DD296699A5 - Neuartiges expressionssystem - Google Patents

Abstract

Rekombinante DNA-Molekuele mit einer Codierung fuer Pektinylaseexpressionssysteme (PL-Expressionssysteme) und deren Derivate, wie die Strukturgene von PLA, PLB, PLC, PLE und PLF, und die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, z. B. Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen, und Hybridvektoren, welche aus entsprechenden DNA bestehen, einschlieszlich Hybridvektoren mit einer DNA-Codierung fuer homologe oder heterologe Polypeptide, Wirte, insbesondere Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, die durch diese Wirte transformiert wurden, Methoden fuer die Herstellung der rekombinanten DNA-Molekuele und der Wirte und der Einsatz der rekombinanten DNA-Molekuele fuer die Herstellung von neuen Expressionssystemen. Ein weiteres Ziel ist die Herstellung von Polypeptiden durch diese DNA und diese Wirte.

Description

Hierzu 32 Tabellen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und beschreibt neue DNA-Moleküle, die aus DNA-Folgen gebildet sind, welche für verschiedene Pektinlyasen von Aspergillus niger und/oder deren Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen codieren. Die neuartigen DNA-Moleküle sind von Nutzen für die Überproduktion von Pektinlyasen in Aspergillus und/oder für die Konstruktion von Hybridvektoren, welche Fremdgene in Faden- und anderen Pilzen expressieren. Es ist nun möglich, eine einzelne Pektinlyase zu produzieren, die nicht mit anderen Pektinlyasen kontaminiert ist.

Ausgangssituation der Erfindung

Obwohl auf dem Gebiet der Gentechnik bereits zahlreiche Polypeptidexpressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Wirte bekannt sind, besteht weiterhin ein Bedarf an neuartigen Systemen, die Vorteile gegenüber den bekannten Systemen aufweisen.

Sehr verbreitet eingesetzt werden der prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaryotische Hefewirt, z. B. Saccharomyces cerevisiae, für welche eine große Zahl unterschiedlicher Hybridexpressionsvektoren, vor allem Plasmide, entwickelt worden ist. Die Nachteile von E.coli-Wirten bestehen darin, daß sie das gebildete Polypeptid nicht glykosylieren können und daß sich auf Grund fehlender Sekretion das Fremdpeptid innerhalb der Wirtszelle akkumulieren und ein weiteres Wachstum verhindern kann. Die Hefewirte glykosylieren, aber wie E. coli scheiden sie die Polypeptide, von ganz kleinen abgesehen, nicht in das Nährmedium aus. Hefen sekretieren nur in den periplasmatischen Raum. Höhere eukaryotische Wirte sind Krebszellen von Säugetieren, die in der Lage sind, zu glykosylieren und in das Nährmedium zu sekretieren, ihre Kultivierung erfolgt jedoch sehr langsam und ist sehr teuer, und es besteht die Gefahr, daß zusammen mit dem gewünschten Peptid onkogene Nukleinsäuren isoliert werden, von denen das Peptid nicht befreit werden kann.

Bei der Suche nach anderen Wirten wurden auch Fadenpilze, beispielsweise Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, untersucht. Solche Pilze werden für industrielle Zwecke bereits verbreitet angewendet, ihre Anwendung in der Gentechnik dagegen blieb zurück, vor allem auf Grund des Fehlens entsprechender Transformationssysteme. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze keine Plasmide, welche für die Einführung von Fremdgenen und für die Phänotypauswahl genutzt werden könnten. Es ist jedoch möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, welches ein wählbares Markergen enthalten, zu transformieren. Alle bisher für Fadenpilze beschriebenen Vektoren replizieren nicht autonom, wie das bei Hefen der Fall ist, sondern werden in das Pilzchromosom integriert. Das geschieht nur mit einer sehr geringen Frequenz. Vorteilhaft ist es dagegen, daß die integrative Transformation die Transformanten mitotisch sehr stabil macht, selbst unter nichtselektiven Bedingungen. Es wurde über die stabile Integration von mehr als einhundert Kopien berichtet. Der erste beschriebene Vektor für Fadenpilze enthielt als selektierbaren Marker das qa-2-Gen von Neurospora crassa. Dieses Gen codiert die enzymkatabolische Dehydrochinase und kann als funktioneile Komplentierung von Aro-Mutanten von N.crassa verwendet werden (Case, M.E., Schweizer, M., Kushner, S. R., und Giles, N. H. [1979], Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,5259-5263). Aro-Mutanten können ohne ein aromatisches Aminosäurensupplement nicht auf Minimalmedium wachsen. Die Transformation von N.crassa durch den qa-2-Vektor erfolgte durch Integration einer einzelnen Kopie des Plasmids in das Chromosom. Bei 30% der stabilen Aro"4ntegranten war das integrierte qa-2-Gen noch an die bakteriellen Plasmidfolgen gebunden (Case, M. E., [1982] in Genetic Engineering of Microorganismus for Chemicals [Gentechnik von Mikroorganismen für Chemikalien] [Hollander, Α., DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D., und Wolfe, R. S., Hsg.), S. 87-100, Plenum). Durch diese Beobachtung wurde die Kotransformation von nichtselektiven DNA-Folgen zusammen mit selektiven zu einer realisierbaren Aufgabe. Bei Aspergillus nidulans, das einen Sexualzyklus hat und damit für klassische genetische Manipulationen geeignet ist, wurden sowohl negative als auch positive Selektionssysteme identifiziert. Unter Verwendung von heterologer DNA von N. crassa oder homologer DNA wurde die funktionell Komplementierung von A.nidulans-pyrG-Mutanten durch Transformation mit Plasmiden, welche das pyrG-Gen enthielten, erreicht (Bailance u.a., BBRC 112,284 [1983]; Tilburn u.a., Gene26,205,1983). Bei

anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Lokus durch Transformation mit den geeigneten Plasmiden funktionell komplementiert. (Yelton, u.a., PNAS81,1470,1984; Yelton et Timberlake, J. Cell Biochem. Suppl. 9C 173,1985; Johnstone u.a., EMBOJ. 4,1307,1983)

Ein dominantes positives Selektionssystem wurde auch unter Verwendung des amdS-Gens entwickelt, das aus A. nidulans isoliert wurde und es ermöglicht, daß damit transformierte A.niger auf Azetamid als der einzigen Stickstoffquelle wachsen (Tilburn u.a., Gene26.205,1983; Wernars u.a., Curr. Genet. 9,361,1985; Kelly, J.M.,u.a., EMBOJ. 4,475,1985).

Im Vergleich zu N. crassa oder A. nidulans ist A. niger der bei weitem wichtigere Organismus. Er wird verbreitet bei der industriellen Produktion von Enzymen eingesetzt, z. B. zum Einsatz in der Nahrungsmittelindustrie. A. niger unterscheidet sich von A. nidulans dahingehend in seiner sekretorischen Kapazität, daß es eine Vielfalt von hydrolytischen Enzymen sekretiert, z. B.

Glukoamylase, a-Amylase, Pektinase, Zellulase, ß-Glukanase, ß-Galaktosidase, Naringinase, Pentosanase, Säureprotease und Lignase, wobei der Glukoamylase- und Pektinasekomplex die wichtigsten sind.

A. niger hat keinen bekannten Sexualzyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt werden. Ourch klassische Mutations- und Selektionsverfahren sind jedoch umfassende Stammverbesserungen in der Sekretion von hydrolytischen Enzymen erreicht worden.

Von den Genen der A.niger-Enzyme wurden nur die von Glukoamylase (Boel u.a., EMBO J. 3,1581,1984) und Alkohol und Aldehyddehydrogenase (WO 86/06097) zusammen mit ihren Promotor- und Signalsequenzen charakterisiert und bei Transformationsexperimenten mit A. nidulans bzw. A. niger eingesetzt. Als Selektionsmarker für A.niger wurden das heterogene amds-Gen (Kelly und Hynes, EMBO J. 4,475,1985) und das argB-Gen (Buxton u.a., Gene 37,207,1985; EP 184438; WO 86/ 06097), die beide von A. nidulans gewonnen wurden, verwendet.

A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Produktion von pektinabbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalakturonide mit hohem Molekulargewicht (20000 bis 40000D), die aus a-1,4-glykosidisch gebundenen D-Galakturonsäurepolymeren bestehen und in der Natur als Bestandteile von höheren Pflanzenzellen vorkommen, wo sie an Zellulosemoleküle gebunden werden und wo sie vor allem in der Primärzellenwand und der mittleren Lamelle vorkommen. Zu den reichsten Pektinquellen gehören Zitronen- und Orangenschale, die etwa 30% dieses Polysaccharids enthalten. Pektinenzyme bauen das Kohlehydratpolymersubstrat entweder durch Hydrolyse der a-1,4-Glykosidbindung (Polygalakturonase) oder durch Transelimination des a-4,5-ungesättigten galakturonischen Restes des Pektinmoleküls (unterschiedliche Pektinlyasen) ab. Der Systemname von Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC 4.2.2.10).

In A. niger werden die Proteine des Pektinkomplexes nicht konstitutiv expressiert. Unter induzierenden Bedingungen expressiert

A. niger bei Verwendung von Pektin oder dessen Abbauprodukten die oben genannten Enzyme, einschließlich PLI, wenn andere Kohlenstoffquellen, wie Gl ukose oder Sukrose, begrenzend sind. Bei Oberflächenkulturen besteht für Pektinenzyme die Tendenz, der äußeren Zellwand zugeordnet zu bleiben. Eine Zunahme der Pektin- und der Ca²⁺-Konzentration im Medium führt zur vollständigen Sekretion.

Pektinasen, beispielsweise PLI, werden von der Nahrungsmittelindustrie vor allem zum Klären von Fruchtsäften eingesetzt.

Aus A.niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise von F.E. A. Van Houndenhoven (22) charakterisiert. PLI enthält vier Mannosereste, während PLII jeweils zwei Mannose- und Glukosereste enthält. Die Enzyme haben unterschiedliche Molekulargewichte (PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). Die Aminosäurefolge von PLI wurde bestimmt und in EP 88101 397.3 offengelegt. Diese Erfindung basierte auf einer partiellen Strukturbestimmung von Pektinlyase I (PLI), was die Synthese von DNA-Sonden mit einer Codierung für relevante Teile des Proteins ermöglichte. Mit Hilfe der DNA-Sonden war es möglich, auf DNA-Codierung für PLI zu screenen und diese, eventuell zusammen mit deren Vor- und Nachfolgen, aus einer Genbibliothek von A. niger zu isolieren.

Durch Hybridisieren von Teilen des PLI-Gens auf eine genomische Bibliothek von A. niger konnten weitere PL-Gene entdeckt werden, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind. Das PLI-Strukturgen mit dem N-Endflankierungsbereich, das von

A. niger N 756 gewonnen wurde, ist am N-Ende mit dem PLD-Gen identisch, das von A.niger N400 gewonnen wurde. Demzufolge ist letztgenanntes nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Das vorliegende PLA scheint Teil des früher gereinigten PL-Gemisches mit der Bezeichnung PLII zu sein.

Nachstehend wird PLI auch als PLD bezeichnet, und das PLI-Strukturgen hat die Bezeichnung pel D.

Ziele der Erfindung

Ziel der Erfindung sind rekombinante DNA-Moleküle, die aus DNA-Folgen bestehen, welche neuartige Pektinlyaseexpressionssysteme und deren Derivate codieren, wie die Strukturgene dieser Pektinlyasen und entsprechende regulatorische Sequenzen, z.B. Promotor·, Signal- und Terminatorsequenzen, und Hybridvektoren, die aus entsprechenden DNA bestehen, einschließlich Hybridvektoren mit einer DNA-Codierung für homologe oder heterologe Polypeptide, Wirte, vor allem Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, welche durch diese Vektoren transformiert wurden, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Moleküle und dieser Wirte und der Einsatz der rekombinanten DNA-Moleküle für die Herstellung von neuen Expressionssystemen. Ein weiteres Ziel ist die Herstellung von Polypeptiden mittels dieser DNA und dieser Wirte. Die neuartigen Pektinlyaseexpressionssysteme bestehen aus DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotoren, die Signalsequenzen, die Strukturgene und die Terminatoren dieser neuartigen Pektinlyasegene. Die neuartigen Pektinlyasen werden als PLA, PLB, PLC, PLE und PLF bezeichnet.

Insbesondere ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Hybridvektoren zu konstruieren, die aus DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotoren von PLA, PLB, PLC, PLE und PLF bestehen, wahlweise f ü r die Signalsequenzen dieser Proteine und wahlweise für deren Terminatoren. Diese Hybridvektoren werden für die Einbeziehung von Genen mit der Codierung für bestimmte Proteine und für die Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium verwendet. Die Kotransf ormation von A. niger mit zwei verschiedenen Plasmiden kann durchgeführt werden, wobei eines der Plasmide aus der Gruppe der neuartigen Hybridvektoren der Erfindung ausgewählt wird und das andere ein speziell konstruiertes Selektionsplasmid ist, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines Fadenpilzes wirksam wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Überproduktion dieser neuartigen Pektinlyasen in den Aspergillus-Spezies und die Produktion von einzelnen PL, die durch andere PL unkontaminiert sind, oder von deren festgelegten künstlichen Gemischen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion jedes Proteins, dessen Strukturgen bei Vorhandensein oder unter Kontrolle der vorliegenden rekombinanten PL-DNA expressiert werden kann. Die verschiedenen Ziele der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die rekombinanten DNA-Moleküle

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein rekombinantes DNA-Molekül, das aus einer DNA-Folge mit der Codierung für die Expressionssysteme der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder deren Derivate besteht.

Unter dem Begriff „Expressionssystem" versteht man eine DNA-Folge, die in der Lage ist, ein Polypeptid zu expressieren, und aus dem Promotor, der Signalsequenz, dem Strukturgen und dem Terminator besteht.

Wird der Begriff „Derivat" in Verbindung mit den neuartigen DNA-Folgen verwendet, soll er größere Derivate oder Ableitungen mit Flankierungssequenzen, Fragmente der genannten DNA-Folge, Mutanten, vor allem natürlich vorkommende Mutanten, und DNA-Folgen einschließen, die entsprechend dem genetischen Code degeneriert sind.

Größere Derivate der neuartigen rekombinanten DNA-Moleküle sind die, welche aus dem A. niger-Genom herausgeschnitten werden können und aus den DNA-Folgen bestehen, die in den Abbildungen 1 bis 3,5 und 6 gezeigt werden, wie sie beispielsweise in einer genomischen Bibliothek von A.niger N 400 gefunden werden, gewonnen durch Fragmentierung der Nukleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z.B. EcoRI, BamHI oder Hindill, Ligierung in einen geeigneten Vektor, z.B. das Lambda-Phag und Plasmid pBR322, Klonieren, z. B. in E.coli, und erneutes Schneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym. Solche Derivate sind z. B. die Inserte der Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 und pGW880, die in den Abbildungen 1,2,3,4,5 und 6 gezeigt werden.

Fragmente der DNA-Folge mit der Formel I (Abb. 9) sind die, welche sich zwischen zwei Restriktionsstellen dieser Plasmide befinden und Promotor-, Signal-, Struktur- oder Terminatorfunktionen beibehalten.

Bevorzugte Fragmente sind die, welche die Promotorsequenz, die Signalfrequenz, das Strukturgen eines neuartigen PL oder die Terminatorsequenz oder jede Kombination dieser Elemente enthalten.

Die Fragmente der DNA-Folge können Linker enthalten, die eine erfolgreiche Bindung an andere DNA-Moleküle ermöglichen.

Die PL-Promotorfolge ist im DNA-Bereich vor dem Strukturgen enthalten und besteht aus bis zu 2000, vorzugsweise bis zu etwa 1000 bis 1400 Nukleotiden. In pGW820 befindet sich der Promotor auf der Sequenz zwischen Sail (1240) und Pstl (2420) als Restriktionsstellen. Für die Promotorsequenz sind die TATAA-Boxen als die RNA-Polymeraseerkennungsstellen wichtig. Auf PeIA befindet sich die TATAA-Box an der Position 1221 (Abb. 10), auf pelB in Position 951 (Abb.! 1) und auf pelCbei Position 1261 (Abb. 12). Die kurzen Promotoren etwa von den TATAA-Boxen bis zum Beginn der Signalsequenzen sind für die nichtinduzierte Expression der Polypeptide von besonderem Interesse. Wenn eine pektininduzierte Expression erforderlich ist, sind die Sequenzen oberhalb der TATAA-Boxen für die Regulierung der Stärke des Promotors erforderlich. Diesen Fragmenten können geeignete Linker angefügt werden.

Der Promotor des PLI von A. nlger ist induzierbar, d. h., die Expression des diesem angefügten Strukturgens, z. B. das Strukturgen mit der Codierung für ein PL oder ein Fremdgen, wird durch den Zusatz von Pektin oder Pektinabbauprodukten zum Medium induziert. Fehlt Pektin und ist ausreichend Glukose vorhanden, wird der Promotor nicht wirksam. Fehlen die oberhalb gelegenen regulatorischen Sequenzen, wird der Promotor konstitutiv.

Die DNA-Codierung für die Signalsequenz erstreckt sich zwischen dem Ende des Promotors und dem Beginn der Sequenzmit der Codierung für das reife Protein. Bei PLA und PLB enthält die Signalsequenz etwa 20 Aminosäuren, bei pelC sind es etwa 18 Aminosäuren. Der entsprechende Codierungsbereich erstreckt sich bei pelA vom ATG-Codon in der Position 1361 bis hinunter zur Pstl-Schneidestelle in der Position 1420, bei pelB von der Position 1134 bis wenigstens zur Position 1191 und bei pelC von der Position 1368 bis zur Position 1422.

Wie aus den Formeln I, Il und III hervorgeht, enthalten die Strukturgene von PLA, PLB und PLC mehrere Introns. Die Strukturgene können auch geeignete Linker enthalten.

Die Terminatoren beginnen mit den Stoppcodons, z.B. TAA, und können bis zu einer der Restriktionsstellen innerhalb dieser Sequenzen reichen. Das Terminatorfragment enthält wenigstens 300bρ und kann geeignete Linker enthalten.

Geeignete Linker für die obigen Fragmente haben eine DNA-Folge, die in die Restriktionsstelle der DNA paßt, an die das Fragmem gebunden ist. Sie können eine festgelegte Restriktionsstelle enthalten.

Fragmente der DNA-Folge der Erfindung sind auch die, welche aus kleineren Fragmenten zusammengesetzt sind, z. B. solche, die den Promotor, den Promotor und die Signal- oder Struktursequenz, das Signal und die Struktursequenz oder das Strukturgen ohne die Introns und ähnliche, enthalten.

Mutanten der DNA-Folge der Erfindung sind z.B. natürlich vorkommende Mutanten. Die Erfindung beinhaltet auch natürliche oder synthetische Mutanten der Signalsequenz mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z. B., wenn Codons für die polaren Aminosäuren Lysin (K⁸⁺), Tyrosin (Y*") und Arginin (R⁶⁺) ausgetauscht werden durch Codons für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leuzin (L) und Threonin (T) ersetzt werden durch Codons für andere hydrophobe Aminosäuren. Beispielsweise kann das Codon für das positiv geladene Lysin durch einen Codon für Arginin ersetzt werden und umgekehrt, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nichtpolare, hydrophobe Alanin durch eines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleuzin, Leuzin, Methionin oder Phenylalanin und ähnliches. Andere Mutationen sind „schweigende Mutationen", bei denen ein oder wenige Nukleotide, z. B. bis zu etwa 30, durch ein oder mehrere andere Nukleotide ersetzt werden, wodurch die neuen Codons die Codierung für dieselbe(n) Aminosäure(n) aufweisen.

DNA-Folgen der Erfindung, die abgebaut werden, sind wie die schweigenden Mutationen solche, die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes dahingehend abgebaut werden, daß eine unbegrenzte Zahl von Nukleotiden durch andere Nukleotide ersetzt wird, ohne die Aminosäurenfolge zu verändern, für die sie codieren. Solche degenerierten DNA-Folgen können auf Grund ihrer unterschiedlichen Restriktionsstellen von Nutzen sein.

