DD297416A5

DD297416A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden mit der faehigkeit, die cgmp-aktivitaet in der human-t-zellinie cem zu erhoehen und verwendung der peptide

Info

Publication number: DD297416A5
Application number: DD89333073A
Authority: DD
Inventors: George Heavner; Tapan Audhya; Gideon Goldstein
Original assignee: ��@��@��k��Kk��
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-28
Publication date: 1992-01-09
Also published as: FI902534A0; FI902534A7; EP0361977A3; HUT54710A; HU205143B; IE893110L; GR900300088T1; DE361977T1; HU896052D0; NZ230707A; EP0361977A2; JPH03502930A; BR8907105A; WO1990003180A1; CZ553289A3; AU4346489A; KR900701298A; PT91846A; CN1041366A; MX17750A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahen zur Herstellung von Peptiden mit der Faehigkeit, die cGMP-Aktivitaet in der Human-T-Zellinie CEM zu erhoehen, ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend die Peptide, und die Verwendung der Peptide zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.{Peptide-Herstellung; Pharmazeutika; Regulierung; Immunsystem; Mensch}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Im allgemeinen ein Verfahren zur Heutellung synthetischer Peptide, die in der Lage sind, die Suppressor-T-Zellen-Aktivität zu stimulieren. Insbesondere sind die erfindungsgemäß hergestellten Peptide Tetrapeptide, die am Carboxyterminus Amidsubstitutionen besitzen, die sich am Thymopoietinmolekül befinden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die immunmodulierenden Proteine Thymopoietin und Tysplenin (früher .Splenin") wurden aus Rinder- bzw. Humanthymus und Rinder- bzw. Humanmilz isoliert. Außerdem wurden kleine Peptide auf chemischem Wege synthetisiert, die die biologische Wirksamkeit von Thymopoietin und Thysplenin nachahmen, und sie wurden weiter modifiziert und mit zusätzlichen Eigenschaften wie Beständigkeit gegenüber Enzymreaktionen ausgestattet. Siehe z. B. US-Patent 4,505,853 und unsere gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung SN 196,138.

Eine große Menge an Artikeln und Patenten wurde jetzt veröffentlicht, die derartige Proteine und synthetisierte Peptide betreffen. US Patent Nr.4,190,646 offenbart das Pentapeptid Thymopentin, das die aktive Stelle von Thymopoietin ist und die Sequenz Arg-i ys-Asp-Val-Tyr besitzt, sowie Peptidzusammonsetzungen, bei denen an den Amino- und/oder Carboxytermini dieses Pentapeptids Substitutionen vorgenommen wurden/Sowohl Thymopoietin als auch Thymopentin induzieren biologische Veränderungen in zwei Human-T-Zellinien, CEM und MOLT-4, worin sich ihre Rolle bei der Stimulierung sowohl der Suppressorals auch der Helferaktivitäten dr; T-Zellen zeigt. Es wurden keine Anatoga von Thymopentin, die kürzer als Pentapeptide (eine Sequenz von 5 Aminosäuren) waren, mit einer Aktivität an den CEM-Zellen gefunden.

In der anhängigen US-Patentanmeldeseriennummer 53186 des Anmelders wird ein Immunomodulisrendes Protein aus 48 Aminosäuren, Splenin (im folgenden als „Thysplenin" bezeichnet), das aus Humanmilz isoliert wurde, offenbart. Die aktive Stelle von Rinder-Thysplenin, als SP-5 bezeichnet, die dessen Aminosäurereste 32-36 umfaßt und die Sequenz Arg-Lys-Glu-Val-Tyr aufweist, stimuliert die T-Zellen-Helferaktivität in vivo in Mäusen. Es wird demzufolge erwartet, daß Human-Thysplenin eine analoge biologische Aktivität beim Menschen ausübt. Human-Thysplenin wurde in der oben angegebenen Anmeldung so beschrieben, daß es die Elevation von intrazellulärem cGMP in der Human-T-Zellinie MOLT-4 induziert. In der Anmeldung SN 56186 wurde die aktive Stelle der Human-Sequenz als Arg-Lys-Ala-Val-Tyr offenbart.

