DD295553A5

DD295553A5 - Impfstoff gegen die lyme-krankheit

Info

Publication number: DD295553A5
Application number: DD34403990A
Authority: DD
Inventors: Markus M Simon; Ulrich E Schaible; Klaus Eichmann; Michael Kramer; Wallich Reinhard
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V.,De; Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts,De
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-17
Publication date: 1991-11-07
Also published as: JPH03170858A; DE3931235A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen passiven Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der einen oder mehreren fuer das 31 kD Antigen (OspA) oder/und das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi spezifische monoklonale Antikoerper enthaelt und in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfaehigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Pancarditis und Hepatitis verhindert. Die Erfindung betrifft weiterhin auch ein Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemaeszen Impfstoffs, die Hybridoma-Zellinien ECACC 89 09 1302, ECACC 90050405, ECACC 90050406 und ECACC 90050407, welche erfindungsgemaesze Antikoerper sekretieren und den pathogenen B. burgdorferi Stamm ZS 7 (DSM 5527). Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Antigen aus B. burgdorferi, das mit einem erfindungsgemaeszen Antikoerper immunreagiert, ein Verfahren zur Gewinnung von erfindungsgemaeszen Antigenen sowie aktiven Impfstoffen gegen die Lyme-Krankheit, die ein erfindungsgemaeszes Antigen als wesentlichen Bestandteil enthalten. Die Erfindung betrifft schlieszlich ein Verfahren zur Isolierung und Rekultivierung von pathogenen B. burgdorferi Organismen aus immundefizienten Versuchstieren.{passiver Impfstoff; Lyme-Krankheit; monoklonale Anti-Koerper; Antigene; B. burgdorferi; Arthritis; Pancarditis; Hepatitis}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Patentbeschreibung

Die Lyme-Borreliose ist die häufigste, von Zwecken übertragene Infektionskrankheit in den gemäßigten Breiten. Sie wird durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi hervorgerufen, die vor allem durch Zecken des Stamms Ixodes auf den Menschen übertragen wird. Die Krankheit ist eine chronische progressive Infektion, die viele Organe, wie die Haut, das zentrale und periphere Nervensystem, das Herz, die Leber, die Niere und das musculoskeletale System befällt. Da eine zuverlässige Behandlung dieser Krankheit durch Therapie mit Antibiotika schwierig ist, werden gegenwärtig große Anstrengungen unternommen, den Erreger selbst und die Immunantwort des Wirts auf Infektion mit B. burgdorferi zu erforschen. Bei von der Lyme-Krankheit betroffenen Personen wird zwar ein hoher Titer an Antikörpern gegen B. burgdorferi festgestellt, der aber keinen Schutz gegen die Infektion bewirkt. Es wird angenommen, daß der Erreger sehr rasch aus der Blutbahn in das Gewebe übertritt und dort für das Immunsystem nicht mehr unmittelbar erreichbar ist. Dies würde bedeuten, daß ein Schutz durch Antikörper nur unmittelbar nach Beginn der Infektion, solange also die Erreger sich noch in der Blutbahn befinden, möglich ist.

Die Tatsache, daß eine natürliche Infektion mit B. burgdorferi in verschiedenen Tierarten gefunden wurde, hat zum Versuch geführt, Labormodelle für die Lyme-Krankheit zu etablieren. Dies gelang auch mit begrenztem Erfolg. So wurde bei Experimenten, welche die Induzierung einer für B. burgdorferi spezifischen Immunantwort in der Maus zum Ziel hatten, gefunden, daß die Infektion von Inzucht-Mausstämmen mit einem schon lange Zeit kultivierten B. burgdorferi-lsolat zu mäßigen, aber signifikanten pathomorphologischen Veränderungen in verschiedenen Organen wie dem Gehirn, dem Herz, den Lungen und den Nieren führte, die vergleichbar mit denjenigen waren, die bei Patienten mit Lyme-Krankheit zu beobachten sind (Schaible et al., [1988] Infect. Immun. 1,41). Die Ausbildung eines ernsteren Krankheitsbildes bei Tieren wurde vermutlich entweder durch die Immunabwehr des Wirts und/oder durch die reduzierte Virulenz von für einen längeren Zeitraum in vitro kultivierten Spirochäten (Johnson et al., [1984], J. Clin. Microbiol. 20,747; Schwan et al., [1988], Infect, and Immun.56,1837) verhindert.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, einen wirksamen Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit bereitzustellen. Dazu ist jedoch zunächst die Entwicklung eines geeigneten tierischen Labormodells erforderlich. Es wird nun vorgeschlagen, daß ein Maus-Stamm ohne funktionsfähige T- und B-Zellen, die sogenannte Scid-Maus (Bosma et al., [1983] Nature 10, 52), als Versuchstier dienen kann, da Scid-Mäuse bei Infektion mit einem pathogenen B. burgdorferi-lsolat eine multisystemische Krankheit und zwar hauptsächlich Polyarthrithis und Carditis, entwickeln. Durch dieses Tiermodell wird es erst möglich, die Wirkung von Impfstoffengegen die Lyme-Krankheit zu erproben.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein passiver Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der einen oder mehrere für das 31 kD Antigen (OspA) oder/und das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi, insbesondere OspA oder/und OspB von B. burgdorferi der Stämme B31 (ATCC 35210) oder/und ZS7 (DSM 5527) spezifische monoklonale Antikörper enthält. Bevorzugt ist ein Impfstoff, dereinen erfindungsgemäßen Antikörper der Klasse IgG, besonders bevorzugt der Subklasse IgG 2 b oder IgGI, enthält. Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers bewirkt überraschenderweise im Gegensatz zur Verabreichung eines anderen Antikörpers, z. B. gegen das 41 kD Oberflächenantigen von B. burgdorferi (Flagellin) bei immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Scid-Mäusen, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi, vorzugsweise B. burgdorferi ZS7 infiziert wurden, daß die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis vollständig oder zumindest weitgehend verhindert wird. Gegebenenfalls kann der erfindungsgemäße Impfstoff mit dem Antikörper als Wirkstoff auch noch übliche Träger-, Füll- und Hilfsstoffe enthalten.