Rekombinante DNA-Moleküle, die eine DNA-Folge der Erfindung oder deren Derivat enthalten, sind vor allem rekombinante Vektoren, auch als Hybridvektoren bezeichnet, welche diese DNA-Folgen als Inserts enthalten. Sie können zum Klonieren in Wirten, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden von jedem Vektor abgeleitet, der auf dem Gebiet der Gentechnik eingesetzt wird, beispielsweise von Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder Chromosomal-DNA, wie die Derivate von Phag λ, ζ. B. NM 989, oder von Phag M13, z. B. M 13mp8-Phag-DNA (Ut. 15), linearisiert durch BamHI-Verdauung, bakterielle Plasmide, z.B. pBR322, pUN 121, pUC 18, oder Hefeplasmide, z. B. Hefe-2u-Plasmid, oder auch Chromosomal-DNA, abgeleitet z.B. von Aspergillus, z.B. A.niger, z.B. die durch EP 184438 offengelegten, oder defekte Phage oder defekte Plasmide bei Vorhandensein eines Helferphags oder eines Helferplasmids, welche die Replikation dieser defekten Phage oder Plasmide ermöglichen, z. B. M13(+)KS-Vektor bei Vorhandensein von z. B. dem Helferphag M13 K07. Ein Hybridvektor nach der Erfindung enthält, neben den DNA-Folgen nach der Erfindung oder deren Derivat, eine Replikationsstelle und wahlweise, in Abhängigkeit vom Typ des DNA-Derivats, eine Expressionssteuerungssequenz, wie eine Erweiterungssequenz, oberhalb der Aktivierungsstelle, eine Promotor- und Signalsequenz und/oder ein Strukturgen, das sich von dem unterscheidet, das in A.niger-abgeleiteten Sequenzen vorhanden ist. Eine solche Erweiterungssequenz kann von der extrachromosomalen ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) abgeleitet sein, oder es kann die Flußaufwärts-Aktivierungsstelle des Säurephosphatase-PH05-Gens (EP Appl. Nr.86111820.6) oder das PH 05, trp PH 05-G APDH-Hybrid (EP Appl. Nr.86111820.6) oder der ähnliche Promotor sein.

Strukturgene, die mit den vorliegenden Promotor-, Signal- und/oder Terminatorsequenzen ligiert sind, sind neben denen mit der Codierung für die Pektiniyasen PIA Pl-B, PiC, PLE und PLF mit oder ohne inirons auch andere homologe Pektiniyasegene, г. В. das PLD- (oder PLI-) Gen, oder andere Aspergillus-Gene und heterologe Strukturgene, die von genomischer DNA oder von aDNA abgeleitet wurden, die über die mRNA-Route hergestellt oder chemisch synthetisiert werden können, mit einer Codierung für eine breite Vielzahl von nützlichen Peptiden, einschließlich glykosylierten Polypeptiden, vor allem von höherem eukaryotischen, besonders Säugetier-, wie tierischem oder speziell menschlichem, Ursprung, wie Enzymen, die beispielsweise für die Produktion von Nahrungsmitteln und für die Durchführung von enzymatischen Reaktionen in Chemie eingesetzt werden können, oder Polypeptide, die nützlich und wertvoll für die Behandlung von Krankheiten bei Mensch und Tier oder für deren Verhinderung sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, antiviralen und Antitumoreigenschaften, Antikörper, Virenantigene, Vakzine, Gerinnungsreaktoren, Nahrungsmittel und ähnliche.

Beispiele für solche heterologe Strukturgene sind z. B. die mit der Codierung für Hormone wie Sekretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierende Hormone, Parathyroidhormon, Adrenokortikotropin, melanozytstimulierendes Hormon, ß-Liptropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor, insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF), z. B. IGF-I und IGF-II, Mastzellenwachstumsfaktor, Nerven Wachstumsfaktor, gliaabgeleiteter Nervenzellenwachstumsfaktor oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF) wie TGFß, Wachstumshormone wie Menschen- oder Rinderwachstumshormone, Interleukin wie lnterleukin-1 oder-2, menschlicher makrophagmigrationshemmender Faktor (MIF), Interferone wie menschliches α-Interferon, beispielsweise Interferon-aA, aB, aD oder aF, ß-lnterferon, γ-lnterferon oder ein Hybrid-Interferon, beispielsweise ein aA-aD- oder ein aB-aD-Hybridinterferon, vor allem das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren wie a_rAntitrypsin, SLPI und ähnliche, Hepatitisvirusantigene, wie Hepatitis-B-Virus-Oberflächen- oder -Kernantigen oder Hepatitis-A-Virusantigen oder Hepatitis-NonA-NonB-Antigen, Plasminogenaktivatoren wie Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, ß-Endorphin, Immunoglobuline wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunoglobulin D, E oder G oder Mensch-Maus-Hybridimmunoglobuline, Immunoglobulinbindungsfaktoren wie Immunoglobulin E-Bindungsfaktor, Calzitonin, menschliches calzitoninverwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie die Faktoren IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin wie Eglin C, Hirudin, Desulfatorhirudin, wie Desulfatorhirudinvariante HV1, HV2 oder PA, menschliche Superoxiddismutase, Virenthymidinkinase, ß-Laktamase, Glukoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die mit einer Codierung für ein menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, menschlichen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAG), insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, z.B. Variante HV1. Bei den Hybridvektoren der vorliegenden Erfindung sind die vorliegende Promotor- und/oder Signalfolge operabel mit dem Polypeptidcodierungsbereich verbunden, um so die effektive Expression des Polypeptids zu gewährleisten.

Die DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung können in Abhängigkeit von dem Wirt, der transformiert, selektiert und kloniert werden soll, selektive Marker enthalten. Es kann jedes Marker-Gen verwendet werden, welches die Auswahl von Transformanten auf Grund der phänotypen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind vor allem solche, die eine antibiotische Resistenz expressieren, z. B. gegen Tetrazyklin oder Ampizillin oder, bei auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene übermitteln beispielsweise Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Zykloheximid oder vermitteln Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise die Gene ura3, Ieu2, his3 oder trpi. Möglich ist es auch, als Marker Strukturgene einzusetzen, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt für das Produkt, das durch den Marker expressiert wird, auxotroph ist. Von besonderer Bedeutung sind Markergene, welche A. niger-Wirtsläsionen komplentieren, sie das argB-Gen mit der Codierung für Ornithinkarbomoyltransferase, z. B. abgeleitet von A. niger oder A. nidulans (EP 184438), oder A. nidulans-DNA-Fragmente, die zum N.crassa-pyr4-Gen homolog sind (26).

Bevorzugte Ausführungsbeispiele für die vorliegende Erfindung sind Hybridvektoren, bei denen das Strukturgen, insbesondere das heterologe Strukturgen, operativ an die Promotor- und Signalsequenzen der vorliegenden Erfindung gebunden ist. Ein solcher bevorzugter Hybridvektor ist z. B, pUC 19/pel;-IFN AM 119. Ein anderer bevorzugter Hybridvektor ist z. B. M13(+)KS/ pelA-IFNAM119.

Bei einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel nach der vorliegenden Erfindung ist das Strukturgen, insbesondere das heterologe Strukturgen, operativ direkt mit den Promotorsequenzen nach der vorliegenden Erfindung verbunden. Ein solcher bevorzugter Hybridvektor ist z. B. M 13(+)KS/pelA-ss-IFN AM 119.

Die DNA-Moteküte nach der Erfindung und deren Derivate, einschließlich Fragmente, können zum Screenen von DNA-Genbänken oder mRNA nach weiteren ähnlichen DNA oder mRNA genutzt werden.

Verfahren für die Herstellung derrekombinanten DNA-Moleküle

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls mit einer Codierung für das Expressionssystem von Pektinlyase PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder dessen Derivat, welches darin besteht, einen Wirt zu züchten, der mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, das eine DNA-Folgencodierung für das Pektinlyaseexpressionssystem oder dessen Derivat enthält, und das gewünschte rekombinante DNA-Molekül oder dessen Derivat zu isolieren oder dieses durch In-vitro-Synthese herzustellen.

Die Züchtung der Wirte erfolgt in einem herkömmlichen Nährmedium, das durch chemische Verbindungen, welche eine positive oder negative Selektion der Transformanten ermöglichen, ergänzt oder von diesen befreit werden kann, d. h., solchen Wirten, die das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker aus den Nichttransformanten, d.h., solchen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt.

Es können alle auf diesem Gebiet anwendbaren Wirte eingesetzt werden, z. B. Bakterien wie E. coli, Pilze wie Saccharomyces cerevisiae oder vor allem Fadenpilze wie Aspergillus, z. B. A. nidulans, A. oryzae, A.carbonarius, A. Awamori und vor allem A. niger. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger An 8, ein neuartiger Mutant ohne das pyrA-Gen, wie weiter unten beschrieben wird. Die Transformation der Wirte erfolgt nach herkömmlichen Methoden.

Die DNA-Folgecodierung für das PL-Expressionssystem erhält man aus Fadenpilzen, die ein solches System enthalten, vor allem aus deren genomischer Bibliothek, oder auch über die mRNA.

Nachfolgend wird die Herstellung der vorliegenden PL-Expressionssysteme ausführlicher beschrieben. Eine genomische Bibliothek kann hergestellt werden z. B. durch partielle Verdauung von genomischer DNA eines A. niger-Stammes, z.B. N756 oder N400, mit z.B. Sau 3Al oder Mbol und Klonierung der DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht in einen geeigneten Wirtsvektor, z.B. das E.coli-Plasmid pUN121, oder einen Lambda-Vektor, z. B. EMBL4. Jeder andere A. niger-Stamm, der die gewünschten PL erzeugt, kann ebenfalls als Quelle für die genomische Bibliothek dienen, und ebenso kann jeder andere geeignete Vektor als Rezipient für die Fragmente eingesetzt werden. Um die genomische Bibliothek erfolgreich nach DNA-Folgen mit der Codierung für PL screenen zu können, wird eine hybridisierende DNA-Sonde gebraucht. Das kann eine synthetische DNA-Sonde sein, wenn die Folge des gewünschten PL bekannt ist, oder es kann ein bekanntes PL-Gen oder Teile davon können es sein. Die erste Methode wurde angewendet, um das PLI-Gen zu finden, wie das in EP 88101397.3 beschrieben wird. Die zweite Methode wurde in der vorliegenden Erfindung angewendet. Da die gesamte DNA-Folge des PLI-Gens verfügbar wurde, können nun entweder DNA-Folgen, die das gesamte Gen enthalten, oder jeder Teil davon mit wenigstens 14bp zum Screenen verwendet werden, was auch das Screenen nach mRNA mit Codierung für das PL-System einschließt.

Für Screening-Zwecke werden die DNA-Sonden 5'-radioaktiv nach den bekannten Methoden unter Verwendung von y^P-ATP und T4-Kinase markiert. Wirtsmikroorganismen, welche die Nukleinsäuren nach der vorliegenden Erfindung tragen, als Insert, werden durch Hybridisierung mit der markierten DNA-Sonde auf Filterkopien der Genbibliothek identifiziert. Klone, die eine Hybridisierungsreaktion auf eine oder mehrere DNA-Sonden aufweisen, werden isoliert und vermehrt. Die angewendeten Hybridisierungsbedingungen können mehr oder weniger streng sein, z.B. einfach durch Wahl unterschiedlicher Temperaturen, und in Kombination mit dem Einsatz unterschiedlicher DNA-Sonden, die vom PLI- (oder PLD-) Gen abgeleitet wurden, z. B. durch Messung der verschiedenen Hybridisierungsreaktionen auf das komplette 1 ,бкЬр-ВатНІ/ Pstl-Fragment, das 649bp-BamHI/Xhol-Fragment (das N-Endfragment) und das 244 bp-Xhol/Pstl-Fragment (das C-Endfragment) von pCG 3 B11 oder pGW840 (Abb. 4), können die Klone in verschiedene Klassen auf der Grundlage ihres Grades von Homologie eingeteilt werden (Tabellen Il oder IV). Fünf λ-Vektoren (λ-PL 113, λ-PL 122, λ-PL 109, λ-PL 102 und λ-PL 116) wurden schließlich identifiziert, restriktiert und in pBR322 Subklone ihre pel-Gene hergestellt, was zu den Plasmiden pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 führte (Abbildungen 1 bis 3,5 und 6). Die fünf Gene dieser Klone werden als pelA, pelB, pelC, pelE bzw. pelF bezeichnet.

Die Gene können sequenziert werden. Vollständige Sequenzen von pelA, рѳІВ und pelC werden durch die Formeln I, Il und III dargestellt (Abbildungen 10,11 und 12).

Eine rechnergestützte Suche nach Konsensus-Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungsstellen sowie nach Intron-Innensequenzen (Boel, E., u.a. [24] und Mount S. M. [25]) führt dazu, wie in pelD das Vorhandensein von vier Introns in pelA und pelB (Abbildungen 10 und 11) und von drei Introns in pelC (Abb. 12) zu postulieren.

Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 werden zur Herstellung anderer rekombinanter DNA-Moleküle nach der Erfindung verwendet. Diese anderen DNA-Moleküle werden auf herkömmliche Weise durch Anwendung herkömmlicher Restriktionsenzyme, Linker, Ligierungs-, Vermehrungs- und Isolierungsprozesse hergestellt. Beispielsweise wird das Plasmid pGW820 mit Hindill restriktiert. Das 3,9kbp-Hindlll-Fragment wird in die Hindlll-Stelle von pBR322 subkloniert. Das 3,3-kbp-BamHI-Hindlll-Fragment des gewonnenen Plasmids pGW822 mit dem pelA-Gen wird in die BamHI- und Hindlll-Stelle des Vektors pUC 19 kloniert und ergibt einen als pUC 19/pelA bezeichneten Vektor. Das Strukturgen von pelA wird durch Verdauung mit Sail und Psti herausgeschnitten. In das verbleibende Fragment, das die pelA-Promotor-, -Signal- und -Terminatorsequenzen enthält, wird zwischen die Signal- und die Terminatorsequenz ein Gen mit einer Codierung für der Interferonhybrid BDBB durch einen geeigneten Linker ligiert. Das gewonnene Plasmid wird als pUC19/pelA-IFN AM 119 (Abb. 11) bezeichnet und enthält die Promotor· und Signalsequenz von pelA, das IFN-BDBB-Gen und den pelA-Terminator, der an das Hindlll-BamHI-Fragment von pUC 19 angefügt ist. Dieses Plasmid wird mit pCG 59D7 in den uridinauxotrophen A. niger· Mutanten An 8 (DSM 3917) kotransformiert. Transformanten werden in Minimalmedium, das Arginin und Bacto-Agar enthält, selektiert und auf Interfereon-Expression analysiert.

Bei einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Signalsequenz von pelA gelöscht werden. Das gewonnene Plasmid wird als M13(+)KS/pelMss-IFN AM 119 bezeichnet und enthält die Promotersequenz von pelA, das IFN-BDBB-Gen und den pelA-Terminator, der an das Hindlll-BamHI-Fragment des Bluescript-M 13(+)KS-Vektors angefügt ist. Dieses Plasmid wird mit pCG59D7 in den uridinauxotrophen A.niger-Mutanten An8 (DSM3917) kotransformiert. Transformanten werden in Minimalmedium, das Arginin und Bacto-Agar enthält, selektiert und auf Interferon-Expression analysiert. Mutanten, die neue Restriktionsstellen enthalten, können beispielsweise in vitro durch stellengerichtete Mutagenese nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden (siehe Übersichtsartikel von M. J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100,468 [1983]; D.Botstein und D.Shortle, Science229,1193 [1985] oder K.Norris u.a., Nucl. Acids Res. 11,5103 [1983]). Für höhere Expressionsraten kann jede eukaryotische Terminatorsequenz an das Ende des Strukturgens ligiert werden.

Bakterien werden nach einer herkömmlichen Methode transformiert, und die Transformanten werden durch ihre Resistenz, z. B. gegen Tetrazyklin, identifiziert.

Speziell werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB101, vermehrt, transformiert und nach gebräuchlichen Methoden für das Fachgebiet selektiert. Die vermehrte Plasmid-DNA wird nach herkömmlichen Methoden, wie sie vor allem von Birnboim und DoIy (23) beschrieben wurden, von den Bakterien isoliert. Auf ähnliche Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterologen Genen konstruiert werden. Die DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung können auch nach herkömmlichen Methoden durch eine In-vitro-Synthese hergestellt werden. Die In-vitro-Synthese kann vor allem für die Herstellung kleinerer Fragmente des PL-Expressionssystems eingesetzt werden, z. B. von DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotor- oder die Signalsequenz der PL oder deren Mutanten.

DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung, die einen PL-Promotor und wahlweise eine PL-Signalsequenz, ein PL-Strukturgen, jedes andere heterologe Strukturgen und/oder einen PL-Terminator enthalten, können auch für die Transformation von Fadenpilzen wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, z. B. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und vor allem A.niger, eingesetzt werden.

Um die Selektion der transformierten von den nichttransformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder werden als Alternative die Pilze mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, kotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein expressierbares Strukturgen, dessen expressiertes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen Verbindungen vermittelt, die für den Transformanten toxisch sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten vervollständigt, dem ein solch wesentliches Polypeptid fehlt. Solche Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.

Wie in EP 88101397.3 beschrieben wird, wurde aus der genomischen Bibliothek von A. niger ein neuartiges Markergen mit der Bezeichnung pyrA isoliert, das mit pyrG von A.nidulans und pyr4 von N.crassa verwandt ist und ähnliche Funktion hat, nämlich die Produktion des Enzyms Orotidin-S'-phosphatdekarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Dekarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat in Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluoroorotinsäure in das toxische Fluorouridin. Ein E.coli-Klon, der das pyrA-Gen enthält, wurde durch Hybridisieren mit dem 1,1 kb-Hind Ill-Fragment von pDJB2 (24), welches einen Teil des pyr4-Gens enthält, identifiziert, es kann jedoch auch DNA von jedem anderen руг-Gen, das Orotidin-5'-phosphatdekarboxylase codiert, verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coli B75183/pCG59 D7 wurde das Plasmid pCG59 D7 mit dem pyrA-Gen isoliert und für die Kotrareformation eines A. niger-pyrA'-Mutanten verwendet. Einem solchen pyrA~-Mutanten fehlt das Orotidin-5'-phosphatdekarboxylasegen, und es ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Ein solcher Mutant wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A.niger N756 unter einer mutierenden UV-Bestrahlung hergestellt, und die bei Vorhandensein von Fluoroorotinsäure und Uridin überlebenden Kolonien wurden ausgewählt. Kolonien, die bei Vorhandensein von Fluoroorotinsäure und Fehlen von Uridin überleben, wurden ausgeschaltet. Die verbleibenden uridinbenötigten Mutanten gehören nach ihrer Fähigkeit, transformierbar zu sein, zu zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An 10 dargestellt werden. Sie werden in Form ihrer Protoplaste unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA-haltigen Plasmid pCG59D7 behandelt. Es wurde festgestellt, daßnurdieAn 8-Kolonien transformiert worden waren und das pyrA-Gen enthalten, wie durch die Hybridisierungsfähigkeit von verdauter DNA mit DNA von pUN 121 ausgewiesen wird.

Die Erfindung betrifft außerdem Wirte, die mit den Hybridvektoren der Erfindung transformiert werden, und Methoden zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind beispielsweise Bakterien wie E.coli oder Fadenpilze wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium und insbesondere A.nidulans, A.oryzae, A.carbonarius, A.awamori und vorzugsweise A. niger, z. B. A. niger An8. Die Erfindung betrifft auch eine Methode für die Herstellung solcher Transformanten, welche die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, insbesondere einem Hybridvektor, nach der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und die Selektion der Transformanten einschließt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNA oder deren Derivate für die Herstellung von Hybridvektoren, welche nützliche homologe oder heterologe Polypeptide expressieren. Beispiele für Gene, welche solche nützlichen Polypeptide codieren, werden vorstehend gegeben.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode für die Herstellung von Polypeptiden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in einem geeigneten Wirt ein Hybridvektor nach der Erfindung expressiert wird. Bei Bedarf wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit von der Konstruktion des Vektors werden die Produkte entweder expressiert oder, wenn eine Signalsequenz vorhanden ist, expressiert und sekretiert.

Diese Methode beinhaltet die Produktion von nützlichen homologen oder heterologen Proteinen in einem geeigneten Wirt, z. B. den Aspergillus-Spezies, durch Kultivierung eines mit einem Expressionshybridvektor transformierten Wirts. Beispiele für Gene, welche solche Proteine codieren, werden vorstehend gegeben.