Thysplenin erzeugt irr Gegensatz zu Thymopoietin keine Veränderungen in der biologischen Aktivität von CEM-Zellen. Damit ist Thysplenin an der Stimulierung der T-Zellen-Helferaktivität, nicht aber an der T-Zellen-Suppressoraktivität beteiligt. Siehe auch die US-Patente 4,190,646; 4,261,886; 4,361,673; 4,420,424 und 4,629,723. Für eine Diskussion von weiterem Hintergrundmaterial und der entsprechenden biologischen Prozesse der vorliegenden Erfindung wird auf die oben beschriebenen Patente, Anmeldungen und Artikel Bezug genommen.

In US-Patent Nr. 4,428,938, ausgegeben am 31. Januar 1984 von Kisfaludy u. a. wurden bestimmte, die Immunregulierung beeinflussenden Peptido, offenbart. Zu diesen Peptiden gehören die folgenden Tetrapeptide:

Arg-Lys-Asp-Val

Arg-Lys-Asn-Val

Arg-Lys-Ala-Val

Arg-Lys-Asp-Ala

Arg-Lys-Asp-Ile

Arg-Lys-Glu-Val

Glp-Arg-Lys-Asp

Das US-Patent Nr.4,428,938 gibt allgemein an, daß die Salze, Amide, niederen Alkylester und geschützten Derivate dieser Sequenzen ebenfalls in der Lage sind, die Immunregulation zu beeinflussen. Es wurde jedoch kein spezielles Amid dieser Sequenzen mit einer spezifischen Aktivität dabei identifiziert. Es werden auch Methoden zur Verwendung dieser Sequenzen bei der Behandlung von immunologischen Störungen infolge von Schwächen der Thymusdrüsen diskutiert. In diesem Patent wurden die Peptide auf ihre Aktivität in einem In- vllro-E-Rosettentest geprüft.

In der gleichzeitig anhängigen US· Anmeldung SN 196,138 des Anmelders wird eine Reihe von Thyspleninpeptidanaloga offenbart, die in der T-Zellinie MOLT-4 eine biologische Aktivität induzieren können. Im Gegensatz zu den früher mitgeteilten Thymopentinanaloga waren Peptide, die eine Länge unter fünf Aminosäuren hatten und mit Thysplenin verwandt waren, bei einer Induzierung von T-Zellen-Helferaktivität in MOLT-4-Zellen ebenso aktiv wie die hier beschriebenen Pentapeptidanaloga von Thysplenin. Verschiedene darin beschriebene Tetrapeptide waren:

Arg-Pro-Asp-Val

Arg-Pro-Asp-Val-NH₂

Formyl-Arg-Pro-Asp-Val

Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val

Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-NHj

Acetyl-Arg-Pro-Ala-Val-NH₂

Acetyl-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-NH₂

Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val-NH₂

Acety I-Arg-Pro-G Iu-VaI

Acetyl-Arg-Aib-Ala-Val-NH₂

Acetyl-Arg-Aib-Glu-Val-NH₂

Acetyl-Arg-Pro-Asp-Gly-NH₂.

Bei diesen Paptiden wurde festgestellt, daß sie die Wirkung von Thysplenin im MOLT-4-Test, nicht aber die Thymopentinaktivität im CEM-Zellinientest nachahmten.

Im Fachgebiet bleibt der Bedarf an zusätzlichen Peptiden bestehen, die bei der Stimulierung der Suppressor- und Helferaktivitäten im Immunsystem des Menschen für eine Vielzahl von T-Zellen-Schwächezuständen nützlich sind.

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Veifahren werden Peptide mit bestimmten Amldsubstitutionen am C-Terminus, die die biologische Aktivität eines Human-Thymopentinmoleküls haben, zur Verfügung gestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Vorfahren zur Herstellung pharmakologisch wertvoller Peptide zur Verfügung zu stellen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Reihe von Tetrapeptide^ die am Carboxyterminus substituierte Amide

besitzen, die T-Zellen-Suppressoraktivität aufweisen-, die für Thymopentin in Tests auf zyklisches GMP an CEM-Zeliencharakteristisch ist. Diese Entdeckung ist deshalb überraschend, da die gleichen Tetrapeptide mit einem freien Carboxyterminusoder solche, die mit verschiedenen C-Terminusamidgruppen amidiert sind, eine derartige T-Zellen-Suppressoraktivität nichthervorrufen. Mehrere Totrapeptidsequenzen wurden kürzlich identifiziert, z. B. im US-Patent 4.428.938, die mit einem freien

