DD295167B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30 kDa - Google Patents
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30 kDaInfo
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Description
Seit längerem sind Versuche zur Herstellung von Anti-Sperma-Seren bekannt, die im Sperma vorhandene, fur dieses Material spezifische Antigene in angetrocknetem denaturiertem Material nachweisen (H Suyama, H Sawada, Dtsch Zschr gerichtl Med 1963, 53,175-185, W Klumpen, Diss Marburg, 1967, A Rambow, Diss , Mainz, 1978) Derartige polygonale Antiseren ergeben jedoch Kreuzreaktionen mit anderen Korpersekreten, wie Nasensekret oder Speichel, die auf das Vorhandensein ubiquitar verbreiteter Proteine im menschlichen Organismus zurückzuführen sind (H Schmechta, B Kopetz, H Schlosser, Krimin for Wiss , 1982, 47, 75-85, H Wissel,W Fregm, Krimin for Wiss , 1986, 63/64, 237) Die wesentliche Voraussetzung fur die Erzeugung monospezifischer polyklonaler Antiseren wurde mit der Isolierung des spermaspezifischen Proteins „P30", einem aus dem Prostatasekret stammenden Glykoprotem mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 geschaffen (G F Sensabaugh, J For Sei, 1978, 23,106-115) „P30" ist, bezogen auf andere Organismen, nur noch im Sperma subhumaner Primaten vorhanden Im weiblichen Organismus wurde es bisher nicht nachgewiesen Seine Konzentration im humanen Spermaplasma wurde im Bereich zwischen 0,15 mg/ml und 5,9 mg/ml bestimmt (E T Blake, M Gibbons, G F Sensabaugh, J Bashinski, 1981, J For Sei Soc , 22, 318)
Im Serum gesunder Manner wurden Konzentrationen um 0,5 ng/ml, bei Prostata-Tumoren um 25 ng/ml bestimmt (M Kunyama, Prostate, 1986, 8, 301-311)
Im Urin soll es auf Grund des Gehaltes geringer Mengen an Prostatasekret in Konzentrationen von durchschnittlich 260 ng/ml vorhanden sein (H C Graves, G F Sensabaugh, E T Blake, N Engl J Med , 1985, 312-338-343) Es ist dabei nicht sicher auszuschließen, daß eine Reihe von Proteinen, die von anderen Autoren beschrieben werden und ein ähnliches Molekulargewicht aufweisen, wie das „Gamma-Seminoprotein" (M Hara, Y Koyanagi, T Inoue, T Fukuyama, Jpn J Leg Med, 1971,25, 322-324), das „Protein E1" (T S Li, C Behling, Fertil Steril, 1973, 24, 134-144) oder das „Prostataspezifische Antigen/PSA" (M C Wang, L A Valenzuela, G P Murphy, T M Chu, Invest Urol, 1979,159-163), mit dem „P30"-Antigen identisch sind
Weitere spermaspezifische Proteine wurden im Molekulargewichtsbereich zwischen 10 000 und 17 000 beschrieben (H Lilja, P A Abrahamson, Prostate, 1988,12, 29 - 38)
Monoklonale Antikörper (mAk) gegen verschiedene Spermaantigene wurden bereits gewonnen und vor allen in der Tumorforschung eingesetzt Zum Teil konnte ihre prinzipielle Eignung auch fur spurenkundliche Untersuchungen bestätigt werden Die Spezifitat derartiger Antikörper wurde mit „Anti-PSA" (Amersham Product Specificatin, DA 112620, Nov 1985), „Anti-PA" (A Tsutsumi, Y Yamamoto, H Ishizu, Act Crim Japan 1988, 54, 239-246) bzw „Anti-РЗО" (Firma Hybritech/USA L Kamenev, M Leclerg, Ch Francois-Gerard, J For Sei Soc 1989, 29, 233-241) bezeichnet Es wurden auch bereits Patente fur solche monoklonalen Antikörper erteilt Inhaltsschwerpunkt von Chu et al, US-PS 4 446 122