Es ist nun auch möglich, einzelne Polypeptide PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLF zu produzieren, d. h., in reiner Form und nicht durch andere PL kontaminiert, wobei verschiedene Methoden angewendet werden können. Beispielsweise ist eine Methode für die Produktion eines einzelnen Polypeptide, das aus der von PLA, PLB, PLC, PLD, PLE und PLF gebildeten Gruppe ausgewählt wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirt, der nicht in der Lage ist, eine Pektinlyase PL zu expressieren, mit einem DNA-Expressionsvektor transformiert wird, der das Produkt von PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLF expressiert. Ein Wirt, der nicht in der Lage ist, eine Pektinlyase PL zu expressieren, ist entweder ein Mikroorganismus ohne ein entsprechendes Gen, z. B. ein PL'-Aspergillus-Stamm, ein anderer, nicht zu den Aspergillus gehörender Pilz oder jedes andere eukaryotische oder prokaryotische Mikroorganismus oder ein Aspergillus-Stamm, dessen Produktion von PL in einem entsprechend konditionierten Wachstumsmedium unterdrückt wird. Beispielsweise kann ein einzelnes PL-Gen expressiert werden unter der Kontrolle des Glukoamylasepromotors in A.niger oder A. awamori, unter der Kontrolle des PH05-Promotors in S.cerevisiae oder unter der Kontrolle eines PL-Promotors in einem PL^--A. niger-Stamm. Die Erfindung wird veranschaulicht durch die beigefügten Zeichnungen, in denen

Abb.1 eine Restriktionskarte von pGW820 mit dem pelA-Gen zeigt; Abb. 2 die Restriktionskarte von pGW830mitdem pelB-Gen zeigt;

Abb.3 die Restriktionskarte von pGW850 mit dem pelC-Gen zeigt; Abb.4 die Restriktionskarte von pGW840 mit dem pelD-Gen zeigt; Abb. 5 die Restriktionskarte von pGW880 mit dem pelE-Gen zeigt; Abb. 6 die Restriktionskarte von pGW860 mit dem pelF-Gen zeigt; Abb. 7 die Sequenzierungsstrategie für das pelA-Gen zeigt; Abb.8 die Sequenzierungsstrategie für das pelB-Gen zeigt; Abb. 9 die Sequenzierungsstrategie für das pelC-Gen zeigt; Abb. 10 die Sequenz eines DNA-Moleküls pelA mit der Formel I zeigt, welches die Gencodierung für PLA enthält; Abb. 11 die Sequenz des DNA-Moleküls pelB mit der Formel Il zeigt, welches die Gencodierung für PLB enthält; Abb. 12 die Sequenz des DNA-Moleküls pelC mit der Formel IM zeigt, welches die Gencodierung für PLC enthält; Abb. 13 die Homologie beim Aminosäurefolgenpegel zwischen PLD, PLA und PLC zeigt; Abb. 14 die Konstruktion des Vektors pUC 10/pelA-IFN AM 119 mit der Gencodierung für das Hybridinterferon BDBB zeigt; Abb. 15 den nichtcodierenden Strang eines Teils der pelA-IFN-Fusion am Plasmid pelA-IFN AM 119 mit herausgezogener Signalsequenz zeigt, die mit dem Oligonukleotidstarter ausgerichtet ist, der für die Deletionsmutagenese des pelA-Signalsequenz verwendet wird.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, sind jedoch in keiner Weise als Einschränkung zu betrachten.

Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

Amp Ampizillin

ATP Adenosintriphosphat

BSA Rinderserumalbumin

CIP Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

DNA Deoxyribonukleinsäure

DTT 1,4-Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz

EGTA Bis-(Aminoethyl)glykolether)N,N,N',N'-tetraessigsäure

kbp Kilobasenpaar

LMP Niedriger Schmelzpunkt

mOsm Milliosmole

PEG Polyethylenglykol

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen/min

SDS Natriumdodekylsulfat

Tc Tetrazyklin

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Einheiten

V Volt

Puffer, Medien, Reagenzien:

HHA B/g 10facher Restriktionsenzympuffer, der für BamHI-, BgIII-, Hlndlll-, Mbol-, Pstl- und Xhol-Verdauungen

verwendet wird und 6OmM Tris-HCI (pH-Wert 7,4), 6OmM ß-Merkaptoethanol, 60 mM MgCI₂,500 mM NaCI,

0,1 % BSA, 0,1 % Gelatine enthält EcoRI-Puffer 5facher Restriktionsenzympuffer, der für EcoRI-Verdauungen verwendet wird und 50OmM Tris-HCI

(pH-Wert 7,2), 25 mM MgCI₂,250 mM NaCI, 0,05 % BSA, 0,05 % Gelatine enthält IPTG 100 mM Isopropyl-ß-thio-galaktopyranosid (23,8 mg/ml) in H₂O

LC-Medium 1 % Tryptikasepepton (BBL),0,5%Hefeextrakt(BBL),0,8%NaCI, 1 ml Tris-HCI, pH-Wert 7,5, je Liter

Minimalmedium 1,05% K₂HPO₄,0,45 KH₂PO₄,0,1 %(NH₄)₂SO₄,0,05%fürE.coli Natriumzitrat.2H₂0,1 mM MgSO₄, 1 mMThiamin-HCI, 0,2% Glukose

2 XTY-Medium je Liter 16g Tryptikasepepton (BBL), 10g Hefeextrakt, 5 g NaCI TBE-Puffer 1 Liter enthält 10,8 g Tris, 5,5 g Borsäure, 4 ml 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0)

TE-Puffer 10 mM Tris-HCI (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA (pH-Wert 8,0)

geringer 10mMTris-HCI(pH-Wert8,0),0,1 mM EDTA (pH-Wert 8,0)

TE-Puffer

X-gal 2 % (S-Bromo^-chloro-S-indolyl-ß-galaktosid) in Dimethylformamid

SSC 0,15 M NaCI, 0,015 M Natriumzitrat

Minimalmedium 1 Liter enthält 1,5 g KH₂PO₄,0,5 g KCI, 0,5 g MgSO₄ 7 H₂0,4,0 g NH₄CI, 10,0 g Glukose, Spuren von FeSO₄, für A. niger MnSO₄, ZnCI₂, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,5 abgestimmt

Komplettmedium Minimalmedium plus 0,2 % Tryptikasepepton für (BBL) 0,1 % Kasaminosäuren (Difco), 0,1 % Hefeextrakt für A. Niger (BBL), 0,05 % Ribonukleinsäurenatriumsalz für Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 ml Vitaminlösung je Liter

Vitaminlösung je 100 ml 10 mgThiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Panthoteinsäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure, 100 mg Nikotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCI

Für Platten werden alle Medien durch den Zusatz von 1,5% Agar (BBL) verfestigt, für Topagar(ose) werden 0,7% Agar (BBL) oder Agarose (SEAkem) verwendet.

PBS je LiterO,37g NaH₂PO₄,2,7 g Na₂HPO₄,8,5 g NaCI PSB 1OmM Tris-HCI (pH-Wert 7,6), 100mMNaCI,10mM MgCI₂,0,05 % Gelatine LDB 10 mM Tris-HCI (pH-Wert 7,6), 10OmM NaCI, 1OmM MgCI₂ Es wurden folgende Stämme verwendet: A. niger Wildtyp N 400 A. niger N 593 cspA, pyrA A. niger N 756 ausgewählt für die starke Produktion von Pektinasekomplexenzymen A. niger An 8 DSM 3917, uridinauxotropher Mutant von A. Niger N 756 E. coli NM 539 metB, supE, hsdM⁺, hsdFT, supF, (P 2cox 3) E. coli MH 1 araD 139, лІасХ 74, galU, galK, hsr', hsrtT, strA E. coli JM 103 ліас-рго, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR 4 F\ traD36, proAB, laclq, ΖΔΜ15 E. coli J M109 Д(Іас-ргоАВ), recAI, endAI, gyrA 96, thi, hsdR 17, supE 44, relAI, λ", (F', traD 36, proAB, laclq, ΖΔΜ15] E. coli CJ 236 (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ 105(Cm^r); BIO-RAD Muta-Gene M13 In-vitro-M utagenesesatz)

E. coli MV1190 [A(lac-proAB),thi,supE,A(srl-recA)360:Tn 10(tet') (F':traD36,proAB, Iac 1"ΖΔΜ 15)]. Stamm MV1190 wird im Handbuch für den BIO-RAD MUTA-GENE M 13-ln-vitro-Mutagenesesatz beschrieben.

Es werden folgende Vektoren verwendet:

EMBL4

EMBL4 ist ein Lambda-Austauschvektor mit einer Klonierungskapazität von 9-23kbp (Frischauf u.a., Lit.2). Er enthält einen Mehrfachklonierungsbereich zwischen den Lambda-Armen und der nichtwesentlichen Füllregion. Das ermöglicht die Durchführung mehrfacher Restriktionsenzymverdauungen in einer Weise, bei der die Relegation des Füllelementes an die Vektorenarmen verringert wird, da interessierende Fremd-DNA eingefügt wird. Der Vektor nutzt auch den Spi-Phänotypus, um eine direkte Selektion für Rekombinanten zu ermöglichen (Zissler u.a., Lit. 20).

pCG3B11

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das pelD- (PLI) Gen von A. niger N 756, kloniert in pBR322.

pPL29-5

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das N-Terminal-EcoRI-Fragment des pelD- (PLI-) Gens.

pPL35-5

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das C-Terminal-EcoRI-Fragment des pelD- (PLI-) Gens.

pBR322

Plasmid pBR322 trägt Gene für die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampizillin (amp¹") und Tetrazyklin (tet®). Das Plasmid weist mehrere eindeutige Klonierungsstellen auf, von denen sich einige entweder im amp- oder tet-Gen befinden, so daß die Insertion von klonierter DNA zu antibiotikasensitiven Bakterien führt.

pEMBL18undpEMBL19

Diese Plasmide wurden von Dente u.a. (Lit. 7,8) beschrieben.

pGW613

Dieses Plasmid wurde von Goosen u. a. (Lit. 12) beschrieben.

PhagM13mp

Die Vektoren M13mp 18 und M 13mp 19 (Norrander u.a.. Lit. 21) sind Derivate des einzelsträngigen DNA-Bakteriophagen M13 und wurden zur Erleichterung der DNA-Sequenzierung aufgebaut, da sie die Klonierung von DNA-Fragmenten an einer vielseitigen Polylinkerstelle und die Klonierung desselben Restriktionsfragments in beiden möglichen Orientierungen gestatten. Sequenzen, welche in diese Vektoren kloniert werden, können leicht als Matrizen für Sequenzierungsreaktionen oder für die Produktion von einzelsträngigen Sonden unter Verwendung eines Oligodeoxyribonukleotid-Standardstarters und des Klenow-Fragmentes von E.coli-DNA-Polymerase I genutzt werden. Die Vektor-DNA trägt den E.coli-lac-operon-Promotor und die genetische Information der ersten 145 Aminosäuren von ß-Galaktosidase. Die Polylinkersequenzen, welche die Mehrfachrestriktionsstellen enthalten, werden in die Sequenz lacZ eingefügt. Der Polylinker erhält das lacZ-Leseraster, und der Vektor gibt die allelische Komplementierung eines LacZa-Wirtstammes, was auf den Platten blaue Plaques ergibt, die IPTG und X-gal enthalten. Rekombinante Phage, welche Inserts enthalten, die das Leseraster zerstören oder anderweitig die Expression des Peptids lacZa beeinträchtigen, erscheinen als farblose Plaques (Flecken).

pCG59D7

Dieses Plasmid wird in EP 88101397.3 beschrieben und kann aus Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM3968) gewonnen werden. Das Plasmid beinhaltet das pyrA-Gen und wird für die Kotransformation von A.niger-pyrA'-Mutanten verwendet.

M 13(+)KS (Bluescript) (STRATEGENE, San Diego, CA, USA) dsDNA-Vektor, den Replikationsursprung von Phag M13 umfassend. Bei Vorhandensein eines Helfer-Phags, z. B. M13KO7 (Lit. 29) oder R408 (Lit. 9) wird der (+)-Strang des Vektors repliziert, gepackt und in das Medium freigesetzt.

M 13KO 7

Helfer-M 13-Phag für M 13(+)KS. Von Mead u.a. (Lit. 29) beschrieben.

Helfer-M 13-Phag für M 13(+)KS. Von Russell u.a. (Lit.9) beschrieben.

Beispiel 1

Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Aspergillus niger

Beispiel 1.1

Isolierung der hochmolekulargewichtigen DNA aus A. niger

Konidiosporen von Aspergillus niger-Stamm N400 werden in 200ml Minimalmedium mit einer abschließenden Sporendichte von 10⁶ Sporen/ml inokuliert und in einem Erlenmeyer-Kolben von 11 Fassungsvermögen 24 Stunden lang bei 28⁰C mit 300U/ min unter Verwendung eines Rotationsschüttlers von New Brunswick geschüttelt. Das Myzel wird unter Verwendung eines Bücher-Trichters mit Myracloth durch Filtern geerntet, mit kalter, steriler Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder bei -60°C aufbewahrt oder direkt verwendet. Die Methode, die für die Isolierung der DNA zur Herstellung der genomischen Bibliothek angewendet wird, basiert auf dem Verfahren, das von Yelton u.a. (Lit. 1) beschrieben wurde. Der DNA-Ertrag beträgt bei dieser Methode etwa 50-100цд/g Myzel.

Für die Konstruktion der Bibliothek werden 10g Myzel in flüssigem Stickstoff in Portionen zu je 1 g in einem Braun· Mikrodosismembrator gemahlen. Das gemahlene Myzel wird in einen sterilen Erlenmeyerkolben von 11 Fassungsvermögen gebracht, der 200ml Extraktionspuffer (5OmM EDTA, pH-Wert 8,5,0,2% SDS) und 200 μΙ Diethylpyrokarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Zimmertemperatur erhitzt und dann 20 min auf 68°C unter gelegentlichem Schütteln erhitzt. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und 15 Minuten lang bei 12000xgzentrifugiert. Derobenaufschwimmenden Schicht werden ¹/i6 Volumen einer 8 M Kaliumazetatlösung, pH-Wert 4,2, zugesetzt, und man läßt das Gemisch eine Stunde lang auf Eis. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (20min; 16000xg; 4°C) entfernt. Die Nukleinsäuren werden aus der obenaufschwimmenden Schicht durch Inkubation mit 0,6 Volumen Isopropanol auf Eis für die Dauer von 15min ausgefällt. Das Pellet wird durch Zentrifugieren (10min; 6000xg; 4°C) aufgefangen, mit 70% Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10 ml TE, das 20 цд/ті RNase A (Boehringer, Mannheim) enthält, suspendiert und 15min bei 37 ⁰C inkubiert. Die DNA wird mit nukleasefreier Pronase (1 mg/ml Endkonzentration) behandelt (Kochlight, Coinbrook), Dauer 1 Stunde bei 37⁰C. Die Pronasevorratslösung in TE-Puffer enthält 20mg/ml Enzym, das eine Stunde lang bei 37°C inkubiert wird, um die Nukleasen zu verdauen.

In 9ml DNA-Lösung werden 8,5g CsCI aufgelöst, es werden 0,2ml 10mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt, und diese Lösung wird entweder in einem Beckman-Rotor SW41 60 Stunden bei 33000 U/min zentrifugiert oder in einem Beckman-Rotor 50Ti mit Schnellverschlußröhren 40 Stunden lang bei 45000 U/min. Das DNA-Band wird durch Seitdurchschlagen des Rohres aufgenommen. Ethidiumbromid wird durch Mehrfachextraktion mit wasser- und NaCI-gesättigtem Isopropanol entfernt. Es werden 5 Volumen TE zugesetzt, die DNA wird mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1, extrahiert. Die DNA wird durch den Zusatz von 0,1 Volumen von 3M Natriumazetat, pH-Wert 5,2,2,5 Volumen Ethanol und Inkubation bei -20°C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (1 h; ЗООООхд; 4°C) aufgefangen, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400μΙ geringerem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.2

Partielle Verdauung von A. niger-DNA mit Mbo! und Isolierung der Fragmente Um die Mbol-Konzentration, die die größte Menge an Fragmenten zwischen 13,6 und 23kbp ergibt, zu bestimmen, werden Portionen von 1 μg von A. niger N 400-DNA in einem geeigneten Puffer mit abnehmenden Mengen an Mbol (0,5-0,001 Einheiten) für die Dauer von einer Stunde bei 37°C in einem Volumen von 10μΙ verdaut. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1 μΙ 0,25 M EDTA gestoppt, und die Proben werden auf ein 0,6%iges Agarosegel in TBE gebracht, das 1 μg/ml Ethidiumbromid enthält. Geeignete Marker sind ein Gemisch aus Lambda-DNA und mit BgIIII verdauter Lambda-DNA, die Bänder von 49,22,8,13,6,9,8, 2,3kbp und ein nichtsichtbares Fragment von 0,45kbp ergibt. Die erforderliche Mbol-Konzentration, bei der ein hoher Ertrag der gewünschten Fragmente von 13,6-23 kbp erzielt wird, beträgt 0,02 Einheiten^g DNA. Folglich werden 200μg DNA in einem gesamten Volumen von 2ml verdaut und unmittelbar nach Zusatz des Enzyms in 20 Portionen von gleicher Größe geteilt. Nach einer Stunde bei 37°C werden diese Portionen auf Eis gegeben und eine Probe von 1 μg wird auf einem Gel erprobt, um die richtige Verdauung zu testen. Wenn das Ergebnis positiv ist, wird EDTA auf eine Endkonzentration von 25mM zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, das Enzym wird bei 65"C über 10min wärmeinaktiviert, die Proben werden zusammengefaßt und die DNA wird ausgefällt, gewaschen, getrocknet und in 400μΙ TE-Puffer aufgelöst.

Die fragmentierte DNA wird über Nachtauf einem 0,4%igen präparativen Agarosegel (Mittel vertiefung 120 χ 1,5 mm) getrennt. Mit BgIII verdaute Lambda-DNA wird als Marker verwendet, um die Größe der partiell verdauten DNA-Fragmente nach Elektrophorese bei 4°C und 40 V (3 V/cm) zu bestimmen. Der Gelbereich, welcher die Fragmente mit der richtigen Größe enthält, wird a us dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird aus dem Gel in einem sterilen Dialyse-Rohr in 2 ml TBE-Puff er über 2 bis 3 Stunden bei 100 V elektroeluiert. Der Strom wird 30s umgekehrt, und der die DNA enthaltende Puffer wird aufgefangen. Dann werden die Fragmente durch Ethanolausfällung konzentriert und in 100μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.3

Herstellung von Vektor-DNA und Klonierung der hochmolekulargewichtigen DNA-Fragmente von A. niger in EMBL4 Die genomische Bibliothek des A. niger-Stammes N400 wird in den Lambda-Vektor EMBL4 konstruiert. Der Vektor, dereine Klonierungskapazität von 9 bis 23 kbp hat, wird von Frischauf u.a. (Lit. 2) und von Kam u.a. (Lit. 3) beschrieben und wurde von der Promega Biotechn. Inc. bezogen. Um Doppelinserts mit Ursprung in unterschiedlichen Teilen des Genoms zu vermeiden, wurde beim Klonieren mit einer minimalen Fragmentlänge von 13,6kbp gearbeitet.

Es werden Юцд Lambda-EMBL4-DNA vollständig mit 50 Einheiten BamHI in einem geeigneten Puffer in einem Volumen von 10μΙ über die Dauer von 2 Stunden bei 37°C verdaut. Das Enzym wird über 10min bei 65⁰C inaktiviert. Die NaCI-Konzentration wird auf 15OmM erhöht, und es werden 50 Einheiten Sail zugesetzt, anschließend wird weitere 2 Stunden bei 37°C inkubiert.

Nach dem Zusatz von EDTA auf 25mM und der Inaktivierung des Enzyms (10min, 65°C) wird die Lösung mit gleichen Mengen von Phenol (TE-gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol,25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Um die kleinen BamHI/Sall-Polylinkerfragmente auszusondern, wird die DNA mit 0,6 Volumen Isopropanol ausgefällt, nachdem 0,1 Volumen 3M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, zugesetzt worden waren. Nach 15min auf Eis und 15min Zentrifugieren bei 12000xg und 4°C wird der Niederschlag gründlich mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 40μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.4

Ligation und In-vitro-Verpackung von genomischen A. niger-DNA-Fragmenten Es ist wesentlich, daß die cos-Stellen des Vektors, der nach Beispiel 1.3 hergestellt worden ist, vor der Ligationsreaktion hybridisiert werden. Der Vektor in 10OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 1OmM MgCI₂ wird über 10 min auf 65⁰C erhitzt und dann eine Stunde lang bei 42°C hybridisiert. Aus Probeligationen wird ein Verhältnis von Vektor zu Fragmenten von etwa 1:1 (Gewichtsgrundlage) ermittelt, das ein Maximum von Rekombinanten ergibt. Die Ligation erfolgt in 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 1OmMMgCI₂, 1OmM DTT und 1mM ATP, wobei 9,5 цд Vektor und 10pg DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 100μΙ eingesetzt werden. Dann wird DNA-Ligase (BRL) mit einer Konzentration von 0,5 Einheiten/pg DNA zugesetzt, und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 14⁰C inkubiert. Um auf Ligation zu prüfen, wird eine Probe der ligierten DNA auf einem Agarosegel erprobt. Außerdem wird eine Menge von 0,5цд Vektor ohne den Zusatz von Fragmenten in einem Volumen von 5 μΙ ligiert.

Das Ligationsgemisch mit dem großen Volumen wird durch Ethanolausfällung konzentriert und in 20μΙ geringem TE-Puffer vor der In-vitro-Verpackung aufgelöst. Die In-vitro-Verpackung erfolgt mit Promega Packagene-Extrakten nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von ΙΟ-μΙ-Portionen zum Verpacken von 1 μς der DNA. Von dem hochmolekulargewichtigen Lambda-cl857-Sam7, das mit den Extrakten mitgeliefert wird, werden 1 μς getrennt verpackt, um eine Kontrolle zu schaffen. Nach dem Verpacken werden 500μΙ Phaglösungspuffer (PSB) und 5μΙ Chloroform zugesetzt. Die rekombinanten Phag-Vorräte können bei 4°C gelagert werden. Die gewonnene Bibliothek wurde aus zwei getrennten Ligationsexperimenten konstruiert.