Carboxyterminus keine T-Zellen-Suppressoraktivität entwickeln. Wenn jedoch erfindungsgemäß bestimmte Amidsubstitutionen am C-Terminus erfolgen, weisen diese inaktiven Peptide T-Zellen-Suppressoraktivität auf. Eine derartige Aktivität ist im Fachgebiet bisher nicht vorhersagbar gewesen. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt die folgenden amidierten Peptide der Formel R-Arg-X-Asp-Y-NR'R²

zur Verfugung, worin

R H, niederes Alkyl, Acetyl, Formyl, niederes Alkanoyl ist; X Pro, Dehydro-Pro, Hydroxyl-Pro, D-Lys, Aib oder Lys ist; Y GIy oder eine D- oder L-Form eil ier unter VaI, Ala, He, Leu, Asp, GIu, GIn oder Lys ausgewählten Aminosäure ist; R¹ H ist und R² niederes Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, cyclisches Alkyl oder Alkenyl mit 4 bis

8 Kohlenstoffatomen, Aryl oder NHR₃, worin R₃ ein niederes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, cyclisches Alkyl oder

Alkenyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder Aryl ist; oder R' undR²sindzusammeneineMethylenkettemit4bis7Kohlenstoffatomen.

Diese amidierten Peptide und Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten, behalten überraschenderweise die biologische Aktivität von Human-Thymopentin an CEM-Zellen.

Daraus wurde gefolgert, daß diese Peptide eine ähnliche biologische Aktivität In vivo im Menschen entwickeln. Eine große Anzahl dieser Peptide läßt sich durch verstärkte Beständigkeit gegenüber dem Angriff von Endo- und Exopeptidasen und trypsinartigen Enzymen im Verdauungstrakt und im Serum charakterisieren. Diese Peptide bieten damit bedeutsame Vorteile bei der Behandlung von Immunschwächen.

;Ein weiterer erfindungsgemäßerAspekt schließtdie^ersjellypq therapeutischer Zusammensetzungen, die diese Peptide enirfafterf/sdwiedie Verwendung tiiöser Zusammensetzungen zur Regulierung des.lmmunsystams, ein. Weitere erfindungsgemäße Aspekte und Vorteile werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung offenbart.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen: Fig. 1 ist eine grafische Darstellung eines CEM-cGMP-Tests, wobei eine Peptidkonzentration (ug/ml) über cGMP-Werte

(Picogramm/ml) aufgetragen wird und die Aktivität darin von Thymopentin (TP-5) und erfindungsgemäßen Peptiden mit

Kontrollen verglichen wird. Die vorliegende Erfindung stellt überraschenderweise Verbindungen zur Verfügung, die T-Zellen-Suppressoraktivität besitzen

und durch die Formel R-Arg-X-Asp-Y-NR'R², worin R X, Y, R¹ und R² die oben beschriebenen Bedeutungen haben, dargestelltwerden.

Zur Erleichterung sind die Aminosäurekomponenten der Peptide und bestimmte, zu ihrer Herstellung verwendete Materialien in

der gesamten Offenbarung durch Abkürzungen dargestellt. Die meisten der Drei-Buchstaben-Codes für Aminosäuren sindbekannt. Weniger bekannte Abkürzungen sind GIp für Pyroglutanyl (auch p-Glu) und Aib für Aminoisobuttersäure. Falls nichtsanderes angegeben ist, haben alle Aminosäuren die L-Isomerenkonfiguration. Wenn die D-Isomerkenkonfiguratio.: gewünschtwird, ist dies angegeben.