Weiterhin beinhaltet die Erfindung auch ein Verfahren zur Gewinnung eines passiven Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit aus Lymphozyten oder Milzzellen eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, die mit B. burgdorferi Organismen oder Teilen davon, vorzugsweise mit kompletten B. burgdorferi B31- oder/und ZS7-Organismen, immunisiert ist, wobei man aus dem

Lymphozyten oder Milzzellen des immunisierten Tieres durch Zellfusion em Hybridom gewinnt, das einen erfindungsgemaßen monoklonalen Antikörper produziert

Ein Gegenstand der Erfindung ist also auch eine Hybridoma-Zellinie (ECACC 89091302), die einen erfindungsgemaßen Antikörper LA-2 gegen OspA (lgG2b) produziert Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist auch die den Antikörper LA-26 1 gegen OspA (IgGD produzierende Hybridoma-Zellinie ECACC 90050406 sowie die Antikörper LA-25 1 bzw LA-27 1 gegen OspB (IgG 2 b bzw IgGD produzierenden Hybridoma-Zellinien ECACC 90050405 bzw ECACC 90050407 Ebenso beinhaltet die Erfindung den pathogenen B burgdorfen Stamm ZS7 (DSM 5527) Ein Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Antigen, das mit einem erfindungsgemaßen monoklonalen Antikörper immunreagiert Darunter ist ein Antigen zu verstehen, welches die gesamte Aminosäuresequenz von OspA bzw OspB oder auch nur eine immunogen wirkende Teilsequenz (immunogenes Epitop) von OspA bzw OspB enthalt Potentiell immunogene Epitope dieser Proteine kann ein Fachmann ohne Schwierigkeiten durch eine Strukturanalyse des OspA Protein (z B Chou-Fassmann Analyse) ermitteln und dann experimentell auf ihre Wirksamkeit testen Ein Gegenstand der Erfindung ist auch insbesondere ein rekombinantes Antigen, das mit dem erfindungsgemaßen Antikörper immunreagiert, wobei sich die fur das Antigen kodierende DNA Sequenz auf einem rekombinanten Vektor, vorzugsweise einem prokaryontischen Vektor befindet, der geeignet zur Proteinexpression ist

Insbesondere ein Gegenstand der Erfindung ist ein Antigen aus B burgdorfen ZS 7, das spezifisch mit dem erfindungsgemaßen Antikörper immunreagiert und die in Abb 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Epitop aus dieser Sequenz enthalt Demgemäß betrifft die Erfindung auch eine rekombinante DNA, welche (D die in Abb 1 gezeigte, (2) eine, ihr im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nuklemsauresequenz oder (3) eine mit einer Sequenz aus (D oder/und

(2) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz enthalt, die fur das 31 kD Antigen von B burgdorfen ZS7 oder ein immunogenes Epitop davon kodiert Der Begriff, stringente Hybridisierungsbedingungen" ist dabei wie in Mamatisetal, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, zu verstehen Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemaßes Antigen, das ein rekombinantes Nicht Fusionsprotein oder β Galactosidase-Fusionsprotein ist

Weiterhin beinhaltet die Erfindung auch einen rekombinanten Vektor, der eine oder mehrere Kopien einer erfindungsgemaßen rekombinanten DNA enthalt Dererfindungsgemaße Vektor kann ein prokaryontischer oder/und eukaryontischer Vektor sein, er ist vorzugsweise ein prokaryontischer Vektor Der rekombinante Vektor kann ι η der Wirtszelle extrachrom osomal vorliegen (ζ Β Plasmid) oder er kann sich auch in das Genom der Wirtszelle integrieren (z B Baktenophage Lambda) Vorzugsweise ist der erfindungsgemaße Vektor ein Plasmid Besonders bevorzugt ist der rekombinante Vektor pZS 7/31 2

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Gewinnung von erfindungsgemaßen Antigenen durch Untersuchung einer B burgdorfen-Genbank mit einem oder mehreren erfindungsgemaßen Antikörpern, wobei man die Klone isoliert, welche mit den verwendeten Antikörpern eine positive Immunreaktion zeigen

Da ein erfindungsgemaßes Antigen auch selbst zur aktiven Immunisierung, d h zur Induzierung der Antikorperbildung im Organismus, eingesetzt werden kann beinhaltet die Erfindung somit auch einen aktiven Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der als Wirkstoff ein erfindungsgemaßes Antigen, gegebenenfalls mit üblichen Trager-, Full-und Hilfsstoffen, enthalt Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist, wenn man das erfindungsgemaße Antigen auf gentechnologische Weise gewinnt Es konnte in der Tat gezeigt werden, daß die Verabreichung von nativem bzw rekombinantem OspA in normalen Mausen die Bildung protektiver Antikörper induziert, die nach passivem Transfer in Seid Mausen diese gegen die Lyme-Borrehose schützen Insbesondere findet man, daß rekombinantes OspA eine mit nativem OspA vergleichbare protektive Immunantwort induziert und daher einen vielversprechenden Kandidaten fur eine Vakzine gegen die Lyme-Borreliose im Menschen darstellt Ein Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung eines passiven Impfstoffs gegen die Lyme Krankheit, wobei man Versuchstiere, vorzugsweise Mause, mit einem erfindungsgemaßen Antigen immunisiert und aus dem immunisierten Versuchstier auf übliche Weise protektive, polyklonale oder monoklonale Antikörper gewinnt Schließlich beinhaltet die Erfindung noch ein Verfahren zur Isolierung und Rekultivierung von pathogenen B burgdorfen Organismen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man aus immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Mausen, die zuvor mit dem Erreger infiziert werden, den Erreger gewinnt, wobei die Pathogenitat des Erregers erhalten bleibt Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem man pathogene B burgdorferei ZS7 (DSM 5527)Organismen aus Blut oder/und Gelenken von infizierten Seid Mausen gewinnt

Die Verdeutlichung der Erfindung erfolgt durch nachfolgende Beispiele und die Abbildungen 1 und 2 Es zeigen

Abb 1 die DNA-und Aminosäuresequenz des 31 kD Antigens (OspA) aus B burgdorfen ZS 7, Abb 2 die immunologische Charakterisierung des rekombinanten Proteins rZS7/31 2

Beispiel 1

Induzierung von Arthritis, Carditis und Hepatitis in Scid-Mausen durch Infektion mit B burgdorfen-Stamm ZS7

Behandlung der Mäuse mit B burgdorfen

Erwachsenen Mausen der Stamme C B 17 Seid (homozygot fur dieScid-Mutation) und C B 17 wurden 1x 10⁵,5x 10⁵,1x 10⁶ oder 1 χ 10⁸ lebensfähige oder abgetötete (UV Strahlung) B burgdorfen Organismen subkutan in die Schwanzwurzel injiziert