Beispiel 1.5

Titration und Amplifikation der genomischen Bibliothek des A. nlger-Stammes N 400 Zellen von E. coli NM 539 werden auf einem LC-Medium, das 0,2% Maltose, 1OmM MgSO₄ und 1 mM CaCI₂ enthält, auf eine optimale Dichte von 1,0 (600 nm) gezogen. Dann werden Aliquote dieser Kultur zu 0,2 ml 0,1 ml einer Phag-Verdünnungsreihe in PSB zugesetzt. Nach der Adsorption der Phage über 20min bei 37⁰C werden 3ml 0,6%iges LC-Topagar zu 45°C zugesetzt, das Gemisch wird auf LC-Agar-Platten plattiert, und diese werden bei 37⁰C über Nacht inkubiert. Die Titrationsergebnisse, ausgedrückt als Anzahl der plaquebildenden Einheiten (pfu)jemlPhag-Suspension, lauten 12 χ 10⁵ und 4,2 χ 10^spfu/mlfürdie beiden Phag-Vorratslösungen, die nach Beispiel 1.4 hergestellt worden sind. Nach der Subtraktion des Hintergrundes, der aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wird (17% bzw. 40%), beträgt die absolute Zahl der Rekombinanten 6 x 10⁵, was mehr als das 200fache der Genomlänge ist.

Um die Bibliothek zu erweitern, werden Portionen zu 80 μΙ von beiden Phag-Vorratslösungen verwendet, um E. coli NM539-Zellen zu infizieren, die in LC-Topagarose auf LC-Agaroseplatten plattiert und dann bei 37⁰C über Nacht inkubiert werden. Die Phage werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5ml PSB je Platte über eine Stunde bei Zimmertemperatur eluiert. PSB wird aufgefangen, zur Entfernung der Bakterien zentrifugiert (10min bei 6000xg), und es wird Chloroform zugesetzt (Endkonzentration 0,5%). Beide Phag-Vorratslösungen, die etwa im gleichen Umfang erweitert werden, werden dann gemischt (40ml Vorrat), titriert (8 χ 10⁹pfu/ml) und bei 4°C aufbewahrt.

Beispiel 2

Screening der genomischen Bibliothek von A. niger N400 auf das Pektinlyase-D-Gen (pelD) und Isolierung des Gens

Beispiel 2.1

Screening der Bibliothek

Zur Isolierung des pelD-Gens aus der Lambda-genomischen Bibliothek, die nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnen wurde, werden 2,5 χ 10⁴ Phage mit verflüssigter LC-Topagarose gemischt und auf 5 LC-Ag a rp latte η plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37 ⁰C inkubiert und 2 Stunden lang bei 4°C abgekühlt. Auf jeder Platte werden nach Benton und Davis (Lit. 4) und ihrer Plaque-Hybridisationsmethode 2 Replikate hergestellt. Der erste Filter (Schleicher und Schüll, BA85, oder Millipore, HATF

085) wird für eine Minute oben auf die Platte gelegt, das zweite Replikat für 2 min, und die Position der Replikate wird unter Verwendung von Ausziehtusche markiert.

Nach der Entfernung der Filter werden sie in eine Schale gegeben, die 100ml einer Denaturierungslösungd M NaCI, 0,5 M NaOH) enthält, dort bleiben sie 1 min, anschließend gibt man sie ebenfalls für eine Minute in 100 ml Renaturierungslösung (0,5 M Tris/HCI, pH-Wert 7,5,1,5M NaCI). Dann werden die Filter in eine Schale gegeben, die 3x SSC enthält (SSC = 0.15M NaCI, 0,015 M Natriumzitrat, pH-Wert 7,0). Die Filter werden vorsichtig mit einer behandschuhten Hand geschrubbt, um Bakterientrümmer zu entfernen, in eine frische Schale mit 3x SSC gegeben und 20min bei Zimmertemperatur vorsichtig

geschüttelt. Die Filter werden auf Whatman-Papier 3MM übertragen und 10 min bei Zimmertemperatur getrocknet. Die Filter werden auf 3 Whatman-Papier MM in einem Ofen bei 80⁰C für die Dauer von 2 Stunden gebacken. Anschließend werden sie 0,5 Stunden in 6x SSC bei Zimmertemperatur gewaschen und dann auf 50 ml vorgewärmtes (56Ό Vorhybridisierungsgemisch übertragen, dasaus 5OmMTHs-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM EDTA, 1MNaCI, 0,5% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 10X Denhardt-Lösung (5OS Denhardlösung = 1 % BSA, Boehringer-Fraktion V; 1 % Polyvinylpyrrolidon -40; 1 % Ficoll 400) besteht. Dem Vorhybridisationsgemisch werden frisch zugesetzt: 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA (Maniatis u.a., S.327; Lit.5) und 0,01 mg/ml Poly-rA. Die Vorhybridisierung erfolgt unter sanftem Schütteln bei 56°C über die Dauer von 4 Stunden. Als Sonde für die Hybridisierung wird das einzelstrangbruchtranslaterierte 3,5kbp-EcoRI-Fragment von pPL35-5 verwendet, welches den C-Terminalbereich des pelD-Gens des A.niger-Stammes N756 (erhältlich von E. coli BJ 5183/pCG 3B11, DSM 3916, EP 88101397.3) enthält. Das Fragment wird vorher aus einem niedrigschmelzenden Agarosegel isoliert, und 0,3 μg des Fragments werden einzelstrangbruchtranslateriert (Maniatis u.a., S. 109-112; Lit. 5). Die EinzelstrangbruchtranslaterierteDNA wird 10 min lang in einem siedenden Wasserbad denaturiert, auf Eis gekühlt und 50 ml vorgewärmtem Vorhybridisationsgemisch zugesetzt. Die vorhybridisierten Filter werden einer nach dem anderen auf das Hybridisierungsgemisch übertragen. Die Hybridisierung erfolgt unter sanftem Schütteln über Nacht bei 56⁰C. Die Filter werden bei 56°C gewaschen: 2x 30min mit 0,514x SSC, 0,1 % SDS und 2x 30min mit 2x SSC, 0,1 % SDS. Die Filter werden auf 3 MM-Papier übertragen und über eine Stunde durch Luft getrocknet. Nachdem sie auf 3MM-Papier geklebt wurden und eine entsprechende Markierung mit radiomarkierter Tusche erfolgt ist, werden die Filter mit Saran-Deckmaterial abgedeckt und über Nacht bei —70"C autoradiografiert, wozu Konica-Röntgenfilme und röntgen-omatische Kodak-Kassetten sowie normale Intensivierungsschirme verwendet werden. Auf diese Weise erhält man 44 positive Signale von den 5 gescreenten Planen. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette aufgenommen, wozu die Platten auf dem Autoradiogramm sorgfältig in der richtigen Weise positioniert werden und die Tuschemarkierungen genutzt werden. Die Agarstücke, welche die positiven Plaques enthalten, werden in 1 ml PSB dispergiert. Man läßt die Phage über eine Stunde bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Wirbeln aus dem Agar diffundieren. Das Agar und die bakteriellen Zelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugeren entfernt, es werden 10μΙ Chloroform zugesetzt und die Phag-Vorratslösungen bei 4°C aufbewahrt. Die positiven Klone erhalten die Bezeichnungen X-PL1 bis X-PL4A. Da Phage in hoher Dichte plattiert werden, müssen die positiven Plaques zweimal gereinigt werden, wozu sie in geringer Dichte (±100Phag je Platte; 0,1 ml einer 10³-Verdünnung der Phag-Vorratslösung) plattiert und das gesamte Verfahren der Replikatplattierung, Hybridisierung und Aufnahme der positiven Plaques wiederholt werden.

Beispiel 2.2 Isolierung der Lambda-DNA

Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, wird zuerst eine Amplifikation der Phage durch Infektion von E. coli NM 539 mit 0,1 ml der Phag-Vorratslösungen, die von gereinigten Klonen stammen, wie im Beispiel 1.5 vorgenommen und werden dann die Zellen in LC-Topagarose auf LC-Agar-Platten plattiert. Dadurch erhält man Platten mit konfluenter Lysis der Indikatorbakterien. Über die Platten werden 5ml PSB gegeben, und die Phage werden über einen Zeitraum von zwei Stunden durch sanftes Schütteln eluiert. Die eluierten Phage werden geerntet, Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren entfernt, und es wird Chloroform bis zu 1 % zugesetzt. Das resultierende Plattenlysat wird bei4°C aufbewahrt. Es hat in der Regel ein Titer von etwa 10¹¹pfu/ml.

Da Isolierungsverfahren im kleinen Maßstab aus Plattenlysatvorratslösungen und aus kleinangelegten flüssigen Kulturen (Maniatis, u. a., S. 65-68; Lit. 5) nicht immer verdauungsfähige DNA ergeben, werden Phage aus 250-ml-Lysaten isoliert. Diese werden hergestellt durch Züchten des Wirts, E. coli NM 539, auf einen O. D.eoo von 0,3 in LC + 0,2 % Maltose, 1OmM MgSO₄,1 mM CaCI₂ und anschließendes Zufügen von etwa 10¹⁰pfu des Plattenlysats. Nach weiterem Wachstum lösen sich die Bakterien innerhalb von 4 Stunden auf.

RNase und DNase werden den Lysaten bis zu einer Endkonzentration von 2цд/тІ zugesetzt, und man läßt das Lysat bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen. Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (20min, Zimmertemperatur, ЮОООхд) entfernt. In der obenaufschwimmenden Schicht werden 14,8g NaCI und 25g PEG 6000 aufgelöst, um Endkonzentrationen von 1M NaCI und 25% PEG zu erhalten. Man läßt die Phage über eine Stunde auf Eis oder über Nacht bei 4°C ausfällen und erntet sie durch Zentrifugieren (20min; ЮОООхд; 4°C). Die Pellets werden in 3ml Lambda-Verdünnungspuffer (LDB = 1OmM Tris/HCI, pH-Wert7,5,2OmM MgCI₂,10OmM NaCI)suspergiert.ln4ml derPhagsuspension werden 2,5g CsCI aufgelöst, und das Gemisch wird mit der Pipette in 5-ml-Beckman-Schnellschlußröhrchen gegeben, die dann bis zur selben CsCI-Konzentration in LDB gefüllt werden. Die Röhrchen werden verschlossen und über Nacht in einem Beckman-RotorVTi65.2bei 50000U/min und4^:C zentrifugiert. Das trübe Phagband, das unter einer normalen Lampe sichtbar ist, wird von der Seite des Rörchens punktiert. CsCI wird durch Dialyse in sterilen Röhren anhand von 211OmM Tris/HCI, pH-Wert 7,5,19 mM MgCI₂,5OmM NaCI bei 4°C über die Dauer von 4 Stunden entfernt. Der Puffer wird einmal ausgewechselt. Phage werden in sterilen Greiner-Rohren aufgefangen, das Volumen wird mit dem Dialysepuffer auf 1 ml abgestimmt, es werden 50 μ110% SDS, 50μΙ 0,5 M EDTA, pH-Wert 8,0, und 25 μΙ von 20mg/ml-nukleasefreier Pronase zugesetzt und die Röhrchen 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Das Volumen wird mit TE auf 3 ml erhöht, und diese Lösung wird mit gleichem Volumen von TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1, extrahiert. Nachdem 0,1 Volumen von 3M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, und 2,5 Volumen Ethanol zugesetzt worden sind, wird die DNA bei -20⁰C über Nacht ausgefällt und durch Zentrifugieren (1 h, 20000x g bei 4⁰C) aufgefangen. Das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst. Die Ausbeute an Phag-DNA beträgt etwa 200μg/250ml Lysat.

Beispiel 2.3

Restriktionsanalyse von pelD-Klonen

Von den positiven Phagen wurden 10 willkürlich für die weitere Analyse ausgewählt. Es wird lyg Phag-DNA mit 10 Einheiten EcoRI oder BgIII in einem Volumen von 20 μΙ für die Dauer von 2 Stunden bei 37 ⁰C in den Puffern verdaut, die vom Hersteller empfohlen werden. Die Proben werden auf einem 0,6%igen Agarosegel getrennt, wozu 1 μg Lambda el 857-Sam 7-DNA verwendet wird, die mit Hind III (Lambda χ Hind III) verdaut wurde, als Marker, und EMBL4-DNA und pCG 3B11 -DNA, verdaut mit

EcoRI, dient als Kontrolle. Das Gel wird auf einem UV-Transilluminator unter Verwendung von Polaroid-Filmen 667 (4s, Blende 8) fotografiert. Die DNA wird auf Nitrozellulosefilter von Schleicher und Schüll, BA85, nach der Methode von Southern (1975), wie das von Maniatis, S. 382-386 (Lit. 5) beschrieben wurde, übertragen. Die Filter werden mit einem Gemisch von ³²P-markierten (einzelstrangbruchtranslaterierten) Fragmenten des pelD-Gens, die den Bereich des gesamten Gens erfassen, markiert. Diese Fragmente sind das 2,9 kbp EcoRI-Fragment von pPL29-5 und das 3,5kbp EcoRI-Fragment von pPL35-5. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.

Die Bandlängen werden aus den Fotografien und Autoradiogrammen durch grafischen Vergleich auf einfachlogarithmischem Papier mit den bekannten Marker-Bändern errechnet. Die Restriktionskarten der Klone werden in der Abb. 1 gegeben. Die Klone λ-ΡΙ.4, -14, und -40 enthalten sowohl das 2,9- als auch das 3,5-kbp-EcoRI-Hybridisierungsfragment, wie es in pCG 3 B11 gefunden wird. λ-ΡΙ_5, -6, -10 und -33 enthalten das 3,5-kp-EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden EcoRI-Fragment. Die Klone X-PL26 und -28 enthalten das 2,9-kbp-EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden Fragment, während A-PL9 nur ein kleines hybridisierendes EcoRI-Fragment von 1,2 kbp enthält. Das vollständige 5,0-kbp-Bglll-Fragment von pCG 3 B11, welches das gesamte pelD-Strukturgen enthält, ist nur in den Klonen A-PL4, -14 u nd -40 enthalten. Das 3,7-kbp-Hybridisationsband, das in den Klonen A-PL5, -6, -10, -14, -33 und -40, nicht aber in pCG 3 B11 vorhanden ist, befindet sich flußabwärts des pelD-Gens im 5,0-kbp-Fragment. Einige hybridisierende Bglll-Fragmente enthalten noch 1,2 kbp des rechten Armes des Vektors. Alle Klone enthalten auch nichthybridisierende Fragmente, die identisch sind. Da es also offensichtlich den Anschein hat, daß die Restriktionsmuster sowohl des Strukturgens als auch den Gens in der Umgebung in allen Klonen identisch sind, wird geschlußfolgert, daß sie ihren Ursprung im selben Gen haben, dem pelD-Gen des A. niger-Stammes N400. Aus der Anzahl der plattierten Klone und der angenommenen Genomlänge von 3 χ 10⁷bp wird abgeleitet, daß bei 25000 Klonen mit einer durchschnittlichen Insert-Länge von 15 kbp wenigstens 12 pelD-Klone gefunden werden. Da nur 2 der 10 analysierten Klone identisch sind, ist die Komplexität der Bibliothek sogar noch höher als angenommen (siehe Beispiel 3).

Beispiel 2.4

Subklonieren von pelD-Fragmenten

Die 5,0-kbp-Bglll-Fragmente von \-PL4 und pCG3B11, welche die pelD-Gene von A.niger N400 bzw. N 756 enthalten, werden in die BamHI-Stelle von Plasmid pBR322 subkloniert (siehe Klonierungsvektoren). In 20μΙ werden 4цд X-PL4 und 2цд pCG3B11 mit 10 Einheiten BgIII über zwei Stunden bei 37⁰C bis zur Kompletion verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (BRL) in TBE + 1 цд/rnl Ethidiumbromid bei 50V getrennt. Das 5,0-kbp-Fragment wird aus dem Gel herausgeschnitten, mit 0,4 ml TE verdünnt, es wird ein gleiches Volumen Phenol zugesetzt, und das Gemisch wird 10min auf 65⁰C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen. Nach einem fünfminütigen Zentrifugieren bei 12000U/min in einer Eppendorf-Tischzentrifuge 5414S wird die wäßrige Phase mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, gewaschen, getrocknet und schließlich in 10μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Es werden 1 цд pBR322-DNA, die nach der Plasmidherstellungsmethode im großen Maßstab (Maniatis, u.a., S.86; Lit.5) hergestellt wurde und durch CsCI-Gradientenzentrifugation gereinigt worden ist, mit 5 Einheiten BamHI für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C in einem Volumen von 20μΙ verdaut. Es werden 2 μΙ von 10 χ ClP-Puffer und 0,02 Einheiten von CIP zugesetzt und weitere 30min inkubiert. EDTA wird auf eine Endkonzentration von 25 mM zugesetzt, und das Gemisch wird für 10 min auf 65°C erhitzt. Die Lösung wird mit TE auf 200μΙ verdünnt und dreimal mitTE-gesättigtem Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach der Ethanolausfällung wird die DNA in 50 μΙ geringen TE-Puffer aufgelöst. Ein DNA-Fragment zu 100 ng wird mit 20 ng der Vektor-DNA in einem Volumen von 20 μΙ unter den in Beispiel 1.4 beschriebenen Bedingungen ligiert. Die Hälfte des Ligationsgemischs wird für die Transformation von E. coli-MH 1-kompetenten Zellen verwendet, die nach derCaCI₂-Methode (Maniatis, u.a., S. 250; Lit. 5) hergestellt wurden. Die Zellen werden auf LC-Agar-Platten, die 50pg/ml Ampizillin enthalten, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transformanten werden auf ihre Tetrazyklinsensitivität getestet, wozu sie in Kolonien zuerst auf LC-Platten mit 20 pg/ml Tc und dann auf LC+amp-Platten gestrichen werden. Die Transformanten werden über Nacht bei 37⁰C in 5ml von LC+amp gezogen und die DNA wird unter Anwendung der alkalischen Lysis-Miniprep-Methode (Maniatis, u.a., S.368; Lit. 5) aus 1,5ml der Kultur isoliert. Die Miniprer-DNA werden mit BamHI und Pstl verdaut, und die Fragmente werden auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert. Zwei Plasmide mit ihrem Ursprung von A-PL 4, welche das 5,0-kbp-Bglll-Fragment in entgegengesetzten Orientierungen enthalten, werden mit pGW840 und pGW841 bezeichnet. Weitere Plasmide, die von pCG3B11 stammen, werden mitpGW870und pGW871 bezeichnet. Die MH 1-Zellen, welche sie aufnehmen, werden bei -70⁰C auf Glyzerol gehalten. Plasmid-DNA von 0,5-l-Kulturen dieser Klone wird im großen Maßstab isoliert (Maniatis u.a., S.86; Lit.5), durch CsCI-Zentrifugation gereinigt, phenolisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 400μΙ geringen TE-Puffer aufgelöst. Die Ausbeute beträgt etwa 500μg. Die Plasmide werden der Restriktionskartierung unterzogen. Die Karte für Plasmid pGW840 wird in der Abb. 2 gezeigt und ist nicht von der für pGW870 zu unterscheiden. Auch die Plasmide pGW841 und pGW871, welche das Fragment in der entgegengesetzten Orientierung enthalten, sind nichtunterscheidbar, was auf die Identität der pelD-Gene von den A. niger-Stämmen N400 und N756 hinweist.

Beispiel 3

Screenen nach. Isolierung und Charakterisierung von pelO-verwandten Genen

Beispiel 3.1

Schaffung der Hybridisationsbedingungen durch Analyse von genomischen Übertragungen von A. niger-N400-DNA In einem Volumen von 20μΙ werden bei 37"C über die Dauer von 4 Stunden 2^g-DNA-Proben des A. niger-Stammes N400, die wie im Beispiel 1.1 isoliert worden sind, unter Verwendung von BamHI (BRL) oder Hind III (BRL) in HHA BOg Puffer verdaut. Die verdauten Proben werden auf 0,6%igen Agarosegels bei 40 V über die Dauer von 18 Stunden elektrophoretisch getrennt. Die DNA wird auf Nitrozellulosefilter transferiert und wie im Beispiel 2.3 gebacken. Die (Vor-)Hybridisationslösungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.