Bestimmte bevorzugte erfindungsgemäß hergestellte Peptide sind diejenigen der Formel, in deren die zweite Aminosäure Pro

oder Aib ist. Von Tetrapeptiden mit C-Terminusamiden, bei denen die zweite Aminosäure X Pro oder Aib ist, wird erwartet, daßsie eine verstärkte Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Verdauungs- oder Serumenzyme haben. Derartige Peptide sind:

Arg-Pro-Asp-Val-Isopropylamid Arg-Pro-Asp-Val-Methyiamid Formyl-Arg-Pro-Asp-Val-Methylamid Weitere bevorzugte erfindungsgemäß hergestellte Peptide sind: Arg-Lys-Asp-Val-Anilinamid Arg-Lys-Asp-Val-Methylamid Arg-Lys-Asp-Val-2-Phenylhydrazid Arg-Lys-Asp-Val-Piperidinamid Arg-Lys-Asp-Val-Cyclohoxylamid Arg-Lys-Asp-Val-Isopropylamid

Die überraschende und nicht vorhersagbare Aktivität der substituierten Tetrapeptide stellt neuartige und nicht offensichtliche Verbindungen, insbesondere im Vergleich zum bisherigen Stand der Entwicklung, zur Verfügung. Obwohl die erfindungsgemäß hergestellten Tetrapeptidsequenzen schon früher offenbart worden sein können, z. B. die Sequenz-Arg-Lys-Asp-Val in US-Patent Nr.4,428,938, haben die Erfinder überraschenderweise festgestellt, daß die selektive Amidierung dieser Sequenzen an ihren Carboxytermini Verbindunger τι it T-Zellen-Supprossoraktlvität zur Verfügung stellt. Weiterhin haben die Anmelder entdeckt, daß mehrere der oben beschriebenen Peptide überraschenderweise und nicht erklärlich sowohl T-Zellen-Suppressoraktivität als auch T-Zellen-Helferaktivität wie Thymopentin aufweisen. Diese Peptide sind, wie oben boschrieben, Ar j-Pro-Asp-Val-Isopropylamid, Formyl-Arg-Pro-Asp-Val-Methylamid und Arg-Lys-Asp-Val-Isopropylamid.

Die vorliegende Erfindung stellt demzufolge durch ihre Darlegungen neuartige Verbindungen für die pharmazeutische Verwendung zur Verfügung. Im Fachgebiet wird weder über die Selektion der zur Herstellung der aktiven Verbindungen der oben offenbarten Tetrapeptidsequenzen erforderlichen Amidgruppen, noch über die Tatsache, daß die selektive Amidierung der vorliegenden Erfindung biologisch aktive Verbindungen aus mehreren Tetrapeptiden erzeugt, die bei freien Carboxytermini biologisch inaktiv sind, berichtet. Ferner zeigen nicht alle der oben beschriebenen Tetrapeptidsequenzen bei Amidierung an ihren Carboxytermini eine derartige biologische T-Zellen-Suppressoraktivität analog zu Thymopentin. Beim Test waren eine Reihe Tetrapeptide des bisherigen Standes im Fachgebiet bei Amidierung nicht in der Lage, eine derartige T-Zellen-Suppressoraktivität zu zeigen. Durch eino verallgemeinerte Aussage wird für die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen nicht vorhergesagt, daß Amide derartiger Sequenzen die Fähigkeit haben, das Immunsystem zu beeinflussen oder die T-Zellen-Helferaktivität zu stimulieren. Beispielsweise zeigen die folgenden Peptide

Arg-Pro-Asp-Val-Morpholinoamid Arg-Lys-Asp-Val-Dimethylamid Arg-Lys-Asp-Val-2-Naphthylamid Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val-Ethylamid

nicht die stimulierende T-Zellen-Suppressoraktivität des Thymopentins, Sie haben jedoch die gleichen oder ähnliche Peptidsequenzen, wie in US-Patent Nr.4,428,938 von Kisfaludy oder in dem gleichzeitig anhängigen Patent SN 196,138 des Anmelders beschrieben wurde.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die Peptide wie im folgenden beschrieben hergestellt werden. Günstigerweise erfolgt die synthetische Produktion des Polypeptids nach der Festphasenmethode oder nachStandardlösungssynthesemethoden. Beispielsweise ist die von Merrifield in J.A.C.S.; 85:2149-2154 (1963) beschriebene Festphasenmethode gut eingeführt und eine zur Peptidherstellung allgemein angewandte Methode. Die Festphasenmethode der Synthese umfaßt die stufenweise Zugabe von geschützten Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette, die durch kovalente Bindungen an ein festes Harzpartikel gebunden ist. Bei dieser Verfahrensweise werden Reagenzien und Nebenprodukte durch Filtration entfernt, wodurch Zwischenverbindungen nicht gereinigt werden müssen. Das allgemeine Konzept dieser Methode hängt von der Anknüpfung der ersten Aminosäure der Kette an ein festes Polymer durch eine kovalente Bindung ab. Nacheinander werden geschützte Aminosäuren einzeln oder im Block zugegeben, bis die gewünschte Sequenz montiert ist. Anschließend wird das geschützte Peptid aus der festen Harzunterlage entfernt, und die geschützten Gruppen werden abgespalten.