Isolierung von B burgdorfen aus Zecken und Mäusen

Die Untersuchungen wurden mit dem schon seit langem kultivierten B burgdorfen-Stamm B31 Stamm B31 (ATCC 35210) und dem frischen IsolatB burgdorfen ZS7 (DSM 5527), das aus einer weiblichen Ixodes rizinus Zecke isoliert wurde, durchgeführt AIIeB burgdorferi-Stammewurden in modifiziertem Kellys Medium kultiviert (Barbouret al ,[1983] Switzerland Curr Microbiol 8,123) B burgdorferi-Organismen, die aus dem Mitteldarm von mit Ethanol sterilisierten Zecken oder aus Blut von infizierten Mausen gewonnen wurden, wurden anfangs in Kellys Medium unter Zusatz von 8мд/тІ Kanamycin und 230рд/тІ Fluoruracil kultiviert (Johnson et al ,[1984] J CIm Microbiol 1,81)

Serologische Tests

Die Detektion von B burgdorfen spezifischen Antikörpern wurde in einem konventionellen ELISA-Verfahren durchgeführt (Justus et al, [1988] Wehrmed Mschr. 32, 263) Die Standardkurve fur den Gehalt an Immunglobulin (Ig) wurde durch Beschichtung einer Schale mit Anti-Maus Ig (1 500 Verdünnung der Serumlosung von Paesel, Frankfurt, BRD) und Titration des Gesamt-Maus IgG- oder IgM-Gehalts (Calbiochem , LaJoIIa, USA) erhalten Gesamtserum IgM und IgG wurde ähnlich gemessen Die Konzentration von B burgdorfen spezifischen IgM- oder IgG-Antikorpern ist in μg lg/ml Serum angegeben.

Immunfluoreszenz und Giemsa-Anfarbung

50 μΙ Blut wurden in einen Hematocrit-Rohrchen pipettiert (Becton und Dickinson, Heidelberg, BRD) und bei 5000g in einer Hematocrit-Zentnfuge (ECCO, BRD) zentrifugiert. Die Rohrchen wurden an der Interphase zwischen Serum und Erythrozyten aufgeschnitten und 5μΙ des Serums wurden auf Objektträger aufgetragen (Superior, Bad Mergentheim, BRD) Die mit den Serumproben beladenen Objektträger wurden an der Luft getrocknet und in 100% Ethanol eine Minute lang bei -20⁰C fixiert Nach einstundiger Inkubation mit Kaninchen-Anti B burgdorfen- Hypenmmunserum (1 100 Verdünnung) bei Raumtemperatur wurden die Objektträger fünfmal in PBS gewaschen und dann mit FITC konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antiserum (1 Verdünnung, Jackson Lab , West Grove, USA) eine Stunde lang angefärbt Die Objektträger wurden gewaschen und in Kaisers Glycerin-Gelatine (Merck, Darmstadt, BRD) eingebettet und sofort fluoreszenzmikroskopisch untersucht Unbehandelte Bluttropfen wurden an der Luft getrocknet, in Methanol fixiert, mit Giemsa (0,1 % Merck, Darmstadt, BRD) angefärbt, in PBS entfärbt und in Entellan (Merck, Darmstadt, BRD) eingebettet

Histologische Präparationen und Färbeverfahren

Verschiedene innere Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Nieren, Milz und Gelenke) wurden von zuvor mit B burgdorfen infizierten Mausen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion entfernt und entweder in flussigem Stickstoff zur Präparation von Gefrierschnitten oder in 5% Formaldehyd (in PBS) zur Einbettung in Paraffin oder Methacrylat aufbewahrt Schnitte von 4 bis 7 μηη wurden hergestellt, mit Hematoxylin-Eosin angefärbt und in Entellan (Merck AG, Darmstadt, BRD) eingebettet Die Immunhistologie wurde unter Verwendung des Streptavidin Biotin-Peroxidase-Systems durchgeführt (Kramer etal,[1989]Eur J Immunol 19,151)

Tabelle 1 zeigt, daß B burgdorferi-Orgamsmen der Isolate ZS7 und B31 wahrend der gesamten Versuchsdauer im Blut von Scid-Mausen nachgewiesen wurden, die zuvor mit lebensfähigen Organismen geimpft wurden Allerdings konnten nur Spirochäten vom Stamm ZS7, aber keine vom Stamm B31 in vitro rekultiviert werden Bei Vergleich der rekultivierten Organismen mit dem primären B burgdorfen ZS7-lsolat konnten keine Veränderungen im Proteingehalt oder im Plasmidprofil festgestellt werden Keine oder nur äußerst geringe Titer an irrelevanten Antikörpern wurden in mit B burgdorfen infizierten Scid-Mausen wahrend der gesamten Beobachtungsdauer nachgewiesen In diesen Tieren wurden keine fur B burgdorfen spezifische IgM-oder IgG-Antikorper gefunden (Tabelle 1) Dagegen exprimierten alle C B-17-Kontrollmause, die mit B burgdorfen infiziert wurden, große Mengen an Gesamt-lg und erhöhte Titer an fur B burgdorfen spezifischen IgM- und IgG-Antikorpern

Zwischen 7 und 20 Tagen nach der Infektion mit B burgdorfen ZS7 zeigten die Seid Mause erste klinische Symptome von Arthritis (Rötung und Schwellung beiderTibiotarsalgelenke), die mit der Zeit zunahmen Dagegen wurden keine Symptome von Arthritis in Scid-Mausen, die entweder mit UV-bestrahlten B burgdorfen ZS7 oder mit lebensfähigen B burgdorfen B31-Organismen infiziert wurden, und in C B-17-Kontrollmausen, die mit lebensfähigen B burgdorfen ZS7-0rgamsmen infiziert wurden, gefunden

Auch histopathologisch wurden arthntische Gelenksveranderungen in Scid-Mausen nachgewiesen, die mit lebensfähigen B burgdorfen ZS7 infiziert wurden (Tabelle 1) Es wurden schwere Gelenkschadigungen festgestellt, gekennzeichnet durch die Anwesenheit von hyperplastisch entzündeten Synovial-Auskleidungszellen, verbunden mit Erosion und Zerstörung von Knorpelgewebe und/oder Knochen Weiterhin wurde Pancarditis mit Infiltration von Mononuklearzellen in das Endocardium, Myocardium und Pericardium festgestellt Ebenfalls wurde eine progressive Entzündung der Leber festgestellt, wobei eine Infiltration von Mononuklearzellen, die auf den Pfortaderbereich und die Zentralvene beschrankt war, granulomatose Reaktionen und schließlich das Auftreten von Leberfibrose beobachtet wurde Zusätzlich wurden geringere Schaden in den Nieren, der Lunge, dem Gehirn und der gestreiften Muskulatur festgestellt