Die bei der Vorhybridisation angewandte Temperatur ist immer die gleiche wie die Hybridisationstemperatur. Das einzelstrangbruchtranslaterierte BamHI/Pstl-Fragment von pGW840, das den Codierungsbereich des pelD-Gens enthält, wurde als Sonde verwendet. Die Hybridisation wird über 16 Stunden und über 40 Stunden bei unterschiedlichen Temperaturen (52°C, 60°C und 68⁰C) ausgeführt. Bei den drei unterschiedlichen Temperaturen wird mit den beiden folgenden Waschbedingungen gearbeitet: 2x 30min 5x SSC, 0,1% SDS, gefolgt von 2x30min3x SSC, 0,1 %SDS im Vergleich zu4x 30min 5x SSC, 0,1 %SDS. Bei 68% wird außerdem eine Waschung zweimal mit 2x SSC, 0,1 % SDS und zweimal mit 0,2x SSC, 0,1 % SDS einbezogen. Bei 68°C und Verwendung der 0,2x SSC-Waschungen tritt nur homologe Hybridisation ein. Werden höhere Salzkonzentrationen angewendet, treten einige andere schwache Signale auf. Bei 52 ⁰C ist der Hintergrund stark und die Hybridisation schwach. Die besten Bedingungen für eine „heterologe" Hybridisation erreicht man bei 60°C über die Dauer von 40 Stunden bei Anwendung der Waschkombination 5 χ SSC und 3 χ SSC. Diese können noch weiter optimiert werden, wenn man 4x SSC in Verbindung mit 2x SSC anstelle von 5χ SSC in Verbindung mit 3x SSC anwendet. Die Signale, die bei diesen genomischen Übertragungen von A. niger N400 bei einer Sondierung mit dem 1,6-kbp-BamHI:Pstl-Fragment von pGW840 Sichtbarwerden, werden in der Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle 1

Hybridisationssignale in genomischer DNA von A. niger N 400, sondiert mit dem 1,6-kb-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840

BamHI Hind III

7,5 kbp stark homolog; pelD 21,0 kbp stark homolog; pelD

4.3 kbp stark 3,9 kbp stark

4,1 kbp schwach 7,1 kbp schwächer

18,0 kbp schwach 4,4 kbp schwach

8.4 kbp sehr schwach 4,6 kbp schwach

1,5 kbp sehr schwach

Beispiel 3.2

Screenen der Bibliothek

Auf 5 Platten werden 2,5 χ 10⁴ Phage der N400-Lambda-Bibliothek plattiert und von jeder Platte 3 Nitrolzellulosereplikate gemacht, wie das im Beispiel 2.1 beschrieben wurde. Auch der (Vor-) Hybridisationspuffer wird im Beispiel 2.1 beschrieben. Das erste Replikat von jeder Platte wird bei 60⁰C über 40 Stunden mit dem 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Fragment von gGW840 hybridisiert und zweimal bei dieser Temperatur über 30min mit 4x SSC, 0,1 % SDS, und zweimal über 30min mit 2x SSC, 0,1 % SDS gewaschen, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde. Diese Bedingungen werden als heterologe Bedingungen bezeichnet.

Das zweite Replikat von jeder Platte wird bei 68 ⁰C mit dem gleichen Fragment hybridisiert und zweimal über 30 min mit 2 χ SSC, 0,1 % SDS, und zweimal über 30min mit 0,2χ SSC, 0,1 % SDS, gewaschen. Diese Bedingungen werden als homogene Bedingungen bezeichnet. Das dritte Replikat von jeder Platte wird homolog mit dem 0,35-kbp-BamHI-Fragment von pGW840 hybridisiert, das sich im Promotorbereich von pelD direkt im Anschluß an das 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Fragment befindet. Man erhält 29 Plaques, die heterolog hybridisieren, nicht aber (oder sehr schwach) homolog. Sie werden als λ-PL 101 bis λ-PL 129 bezeichnet.

Man erhält 19 Plaques, die stark homolog und heterolog mit der BamHI/Pstl-Sonde hybridisieren. Sie werden als λ-PL 130 bis X-PL148 bezeichnet und als pelD-Klone betrachtet. Davon hybridisieren 2 nur schwach mit der 0,35-BamHI-Sonde (λ-ΡΙ.145 und λ-ΡΙ_146) und enthalten daher wahrscheinlich nur einen Teil des Promotorbereiches. Die anderen hybridisieren stark. Man erhält nur einen Klon, der nur mit der 0,35-kbp-BamHI-Sonde hybridisiert (X-PL149).

Alle Klone werden aufgenommen und zweimal durch Plattieren und heterologes Hybridisieren mit der 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Sonde gereinigt. Bei einem zweiten Screening-Experiment wurden zusätzlich 23 pelD-Klone und 25 andere Klone ermittelt (\-PL151bisX-PL198).

Beispiel 3.3

Charakterisierung von Lambda-Klonen durch Plaque-Hybridisierungssignal mit unterschiedlichen, von pelD abgeleiteten Sonden

Bei diesem Experiment wird eine Klassifizierung der isolierten Klone unter Verwendung unterschiedlicher Teile des Codierungsbereichs von pelD als Sonde beschrieben. Einbezogen werden λ-PLI 01 bis -130, während K-PlA als positive Kontrolle verwendet wird. Einbezogen wird auch λ-PL 145. Die Klone werden plattiert, und es wird nur ein Replikat hergestellt, das in 6 Teile unterteilt wird. Auf diese Weise sollen Unterschiede im Hybridisationssignal zwischen Replikaten ausgeschlossen werden. Getrennte Teile der Replikate werden mit den folgenden ³²P-markierten Sonden sowohl homolog als auch heterolog hybridisiert:

1: das komplette 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840

2: das 649-bp-BamHI/Xhol-Fragment von gWG 840 (N-Terminalcodierungsbereich von pelD) 3: das 244-bp-Xhol/Pstl-Fragment von pGW840 (C-Terminalcodierungsbereich von pelD).

Wie für pelD-Klone erwartet wurde, hybridisieren λ-Ρί4, -130 und -145 sowie λ-PLIOI unter homologen und heterologen Bedingungen stark mit diesen Sonden. Der letztgenannte Klon, λ-PL 101, befindet sich am Rand eines Filters in Beispiel 3.2 und wird daher beim ersten Screening nicht als pelD aufgeführt. Die eben genannten Klone werden als (pelD-) Klone der Klasse I klassifiziert. Alle anderen Klone können in zwei andere Klassen unterteilt werden: Klasse Il hybridisiert nicht nur heterogen mit der gesamten Sonde, sondern auch mit der N-Terminalsonde. Die homologe Hybridisation ist mit dem gesamten pelD-Gen als Sonde nur schwach. Klone der Klasse III hybridisieren überhaupt nicht mit der N-Terminalsonde und auch nicht homolog mit der gesamten Sonde. Die C-Sonde hybridisiert nicht mit Klonen der Klasse Il und III. Aus diesen Experimenten wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß wenigstens zwei verwandte Gene bei den isolierten Klonen sind. Zu den Klonen der Klasse Il gehören: λ-Ρί104,-105,-109,-113,-114,-115,-119,-122,-124,-125,-128 und-129. Die Klone der Klasse III sind: λ-Ρί102,-103,-106,-107,-108,-110,-111,-116,-117,-118,-120,-121 und-123.

Beispiel 3.4 Restriktionsanalyse der isolierten Lambda-Klone (Klasse I, II)

Plattenlysatvorratslösungen, 250ml flüssige Lysate und Phag-DNA-Präparate im großen Maßstab aus diesen Lysaten werden wie im Beispiel 2.2 hergestellt. Das geschieht für 24 Klone, von denen 3 pelD-Klone {λ-ΡΙ4, -130, -145) sind. Eine Klon-DNA geht während der DNA-Isolierung verloren (λ-PL 124). Die aus diesen Klonen isolierte DNA wird in 1 -pg-Proben in insgesamt 20 μΙ mit 10 Einheiten Enzym verdaut. Alle Klone werden mit EcoRI, BamHI, Hind III, EcoRI/BamHI, BamHI/Hind III, EcoRI/Hind III und EcoRI/BamHI/Hind III verdaut. Die Fragmente werden auf 0,6%igem Agarosegel getrennt und wie im Beispiel 2.3 auf Nitrozellulosefilter übertragen. Übertragungen werden heterolog mit dem 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840 hybridisiert, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde.

Zwei Klone (λ-PL 112 und λ-PL 129) hybridisieren nicht. Die Bandlängen werden sowohl aus den Fotografien wie auch aus den Autoradiogrammen berechnet. Vom Klon λ-PL 113 abgesehen, enthalten alle Klone zu viele Fragmente, um eine vollständige Karte abzuleiten.

Es ist jedoch möglich, eine Karte des Hybridisierungsbereiches abzuleiten und durch Kombination von Daten zu anderen nichthybridisierenden Bändern zuzuweisen, welche Klone vom selben Gen abgeleitet sind. Es ist klar, daß von den restlichen 18 analysierten Klonen der Klassen Il und IM 5 Gene vorhanden sind. Sie werden als pelA, pelB, pelC, pelE und pelF bezeichnet. Die Zuweisung von Klonen zu diesen Genen wird in der Tabelle Il zusammengefaßt.

Tabelle Il

Zuweisung von isolierten Klonen zu unterschiedlichen pel-Genen

(part heißt, daß die Hybridisierungsbänder nur teilweise in diesen Klonen vorhanden sind)

Klasse	Gen	-Klone
I.	pelD	PL 4, PL 130, PL 145 (part)
II.	pelA pelB pelC	PL 113, PL 104, PL 115, PL 125 (part) PL 119, PL 122, PL 128, PL 105 (part) PL 109

pelE PL 116, PL 107 (part)

pelF PL 102, PL 103, PL 110, PL 120, PL 121 (part), PL123 (part)

Tabelle III Vergleich der Hybridisationsbänder in Chromosomalübertragungen und isolierten Genen

Die Bandlänge wird in kbp angegeben.

EcoRI BamHI Hindill

Chromosomal	2,9 + 3,5	7,5	21,0 homologes Signal pelD
	+ größere	4,3	3,9 stärkste heterologe
	Bänder		Signale
		18,0	7,1 schwächere Signale
			4,4 schwache Sig nale
		8,4	4,6 schwache Signale
		4,1	1,5 schwache Signale
pelD	2,9 + 3,5	7,5	groß
pelA	7,5	4,3	3,9
pelB	8,7	groß	7,1
pelC	5,0	groß	4,4
pelE	6,2	8,4	4,6
pelF	groß	4,1	1,5 + 2,8 (sehr schwach)

Ein Vergleich der Länge des Hybridisierungsfragmentes der isolierten Gene und der Länge der Hybridisationsfragmente von genomischen DNA-Übertragungen wird in der Tabelle III gegeben. Aus diesen Daten wird geschlußfolgert, daß alle Bänder, die in den genomischen Übertragungen hybridisieren, in den isolierten Klonen vorhanden sind und daß unter diesen Hybridisationsbedingungen keine anderen verwandten Gene isoliert werden können. Die Plaque-Hybridisationsergebnisse (Beispiel 3.3) zeigen, daß jedes Gen, wenn man partielle Klone nicht berücksichtig, ein spezifisches Hybridisationsmuster mit den getesteten Sonden hat. Das wird in der Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Vergleich der Signalstärke von unterschiedlichen Genen bei der homologen und heterologen Plaque-Hybridisation mitunterschiedlichen petD-Sonden nach dem Experiment in Beispiel 3.3 Der Grad der Hybridisation wird durch die Anzahl der +-Zeichen ausgedrückt. Das homologe pelD-Gen hybridisiert mit wenigstens 10 +-Zeichen; + sehr schlechte Hybridisation, — keine Hybridisation

Heterologe Hybridisation Homologe Hybridisation

Sonde Ganzes N-Term. C-Term. Ganzes N-Term. C-Term.

Gen Gen

pelF ++++ + ± ±n - -

Beispiel 3.5 Subklonieren von pelD-verwandten Genen in pBR322

Subklone der Hybridisationsfragmente, die aus den im Beispiel 3.3 gewonnenen λ-Klonen gewonnen werden, werden im Vektor pBR322 hergestellt, der durch EcoRI, BamHI oder Hind III verdaut und anschließend dephosphoryliert wird. Fragmentisolierung aus LMP-Agarosegels, Vektorherstellung, Ligation, Transformation von E. coli MH1, Miniprep-DNA-Isolierung und großangelegte Plasmidisolierung werden nach den Standardverfahren durchgeführt, die im Beispiel 2.4 beschrieben worden sind.

Die Fragmente werden in den geeigneten Vektor ligiert, wie das im Beispiel 2.4 beschrieben wurde. Transformierte E.coli MH 1-Zellen werden auf LC + 50pg/ml amp plattiert. Die Transformanten werden auf Tetrazyklinsensitivität getestet. Die EcoRI-Klone sind alle resistent. Dann werden Miniprep-DNA mit geeigneten Enzymen verdaut, um auf die richtigen Inserts zu prüfen und die Orientierung der Fragmente zu bestimmen. Die ausgewählten Plasmide werden in der Tabelle V zusammengefaßt. Zellen, welche diese aufgenommen haben, werden bei -70°C auf Glyzerol gelagert.

Tabelle V Subklone von pel-Genen in pBR322

Plasmid Gen Fragment Ursprung Orientierung

pGW820 pel A 7,5 EcoRI X-PL113 2

pGW821 4,3 BamHI 2

PGW822 3,9 Hindill 2

pGW823 7,5 EcoRI 1

pGW824 4,3 BamHI 1

pGW825 3,9Hindlll 1

pGW830	pelB	7,1 Hindill	λ-ΡΙ.122	1
pGW850 pGW851	pelC	5,0 EcoRI 5,0 EcoRI	X-PL109	1 2
pGW860	pelF	4,1 BamHI	X-PL102	1

pGW880 pelE 4,6Hindlll X-PL109 1

pGW881 4,6Hindlll 2

Die Plasmide pGW820, -830, -860 und -880 wurden im großen Maßstab isoliert und einer Restriktionskartierung unterzogen.

Karten dieser Plasm ide werden in den Abbildungen 1 bis 6 gegeben.

Um die Genlage und -orientierung zu bestimmen, werden Southern-Transfers von Plasmidverdauungen heterolog mit dem 1,6-kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840 hybridisiert, und identische Transfers werden heterolog mit einem N-Terminalfragment desselben Plasmids hybridisiert, welches das 649-bp-BamHI/Xhol-Fragment für die Kartierung von pGW820 und -830 und das 766-bp-BamHI/EcoRl-Fragment für pGW850 und -860 ist.

Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 wurden in E.coli HB101 kloniert und am I.Februar 1988 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Grisebachstr.8,3400 Göttingen, hinterlegt. Sie erhielten die DSM-Nr.4388, 4389,4390,4391 bzw. 4392.

Beispiel 4 Sequenzbestimmung der Gene pelD, pelA, pelB und pelC Beispiel 4.1

Partielle Sequenz des pelD-Gens des A. niger-Stammes N400 und deren Identität mit pel I von A. niger-Stamm N Nach der LMP-Agarosegel-Elektrophorese, wie sie im Beispiel 2.4 beschrieben, wurde, werden geeignete Restriktionsfragmente von pGW840 isoliert. Diese werden nach dem BRL-M 13-Cloning/Dideoxysequenzierungshandbuch (S. 26,27; Lit6) in die Vektoren M13mp18RF und M13mp 19RF kloniert. Die Transformation von E. coli JM103, die Plattierung auf Minimal-X-gal-

Indikatorplatten und die Isolierung von einzelstrangiger DNA aus rekombinanten Phagen erfolgen nach den Anweisungen im gleichen Handbuch (S. 29-34). Einige Klone werden nach der Dideoxykettenterminationsmethode nach Sanger sequenziert, die auf den Seiten 38-74 des BRL-Handbuches beschrieben wird

Die zwischen den Nukleotiden —457 und +100 bestimmten Sequenzen sind mit der entsprechenden Sequenz des PU-Gens identisch, das von A. niger N756 abgeleitet wurde und im Plasmid pCG3B11 (EP88101 397 3) vorhanden ist Die Sequenz, die aus BamHI von der Position— 457 bis zur Position +100 bestimmt wurde, besteht aus 457 Nukleotiden der Promotorsequenz, den 57 Nukleotiden mit der Codierung der Signalsequenz und 43 Nukleotiden mit der Codierung fur die ersten ISN-Terminal-Ammosauren des reifen PLD-Protems.

Auf Grund der identischen Restriktionskarten des N400-pelD-GEns in pGW840 und des N756-pelD-Gensin pCG3B11 und der vollständig identischen Daten der N-Terminalsequenz wird angenommen, daß die beiden Gene identisch sind Demzufolge wird angenommen, daß das PLD-Protein mit dem früheren PLI-Protein identisch ist

Beispiel 4 2

Sequenzbestimmung des pelA-, pelB- und pelC-Gens

Fragmente von pGW820, pGW830 und pGW850 werden in M13mp 18RF und Μ13mp 19RF (siehe Beispiel 4.1) oder in die Plasmide pEMBL 18 und pEMBL19 (Dente u.a.. Lit.7,8) subkloniert Einzefstrangige DNA von den Plasmidklonen erhalt man durch Infektion mit dem Helfer-Phag R408 (Russell u.a., Lit.9).

Exonuklease-Ill-Deletionsklone wurden aus pGW850 nach der Methode von Hemkoff (Lit.28) hergestellt. Das3,0kb-Smal-Bglll-Fragment von pGW850, an dem sich das pelC-Gen befindet, wird in pEMBL 19 subkloniert. Mit Saml und Sacl werden 50 цд dieses Klons verdaut und nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und der Ethanolausfallung mit Exonuklease III verdaut Zu unterschiedlichen Zeitintervallen werden Proben genommen, die Exonuklease III wird durch den Zusatz von NaCI und EDTA inaktiviert, und es wird 10 min bei 70⁰C inkubiert. Überstehende ssDNA-Enden werden durch S1-Nuklease entfernt, und die kohasiven Enden werden mit T4-DNA-Polymerase glatt gemacht Nach der Selbstligierung und der Transformation von E coli JM103 mit diesen Deletionsklonen erhalt man einzelstrangige DNA durch Infektion mit dem Helfer-Phag R408. pGW820 wird von der Pvull-Stelle an Position 1000 bis zur Clal-Stelle an Position 4175 sequenziert (siehe Abb. 1). Bei pG W 830 wird das 2 774 bp-Xhol-Fragment sequenziert (siehe Abb.2). pGW850 wird von der EcoRI-Stelle in Position 0 bis zur Position 3168 sequenziert (siehe Abb.3)

Die Sequenzstrategien fur diese Gene werden in den Abbildungen 7,8 und 9 angegeben. Es werden mehrere Oligonukleotide unter Anwendung der Phosphoramiditmethode von Caruthers (Lit. 10) bei Einsatz eines Oligonukleotidsynthesiziers von Applied Biosystems (Modell 380 B) synthetisiert. Sie werden als Sequenzierungsstarter verwendet, ihre Position wird in den Abbildungen 7 und 8 angegeben.

Die gesamte Sequenz des pelA-Gens wird in der Abb.9 in der 5'-»3'-Richtung gegeben. Die 3175bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nukleotiden der Pvull-Stelle in der Position 1000 von pGW820 und endet beim letzten Nukleotiden der Clal-Stelle in der Position 4175 in pGW820.

Die pelA-Sequenz besteht aus 1360 Nukleotiden des Promotorbereichs, 1355 Resten des Strukturteils und 360 Nukleotiden des Terminatorbereichs.

Der Aminosaurefolge von PLA (siehe Beispiel 6.3) geht eine Signalsequenz von 20 Aminosäuren voraus, wie aus der Nukleotidfolge abgeleitet werden kann.

MET-LYS-TYR-SER-THR-ILE-PHE-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-VAL-PHE-ALA-GLY-SER-ALA-ALA-ALA

Die Homologie mit der Signalfolge des pelD-Gens wird durch ein Sternchen angegeben. Auch die ersten 5 Reste des reifen Proteins haben dieselbe Aminosäurefolge in pelA und pelD.

Die gesamte Folge des pelB-Gens wird in der Abb. 10 gegeben, ebenfalls in der 5'—>3'-Richtung. Die 2 774bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nukleotid der Xhol-Stelle in pGW830 und endet am letzten Nukleotiden der zweiten Xhol-Stelle.

Die pelB-Sequenz umfaßt 1133 Nukleotide des Promotorbereichs, 1373 Reste des Strukturteils und 268 des Terminatorbereichs Das pel B-Gen codiert eine Signalfolge von wenigstens 20 Aminosäuren.

