffer (siehe Allgemeiner RT-Aktivitätstest, Beispiel 1) in die Kavitäten dosiert und 90min bei 370C inkubiert. Von diesem Schritt an verläuft der Test weiter wie unter Allgemeiner RT-Aktivitätstest, Beispiel 2.1., beschrieben.
Zur Spezifitätskontrolle des Tests gegenüber HIV-1 assoziierter RT wurde AMV-RT, eingestellt auf eine Volumenaktivität von 50 Einheiten (U)/ml, geometrisch bis zu einer Aktivität von 0,09 U/ml verdünnt. Jeweils 100μΙ dieser Verdünnungen wurden in die mit Anti-HIV-1-RT-Antikörpern beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatten dosiert und 90min bei 370C inkubiert. Nach Absaugen der Lösung und dreimaligem Spülen der Kavitäten mit Waschpuffer wird der Test wie unter Beispiel 2.1. beschrieben weitergeführt.
3. Ergebnisse
Zu Beispiel 2.1.: HIV-RT läßt sich unter der im Beispiel 2.1. beschriebenen Methode mit BrdUTP bis zu einer Aktivität von 0,2OuVmI nachweisen. Mit Digoxigenin-11-dUTP liegt die Nachweisgrenze zwischen 0,05 und 0,10U/mI. Die höhere Empfindlichkeit ist wahrscheinlich durch die Vermeidung der Probenverdünnung durch Hydrolyse und Neutralisation bedingt, wie sie im Falle des BrdUTP-Nachweises im Einzelstrang durch den Zwei-Seiten-Bindungsassay nicht zu umgehen ist (Abb. 2). Zu Beispiel 2.2.: Die untere Nachweisgren?) für AMV-RT liegt bei 0,03 U/ml. Auch hier wird mit dem Nachweis des inkorporierten Digoxigenin-11 -dUTP eine doppelt so hoiie Empfindlichkeit (0,015 U/ml) erzielt. Die Extinktionen im Immunoassay zum Nachweis von Poly-BrdUTP verhalten sich über den Bereich von 0,02 bis 0,2 U/ml RT linear zur eingesetzten RT-Aktivität (Abb. 1). Die analytische Empfindlichkeit bei der Erfassung der geringsten Differenz zweier unterschiedlicher RT-Konzentrationen beträgt für beide Systeme 0,01 U/ml (Abb.1).
Zu Beispiel 2.3.: Der HIV-RT-Aktivitätsnachweis ist um den Faktor 5-10 (BrdUTP) und 10-20 (Digoxigenin-11-dUTP) empfindlicher als der Nachweis der RT-Aktivität des gleichen Präparates im Allgemeinen RT-Aktkivitätstest, bedingt durch Entfernung von hemmenden Substanzen (PEG) vor der RT Reaktion (Abb. 2). AMV-RT-Aktivität läßt sich in diesem Test nicht nachweisen, da sie über den anti-HIV-1 RT Antikörper nicht gebunden und demzufolge durch die nachfolgende BF-Trennung vor der RT-Enzymreaktion aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde (Abb. 2).
Claims (6)
1. Verfahren zur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen (RT), dadurch gekennzeichnet, daß Hapten-markierte oder substituierte Nukleotidtriphosphate, gegen die sich entweder spezifisch Antikörper herstellen lassen oder die durch andere Binder spezifisch gebunden werden, zur Strangpolymerisation eingesetzt werden und ihr Einbau in einem Bindungstest quantifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymerisierten Nukleotide in einem Zwei-Seiten-Assay nachgewiesen werden, in dem bei Verwendung identischer Antikörper als Festphaseantikörper und als markierter Antikörper der gebildete Strang über einen Teil der markierten Nukleotide an den Festphaseantikörpergebunden wird und derverbleibendeTeil durch die markierten Antikörper im jeweiligen Immunoassay nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Abtrennung der nicht eingebauten markierten Nukleotide durch Substratoptimierung bei der Reaktion der RT überflüssig wird oder aber im Verlauf eines Zwei-Seiten Zwei-Schritt-Assays realisiert werden kann, wobei die Strangbindung an die feste Phase nicht über eine Interaktion mit den markierten Nukleotiden realisiert wird und letztere nach dem Waschprozeß zur Entfernung der nicht eingebauten markierten Nukleotide voll dem Nachweissystem zur Verfügung steht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein RT-Puffer Verwendung findet, der neben RSA, Poly(rA)dTi8,Tris HCI, DTT, MgCI2, KCI, EGTA, Glutathion, Glycerol und Triton X-100 zusätzlich ein haptenisiertes Nukleotid enthält, wogegen spezifische Antikörper oder andere Binder verfügbar sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die RT-Aktivität des HIV-1 gemessen wird, indem die RT aus einem HIV-1-Lysat vor der RT-Reaktion durch einen insolubilisierten anti-HIV-1-RT-Antikörper isoliert wird und andere, die RT-Reaktion störende Substanzen vorder RT-Reaktion eliminiert werden können.
6. Testbesteck zur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen (RT), dadurch gekennzeichnet, daß es aus a) festen Phasen, wie Mikrotiterplatten oder Röhrchen bzw. Kugeln mit immobilisierten anti-HIV-1-RT-Antikörpern, b) festen Phasen gem. a) mit insolubilisierten Antikörpern zur Bindung des Einzel- bzw. Doppelstranges, c) markierten Antikörpern gegen die haptenisierten Nukleotide, d) einem RT-Pufferkonzentrat mit dem entsprechenden haptenisierten Nukleotid, e) einem Substratgemisch für die Enzymreaktion, f) einem Stoppreagens zum Abbruch der Enzymreaktion, g) Verdünnungsmedien für Proben und Konjugate, h) Waschpuffer, i) Kontrollmaterialien - und im Falle der Einzelstrangherstellung j) Natronlauge und k) Citrat-Phosphatpuffer — besteht.
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