Tabelle 1

Infektion von C B-17 Scid-Mausen und C B-17 Kontroll-Mausen mit B burgdorfen, Reisolierung von Spirochäten aus dem Gewebe, Antikorpertiter und Ausbildung von Arthritis

	B. burgdorfen	Anzahl	Tage	B burgdorfen	Isolie	Arthritis	Histopa-	Antikörper (pg/ml)⁰⁰
Mause-		bei In	nach In	Detek	rung**	kli- tholo-
Sta mm	Stamm	fektion	fektion	tion im	_	nisch° gisch	Gesamt Ig spezifische Ig
		5X10⁵	7	Blut*		_ _	μ γ μ γ
C B-17	ZS 7			+	⁺B		20
seid			36		⁺B	+ +
(n = 1)			49	+	ffl	+ +	21
			59	+	—	+ +	26
		1x10⁸	7	+	⁺B	+ +	396
	ZS 7		23	+	—	+ +	108 - -
		1x10⁸	22	+	⁺G	+ +	54
	ZS 7		29	+	⁺B/G	+ +	41
			87	+	+ +	_ _ _ _
			₊

	B burgdorferi	Anzahl	Tage	B burgdorferi	Isolie	Arthritis	Histopa-	-6-	η b	—	-	Y	—	- 295 553
		bei In	nach In	Detek	rung**		tholo-	Antikörper (цд/ті)'	η b	26		-
Mause-	Stamm	fektion	fektion	tion im	η b	kli	gisch		—		37
Stamm		1x10⁶	_	Blut*	η b	nisch"	η b	Gesamt Ig	—	—	spezifische Ig
	ZS 7	1x10⁶	—	η b	+	+	η b	μ	54	47	μ γ
		1x 10⁸	16	η b	-	+	+	2515	364	n.b.
		1x10⁸	16	+	—	+	-	2145	5963	n.b
	ZS 7 uv_tr	1x10⁸	22	-	—	-	-	304	6 374	- -
	B31		29	+	-	—	—	216	3 804	-
			22	+	—	—	-		1 952	- -
	—		29	-	—	—	—		— —
	—	1x10⁸	16	-	—	—	—	- -
	ZS 7		24	-	-	—	-	- -
С 8-17		—	-	-	-	—	—	438 56
(η = 7)	-	-	-	—		—	-	506 94
	-			-	-		- -
					- -

* Durch Giemsa Färbung oder Immunfluoreszenz

** Isolierung aus Blut (B) Gelenken (G)

°+ Rötung und Schwellung dertibiotarsalen Gelenke

°°— <7 5pg/ml Serum

Beispiel 2

Wirkung eines für das B burgdorferi 31 kD Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpers auf den Verlauf der Lyme-Borreliosein Scid-Mausen

Herstellung des monoklonalen Antikörpers

Bei Immunisierung einer Maus, die ein intaktes Immunsystem besitzt, mit B burgdorferi Organismen werden polygonale Antikörper exprimiert, die fur B burgdorferi spezifisch sind (siehe Tabelle 1)

Zehn Wochen alte weibliche Mause des Inzuchtstammes BALB/c wurden mit durch Beschallung homogenisierten Borrelien (B burgdorferi, Stamm B31, ATCC 35210) immunisiert

Immunisierungsprotokoll

Tag 0 200pg Borrelien-Antigen in kompletten Freunds Adjuvants subkutan

Tag 21,35,49,63 Challenge mit 100цд Borrelien Antigen in Phosphat gepufferter Sahne ι ρ Tag 66 Entnahme der Milz und Herstellung einer Einzelzellsuspension

Die immunen Milzzellen wurden mit der Ag8-PAI Myelom-Zellmie nach Standardmethoden unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert (J H Peters, H Baumgarten, M Schulze „Monoklonale Antikörper" Springer-Verlag, Heidelberg) Die Fusionsprodukte wurden in 96 wells Gewebekulturplatten ausgesät Nach 8 Tagen wurden die Zellkulturuberstande auf die Anwesenheit von B burgdorferi spezifischen monoklonalen Antikörpern mit Hilfe eines Festphasen-ELISA, untersucht (J H Peters et al ,so) Die Hybridoma-Zellen aus Antikorper-produzierenden Kulturen wurden nach der Grenzverdunnungsmethode kloniert Die Kulturuberstande individueller Klone wurden anschließend erneut im Festphasen-ELISA sowie durch Western-Blot Analyse und durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen charakterisiert Der monoklonale Antikörper LA 2 der Subklasse lgG2b wird von einer monoklonalen Hybridoma-Linie produziert und sezerniert und reagiert im Western-Blot mit der 31 kDa-Struktur, (Osp-A)von allen untersuchten B burgdorferi Stammen (u a die Isolate ZS 7 und B31) bei Kontakt mit elektrophoretisch über ein SDS Gel aufgetrennten und mittels Westernblot auf eine Membran transferierten B burgdorferi Proteinen Die monoklonalen Antikörper LA-26 1 C(anti-ospAlgGI), LA 25 1 (anti OspB [34kDa Antigen], IgG 2 b) und LA27 1 (anti-OspB [34kDa Antigen], IgGI) wurden auf analoge Weise hergestellt und charakterisiert

Infektion von Mausen mit B burgdorferi ZS 7

C B-17 Scid-Mause wurden mit 1 χ 10⁸ lebensfähigen B burgdorferi ZS7-Organismen subkutan in die Schwanzwurzel infiziert

Behandlung der Mause mit Antiseren

Die infizierten Scid-Mause wurden zweimal pro Woche mit verschiedenen Antiseren behandelt Die eine Gruppe wurde mit NMS (normales Mausserum), eine zweite Gruppe mit IMS (immunes Mausserum) und eine dritte Gruppe mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 (gegen ds 31 kD Antigen von B burgdorferi) behandelt Die Dosis der verabreichten Antiseren betrug in der ersten Wochen 100 μΙ bzw 100 pg bei LA 2, in der zweiten Woche 200 μΙ bzw 200 μg bei LA-2 und in der dritten Woche 300 μΙ bzw 300 μg bei LA-2

Tabelle 2 zeigt, daß unbehandelte oder mit NMS behandelte Scid-Mause nach 12 Tagen klinische und histopathologische Anzeichen von Arthritis bzw Carditis und Hepatitis entwickelten Dagegen bewirkte die Verabreichung des monoklonalen Antikörpers LA-2 bei Seid Mausen eine deutliche Reduzierung der Symptome Klinisch waren nur leichte Rötungen der Gelenke und histopathologisch nur margmale Veränderungen festzustellen Mit IMS behandelte Mause zeigten keine klinischen Arthritisbefunde