Die pelC-Sequenz besteht aus 1367 Nukleotiden des Promotorbereichs, 1340 Resten des Strukturteils und 461 des Terminatorbereichs Das pelC-Gen codiert eine Signalsequenz von 18 Aminosäuren

pelC MET-LYS-VAL-PROX-X-PHE-LEU-GLN-LEU-LEU-CYS-LEU

pelB * *

pelA * * *

pelD * * * *

pelC ASN-ALA-ALA pelB *

pelA *

pel D *

pelC LEU-ALA-SER-ALA pelB * *

pelA * *

pelD * * *

Die Homologie mit der Signalsequenz des pelA-, pelB- und pelD-Gens wird an den einzelnen Positionen mit einem Sternchen bezeichnet. Die X's werden zur Ausrichtung der Sequenzen einbezogen

Die Suche nach Konsensus-Sequenzen für Pilz-Exon/Intron-Spleißungsverbindungen in Intron-Innensequenzen (Baliance, Lit. 11) führt dazu, das Vorhandensein von vier Introns in den Genen pelA, B und C zu postulieren. Die Positionen, an denen sich die Introns innerhalb der Codierungsbereiche dieser pel-Gene befinden, bleiben in dem Sinne erhalten, daß potentiell fünf Intron-Positionen vorhanden sind, in jedem Gen aber ein anderes Intron fehlt. Für das pelC-Gen werden jedoch nur drei Introns postuliert. Von diesen befindet sich nur eines in einer Position, die einer Position eines Introns in pelD und pelA (Intron 5) entspricht. Die Positionen dieser Introns und ihre entsprechende Länge werden in der Tabelle Vl a zusammenfassend gegeben.

Tabelle VIa

Positionen von Introns in den Sequenzen von pelD, pelA, pelB und pelC

Die Positionen beziehen sich auf die Codierungssequenzen in den Abbildungen 10,11 und 12 und auf die Sequenz von pelD

Gen	pel D	pelA	pelB	pelC
Intron	Positionslänge, bp	Positionslänge, bp	Positionslänge, bp	Positionslänge, bp
1	202-267 66	fehlen	1337-139862	fehlen
2	410-47162	1708-175952	1543-159856	fehlen
3	598-66063	1886-193348	1725-178157	fehlen
4	fehlen	fehlen	fehlen	1853-193078
5	1446-150257	2031-209464	fehlen	1998-206265
6	fehlen	fehlen	fehlen	2232-229463
7	fehlen	2329-238254	2113-2169 57	fehlen

Die Länge der Exons zwischen den Introns ist in diesen Fällen bei den vier pel-Genen dieselbe. In der Abb. 13 werden die ausgerichteten, abgeleiteten Aminosäurefolgen von PLA, PLB, PLC und PLD gezeigt. Im N-Terminalteil der Codierungsbereiche von pelA, pelB und pelD wird auf der Grundlage der Nukleotidfolgenhomologie eine Homologie von etwa 80% beobachtet und von mehr als 80% auf der Grundlage der Aminosäurefolgenhomologie. Dieser Prozentsatz ist bei pelC weit geringer. Im C-Terminalteil von pelA, pelB und pelD geht jenseits von des Restes 285 des reifen Proteins (was dem Rest 305 in der Abb. 13 entspricht) die Homologie zum großen Teil verloren und kehrt erst in der Nähe des C-Terminus zurück. Abgesehen von den Konsensus-Sequenzen des Spleißungssignals und von den 5'- und З'-Spleißungsstellen (Tabelle Vl b) wird bei den Introns keine Homologie festgestellt.

Tabelle VIb

Vergleich von Intron-Konsensus-Sequenz

Intron

Donor Exoni

Lasso

Intron

Akzeptor Intron

Exon2

pelD pelB	1 1	AAGAC AGAAC	GTGAGTTT. GTAGGTCG.	.32 .32.	GGCTGACC. .GCCTAACA.	.12. . .8.	.TGCCAG .ATCCAG	TTTCG CTTCG
pe ID pe IA pelB	2 2 2	ACCTA GAATA ACTTA	GTAAGTTG. GTATGTCC. GTATGTTG.	.37. .29. .31.	.TGCTGACA. .ATCTAACT. .TGCTGATA.	..3. ..1. ..3.	.GGATAG .GGATAG .GTATAG	CAACA CTACA TGATA
pelD pelA pelB	3 3 3	ATCCA ATCCA ATCCA	GTATGCAT. GTAGGTTA. GTGAGTGC.	.32. .25. .33.	.AACTAACC. .CTCTAACG. .TGCTAATA.	..9. ..1. ..2.	.CCACAG .AATCAG .GGCCAG	GAACA GAACA GAACA
pelD pe IA pe 1С	5 5 5	TTACT TTACT GCGAG	GTAAGTCG. GTACGTCT. GTAAGACA.	.31. .40. .39.	.CACTAATG. .AGTTAACA. .CGTTGACT.	..4. ..2. ..4.	.CTTCAG .TGACAG .GATTAG	ACTGC ACCGC ACCTC
pelC	6	CCAGA	GTACGTGT.	.30.	.AACTAACA.	.11.	.TCACAG	ACAAC
pelA pelB	7 7	ACTGT ACGCC	GTAAGTTG. GTATGTCG.	.24. .28.	.ACCTGACT. .TACTGACA.	..8. . .7.	.TTGCAG .CTACAG	GTCAA GTGAA
CONSENSUS		GTA-GT--. g с a	.24. 40	.—CTAAC-. t G t	..1. 12	. CAG T

Die abgeleiteten Aminosäurefolgen für die Proteine PLA, PLB, PLC und PLD geben eine Gesamtzahl von 359 Resten für die ersten beiden Proteine, 360 für POC und 354 für PLD an. Im Zusammenhang mit der N-Glykosylation ist in allen vier Proteinen eine potentielle Glykosylationsstelle an Position 109 (im reifen Protein) vorhanden (bei PLC entspricht das der Position 105 in der nichtausgerichteten Folge). Bei PLB ist in der Position 232 eine zweite potentielle Stelle vorhanden, während bei PLD zwei andere potentielle Glykosylationsstellen an den Resten 255 und 329 vorhanden sind.

Beispiel 5

Kotransformation von A. niger unter Verwendung des A. niger pyrA-Gens als Selektionsmarker und von verschiedenen A. niger pel-Genen als kotransformierenden Plasmiden

Beispiel 5.1

Fortpflanzung und Reinigung von Plasmiden, die für die Transformation von A. niger verwendet werden Alle Plasmide werden im E.coli-Stamm MH1 vermehrt, und die Plasmid-DNA wird aus 500-ml-Kulturen, die über Nacht gebildet wurden, nach der Methode von Maniatis u.a. (S. 90-91, Lit. 5) gewonnen. Zu 2,5ml DNA-Lösung in TE, der bis zu 1 mg DNA enthielt, wurden 2,2g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg/ml in Wasser) gegeben. Die Lösung wird in Schnellschlußröhrchen gegeben, die so gefüllt und verschlossen werden, wie das der Hersteller (Beckman) empfiehlt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Rotor VTi 65.2 bei 20⁰C über die Dauer von 16 Stunden mit 45 000 U/min. Von den beiden fluoreszenten Bändern, die unter Ultraviolettlicht sichtbar sind, wird das untere, in dem sich die Plasmid-DNA befindet, durch seitliches Punktieren des Röhrchens isoliert. Die DNA-Lösung (etwa 1 ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird die DNA durch Ethanol ausgefällt, wieder in TE zur Suspension gebracht, einmal mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, erneut ausgefällt und bei -20⁰C gelagert.

Das Plasmid pGW613, welches das OMP-Dekarboxylase-Gen (pyrA) auf einem 5 kbp-DNA-Fragment von A. niger trägt, wird dazu genutzt, Transformanten auszuwählen (Goosen u.a.; Lit. 12).

Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 und pGW880, die im Beispiel 3.5 beschrieben wurden, werden als ^transformierende Plasmide verwendet.

Beispiel 5.2

Herstellung von Protoplasten und Transformation des uridinauxotrophen Mutanten A.niger-Stammes N593 Der A.niger-Stamm N593 (cspA, pyrA), derein Derivat des Parentalstammes N400 ist, wurde durch positive Selektion anhand des toxischen, 5-fluoroorotinsäuregleichen Analogs in Hefe (Boeke u.a.; Lit. 13) bei Vorhandensein von Uridin gewonnen, wie das von Goosen u.a. (Lit. 12) beschrieben wurde.

Flüssiges Minimalmedium, ergänzt mit 0,5% Hefeextrakt,0,2 Kacasaminosäuren, 1OmM Uridin (Janssen Chimica) und 50mM Glukose, wird mit 10⁶ Konidiosporen von A.niger N593 inokultiert und 20 Stunden bei 30⁰C in einem Orbitalschüttelapparat von New Brunswick inkubiert. Myzel wird durch Filtern durch Miracloth geerntet, mit isoosmotischem Minimalmedium (STS STC) mit folgender Zusammensetzung gewaschen: 1,33M Sorbitol, 1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI₂, abgestimmt auf 1,7m0sm. Eine Menge von 1g Myzel wird in 20 ml STC wieder zur Suspension gebracht. Innerhalb von 2 Stunden werden aus dem Myzel durch den Zusatz von 250 mg filtersterilisiertem Novozym 234 (Novo Industries, Dänemark) und Inkubation des Gemischs bei 30⁰C in einem Schüttelapparat mit 95 U/min Protoplasten freigesetzt. Die Protoplasten werden vom restlichen Myzel durch Filtern unter Verwendung eines Trichters mit einem Stöpsel aus Glaswolle getrennt und durch Zentrifugieren (10 min 2 500U/min) gereinigt, pelletiert und erneut in STC zur Suspension gebracht.

Zur Transformation werden 5 χ 10⁶ Protoplaste in 200μΙ gegeben, die dann zusammen mit 1 \ig pGW631 und Юцд eines der Plasmide pGW820, pGW830,pGW850, pGW860 oder pGW 880 (Volumen weniger als 20 μΙ) inkubiert werden. Für pGW 840 wird ein Verhältnis von 1:3 unter Verwendung von бцд pGW613 angewendet. Nach dem Zusatz von Plasmid-DNA zu den Protoplasten werden 50μΙ PCT(IOmM Tris-HCI, pH-Wert7,5,5OmM CaCI₂ 25% PEG6000)zugesetzt, und das Inkubationsgemisch wird 20 min auf Eis gehalten.

Dann werden weitere 2ml PCTzugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5min bei Zimmertemperatur inkubiert. Abschließend werden 4ml STC zugesetzt und gemischt. Aliquote von 1 ml dieser abschließenden Transformationslösung werden mit 4ml verflüssigtem isoosmotischem MM-Top-Agar gemischt, das durch 0,95 M Sukrose stabilisiert worden war (abgestimmt auf 1,7m0sm). Das Protoplastgemisch wird sofort auf Agar-Platten plattiert, die das gleiche isoosmotische Minimalmedium enthalten, und diese werden bei 30⁰C inkubiert. Entsprechende Kontrollexperimente beinhalten Protoplaste, die ebenso, aber ohne Plasmid-DNA, und auf nichtstabilisiertem Minimalmedium mit 2,5mM Uridin behandelt wurden. Nach 3 Tagen Wachstum bei 30⁰C erscheinen gut wachsende Transformanten, die Sporen bilden (50-150 Transformanten je \ig pGW613). Außerdem erscheint eine große Zahl von vermutlich abortiven Transformanten. Die Sporen von einzelnen Transformanten werden dann genommen und getrennt auf 50-mM-Glukose-Minimalmedium plattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten, die zur Vermeidung der Sporen für die weitere Analyse der Transformanten verwendet werden. In jedem Fall werden wenigstens zehn Transformanten auf flüssigem Minimalmedium gezogen, die DNA wird extrahiert und auf das Vorhandensein von kotransformierendem Plasmid-DNA analysiert. Pilz-DNA wird nach einem Verfahren isoliert, das gegenüber dem Verfahren zur Isolierung von Pflanzen-RNA leicht modifiziert ist (Slater; Lit. 14). Das Myzel wird mit Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren, und 0,5g werden unter Verwendung eines Mikrodismembrators (Braun) aufgebrochen. Das Myzelpulver wird mit frisch hergestelltem Extraktionspuffer extrahiert. Der Extraktionspuffer wird folgendermaßen hergestellt: 1 ml Triisopropylnaphthalensulfonsäure (TNS), 20mg/ml, wird mit 1 ml p-Aminosalizylsäure (PAS), 120mg/ml, und 0,5ml 5x RNB-Puffer (5x RNB-Puffer enthält 121,1 g Tris, 73,04g NaCI und 95,1 EGTA in 11, pH-Wert 8,5) gemischt. Nach dem Zusatz von 1,5 ml Phenol wird der Extraktionspuffer für die Dauer von 10 min bei 55°C äquilibriert. Der warme Puffer wird dann dem Myzelpulver zugesetzt, und die Suspension wird eine Minute lang mit einem Vortex-Mischer gründlich gemischt. Dann wird ein Milliliter Chloroform zugesetzt, und es wird 1 min lang gemischt.

Durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) wird die wäßrige Phase abgetrennt und ein weiteres Mal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) und anschließend zweimal mit Chloroform extrahiert.

Die wäßrige Phase enthält sowohl RNA als auch DNA. Die DNA wird bei Zimmertemperatur mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) aufgefangen, zweimal durch Auflösen in destilliertem, sterilen Wasser und erneutes Ausfällen mit Ethanol gewaschen. Die RNA wird durch den Zusatz von RNase A (20 цд/ті) zur Endlösung entfernt. Das Verfahren ergibt hochmolekulargewichtige DNA (100 bis 200kbp) in einer Ausbeute von etwa ЗООрд DNA/g Myzel, die weiter gereinigt wird durch CsCI/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation, wie das im wesentlichen von Maniatis u.a., S.93; Lit. 5, beschrieben wurde.

Verdauungen von Chromosomal-DNA (2цд) werden durch Inkubation bei 37°C mit EchoRI für pelA-(pGW820) und pelC-(pGW 850) Transformanten, Hindlll für pelB-(pGW 830) Transformanten und EcoRl oder BgIII für pelD-Transformanten über die Dauer von 2 Stunden hergestellt. In allen Fällen werden anfangs 20 Einheiten Restriktionsenzym verwendet, anschließend wird die Inkubation durch den Zusatz von erneut 20 Einheiten Restriktionsenzymen um weitere 2 Stunden verlängert. Die Verdauungen werden in den geeigneten Reaktionspuffern ausgeführt, die von BRL geliefert werden.

Dann wird die DNA auf 0,6% Agarose fraktioniert, auf Nitrozellulose übertragen und im wesentlichen so hybridisiert, wie das von Maniatis u.a. (Lit.5), S.382-386 beschrieben wurde, wozu die entsprechend la-³²P)-markierten Sonden eingesetzt werden.

Es werden folgende Kotransformationshäufigkeiten gefunden: pGW820(pelA) 70%; pGW830(pelB) 70%; pGW840(pelD) 15%; pGW850(pelC)60%.

Das Massenverhältnis von pGW 613 zum kotransformierenden Plasmid pGW820, pGW830, pGW950 (1:10) und pGW840 (1:3) führt in der Mehrzahl der beobachteten Fälle zur Mehrfachkopie der chromosomalen Integration von kotransformierenden Plasmiden.

Beispiel 5.3

Genomische Analyse des pelA-transf ormierten A. niger-Stammes A15

Eine Reihe der Mehrfachkopietransformanten, die in Beispiel 5.2 beschrieben worden sind, wurde analysiert, und die Analyse des pelA-Transformanten A15 wird als ausführliches Beispiel gegeben.

DNA des A. niger-Stammes N 593 und des mehrfachkopietransformierten pelA-Stammes Al 5 werden isoliert und durch Hybridisierung von Southern Transfers analysiert, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde. Als pelA-Sonde wird das 7,5 kbp-EcoRI-Fragment verwendet (siehe Abb. 3 a). In der genomischen Übertragung findet man ein intensives Band von 7,4kbp im transformierten Stamm A15, das aus Integrationsereignissen vom Typ I und/oder Typ Il resultiert (siehe Hinnen u.a.; Lit. 14a). Es werden auch einige kleinere Bänder von unterschiedlicher Länge gefunden, die Genzfragmente von Integrationsereignissen Typ Il von Umstellungen darstellen.

Die optischen Dichten der 7,4kbp-EcoRI-Bänder in den A. niger-pelA-Transformanten A15 und den A. niger N593-Autoradiogrammen werden unter Verwendung eines Geräts Ultroscan XL (LKB) abgetastet. Die Werte werden für geringe Unterschiede in der DNA-Konzentration zwischen N593 und dem Transformanten A15 durch Abtasten der ermittelten Dichten mit einer zweiten Sonde korrigiert, welche mit dem Pyruvatkinasegen hybridisiert, das als Einzelkopie in beiden Stämmen vorhanden ist. Aus diesen Daten wird berechnet, daß im pelA-Transformanten von A15 etwa 19 intakte Kopien des pelA-Gens vorhanden sind.

Unter Verwendung des Hindlll-Inserts von pGW830 (Abb. 3b) als Sonde, zeigt die Analyse des Southern-Transfer des transformierten Stammes A15, daß die Integration der pelA-Sequenzen nicht an der pelB-Stelle erfolgt ist. Ebenso ergibt die Analyse des transformierten pelB-Stammes B13, des pelC-Stammes C15 und des pelD-Stammes D12 mit entsprechenden, geeigneten Sonden Kopiezahlen von etwa 15,50 und 10.

Beispiel 5.4

Northern-Transfer-Analyse von induzierten und nichtinduzierten Myzelien des рѳІА-transformierten A. niger-Stammes A15 und von A. niger N400

Minimalmedium (250ml), das 5OmM Glukose oder 1 % Apfelpektin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, Bischofszeil) enthält, wird mit einer Sporendichte von 10^е Sporen/ml mit Sporen des Transformanten A15 oder Sporen des Wildtypstammes N400 inokuliert, und nach 30 Stunden Wachstum bei 30°C wird geerntet. Es werden auch Proben des Kulturmediums (2ml) aufgenommen, anhand von 211OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, bei 4⁰C dialysiert und bei —20°C aufbewahrt. Aus dem Myzel werden Nukleinsäuren isoliert, wie das im Beispiel 5.2 beschrieben wurde. Die RNA wird aus der wäßrigen Phase nach Chloroformextraktion durch den Zusatz von Vs Volumen von 8 M LiCI ausgefällt. Die RNA wird durch Zentrifugieren (300 U/min, 30 min) unter Verwendung einer Zentrifuge MSE Spuer-Mlnor aufgefangen und dann einmal mit kaltem (-20⁰C) 2 M LiCI und einmal mit kaltem (-20⁰C), 96%igen Ethanol gewaschen. Abschließend wird die RNA in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von etwa 1 mg/ml aufgelöst. Die Präparate sind im wesentlichen frei von DNA und ergeben eine Ausbeute von 1-2 mg RNA je Gramm Myzel. Mengen von etwa Юцд RNA werden behandelt nach Maniatis u.a., S. 202-203 (Lit. 5) auf denaturiertem Formaldehyd-1 %-Agarosegel unter Verwendung von Hindlll-verdauter Lambda-DNA oder der RNA-Leiter von BRL als Molekulargewicht-Marker. Die Gels werden übertragen und auf Nytran (Schleicher und Schuell) gebacken, wie das vom Hersteller empfohlen wird, und 16 Stunden lang bei 68 ⁰C mit der 7,4 kbp-EcoRI-pelA-DN Α-Sonde hybridisiert. Die Hybridisationsund Waschverfahren sind die gleichen wie bei der DNA-Hybridisation unter homologen Bedingungen nach Beispiel 3.2. Beide A. niger-Stämme erzeugen eine pektininduzierbare mRNA mit einer Länge von etwa 1,6kbp. Das Abtasten der optischen Dichte der beiden Autoradiogramme weist eine 15- bis 20fache Differenz in der Intensität zwischen dem A15-Transformanten und dem Wildtypstamm auf, was in Korrelation mit der Zunahme der Kopienzahl steht, die aus der Analyse des Southern-Transfer berechnet wurde.

Beispiel 5.5

Pektinylaseproduktion durch den transformierten A. niger-Stamm D12

Der A. niger-pelD-Transformant D12, der nach Beispiel 5.2 gewonnen wurde, wird in einem zweistufigen Kultivationsverfahren ähnlich dem Verfahren gezogen, das von Hermersdörfer u.a. (27) für die Produktion von Polygalakturonase beschrieben wurde. Oben auf einer flüssigen Kultur wird eine Myzelschicht gebildet durch Modulation von 10⁶ Sporen je Milliliter des

Vorkultivationsmediums (PCM), das aus Zuckerrübenbrei (4%) und NH₄NO₃ (1 %), pH-Wert 4,5, besteht. Nach einer Wachstumsperiode von 5 Tagen bei 30⁰C wird das in 30ml Medium gezogene Myzel mit Salzlösung gewaschen und auf 50ml Hauptkultivationsmedium (MCM) übertragen. Diese Kultur wird bei 30°C in einem Orbitalschüttelapparat bei lOOU/min gezogen. Das Hauptkulturmedium ist je Liter Medium zusammengesetzt aus Glukose (5%), Pektin (d. e. 72,8%; 0,1 %), NH₄NO₃ (0,75%), KH₂PO₄ (0,5%), FeSO₄ · 7 H₂O (0,03%), MgSO₄ · 7 H₂O (0,03%), CaCO₃ (0,03%), NaNO₃ (0,03%), pH-Wert 4,5. Innerhalb von 24 Stunden werden zu unterschiedlichen Zeitintervallen Proben genommen und durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert. Die Expression von pelD ist bereits von 7 Stunden nach Kultivierungsbeginn maximal. Das Protein wandert identisch wie PLI, das als Referenz verwendet wurde.