Die Aminosäuren können jedes geeignete Polymer wie beispielsweise ein Harz geknüpft sein. Das Harz muß eine funktioneile Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck sind viele Polymere geeignet wie Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethylmethacrylat und N-Alkylbenzylamin, N-Alkylbenzhydrylamin und Polystyrenharze. Geeignete geschützte Gruppen, die bei diesen Synthesen verwendet werden können, sind t-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyl (BzI), t-Amyloxycarbonyl (ACC), Tosyl (Tos), o-Bromphenylmethoxycarbonyl (Brz) sowie Phenylmethoxycarbonyl (Z oder CBZ). Außerdem sind die geschützten Gruppen im oben genannten Text sowie in J.F.W. McOmie, „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973 genannt. Beide Bücher sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen.

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise der Herstellung der Peptide umfaßt zu Beginn die Anheftung der geschützten C-terminalen Aminosäure an das Harz. Nach der Anheftung wird das Harz filtriert, gewaschen, und die Schutzgruppe (wünschenswerterweise BOC) an der Alpha-Aminogruppe der C-terminalen Aminosäure wird entfernt. Die Entfernung dieser Schutzgruppen muß natürlich stattfinden, ohne die Bindung zwischen der Aminosäure und dem Harz zu zerstören. An das entstandene Harz-Peptid wird dann die vorletzte C-terminale geschützte Aminosäure gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt durch Bildung einer Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe der zweiten Aminosäure und der Aminogruppe der ersten, an das Harz geknüpften Aminosäure. Diese Reihenfolge wird mit aufeinanderfolgenden Aminosäuren wiederholt, bis alle Aminosäuren an das Harz geknüpft sind.

Schließlich wird das geschützte Peptid durch ein den Fachleuten auf diesem Gebiet bekanntes herkömmliches Verfahren abgespalten, z. B, Aminolyse mittels Cyciohexylamid, und die Schutzgruppen werden entfernt, um das gewünschte Peptid zu ergeben. Die Spaltungsverfahren, die angewandt werden, um das Peptid aus dem Harz zu lösen und die Schutzgruppen zu entfernen, hängen von der Wahl des Harzes und der Schutzgruppen ab und sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt.

Alternative Verfahren zur Peptidsynthese werden in „Peptid Synthesis" von Bodanszky u. a., zweite Auflage, John Wiley and Sons, 1976, beschrieben. Die erfindungsgemäß hergestellten Peptide können auch durch die Standardlösungs-Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, bei denen entweder stufenweise oder im Block Aminosäuren oder Peptidfragmente mittels chemischer oder enzymatischer Methoden der Amidbindungsbildung gekoppelt werden. Diese Lösungssynthesemethoden sind im Fachgebiet gut bekannt.

Bei den erfindungsgemäß hergestellten Peptiden wurde eine biologische Aktivität ähnlich der von Human-Thymopentin festgestellt, wie in den oben zitierten US-Patenten, Anmeldungen und Artikeln offenbart wird. Diese biologische Aktivität wird hauptsächlich durch einen Test bewiesen, bei dem die Induktion der Produktion von cyclischem GMP in der Human-T-Zellinie CEM im Vergleich zu Human-Thymopentin gemessen wird. Die Induktion der cCMP-Produktion durch ein erfindungsgemäß hergestelltes Peptid in diesem Test zeigt die Fähigkeit des Peptids, an die Human-Thymopentin-Rezeptorstelle an der Zelle zu binden und eine Humanthymopentin-artige biologische Aktivität zu induzieren.