Ein Nachweis des B burgdorfen-Erregers durch In-vitro- Kultivierung gelang nur bei Mausen, die entweder unbehandelt oder mit NMS behandelt wurden Bei den mit LA-2 oder IMS behandelten Mausen konnte B burgdorferi nicht nachgewiesen werden (Tabelle 2)

Tabelle 2 Behandlung von C.B-17 Scid-Mäusen mit B. burgdorferi und Antiseren

Mausestamm C.B-17 seid	Behandlung mitAntiserum	Arthritis (nach 12 Tagen) klinisch	histopatho- logisch	Carditis/ Hepatitis histopatho- logisch	B burgdorferi Nachweis (Anzucht)
n = 3 n = 2 n = 3	NMS IMS LA-2		oo	ι	II+ +
° leichte Rötung des Gelenks °° nur marginale Veränderung

Beispiel 3

Expressionsklonierung des 31 kD Antigens (OspA) von B burgdorferi ZS7

ONA-Präparation

Hochmolekulare DNA aus dem B burgdorfen-Stamm ZS7 wurde nach Kultivierung in modifiziertem Kellys Medium gereinigt Die Spirochäten wurden durch Zentrifugation bei 10000g pelletiert und dreimal in PBS-Puffer gewaschen Das trockene Pellet wurde in 10ml TE (10mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH7,4) resuspendiert, mit Lysozym (5mg/ml) 15 Minuten lang bei 30⁰C behandelt und die DNA durch Zugabe von 1 ml 20%igem SDS freigesetzt Nach Zugabe von 1,5ml NaCI (5mol/l) wurde die Losung mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform Die DNA wurde dann durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und Inkubation bei -20⁰C über Nacht gefallt Nach Zentrifugation wurde der Ruckstand in 0,5ml TE gelost und mit DNAse freier RNAse A (20μg/ml) 45 Minuten lang bei 55°C inkubiert, gefolgt von einer einstundigen Behandlung mit Protemase K (0,1 pg/ml) bei 37°C Die Losung wurde auf 0,3mol/l NaOAc eingestellt und mit Phenol-Chloroform wie oben beschrieben extrahiert Nach Fallung mit Ethanol wurde die DNA wieder in TE aufgenommen

Herstellung der Genbank

Hochmolekulare DNA wurde durch drei Sekunden lange Ultraschallbehandlung statistisch zerkleinert T4-DNA-Polymerase (30 Minuten bei 37°C) und Klenow-Enzym (5 Minuten bei 20⁰C) wurden dazu verwendet, um die Enden der erzeugten DNA-Fragmente zu glatten DNA mit glatten Enden wurde in die BamHI-Stelle eines Expressionsvektors pUEX1 unter Verwendung einer Adapter-Klomerungsstrategie ligiert (Bresan und Stanley [1987] Nucl Acid Res S 1056) Nach einem Großenselektionsschritt durch eine Molekularsieb-Chromatographie über Sephacryl S-1000 und Transformation von kompetenten Wirtszellen E coil (MC 1061) wurde der Anteil an rekombinanten Plaque bildenden Einheiten (pfu) wie folgt bestimmt zufällig ausgewählte Kolonien wurden gepickt und bis zur Sättigung in 2mlSelektionsmedium ^Втіі25цд/тІ Ampicillin) angezuchtet Die Plasmid-DNA wurde nach der üblichen alkalischen Lysis-Methode isoliert und anschließend mit BamHI geschnitten Mehr als 50% der analysierten Plasmide enthielten durchschnittlich > 1,5 kb lange DNA-Insertionen

Ausplattieren und Screening der B burgdorferi ZS7-Genbank

Die Zellen wurden auf 24cm x 24cm-Platten bei einer Dichte von 7000pfu pro Platte ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert Nach dem Transfer der Kolomen auf Nitrocellulosefilter (NC) wurde die Expression von ß-Galactosidase-Fusionsprotemen durch zweistündige Inkubation bei 42⁰C induziert Die Filter wurden auf ein Whatman ЗММ-Papier transferiert, das mit 5% SDS behandelt worden war, und etwa 25 Minuten lang bei 95⁰C inkubiert Dann wurden die Proteine elektrogeblottet unter Verwendung einer üblichen Apparatur zum halbtrockenen Westernblotting Nach DNAse-Behandlung der NC-Filter wurden immunreaktive Klone durch ein Expressions-Screening unter Verwendung monoklonaler Antikörper identifiziert Unspezifische Bindungsstellen auf den NC-Filtern wurden durch vierstündige Inkubation mit PBS, enthaltend 0,2 % (Gewicht pro Volumen) Gelatine und 3 mmol/l NaN₃ bei Raumtemperatur abgesattigt Anschließend wurden die Filter mit Kulturuberstanden des Anti-31 kD monoklonalen Antikorperklons LA-2 18 Stunden lang unter andauerndem Schuttein inkubiert Nach grundlichem Waschen (PBS + 1 % [Volumen/Volumen] Triton X-100, PBS + 0,5 mol/l Natriumchlorid, PBS + 1 mol/l Natriumchlorid, jeder Schritt 10 Minuten) wurden die Filter mit der 1 10000 Verdünnung einer Peroxidase-markierten F(ab)₂-Praparation von Kaninchen-Anti-Maus-lgG-Antikorpern 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter andauerndem Schuttein inkubiert Die Filter wurden wieder, wie oben beschrieben, gewaschen und dann mit Diaminobenzidin als Peroxidasesubstrat inkubiert Von 10⁴ rekombinanten PFUs reagierten 20 Klone mit dem monoklonalen Antikörper LA-2

Sequenzanalyse des 31 kD Antigens (OspA)

Die insertierte DNA eines rekombinanten E coli-Klons mit positiver Antikorperreaktion mit LA-2 wurde auf übliche Weise isoliert Die DNA-Insertion dieses Klons enthielt das fur das B burgdorferi 31 kD Antigen kodierende ospA-Gen in voller Lange Das Plasmid, das die Insertion enthalt, wurde pZS-7/31-2 bezeichnet und wurde gemäß Budapester Vertrag bei DSM (unter der Nummer DSM 5528) hinterlegt

Das von diesem immunpositiven Klon produzierte rekombinante Protein wurde als rZS7/31-2 bezeichnet Die kodierende DNA-Sequenz des ospA-Gens wurde bestimmt Sie ist zusammen mit der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz des OspA-Protems in Abb 1 dargestellt