Beispiel 5.6

Produktion von Pektinlyase A durch den transformierten A. niger-Stamm A15 und durch A. niger N400 Die dialysierten Kulturfiltrate (Beispiel 5.4) werden lyophiliert, in 0,2 ml destilliertem Wasser resuspergiert und einer SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese (10% Gel) nach Standardmethoden (Laemmli; Lit. 15) unterzogen. Die abgetrennten Proteine werden auf Nitrozellulose übertragen (Towbin u.a.; Lit. 16). Die Übertragungen werden fünf Stunden lang bei Zimmertemperatur mit 1 % BSA-Lösung in 1OmM Tris-HCI-Puffer, pH-Wert 7,5, mit 0,35 M NaCI gesättigt. Daran schließt sich eine sechszehnstündige Inkubation bei Zimmertemperatur mit polyklonalem Antikörper (0,1 %) an, gezogen anhand von zwei Pektinylasen, die nach van Houdehoven (1975) in 50ml des gleichen Puffers gereinigt wurden, der 15OmM NaCI, 0,5% BSam 1 % Triton X100,0,5% Deoxycholat und 0,1 % SDS enthält. Die Übertragungen werden dann fünfmal mit 200ml PBS gespült, bevor die Inkubation mit 30μΙ Ziegen-Antikaninchen-lgG-HRP (Sigma) als 2. Antikörper je 50ml erfolgt, und anschließend erneut 5mal mit PBS gewaschen. Abschließend werden die Übertragungen unter Verwendung von 4-Chloro-1-naphthol als Substrat gefärbt. Es werden 40 mg des Substrats in 0,5 ml 96%igem Ethanol aufgelöst und mit 100ml 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 30μΙ 30%igem Wasserstoffperoxid gemischt und dann den Übertragungen zugesetzt.

Beispiel 5.7

Screenen der pelA-transformierten Stämme durch Halobildung auf pektinhaltigen, festen Medien Conidia von pelA-transformierten Stämmen werden mit einer Sporendichte von etwa 40 Kolonien je Petrischale auf steriles Filterpapier (Schleicher und Schuell) inokuliert, das oben auf 1 %-agarverfestigtes Minimalmedium aufgebracht wird, welches 0,01 % Triton-X 100 und Apfelpektin (1 %, D.e. 72,8%, Obipektin) als Kohlenstoffquelle enthält. Die Inkubationszeit beträgt 72 Stunden bei 30 °C und ergibt einzelne Kolonien (2-4mm). Das Filterpapier wird auf eine andere sterile Petrischale übertragen, und das Medium in dieser Schale wird mit wenigstens 5 ml einer Ruthenium-Rot-Lösung (0,1 %) in destilliertem Wasser gefärbt, 2 Stunden inkubiert und dann mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um den nichtadsorbierten Farbstoff zu entfernen, gefolgt von im wesentlichen dem Verfahren, das von Ried und Collmer (Lit. 17) für Polygalakturonat beschrieben wurde, um die bakterielle Pektatlyaseenzymaktivität zu charakterisieren.

Transformanten mit einer Überproduktion an PL Α-Protein werden anhand einer Zunahme ds Halodurchmessers um die einzelnen Kolonien im Vergleich zum Parentalstamm N400 festgestellt.

Beispiel 6

Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase A (PLA) vom A. niger-pelA-Transformanten A15

Beispiel 6.1

Kulturbedingungen zur Herstellung von Pektinlyase A

Ein A. niger-pelA-Transformant A15, wie er im Beispiel 5 beschrieben wurde, wird auf Komplettmedium in Petrischalen für die Dauer von 3 Tagen bei 28⁰C gezogen, um Conidia zu produzieren. Die Conidia werden von diesen Platten durch Suspendieren der Sporen in 5 ml steriler Salzlösung, die 0,005 %Tween 80 enthält, geerntet. Die Suspension wird auf einem Griffin-Schüttelapparat 20 min stark gerührt. Minimalmedium (Lit. 21), das 1 % Apfelpektin (Brown Ribbon, d. e. 72,8%; Obipektin AG, Bischofzeil) enthält, wird mit einer Sporendichte von 10^e Sporen/ml unter Verwendung von 250ml Medium in 11-Erlenmeyerkolben, die silikonisiert sind, inokuliert. Das Myzel wird 40 Stunden lang bei 30⁰C auf einem Gallenkamp-Oribtalschüttelapparat bei 200U/min gezogen. Nach dem Kultivieren wird das Myzel durch Filtern über Miracloth unter Verwendung eines Bücher-Trichters entfernt. Das Kulturfiltrat (Lit. 21) wird mit destilliertem Wasser verdünnt (Lit. 21), der pH-Wert des Filtrats (pH-Wert 3,7) wird unter Verwendung von 1 N NaOH auf 6,0 gebracht, anschließend wird erneut mit Filterpapier Whatman 1 gefiltert.

Beispiel 6.2 Reinigen der PLA

Das verdünnte Kulturfiltrat (4I) wird in eine Schnellflußkolonne DEAE-Sepharose (Pharmacia) (10cm x 2,6cm) gebracht, die mit 2OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, voräquilibriert wurde. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorbanz bei 280 nm einen Wert von 0,1 OD erreicht. Die Pektinylaseaktivität wird dann aus der Kolonne unter Anwendung eines linearen Gradienten eluiert, derr sich aus 2OmM Natriumphosphatpuffer (150ml) und 2OmM Natriumphosphatpuffer mit 1 M NaCI (150ml) zusammensetzt.

Die Fraktionen werden auf das Vorhandensein von aktiver Pektinylase nach dem Verfahren ü berprüft, das vonvanHoudenhoven (Lit. 18, S. 11) beschrieben wurde, wozu Pektin von Brown Ribbon (d.e. 72,8%) als Substrat verwendet wurde. Die Aktivität erscheint um eine Konzentration von 0,43M NaCI im Salzgradienten. Die aktiven Fraktionen werden dann zusammengefaßt und zweimal anhand von 112OmM Piperazin-HCI-Puffer, pH-Wert 5,5, dialysiert (Probengröße 45,5ml). Im nächsten Schritt wird die dialysierte Probe in 3 Portionen von gleicher Größe unterteilt, die einer anionischen Austauschchromatografie in drei getrennten Durchgängen unter Verwendung einer Standardkolonne MONO Q von Pharmacia in Verbindung mit dem FPLC-System von Pharmacia unterzogen werden. Die Kolonne wird mit 2OmM Piperazin-HCI-Puffer, pH-Wert 5,5, voräquilibriert. Nach der Einführung der Enzymprobe wird die Kolonne mit dem gleichen Puffer bei einer Flußrate von 1 ml/min eluiert, bis erneut die Grundlinienabsorbanz erreicht ist. Dann wird ein linearer Salzgradient angelegt. Im Rahmen von 22 ml des der Kolonnen zugeführten Eluierungspuffers wird eine Endkonzentration von 0,6M NaCI erreicht.

Die aktiven Fraktionen (4,4ml) werden aufgefangen, unter Verwendung des Äquilibrationspuffers auf 25ml verdünnt, und es wird dasselbe Chromatographieverfahren wiederholt. Zwei Fraktionen, die das aktive Enzym enthalten (Gesamtvolumen 3ml) werden dann anhand von 25mM Piperazin-Puffer, pH-Wert 5,0, dialysiert und in 1-ml-Portionen auf eine Kolonne MONO P (Pharmacia) gespritzt, die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert wurde. Nach den Injektionen wird unter Verwendung einer 5%igen Lösung von Polypuffer TM 74 (in destilliertem Wasser, das unter Verwendung von 4 N HCI auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht wurde) ein pH-Wert-Gradient geschaffen. Das aktive Enzym (3,2 ml) tritt um einen pH-Wert von 3,2 auf. Das Präparat wird extensiv anhand von 5OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, dialysiert und bei -20⁰C aufgehoben. Die Reinigungsergebnisse werden in der Tabelle VlI a zusammengefaßt und mit den Daten einer ähnlichen Reinigung von Pektinlyase, die durch den A. niger-Stamm N400 produziert wurde, verglichen (Tabelle VII b).

Tabelle VII a und VIIb

Reinigungsschema für Pektinlyase A aus dem A. niger-pelA-Transformanten N 593 und für Pektinlyase aus dem A. niger-Stamm

Vila Schritt	Volumen ml	Gesamtakti vität (I. U.)	Spezifische Pek- tinlyaseaktivität (I. U./mg Protein)
DEAE-Sepharose MONOQ-Chromatografie(2x) MONOP-Chromatogr. VIIb Wildtyp Schritt	45,5 2,3 3,2 Volumen ml	39,8 19,9 17,4 Gesamtakti vität (I. U.)	4,9 18,4 28,6 Spezifische Pek- tinlyaseaktivität (I. U./mg Protein)
DEAE-Sepharose MONOQ-Chromatografie(2x) MONO P-Chromatogr.	43,0 1,1 1.4	10,1 2,5 1,7	0,9 6,3 10,0

Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des BCA-Proteinprobereagens (Pierce) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Die Gesamtaktivität von A. niger N 593, transformiert mit pGW820 hat im Vergleich zur Gesamtaktivität des Wildtyps nach der Reinigung etwa um das Zehnfache zugenommen, die spezifische Aktivität etwa das Dreifache.

Beispiel 6.3

Bestimmung der Aminosäurenfolgen des N-Terminalteils von Pektinlyase A Es werden 500 pg Pektinlyase (PLA), die nach Beispiel 6.2 gereinigt wurden, dreimal anhand von 11 destilliertem Wasser, das durch Millipore gefiltert wurde, dialysiert und lyophiliert. Die Aminosäurefolgen werden mit einem Proteinsequenziergerät von Applied Biosystems, Modell 470A, das direkt mit einem 120 A-PTH-Analysegerät verbunden ist, nach dervonHunkapiller(Lit. 17) beschriebenen Methode bestimmt

Für das Enzym wird folgende N-Terminalaminosäurefolge bestimmt:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLY-PHE-ALA-GLU-T-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA.

Die so bestimmte Aminosäurefolge entspricht genau der auf der Grundlage der Nukleotidfolge des pelA-Gens (siehe Beispiel 4.2).

Beispiel 6.4

Eigenschaften der Pektinlyase A

Der A. niger-Stamm N400 und der pelA-Transformant A15 werden wie im Beispiel 6.1 kultiviert, und das Enzym wird aus dem Kulturfiltrat nach dem Verfahren in Beispiel 6.2 gereinigt. Die so gewonnenen zwei Enzympräparate werden mit Pektinlyase Il verglichen, die nach van Houdenhoven (Lit. 18) gereinigt wurde.

SDS-Polyakrylamid-Gel-Efektrophorese unter Verwendung von 10%igem Gel ergibt ein einziges Band mit identischem Molekulargewicht in allen drei Fällen wenn in jedem Fall 2 bis 5цд Protein eingesetzt werden.

Unter Anwendung von Standardverfahren (siehe z. B. Anweisungsblatt von Pharmacia, Isoelectric Focussing, 1982) wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Es wurden ein Gerät FSBE-3000 und die entsprechende Stromversorgung ECPS 3000/ 150 (Pharmacia) eingesetzt. Die gewonnene PLA ist nach dem isoelektrischen Fokussieren homogen und hat einen niedrigeren isoelektrischen Punkt (O,2pH-Einheiten) als PLII, der nach van Houdenhoven (Lit. 18) mit 3,75 angegeben wird. Die aus dem N400-Filtrat gereinigte PLII ist nach dem isoelektrischen Fokussieren heterogen. Das Hauptband stimmt in der Position mit PLA-Protein überein. Zwei kleinere Bänder sind geringfügig nach der Kathode verschoben. Folglich fehlen beim A. niger-Mehrfachkopietransformanten A15 die kleineren Enzymformen, die bei N 400 sichtbar sind.

Ein direkter Vergleich der kinetischen Parameter von PLA und PLH, die im letzteren Fall von van Houdenhoven (Lit. 18) ermittelt wurden, unter Verwendung von 95%igem veresterten Apfelpektin als Substrat, zeigt identische K_n,- und V_max-Werte für beide Enzyme.

Beispiel 7 Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase D (PLO) aus dem A. niger-pelD-Transformanten 012 Beispiel 7.1 Kulturbedingungen für die Herstellung von Pektinlyase O

Der A. niger-pelD-Transformant D12, der nach Beispiel 5.2 gewonnen wurde, wird anfangs nach Beispiel 5.5 in Aliquoten von 300ml gezogen. Nach einer Wachstumsperiode von 5 Tagen in PCM bei 30⁰C wird die Myzelmatte auf 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,1 M Natriumchlorid enthält, übertragen. Durch Schütteln des Myzels in 150ml auf einem Orbitalschüttelapparat mit 200U/min für die Dauer von 2 Stunden wird der größte Teil der Pektinlyase in das Medium freigesetzt.

Beispiel 7.2 Reinigung von PLD

Nach der Entfernung des Myzels durch Filtern wird die Enzymlösung einer DEAE-Sepharose-Schnellflußkolonne (Pharmacia) (25cm x 1,25cm) zugeführt, die mit 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,2 M Natriumchlorid enthält, voräquilibriert war. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorbanz bei 280 nm einen Wert von < 0,1 erreicht. Die Pektinlyaseaktivität wird aus der Kolonne durch Anwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0,2 bis 0,7M) in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) (800ml Gesamtvolumen) eluiert. Die Fraktionen werden nach dem Vorhandensein von Pektinlyase D durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese und Western-Transfer (Towbin u. a., Lit. 16) screeniert, wie das im Beispiel 5.6 beschrieben wurde. Die Fraktionen, die Pektinlyase D enthalten, werden zusammengefaßt und dialysiert anhand von 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,15M Natriumchlorid enthält, und einer Anionenaustauschchromatografie unter Verwendung einer Standard-ΜΟΝΟ Q-Kolonne von Pharmacia in Verbindung mit FPLC-System unterzogen. Nach der Beschickung wird die Kolonne mit dem gleichen Puffer gewaschen, bevor ein linearer Nariumchloridgradient zu 50ml in 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) angewendet wird. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen, und Aliquote zu 1 ml werden einer Superose-12-Gel-Permeationskolonne zu 100 ml zugeführt, die in 20 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,0) äquilibriert wurde, das 0,2M Natriumchlorid enthält, und mit dem FPLC-System verbunden. Aktive Enzymfraktionen (jeweils 1 ml), die von der GPC-Kolonne gewonnen wurden, werden durch SDS-Polyakrylamid-GelElektrophorese analysiert, um die Reinheit der gewonnenen Pektinlyase zu überprüfen.

Tabelle VIII Reinigungsschema von Pektinlyase D aus dem A. niger-pelD-Transformanten D12

Schritt Volumen Aktivität Spezifische Pektin-

(ml) (I.U.) lyaseaktivität

(I. U./mg Protein)

Kulturfiltrat 1950 109 0,096

DEAE-Sepharose FF 103 32,2 5,65

MONO Q und GPC 14,5 10,4 7,5

Beispiel 7.3 Bestimmung der Aminosäurenfolge des N-Terminalteils von Pektinlyase D

Es werden 500 цд Pektinlyase D, gereinigt nach Beispiel 6.2, dreimal anhand von destilliertem Wasser, 11, gefiltert durch Millipore, gereinigt und lyophiliert. Die Aminosäurefolgen werden mit einem Proteinsequenziergerät Applied Biosystems Modell 470A bestimmt, das direkt mit einem Analysegerät 120A PTH verbunden wurde, dabei wurde die von Hunkapillar (Lit. 19) beschriebene Methode angewendet

Für das Enzym wird folgende N-Terminalaminosäurefolge bestimmt:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PHE-ALA-SER-SER-ALA-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA-THR

Die bestimmte Aminosäurefolge stimmt genau mit der auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des pelD-Gens überein.

Beispiel 8 Isolierung, Reinigung und Charakterisisierung von Pektinlyase B (PLB) aus dem A. niger-Trartsformanten B13 Beispiel 8.1 Kulturbedingungen für die Herstellung von Pektinlyase B

Der A. niger-pelB-Transformant B13, der nach Beispiel 5.2 gewonnen wurde, wird nach Beispiel 5.3 auf seinen Mehrfachkopiecharakter analysiert. Die Northern-Transfer-Analyse nach dem im Beispiel 5.4 beschriebenen Verfahren zeigt, daß eine pektininduzierbare mRNA mit einer Länge von etwa 1,6kb hergestellt wird. Nach einem Wachstum über 35 Stunden bei 30°C in einem Minimalmedium, das 1 %Zitruspektin (d.e. 72,8%) und 1 % Weizenkleieenthält, wird das Enzym wie im Beispiel 5.4 produziert. Das Enzym wird auch unter Verwendung eines Mediums erzeugt, das aus 4% Zuckerrübenbrei und 1 % NH₄HO₃ besteht.

Beispiel 8.2 Reinigung der PLB

Das Kulturfiltrat wird zweifach mit destilliertem Wasser verdünnt, und der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 6,0 gebracht, anschließend wird mit Filterpapier Whatman 1 erneut gefiltert. Das verdünnte Filtrat (21) wird dann einer DEAE-Sepharose-Schnellflußkolonne (Pharmacia) (9cm x 3,2cm) zugeführt, die mit 5OmM Natriumazetatpuffer, pH-Wert 5,0,

voräquilibriert wurde. Ein Teil der Pektinlyaseaktivität ist im Eluat vorhanden, wie durch das Verfahren gezeigt werden kann, das von van Houdenhoven (Lit. 18, S. 11) beschrieben wurde, dabei wird Brown-Ribbon-Pektin (d.e. 72,8%) oder stark verestertes Pektin (d.e. 94%) eingesetzt. Die Mehrheit der Pektinlyaseaktivität kann durch Zuführung eines Salzgradienten eluiert werden. Diese Aktivität erscheint im Salzgradienten, und es wird festgestellt, daß sie mit PLA auf der Grundlage des Eluierungsverhaltens und des scheinbaren Molekulargewichts bei SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese identisch ist, wie das im Beispiel 6 beschrieben wurde.

Das Eluat aus der DEAE-Schnellflußkolonne wird anhand destillierten Wassers dialysiert und einer Kolonne MONO S (Pharmacia) zugeführt, die vorher mit einem 2OmM Natriumazetatpuffer, pH-Wert 4,5, äquilibriert wurde. Das Enzym wird aus der Kolonne durch Einsatz eines Natriumchlorid-Salzgradienten von 0-1,0M in dem gleichen Puffer eluiert. Das Enzym wird beinahe sofort aus der Kolonne eluiert. Die aktiven Fraktionen werden zusammengefaßt und dann mit destilliertem Wasser etwa vierfach verdünnt. Die Rechromatografie der Enzymlösung ergibt Fraktionen, die auf der Grundlage der SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese das reine PLB-Protein enthalten.

Beispiel 8.3

Eigenschaften von Pektinlyase B

Die Eigenschaften des Enzyms, das nach Beispiel 8.2 aus dem pelB-Transformanten B13 gereinigt wurde, werden bestimmt und mit denen der Pektinlyase A und D verglichen.

SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von 10% Gelen führt zu einem einzelnen Band mit einer scheinbaren Molekularmasse von 39,7 kDa. Unter den gleichen Bedingungen ist die scheinbare Molekularmasse von PLA und PLD 49,1 kDa bzw. 52,3 kDa.

Die isoelektrische Fokussierung wird so durchgeführt, wie das im Beispiel 6.4 beschrieben wurde. Der isoelektrische Punkt von PLB ist 6,0, wenn mit einem pH-Wert-Gradienten zwischen pH-Werten von 3 und 7 gearbeitet wird. Die Probe wird etwa in einer Position zugeführt, die einem pl von 5,0 entspricht.

Das gereinigte Enzym PLB ist auch mit polyklonalen Antikörpern reaktiv, die anhand von PLI und PLII hergestellt wurden, wie durch die Western-Transfer-Analyse geprüft wurde. PLD, A und B können auf diese Weise leicht anhand der Werte ihrer scheinbaren Molekularmasse unterschieden werden.