(1984) ist die Reinigung des PSA als Antigen Ein mAk wurde erzeugt, aber außer seinem Isotyp (IgM, k) nicht naher charakterisiert In Loor et al, US-PS 4 690 890 (1987) ist Schwerpunkt ein spezieller Assay, mit dem gleichzeitig zwei Antigene, PSA und saure Phosphatase, bestimmt werden können Dieser Assay ist ganz spezifisch auf die Diagnose und Verldufskontrolle des Prostatakarzinoms abgestimmt, dazu gehören natürlich mAk Zwei sind explizit genannt und werden mit dem Isotyp (IgGD und den Affinitatskonstanten, die recht hoch sind (1,1 bzw 0,4 χ 10 - 10 l/M), charakterisiert Es steht heute außer Zweifel, daß sich verschiedene monoklonale Antikörper gleicher nomineller Spezifitat, d h selbst wenn sie gegen ein und dasselbe Antigen gerichtet sind, in der Femstruktur ihrer Epitope sowie in ihren weiteren Eigenschaften, die fur ihre Eignung in einem bestimmten Test wichtig sein können, unterscheiden Ein kommerziell vertriebenes Testsytem zum Nachweis spermaspezifischer Antigene im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa aus kriminalistisch relevanten biologischen Spuren gibt es bisher nicht
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30 000 zu erzeugen. Diese monoklonalen Antikörper sollen für den Aufbau von Enzymimmunoassays zum Nachweis von Antigenen in denaturiertem, angetrocknetem Sperma und somit zur Identifizierung kriminalistisch relevanter Spermaspuren geeignet sein. Darüber hinaus sollen die Antikörper zur Differentialdiagnose von Prostatakarzinomen geeignet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen spermaspezifische Antigene ist dadurch gekennzeichnet, daß man (in bekannter Weise) zunächst Milzzellen von BALB/c-Mäusen, die mit durch Ammoniumsulfatfällung fraktioniertem Spermaplasma immunisiert wurden, mit Zellen der Maus-Myelomzellinie X 63-Ag 8.653 fusioniert und die erhaltenen Hybridome in einem geeigneten Selektivmedium selektioniert.
Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit einem Enzymimmunoassay nachgewiesen, der folgendermaßen durchgeführt wird:
Aus auf Baumwollappen angetrocknetem Sperma, 4-10 Wochen als Spermaflecken gelagert, wird mit Bicarbonatpuffer (pH = 9,6) ein Eluat hergestellt. Das Eluat, dem eine Verdünnung des Nativspermas von etwa 1:1 000 entspricht, wird an Mikrotestplatten gebunden. Danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hybridome, eine weitere Inkubation mit phosphatase-konjugiertem Anti-Maus-Ig und anschließende Farbreaktion mit p-Nitrophenylphosphat. Die Extinktion wird bei 405 nm gemessen. Parallel dazu werden die antikörperproduzierenden Hybridome in Enzymimmunoassays, bei denen Eluate aus Speichel-, Vaginal- und Nasensekretflecken und aus angetrocknetem humanem Serum an Mikrotestplatten gebunden sind, geprüft.
Die nur mit Sperma reagierenden Hybridome werden kloniert, weitervermehrt, zur Reserve in flüssigem Stickstoff gelagert und erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation herangezogen. Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle am 13. 2. 1990 unter folgenden Nummern
ZIM-0510(A67-B/E3)
ZIM0509(A67-C/F10)
hinterlegt.
Durch die Erfindung wird die Produktion von zwei monoklonalen Antikörpern möglich, die mit spermaspezifischen Antigenen reagieren. Die Spezifität der Antikörper wurde nachgewiesen durch Enzymimmunoassays unter der Verwendung von potentiell kreuzreagierenden Materialien als Zielantigene, Inhibitionstests mit Antikörpern definierter Spezifität, Immuno-Blot-
Tests und immunhistochemischen Untersuchungen.
Die von den Hybridomen A 67 - B/E3 und A67 - C/F10 produzierten monoklonalen Antikörper reagieren im Enzymimmunoassay nicht mit kriminalistisch relevanten Materialien wie Speichel, Vaginalsekret, Nasensekret, Blut oder Gemischen aus diesen Materialien.
Im Immunoblot wurde festgestellt, daß beide monoklonale Antikörper mit einem im Spermaplasma auftretendem 30 kDa-Protein reagieren. Der vom Hybridom A67 - C/F10 produzierte mAk reagiert außerdem noch mit weiteren Proteinen.