Aus Abb 1 ist auch ersichtlich, daß das 31 kD Antigen von B burgdorferi einem Protein mit 273 Aminosäuren entspricht

Präparation von Nicht-Fusionsproteinen

a) Der Klon, der das immunreaktive Protein rZS 7/31-2 exprimiert, wurde über Nacht bei 30⁰C in 10 ml LB mit Ampicillin gezüchtet 1 ml der Kultur wurde in 100ml Selektionsmedium eingebracht und bei 30⁰C mit guter Belüftung bis zu einer Dichte von 8x 10⁷ Zellen pro ml (A600 = 0,2) gezüchtet Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch einen Transfer der Wirtszellen auf 42°C erreicht Nach Abkühlen und Zentrifugation wurden die Zellen in STE-Puffer (10mmol/l Tris, lOOmmol/l Natriumchlorid, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0) gewaschen und der Ruckstand in 0,6 ml Lysispuffer (25% Sucrose, 50mmol/l Tris, pH 8,0) resuspendiert Nach Zugabe von 150μΙ Lysozym (10mg/ml) wurde die Mischung 15 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation (15 Minuten auf Eis) mit 18μΙ DNAse 1 (10 mg/ml) in Gegenwart von 5μ11 mol/l Magnesiumchlorid Schließlich wurden 250μΙ4χ Detergensmixd % Triton X100,0,5% Deoxycholat, 0,1 mol/l NaCI, 10mmol/l Tris, pH7,4) zugefugt und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert Nach Zentrifugation wurde der Rückstand zweimal mit Puffer A (50mmol/l Tris, 50mmol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA, pH8,0) gewaschen und in 9 Volumina Puffer A, zusätzlich 8M Harnstoff enthaltend, resuspendiert und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert Die Probe wurde verdünnt mit 9 Teilen Puffer B (50mmol/l KH₂PO₄ZK₂HPO₄, 50 mol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA, pH 10,7) und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH Wert durch Zugabe von KOH bei 10,7 gehalten wurde Nach Einstellung eines pH-Werts der Losung auf 7,0 durch Zugabe von HCI wurde die Probe über Nacht gegen Puffer A dialysiert (bei 4°C) und 10 Minuten lang bei 4°C und 10000 Umlaufen pro Minute (Upm) meinem SS 34-Rotor zentrifugiert Der Überstand, der das rekombinante Protein enthalt, wurde bei -20⁰C aufbewahrt

b) Da der Klon das immunreaktive Protein rZS7/31 2 auch in das Kulturmedium sezermert, ist eine Reinigung (Affinitatschromatographie) direkt aus Kulturuberstand möglich

Präparation von rekombinanten OspA (Nicht-Fusions) Protein und affinitätschromatografische Reinigung Die rekombinanten Proteine wurden anschließend affinitatschromatographisch gereinigt Zu diesem Zweck wurden gereinigte monoklonale Antikörper LA-2 an aktivierte Sepharose CL 4 B kovalent gebunden Derdialysierte Harnstoff-Extrakt mit dem rekombinanten Protein wurde an Maus IgG-Sepharose CL 4 B adsorbiert und anschließend über die LA-2-Sepharose CL 4B-Saule gegeben Nach intensivem Waschen wurde das gebundene rekombinante Protein mit 0,1 mol/l Glycin/HCI-0,1 mol/l NaCI,pH2,5eluiert Der pH-Wert der gesammelten Fraktionen wurde durch sofortige Zugabe von ¹AoVoI 0,5mol/l K₂HPO₄ neutralisiert Die proteinhaltigen Fraktionen wurden konzentriert und dialysiert Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese wurde der Grad der Reinigung bestimmt

Immunologische Charakterisierung des rekombinanten Proteins rZS7/31-2 Das rekombinante Protein rZS 7/31-2 wurde immunologisch untersucht Zum Vergleich wurde das rekombinante Protein гВЗІ/41 9 (B burgdorferi 41 kD Oberflachenantigen) herangezogen

Flachboden Mikrotiterplatten wurden mit Harnstoffextrakten der rekombinanten Proteine rZS7/31-2und rB31/41 9 bzw einem Harnstoffextrakt des zur Genexpression verwendeten E coil-Stamms MC 1061 beschichtet Unspezifische Bmdungsstellen wurden mitO,2%Gelatmein phosphatgepufferter Kochsalzlosung blockiert Vertiefungen der so vorbereiteten Mikrotiterplatten wurden mit den angegebenen monoklonalen Antikörpern LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD Flagelhn) bzw ACHT 2 (anti α, Antichymotrypsin) in Ansatz gebracht

Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden mit peroxidasemarkierten speziesspezifischen anti Maus Immunglobulinen zur Reaktion gebracht Gebundene peroxidasemarkierte Antikörper wurden unter Verwendung des Peroxidasesubstrats Orthophenylendiamin quantifiziert Die Absorption bei 492 nm (A₄₉₂) wurde direkt in der Mikrotiterplatte mit Hilfe eines automatisierten Plattenphotometers bestimmt Die Starke der Absorption ist ein Maß fur die Menge gebundener monoklonaler Antikörper

Der monoklonale Antikörper LA-2 reagiert in spezifischer Weise mit rZS7/31 2 aber nicht mit MC 1061 bzw rB31/41-9 Die Kontrollreaktion des monoklonalen Antikörpers LA-1 ist spezifisch fur rB31/41-9 Der monoklonale Kontrollantikorper ACHT 2 (Negativkontrolle) zeigt auf keinem der Proteine eine signifikante Reaktion

Abbildung 2 zeigt, daß das vom monoklonalen Antikörper LA-2 in spezifischer Weise erkannte antigene Epitop auf dem rekombinanten Protein rZS7/31-2 exprimiert ist, das aus dem Genom von B burgdorferi ZS7 kloniert wurde

Beispiel 4

Vergleich von fur das 31 kD (OspA) bzw 34 kD Antigen (OspB) spezifischen Antikörpern mit Antikörpern, die für das 41 kD Antigen (Flagelhn) spezifisch sind