Beispiel 8.4

Kinetische Eigenschaften von PLB

Das nach Beispiel 8.2 gereinigte Enzym wird kinetisch charakterisiert. Das Enzym katalysiert eine Pektinlyasereaktion und ist über einem breiten Bereich von pH-Werten (pH-Wert 5-9,5) aktiv, wie in einem Mcllvaine-Puffer (μ = 0,5) mit unterschiedlichen pH-Werten getestet wurde (van Houdenhoven; Lit. 18). Das pH-Wert-Optimum ist breit (pH-Wert 7,5-8,5). Bei einem pH-Wert von 6,0 beträgt die Aktivität etwa 55%; bei einem pH-Wert von 9,5 beträgt sie immer noch 85% der Aktivität bei einem pH-Wert von 8,0. Sowohl stark verestertes Pektin (d.e. [= Veresterungsgrad] = 94%) als auch Pektine mit einem niedrigeren Veresterungsgrad, wie Brown Ribbon-Apfelpektin (d.e. 72,8%; Obipektin AG, Bischoffzeil), können als Substrat verwendet werden. Die höchste Aktivität erreicht man jedoch mit stark verestertem Pektin. Das Enzym reagiert nicht mit Polygalakturomat. Die Pektinlyasereaktion, die durch PLB katalysiert wird, kann durch den Zusatz von EDTA zum Reaictionsgemisch (es wird mit einer Endkonzentration von 3mM gearbeitet) unterbunden werden; reaktiviert wird das Enzym durch den Zusatz eines Überschusses an Ca²⁺-lonen. Also codiert pelB eine Ca²⁺-abhängige Pektinlyase. Bei 25°C hat das Enzym eine angenäherte Umschlagzahl von 6500 und einen K_m-Wert von 2,5 mM, wenn stark verestertes Pektin als Substrat eingesetzt wird. Diese Werte werden nach dem Verfahren von van Houdenhoven (Lit. 18) unter Einsatz eines Mcllvaine-Puffers, pH-Wert 8,0 (μ = 0,5), bestimmt.

Beispiel 9 Expression und Sekretion von Fremdgenen unter der Kontrolle des pelA-Promotors

Das 3,9kb-Hindlll-Fragment von Plasmid pGW 820 wird in die Hindlll-Stelle von pBR 322 subkloniert. Die Plasmid-DNA von ampizillinresistenten Transformanten wird durch Hindlll- und Sall-Restriktionsverdauungen analysiert. Ein Klon, der das pelA-Insert in Uhrzeigerorientierung enthält, wird als pGW822 bezeichnet. Der induzierbare Promotor von pelA wird dazu genutzt, in A. niger Fremdgene zu expressieren. Auf Plasmid pGW822 ist das vollständige pelA-Gen vorhanden. Der Promotor und die pelA-Signalsequenz befinden sich auf einem 1 kb-BamHI-Pstl-Fragment. Die Pstl-Schneidestelle in der Nukleotidposition 1420 (Abb. 10) fällt mit dem З'-Ende der Signalsequenz zusammen und kann für die Rahmenfusion an die Codierungssequenz eines Fremdgens genutzt werden. Die Transkriptionterminationssignale von pelA befinden sich auf einem 1,3 kb-Sall-Hindlll-Fragment.

Beispiel 9.1

Subklonieren des pelA-Gens in den Vektor pUC19

Das 3,3 kb-BamHI-Hindlll-Fragment von Plasmid pGW322 enthält das pelA-Gen. Das Fragment wird in den Vektor pUC 19 (Pharmacia) kloniert, der mit BamHI und Hindlll geschnitten wurde. Die gereinigten Fragmente werden ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird dazu verwendet, Ca²~-behandelte, kompetente JM 109-Zellen zu behandeln. Die erfolgreiche Klonierung des 3,3kb-BamHI-Hindlll-Fragmentes in pUC19 wird nachwahl auf Ampizillinplatten bei Vorhandensein von X-GaI und IPTG vorgenommen (T.Maniatis u.a., in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Molekularklonierung, ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S.52). Weiße, ampizillinresistenteTransformanten werden herausgegriffen. Die Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamHI/Hindlll-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit einer korrekten Einfügung wird als pUC19/pelA bezeichnet. Eine analoge Konstruktion mit pUC 18 ergibt pUC18/pelA.

Beispiel 9.2

Expression von Humanhybridinterferon-BDBB unter der Kontrolle des pelA-Promotors 9.2.1: Konstruktion des Plasmids pUC 19/pelA-IFN AM 119 (siehe Abb. 14)

Plasmid риСІЭ/реІА wird mit Sail verdaut. Die kohäsiven Enden des linearen Fragments werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) bei Vorhandensein von jeweils 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP. dTTP, 6OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 1OmM MgCI₂ über die Dauer von 30 min bei Zimmertemperatur gefüllt Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA auf eine Endkonzentration von 12,5 mM gestoppt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt. Das lineare Fragment wird mit Pstl verdaut. Nach der Phenol/Chloroform-Extraktion wird die DNA mit Ethanol ausgefällt.

Ein Oligodesoxynukleotid-Linker mit der Formel

Pstl ^DdeI

(I) 5'- TGTGATCTGCC -3'

(II) З'-ACGTACACTAGACGGAGT -5'

wird in die Pstl-Stelle des linearisierten Plasmids ligiert. Der Linker füllt das 3'-rezessierte Ende der Pstl-Stelle, die mit dem Ende der pelA-Signalsequenz zusammenfällt, und gewährleistet die Im-Rahmen-Fusion an die Codierungssequenz von Interferon-BDBB. (I) stellt die 5'-Terminalnukleotidsequenz des Interferon-BDBB-Gens bis zur Ddel-Restriktionsstelle dar.

Es werden jeweils 20OpMoI der Oligonukleotide (I) und (II) phosphoryliert und hybridisiert. Das Pstl-geschnittene pUC 19/PeIA-Plasmid und ein einhundertfacher Molüberschuß der doppelsträngigen Linker-DNA werden in 6OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 1OmM MgCI₂,1 mM ATP, 5mM DTT und 400 Einheiten T4-DNA-Ligase über 16 Stunden bei 15°C ligiert. Die DNA-Ligase wird über 10min bei 85°C inaktiviert. Die überschüssigen Linker werden durch Ausfällung bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, 30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt.

Das große 5 kb-Fragment wird auf einem 0,6%igen präparativen Agarosegel isoliert. Das Fragment enthält den pelA-Promotor und die Signalsequenz (BamHI[Pstl]/Linker) und den pelA-Terminator ((Salllglatt-Hindlll) im Vektor pUC 19.

Das Plasmid pJDB207/PH05-IFN AM 119 (EP 205404) enthält das Gen für Hybrid-a-lnterferon-BDBB unter der Kontrolle des regulierten Promotors der Hefesäurephosphatase (PHO5). Die Plasmid-DNA wird mit BamHI und Hindill verdaut. Das 1,3kb-BamHI-Hindlll-Fragment wird isoliert, welches den PHO 5-Promotor, die Codierungssequenz von IFN BDBB und die PHO 5-Transkriptionsterminationssequenzen enthält. Das Fragment wird durch DE 52-Chromatografie und Ethanolausfällung gereinigt und weiter mit Taql verdaut. Die kohäsiven Enden der Taql-Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) bei Vorhandensein von 0,1 mM von jeweils dCTP und dGTP, 6OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ für die Dauer von 30 min bei Zimmertemperatur gefüllt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 12,5mM gestoppt. Die DNA-Fragmente werden mit Ethanol ausgefällt und weiter mit DdeI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 0,8%igen präparativen Agarosegel getrennt. Das 549bp-Ddel-[Taql]-glatte Fragment wird aus dem Gel elektroeluiert, durch DE 52-lonenaustauschchromatografie gereinigt und mit Ethanol ausgefällt. Das DNA-Fragment wird in H₂O mit einer Konzentration von etwa 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht.

Es werden 0,2pMol des 549bp-Ddel-[Taql]-glatten Fragmentes und 0,1 pMol des 5kb-Vektorfragmentes in 10μΙ von 6OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,3,5mM ATP, 5mM DTT und 200 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs) über 16 Stunden bei 15°C ligiert. Eine Menge von 1 μΙ des Ligationsgemischs wird zur Transformation von Ca²⁺-behandelten, kompetenten HB 101-Zellen verwendet.

Plasmid-DNA wird aus 12 ampizillinresistenten, transformierten Kolonien hergestellt und durch EcoRI-, Pvull-, CIaI- und EcoRI/ Hindlll-Verdauung analysiert. Es wird ein Klon mit dem erwarteten Restriktionsmuster ausgewählt. Die korrekte In-Rahmen-Fusion der peA-Signalsequenz und der reifen Codierungssequenz von Interferon-BDBB wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Plasmid-DNA des ausgewählten Klons wird als pUC 19/pelA-IFN AM 119 bezeichnet.

Eine analoge Konstruktion mit pUC18/pelA ergibt das Plasmid pUC18/pelA-IFN AM 119.

Beispiel 9.2.2

Kotransformation des Aspergillus niger-Mutanten An 8 mitpCG59D7 und риСІЭ/pelA-IFN AM 119 Der uridinauxotrophe Mutant AN 8 {й DSM 3917, offengelegt in EP88101397.3) wird mit Plasmid pCG 59 D7 transformiert, um Uridinprototrophe zu ergeben. Zusammen mit dem transformierenden Plasmid wird das nichtselektive Plasmid pUC 19/pelA-IFN AM 119 zugesetzt, um bei Kotransformation zufällige Kointegranten zu ergeben.

Conidialsporen von A. niger An 8 werden 4 Tage lang bei 28°C bis zur vollständigen Sporenbildung in einem Komplettmedium gezogen. Es werden 2 χ 10⁸Conidiosporen eingesetzt, um 200 ml Minimalmedium, das mit 1 g/l Arginin und Uridin ergänzt wurde, zu inokulieren.

Nach 20 Stunden Wachstum bei 28⁰C und 180U/min wird das Myzel durch Filtern durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen und wieder zur Suspension gebracht in 20ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂,0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Das Gemisch wird in einem Rüttet-Wasserbad (30⁰C, 50U/min) inkubiert, bis mikroskopisch eine maximale Protoplastenfreisetzung festgestellt werden kann (90-120min). Die Protoplastsuspension wird durch einen Glaswollstöpsel in einem Trichter gefiltert, um Myzeltrümmer zu entfernen. Die Protoplaste werden durch sanftes Zentrifugieren (10min, 2000U/min) bei Zimmertemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂gewaschen. Abschließend werden die Protoplaste in 200 bis 500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ wieder zur Suspension gebracht, wobei eine Konzentration von 1 χ 10⁸/ml erreicht wird. ZurTransformation wird ein Aliquot von 200 μΙ der Protoplastdispersion mit 5MgpCG59D7 und 10μgpUC19/pelA-IFN AM 119-DNA, 50μΙ PCT (1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI₂,25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird 20min auf Eis gehalten, es werden weitere 2ml PCTzugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5min bei Zimmertemperatur inkubiert. Es werden 4ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI₂ zugesetzt, und Aliquote zu 1 ml der abschließenden Transformationslösung werden mit lignifiziertem Minimal-Agar-Medium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10g/l Bacto-Agar [Difco]), stabilisiert mit 0,8M KCI, gemischt. Das Gemisch wird sofort auf Agar-Platten mit dem gleichen Medium gegossen und bei 28°C inkubiert

Nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 28°C erscheinen stabile Transformanten als kräftig wachsende und sporenbildende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abortiven Transformanten.

Beispiel 9.2.3

Expression des Hybrid-Interferon-BDBB-Gens unter der Kontrolle des pelA-Promotors Es werden 37 Transformanten des Kotransformationsexperimentes (Beispiel 9.2.2) herausgenommen und auf Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird nach dem Verfahren von Armstrong {J.A.Armstrong, Appl. Microbio. 21,732 [1971]) unter Verwendung von menschlichen CCL-23-Zellen und des vesikularen Stomatitisvirus (VSV als Herausforderungsvirus durchgeführt.

Conidialsporen von Transformanten werden einzeln in 50ml eines Vorkulturmedium vorkultiviert (Pectin Slow Set I [Unipectin, SA, Redon, Frankreich], 3g/l, NH₄CI, 2g/l, KH₂PO₄,0,5g/l, NaCI, 0,5g/l, Mg₂SO₄ · 7 H₂O, 0,5g/l, Ca₂SO₄ · 2 H₂0,0,5g/l, pH-Wert 7,0). Die Vorkultur wird 72 Stunden lang bei 250U/min und 28°C inkubiert. Es werden 10% der Vorkultur dazu genutzt, 50ml des Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl, 20g/l, Pectin Slow Set, 5g/l) zu inokulieren. Die Kultur wird über 72 bis 96 Stunden bei 250U/min und 28°C gezogen.

Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschalldesintegration aufgebrochen. Die obenaufschwimmende Schicht und die Zellextrakte werden beide auf ihre Interferonaktivität untersucht, wie das beschrieben wurde (siehe oben). Es wird festgestellt, daß die Masse der Interferonaktivität in das Medium sekretiert wird.

Beispiel 10

Konstruktion von Plasmid M 13(+)KS/pelA_Ass-IFN AM 119

Die 2,8 kb-umfassende Expressionskassette von Plasmid M 13(+)KS/pelA_uss-IFN AM 119 beinhaltet den induzierbaren pelA-Promotor, die Codierungssequenz von Hybrid-Interferon-BDBB und den pelA-Transkriptionsterminator auf dem Bluescript-M13(+)KS-Vektor. Hybrid-Interferon-BDBB wird expressiert und befindet sich in der Wirtszelle. Plasmid M13(+)KS/pelA-_Ass-IFN AM 119 wird von pUC 18/pelA-IFN AM 119 (siehe Beispiel 9.2.1) abgeleitet. Die pelA-Signalsequenz (ss) wird durch seitlich gerichtete Mutagenese ausgeschaltet (siehe Abb. 15). Es wird erwartet, daß sich Hybrid-Interferon, das ohne Signalsequenz aus der Konstruktion expressiert wurde, im Zytosol befindet.

Beispiel 10.1

Subklonieren der pelA-IFN AM 119-Kassette in den Bluescript-M 13(+)KS-Vektor Plasmid pUC 18/pelA-IFN AM 119 (siehe Beispiel 9.2.1) wird mit BamHI und Hindill verdaut. Das 2,8kb-BamHI-Hindlll-Fragment enthält den pelA-Promotor, die Signalsequenz, die IFN-BDBB-Codierungssequenz und den pelA-Terminator. Das BamHI-Hindlll-Fragment wird isoliert und an den Bluescript-M 13(+)KS-Vektor (Stratagene), der mit BamHI und Hindill geschnitten wurde, ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wird zur Transformation von Ca²⁺-behandelten, kompetenten JM 109-Zellen verwendet. Das erfolgreiche Klonieren des 2,8 kb-BamHI-Hindll-Fragments in M 13(+)KS wird für Ampizillinplatten bei Vorhandensein von X-GaI und IPTG ausgewählt. Es werden 12 weiße, ampizillinresistente Kolonien aufgenommen. Die Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamHI/Bglll-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit dem korrekten Insert wird als M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119 bezeichnet.

Beispiel 10.2

Gewinnung von einzelsträngiger DNA aus Zellen, die das Bluescript M 13(+)KS-Plasmid enthalten Plasmid M13(+)KS/pelA-IFN AM 119 wird dazu genutzt, den kompetenten E. coli-Stamm CJ 236 zu transformieren (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ 105 (Cm'); BIO-RAD Muta-Gene M 13-In vitro-Mutagene-Satz). Dieser Stamm ermöglicht die Einbeziehung von Urazil in die DNA. CJ 236 wird in 10 ml LB-Medium gezogen, das 100mg/l Ampizillin enthält. Bei ODeoo von 0,5 werden die Zellen mit Phag M13KO7 (Mead u.a.; Lit 29) mit einer Infektionsmultiplizität von 50 überinfiziert. Nach einer Stunde bei 37⁰C wird Kanamyzin (50mg/l) zugesetzt, und die Kultur wird bei 37°C 5 bis 6 Stunden lang auf einem Schüttelapparat inkubiert. Der nichtcodierende Strang in bezug auf das pelA-IFN AM 119-lnsert von Plasmid M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119 wird synthetisiert, verpackt und an das Medium freigesetzt. Aus der obenaufschwimmenden Schicht der Kultur wird einzelsträngige DNA nach Kunkel u.a. (Lit.30) hergestellt.

Beispiel 10.3

Seitlich gerichtete Oligonukleotidmutagenese an der einzelstringigen DNA-Matrize Eine seitlich gerichtete Deletionsmutagenese wird an der nichtcodierenden, einzelsträngigen pelA-IFN AM 119-Matrize durchgeführt, um die pelA-Signalsequenz herauszulösen (Abb. 15).

Der mutagene Starter besteht aus einem Teil der pelA-Promotorsequenz, einschließlich ATG (Nukleotidpositionen 1343 bis 1363 in der Abb. 10), und 21 Nukleotiden mit der Codierung für die Aminosäuren 1 bis 7 des reifen IFN-BDBB. Für die Mutagenese werden 20OpMoI des mutagenen Starters in 20μΙ von 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,10 mM MgCI₂,5mM DTT und 0,5 mM ATP unter Verwendung von 8 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase (Boehringer) phosphoyliert. Nach einer Stunde bei 37°C wird die Reaktion durch Erhitzen auf 65°C für die Dauer von 10min gestoppt.

Es werden 0,2 pMol der einzelsträngigen Matrize mit 10pMoI des phosphorylierten, mutagenen Oligodeoxyribonukleotidstarters und 1OpMoI des universellen Sequenzierungsstarter M13 in 30μΙ 2OmM Tris · HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5OmM NaCI, 1 mM DTT bei 80°C über 5 min inkubiert. Man läßt die Lösung langsam über eine Zeitspanne von 30 min auf Zimmertemperatur abkühlen; dem hybridisierten Gemisch werden 10 μΙ der Enzym-dNTP- (-dATP-, -dGTP-, -dCTP-, -dTTP-) Lösung zugesetzt, die 1 μΙ Puffer (0,2M Tris HCI, pH-Wert 7,5,0,1 M MgCI₂), 5μΙ 2mM dNTP-Gemisch, 0,5μΙ 2OmM ATP, 1 μΙ 0,2M DTT, 0,5μΙ T₄-DNA-Ligase (Biolabs, 400 Einheiten/μΙ) und 1,2μΙ Klenow-DNA-Polymerase (BRL, 5 Einheiten/μΙ) enthält. Das Gemisch wird bei 15⁰C 16 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65⁰C über die Dauer von 10 min gestoppt. Es werden 1 μΙ und 3μΙ des Ligationsgemisches zur Transformation von 0,2ml der kompetenten Zellen des Reparatur-Minus-Stammes E. coli MV 1190 UMIac-proAB), thi, supE, A(sr1-recA)306: :Tn10 (tef) (F': traD36, proAB, Iac Ι⁴ΖΔΜ15)] verwendet. Stamm MV1190 wird im Handbuch für den In-vitro-Mutagene-Satz BIO-RAD MUTA-GENE M13 beschrieben. Es werden 12 ampizillinresistente Kolonien aufgenommen. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch Seal-Verdauung analysiert. Das erfolgreiche Auslösen der pelA-Signalsequenz entfernt eine Seal-Stelle. Korrekte Plasmide werden an der Seal-Stelle im

Dep.-Nr.	Deponierungsdatum
DSM 4388	I.Februar 1988
DSM 4389	I.Februar 1988
DSM 4390	I.Februar 1988
DSM 4391	I.Februar 1988
DSM 4392	I.Februar 1988

Bluescript-Vektor linearisiert. Ein Plasmid wird weiter analysiert. Die korrekte Verbindung zwischen dem pelA-Promotor und der Codierungssequenz für Hybrid IFM BDBB mit ATG wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Eine korrekte Konstruktion wird als M 13(+)KS/pelAAss-IFN AM 119 bezeichnet.

Beispiel 10.4

Kotransformation von A. niger und Expression von Hybrid-Interferon

Die Plasmide M 13(+)KS/pelAAss-IFN AM 119 und pCG59D7 werden zur Kotransformation des A. niger-Mutanten An8 nach Beispiel 8.2.2 verwendet. DieTransformanten werden wie im Beispiel 8.2.3 kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschalldesintegration aufgebrochen. Die Zellextrakte werden auf Interferonaktivität getestet (siehe oben). Die Masse der Interferonaktivität wird intrazellulär gefunden.

Deponierung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden nach dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstr.8, D-3400 Göttingen, deponiert:

Mikroorganismen Escherichta coli HB101 /pGW 820 Escherichia coli HB 101/pGW 830 Escherichia coli HB101 /pGW 850 Escherichia coli HB 101/pGW860 Escherichia coli HB101/pGW 880

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Claims (6)

1. Methode zur Herstellung eines Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor, der eine DNA-Folge aufweist, die das Expressionssystem der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder deren Derivat codiert, in einem geeigneten Wirt expressiert wird.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor mit einem Strukturgen, das heterolog zu Aspergillus niger ist, in einem geeigneten Wirt expressiert wird.

3. Methode nach Anspruch 1 für die Überproduktion der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF in Aspergillus-Spezies, gekennzeichnet durch die Kultivierung eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybridvektor für die Expression dieser Pektinlyasen transformiert wurde.

4. Methode nach Anspruch 2 für die Produktion von Hybrid-Interferon-BDBB in Aspergillus-Spezies, gekennzeichnet durch die Kultivierung eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybridvektor für die Expression dieses Hybrid-Interferons transformiert wurde.

5. Verfahren für die Herstellung der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF in reiner Form.

6. Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF in reiner Form.