Viele erfindungsgemäß hergestellte Peptide bieten woitere signifikante Vorteile. Viele erfindungsgemäß hergestellte Peptide zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber einem enzvmatischen Abbau sowohl durch Verdauungs- als auch durch Serumenzyme aus. Sie zeigen somit eine längere Halbwertszeit in vivo, wenn sie durch Injektion an ein biologisches Individuum verabreicht werden. Ein weiterer Vorteil vieler dieser Peptide besteht darin, daß sie oral verabreicht werden können. Wegen der immunomodulierenden Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Peptide sind sie bei der Behandlung von Menschen und möglicherweise von Tieren nützlich, da sie die Differenzierung und Reifung von T-Zellen, die an der Immunreaktion des Körpers teilnehmen können, induzieren können. Deshalb geht man davon aus, daß die erfindungsgemäß hergestellten Peptide vielfältige therapeutische Einsatzmöglichkeiten haben.

Die erfindungsgemäß hergestellten Peptide werden bei der Unterstützung der Gesamtimmunität des Körpers als nützlich angesehen, da sie die therapeutische Stimulierung der zellulären Immunität erhöhen oder unterstützen. Die erfindungsgemäß hergestellten Peptide oder diese Peptide enthaltene pharmazeutische Zusammensetzungen werden im allgemeinen in allen Bereichen als nützlich angesehen, in denen die zelluläre Immunität ein Problem ist und insbesondere, wo eine Immunschwäche besteht. Sie sind deshalb bei der Behandlung von Krankheiten nützlich, die allergische Reaktionen und autoimmune Reaktionen betreffen.

Wenn es zum Beispiel einen Überschuß in der Antikörperproduktion oder der zellulären Immunität infolge von unbalancierten T-Zellen gibt, können die erfindungsgemäß hergestellten Peptide diesen Zustand durch Stimulierung der Suppressor-T-Zellwirkung korrigieren. Es wird erwartet, daß sie bei bestimmten Autoimmunkrankheiten, bei denen zerstörerische Antikörper erzeugt werden, wie beispielsweise bei systemischen Lupus orythematodes, Rheumatoidarthritis oder dergleichen, von therapeutischem Nutzen sein werden.

In ihrer breitesten Anwendung sind die erfindungsgemäß hergestellten Peptide oder die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen bei der Regulierung des Immunsystems eines Individuums, Mensch oder Tier, bei dem eine solche Regulierung erforderlich ist, nützlich. Der Begriff „regulieren" bedeutet in der hier agebrauchten Art und Weise, daß die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen dahin wirken, daß das Immunsystem von einem abnormalen, krankhaften Zustand in einen normalen, balancierten Zustand zurückkehrt. Wobei diese Regulierung sowohl in der Korrektur von Immunschwächen (z. B. DiGeorge-Syndrom) große Anwendung finden wird, als auch bei der Korrektur von Zuständen von - überschüssiger Immunaktivität (z. B. Antoimmunkrankheiten) anwendbar sein wird.

Die Erfindung stallt weiter ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Anwendung dieser Methoden zur Verfügung. Zur erfindungsgemäßen Herstellung der Zusammensetzungen wird ein erfindungsgemäß hergestelltes Peptid als Wirkstoff in inniger Vermischung mit einem pharmazeutischen Trägermittel entsprechend der herkömmlichen pharmazeutischen Mischungsverfahren kombiniert. Dieses Trägermittel kann eine breite Vielfalt von Formen haben je räch Art des Präparat!, das für die Verabreichung gewünscht wird, z. ß. orale, sublinguale, rektale, nasale oder parenterale Verabreichung.

Bei der Hierstellung der Zusammensetzungen der bevorzugten oralen Dosierungsform können alle üblichen pharmazeutischen Mittel angewandt werden. Für flüssige orale Präparate (z. ß. Suspensionen, Elixiere und Lösungen) können Mittel verwendet werden, die beispielsweise Wasser, Öle, Alkohole, Aron.astoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe und dergleichen enthalten. Solche Trägermittel, wie Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granuliermittel, Schmiermittel, Bindemittel, Lösungsvermittler und dergleichen können bei der Herstellung oraler Feststoffe (z. B. Pulver, Kapseln und Tabletten) verwendet werden. Es können auch Formen zur gesteuerten Freisetzung verwendet werden. Wegen ihrer einfachen Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Dosiseinheitenform dar, wobei feste pharmazeutische Trägermittel angewandt werden müssen. Auf Wunsch können die Tabletten mittels Standardverfahren mit Zucker oder einer anderen Tablettenschutzhülle beschichtet werden.