Die monoklonalen Antikörper LA-2 und LA 26 1 erkennen das 31 kD Antigen OspA und sind vom Isotyp IgG 2 b bzw IgG 1 Die monoklonalen Antikörper LA-25 1 und LA-27 1 erkennen das 34 kD Antigen OspB und sind vom Isotyp IgG 2 b bzw IgGI Die monoklonalen Antikörper LA-10 und LA-21 sind spezifisch fur das Flagellen assoziierte 41 kD periplasmatische Protein von B burgdorferi und sind vom Isotyp IgG 2 a bzw IgG 1 Alle obengenannten Antikörper wurden nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten Es sollte in diesem Versuch festgestellt werden, ob auch monoklonale Antikörper gegen ein anderes B burgdorferi Antigen in Scid-Mausen eine Protektion vor den klinischen Symptomen der Lyme-Borreliose bewirken Das polyklonale Anti-B31-Immunserum (IMS) wurde aus C57BL/6-Mausen 91 Tage nach einer subkutanen Inokkulation mit 1 χ 10⁸B burgdorferi ВЗІ-Organismen entnommen Das polyklonale Anti-ZS7 IMS wurde aus C57 BL/6 Mausen 68Tage nach einer subkutanen Inokulation mit 1 x 10⁸ B burgdorferi ZS7 entnommen Beide Sera enthielten 60 μg/ml spezifische Antikörper, wie in einem ELISA-System bestimmt wurde (Schaible et al ,J Exp Med 170(1989], 1427-1432) Das Normal-Maus-Serum (NMS) wurde aus nicht infizierten C57 BL/6-Mausen entnommen

Zum Zeitpunkt der Inokulation und darauffolgend in 4-Tages-lntervallen wurden die angegebenen Antikörper, das IMS, das NMS oder PBS-Puffer passiv intraperitoneal in Scid-Mause gemäß folgendem Protokoll transferiert Tag 0 und Tag 3 100μΙ,

Tag 7 und Tag 10 200μΙ,

Tag 13 und Tag 17 300μΙ

Scid-Mäuse, die entweder mit Anti-ZS7IMS, Anti-B31 IMS oder mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 behandelt wurden, zeigten keine sichtbaren klinischen Symptome von Arthritis, d. h. es trat keine Rötung und Schwellung von Tibioltarsalgelenken während der 21 Beobachtungstage auf. Ebenso waren keine Symptome von Carditis und Hepatitis festzustellen. Histopathologische Untersuchungen ergaben keine Veränderungen in den Gelenken, dem Herzen und der Leber von Scid-Mäusen, die entweder mit Anti-ZS7-IMS, Anti-B31-IMS oder mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 behandelt wurden. Auch der andere OspA-spezifische monoklonale Antikörper LA-26.1 vom Isotyp IgG 1 sowie die OspB spezifischen Antikörper LA-25.1 und LA-27.1 waren in der Lage, die klinischen Symptome von Arthritis, Carditis und Hepatitis zu mildern. Hier zeigten sich leichte pathologische Veränderungen in den untersuchten Organen.

Im Gegensatz dazu zeigten Scid-Mäuse, die entweder PBS-Puffer, NMS oder monoklonale Antikörper gegen Flagellin (LA-10 oder LA-21) verabreicht bekommen hatten, klinische Zeichen von Arthritis, die für unbehandelte Scid-Mäuse typischen, pathologischen Veränderungen (Tabelle 3). Die Schwere der Symptome in den letztgenannten Tieren war mit zunehmender Zeitdauer nach der Inokulation ansteigend und schwächte sich während der gesamten Beobachtungsperiode nicht ab. Aus Scid-Mäusen, die zuvor entweder mit Anti-ZS7-IMS oder mit dem Antikörper LA-2 behandelt wurden, konnten keine Spirochäten isoliert werden. Im Gegensatz dazu war der Nachweis von Spirochäten durch Immunfluoreszenz und durch Kultivierung aus dem Blut von Scid-Mäusen möglich, die mit PBS-Puffer, NMS oder den monoklonalen Antikörpern LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 oder LA-21 behandelt worden waren.

Tabelle 3

Mäusestamm	Behandlung	IgG	klinische	Histopathologie	Nachweis von
C.B.-17Scid	mit	Subtyp	Arthritis	Periarthritis/	B.burgdorferi
(Anzahl der Mäuse)				Arthritis Carditis	(Kultivierung und
					Immunfluoreszenz)

n = 8	PBS (negative Kontrolle)	2b
n = 3	NMS (negative Kontrolle)	2a
n = 3	anti-B31 IMS	1
n = 2	anti-ZS7IMS	1
n = 6	LA-2 (OspA)	2b
n = 3	LA-10 (Flagellin)	1
n = 3	LA-21 (Flagellin)
n = 3	LA-26.1 (OspA)
n = 3	LA-25.1 (OspB)
n = 3	LA-27.1 (OspB)

Der Grad der histopathologischen Veränderung ist wie folgt angegeben:-keine,-* subklinisch, +/- mäßig, + schwere. * Ein B. burgdorferi-Nachweis durch Immunfluoreszenz war nicht in allen untersuchten Individuen möglich.

Beispiel 5

Wirkung von Antiserum aus, mit OspA immunisierten Mäusen auf den Verlauf der Lyme-Borreliose in Scid-Mäusen In diesem Experiment konnte gezeigt werden, daß eine Verabreichung von nativem OspA (isoliert aus B. burgdorferi ZS-7) oder rekombinantem OspA (isoliert aus E. coli-Bakterien, die mit dem rekombinanten Plasmid pZS-7/31-2 [DSM 5528] transformiert waren) in normalen Mäusen (Mäusestamm C57 BL/6) die Bildung von protektiven polyklonalen Antikörpern induziert. Werden diese Antikörper Scid-Mäusen verabreicht, wird ein Schutz gegen die Lyme-Borreliose bewirkt. Dabei wird festgestellt, daß rekombinantes OspA eine mit nativem OspA vergleichbare protektive Immunantwort induziert. Das Ergebnis und die Details der Versuchsdurchführung bei diesem Experiment sind in Tabelle 4 angegeben. Die Gewinnung von rekombinanten OspA ist in Beispiel 3 angegeben

Die Gewinnung von nativem OspA sowie die Immunisierung der Mäuse mit OspA geschah wie folgt:

Anreicherung von nativem 31 kDa OspA

3,2x 10¹⁰ Spirochäten werden für zwei Stunden bei4°Cin 5ml PBS/7,5ml n-Butanol in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (5mmol/l EDTA, 5mmol/l Benzamidin und 0,5mmol/l PMSF) auf dem Magnetrührer gerührt. Danach wird das Gemisch für 90 Minuten bei 10000rpm und 4°C in der Sorvall-Zentrifuge (Festwinkelrotor) zentrifugiert. Die wäßrige Phase, die die Oberflächenproteine enthält, wird abgenommen und dreimal mit Chloroform gewaschen. Der Proteingehalt wird über die Extinktion bei 280 nm bzw. mit dem BCA-Test bestimmt.