Die Isotypen der beiden monoklonalen Antikörper wurden als IgGI (A67 - B/E3) bzw. IgM (A67 - C/F1O) ermittelt.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind für den Aufbau eines Enzymimmunoassays zum Spermanachweis in kriminalistisch relevanten Spuren gut geeignet. Außerdem sind sie zur immunhistologischen Verifizierung der Gewebsherkunft von Prostatatumoren und zum Nachweis von prostataspezifischen Antigenen im Serum von Patienten mit Prostatakarzinom einsetzbar.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
1. Herstellung der Hybridome
BALB/c-Mäuse wurden mit dem durch Ammoniumsulfatfällung aus gepooltem Spermaplasma hergestellten Antigenpräparat immunisiert. Milzzellen dieser Mäuse wurden mit Maus-Myelomzellen der Zellinie X63 - Ag 8.653 (Karney, J. F. et al.; J. Immunol. 123,1548,1979) mittels Polyethylenglykol fusioniert (Peters, H. H. et al.: „Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin, 1985).
2. Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome erfolgte in einem Enzymimmunoassay. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit Eluaten aus angetrockneten Spermaflecken, entsprechend einer Nativspermaverdünnung von etwa 1 :1000 sowie Fleckeneluaten potentiell kreuzreagierender Körpermaterialien wie Speichel und Blut mit Bicarbonatpuffer (pH = 9,6) über Nacht beladen. Danach wurde mit PBS-Tween-20-Lösung gewaschen und die Kulturüberstände unverdünnt sowie 1 : 2 verdünnt zugegeben (Inkubationszeit: 90 Minuten, 25 0C). Nach erneutem Waschen wurde 90 Minuten bei 25 0C mit phosphatase-konjugiertem Anti-Maus-Ig inkubiert. An ein weiteres Waschen schloß sich die Zugabe von 50 μΙ Substratlösung (1 mg P-Nitrophenylphosphat/1 ml Diethanolamin-Pufferlösung) zu jedem Napf an.
Die resultierende Extinktion wurde nach 30 Minuten bei 405 nm gemessen (SUMAL PE1, VEB Carl-Zeiss Jena).
3. Spezifitätsnachweis der selektionierten monoklonalen Antikörper.
Die Spezifität der selektierten monoklonalen Antikörper wurde weiterhin durch Inhibitionstests mit einem monoklonalen Antikörper der definierten nominellen Spezifität „Anti-PSA" (Prostataspezifisches Antigen, Firma Amersham) geprüft. Wurde beim Enzymimmunoassay in der unter Punkt 2 genannten Art und Weise gleichzeitig beim Beschichten der Mikrotiterplatten mit Spermaantigen 50 μΙ des monoklonalen Anti-PSA-Antikörpers zugegeben, so wurde die Bindung des monoklonalen Antikörpers vom Hybridom A67 - C/F10 abhängig vom Titer des Inhibitations-Antikörpers gehemmt.
In ähnlicher Weise wurde eine Inhibition der Bindung der monoklonalen Antikörper der Hybridome A67 - B/E3 und A67 - C/F10 mittels eines polyklonalen Anti-p30-Antiserums erzielt. Im Immunoblot reagierten die von den Hybridomen A67 - B/E3 und A67 - C/F10 produzierten mAk mit einem in Spermaplasma auftretenden Protein mit einem Molekulargewicht von 30 kDa, der vom Hybridom A67 - C/F10 produzierte mAk außerdem noch mit weiteren Proteinen.
4. Isotypen
Die Isotypen der beiden monoklonalen Antikörper wurden als IgGI (A67 - B/E3) bzw. IgM (A67 - C/F10) ermittelt.
5. Gewinnung der Antikörper
Die Gewinnung der monoklonalen Antikörper erfolgte gemäß üblichen Techniken (Peters, H. H. et al. „Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin, 1985) in vitro sowie aus Ascites.
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30 kDa, erzeugt durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit ammoniumsulfatfraktioniertem Spermaplasma, Fusion ihrer Milzzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome in einem Selektivmedium, Klonierung und Weitervermehrung der reaktiven Hybridome durch Kultivierung oder Transplantation in Mäuse in der Ascitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung oder Transplantation die Klone A67-B/E3 (ZIM-0510) und A67-C/F10 (ZIM-0509) eingesetzt werden.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen spermaspezifische Antigene Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Kriminalistik, Gerichtsmedizin und die medizinische Diagnostik
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