Im Silbergel bzw. Westernblot mit anti-B, burgdorferi Kaninchenserum wurden für Stamm ZS7 eine Hauptbande im Molekulargewichtsbereich von 31 kDa sowie schwache Banden bei 20, 34 und 65-68 kDa gefunden. Die Butanol/Wasser-Präparation von B. burgdorferi-Stamm B31 ergab eine Hauptbande bei 31 kDa sowie schwache Banden bei 20 und 34kDa.

Immunisierung von Mäusen mit nativem und rekombinantem OspA

C57BL6bzw. C.B-17 Mäusen wurde 3x im Abstand von 7 bis 10 Tagen 5pg (natives OspA von Stamm B31) bzw. Юцд (natives OspA von Stamm ZS7, rekombinantes OspA von ZS7) in 100μΙ Adjuvant (ABM3; Fa. Sebak, Aidenbach, BRD) subkutan in die Schwanzwurzel gegeben. Frühestens 3 Wochen nach der letzten Immunisierung konnte für 3 bis 4 Monate Serum abgenommen werden. Der Gehalt an spezifischen Antikörpern wird im ELISA-System bestimmt.

Tabelle 4

Effekt von B. burgdorferi-spezifischen monoklonalen und polyklonalen Antikörpern auf die Spirochätose und Entwicklung der Arthritis in mit B. burgdorferi infizierten Scid-Mäusen

Entwicklung von Arthritis Nachweis von nachWoche(n) B. burgdorferi

1 2

- 0/3

Erster Antikörpertransfer i.p. (ΙΟΟμΙ) Tag 0 (Tag der Inokulation mit B. burgdorferi ZS-7,1x 10⁸ Organismen, s.с in die Schwanzwurzel).

Weitere Antikörpertransfers Tag 4 (100μΙ), Tag 7 (200μΙ), Tag 11 (200μΙ), Tag 14 (300μΙ), Tag 18 (300μΙ), (i.p.).

Mäusestamm	Behandlung
C.B.-17Scid	mit
(Anzahl der Mäuse)
n = 6	PBS (negative Kontrolle)
n = 6	LA-2
n = 2	anti OspA(nativ) IMS
n = 3	anti OspA (recomb.) IMS

Claims

1. Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß er einen oder mehrere monoklonale Antikörper enthält, die spezifisch für das 31 kD Antigen (OspA) oder das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi sind.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper spezifisch für das 31 kD oder das 34kD Antigen von B. burgdorferi der Stämme ZS7 (DSM 5527) oder/und B31 (ATCC35210)ist.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er einen monoklonalen Antikörper der Klasse IgG, vorzugsweise der Subklasse IgG 2 b oder IgG 1, als Wirkstoff enthält.

4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi-Organismen infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis verhindert.

5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er in immundefizienten Scid-Mäusen, die mit lebensfähigen B. burgdorferi-Organismen, Stamm ZS7, infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis weitgehend verhindert.

6. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit aus Lymphozyten oder Milzzellen eines Versuchstiers, vorzugsweise einer Maus, die mit B. burgdorferi-Organismen oder Teilen davon immunisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Lymphozyten oder Milzzellen-Zellfusion ein Hybridom gewinnt, das einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 produziert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung komplette B. burgdorferi B31 oder/und ZS7 Organismen verwendet werden.

8. Monoklonaler Antikörper LA2 gegen OspA, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 89091302.

9. Monoklonaler Antikörper LA26.1 gegen OspA, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050406.

10. Monoklonaler Antikörper LA25.1 gegen OspB, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050405.

11. Monoklonaler Antikörper LA 27.1 gegen OspB, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050407.

12. Pathogener B. burgdorferi Stamm ZS7, DSM 5527.

13. Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Antikörper gegen OspA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 immunreagiert.

14. Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Antikörper gegen OspB nach einem der Ansprüche 1 bis 5 immunreagiert.

15. Antigen nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß sich die dafür kodierende DNA-Sequenz auf einem Vektor, vorzugsweise einem prokaryontischen Vektor befindet, der geeignet zur Proteinexpression ist.

16. Antigen nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Epitop aus dieser Sequenz enthält:

mkkyllgi gli lali ackqn
vssl deknsvsvdlpgemnv
lvskeknkdgkydli atvdk
lelkgtsdknngsgvlegvk
adkskvklti sddlgqttle
vfkedgktlvskkvtskdks

STEEKFNEKGEVSEKI I TRA DGTRLEYTEI KSDGSGKAKE VLKSYVLEGTLTAEKTTLVV KEGTVTLSKNI SKSGEVSVE L NDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTI TVNSKKTKDLVFTKE NTI TVQQYDSNGTKLEGSAV El TKLDEl KNALK*

17. Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein ß-Galactosidase-Fusionsprotein oder ein Nicht-Fusionsprotein ist.

18. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Antigen nach einem der Ansprüche 13,15,16 oder 17 kodiert und (1) die im folgenden dargestellte Nukleinsäuresequenz, (2) eine ihr im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Sequenz oder (3) eine mit einer Sequenz aus (1) oder/und (2) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz enthält:

atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaogtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagacggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacctgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa

19. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA nach Anspruch 18 enthält.

20. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er ein prokaryontischer Vektor ist.

21. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.

22. Rekombinanter Vektor pZS-7/31-2 (DSM 5528).

23. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine B. burgdorferi-Genbank mit einem oder mehreren Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 5 untersucht und die Klone isoliert, welche mit dem oder den Antikörpern eine positive Immunreaktion zeigen.

24. Aktiver Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, gekennzeichnet durch ein oder mehrere Antigene nach einem der Ansprüche 13 bis 17 als Wirkstoff, gegebenenfalls mit üblichen Träger-, Füll- und Hilfsstoffen.

25. Impfstoff nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen auf gentechnologische Weise gewinnt.

26. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Mäuse mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 17 immunisiert und aus dem immunisierten Versuchstier auf übliche Weise protektive, polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen OspA oder/und OspB gewinnt.

27. Verfahren zur isolierung und Rekultivierung von pathogenen B. burgdorferi-Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Mäusen, die zuvor mit dem Erreger infiziert wurden, den Erreger gewinnt, wobei die Pathogenität des Erregers erhalten bleibt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man pathogene B. burgdorferi ZS7-0rganismen aus Blut oder/und Gelenken von infizierten Scid-Mäusen gewinnt.