Bei parenteralen Produkten wird das Trägermittel üblicherweise steriles Wasser sein, wobei auch andere Wirkstoffe, die z.B. die Löslichkeit unterstützen oder zu Konservierungszwecken dienen, enthalten sein können. Es können auch injizierbare Suspensionen hergestellt werden, wobei entsprechende flüssige Trägermittel, Suspensionsmittel und dergleichen verwendet werden können.

Ein erfindungsgemäß hergestelltes Peptid ist im allgemeinen wirksam, wenn es in Mengen von etwa 1 μς/kg Körpermasse und vorzugsweise von etwa 0,001 bis etwa 10mg/kg Körpermasse verabreicht wird, wobei auch niedrigere Dosierungen nützlich sein können. Im allgemeinen kann der gleiche Bereich an Dosiermengen bei der Behandlung der erwähnten Krankheiten oder Zustände angewandt werden, wia bei der Behandlung von Immunschwäche. Größere Mengen (z. B. etwa 10-100mg/kg Körpermasse) sind bei der Unterdrückung einer überschüssigen Immunaktivität nützlich.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, ohne die Erfindung darauf zu beschränken. In den Beispielen und in der Beschreibung erfolgt die Mengenangabe, falls nicht anders ausgewiesen, als Masseteile. In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: TFA für Trifluoressigsäure; HOAc für Essigsäure; CH₂CI₂ für Methylenchlorid; CH₃CN für Acetonitril; DMF für Dimethylformamid; NH₄OAc für Ammoniumacetat; nBuOH für n-Butanol; pyr

für Pyridin; DCC für Dicyclohexylcarbodiimid; HOBt für 1-Hydroxyberuotriazol; DMAP für Dimethylamlnopyridin; TCA für Trichloressigsäure; MeOH für Methanol; TLC für Dünnschichtchromatographie, THFfürTetrahydrofuran; EtOAc für Ethylacetat; NaHCO₃ für Natriumhydrogencarbonat; MgSO₄ für Magnesiumsulfat; NMM für N-Methylmorpholin; Et₂O für Diethylether; HPLC für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; Pd/C für Palladium auf Kohlenstoff; DIEA für Diisopropylethylamin; jBuOCOCI für Isobutylchloroformiat; i-Pr₂O für Diisopropylether; ONp für Paranitrophenylester; RPMI für Gewebskulturmedium und PBS für phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung.

Beispiel 1: Synthese von Arg-Pro-Asp-Val-Isopropylamld In 4OmICH₂CIj wurden 2,25g BOC-Pro-(Bzl)Asp-Val gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgeschreckt, und 0,67g HOBt und

0,90g DCC in 4ml DMF wurden zugefügt. Nach lOminütigem Rühren wurde eine Lösung aus 0,30g Isopropylamin in 5 ml CH₂CI₂zugesetzt. Das Gemisch wurde im Eisbad 15 Minuten lang gerührt. Anschließend ließ man die Temperatur auf Raumtemperatursteigen. Nach 3 Stunden wurde der Niederschlag filtriert: Das Filtrat wurde mit 10%iger Zitronensäurelösung, Wasser undgesättigter NaHCO₃-Lösung extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgS04 getrocknet, und das Lösungsmittel wurdeunter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt war ein weißlicher Feststoff mit einer Masse von 2,32g. Die Kristallisation aus

EtOAc-I-Pr₂O ergab 1,64g des Produktes, Schmelzpunkt 179,5-181,5⁰C. Zu 0,84g des oben genannten Produktes wurden 50ml 40%ige TFA in CH₂CI₂ gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten gerührt,

anschließend wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Zusatz von Ether zu dem Rückstand ergab einen

Feststoff, Pro-(Bzl)Asp-Val-lsopropylamidtrifluoraoetat. In 10ml DMFwurden 0,93g BOC-Arginin gelöst. Die Lösung wurde auf -20°C abgeschreckt, undO,18ml NMM und anschließend

0,22g iBuOCOCI wurden zugefügt. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei -15⁰C gerührt, und anschließend wurde 0,18ml

"^M und eine gekühlte Lösung des oben genannten Tr!f!uoracetatsa!zes in 10ml DMF zugegeben. Nach 30 Minuten wurde das Kühlbau untfernt, und es wurde weitere 2 Stunden gerührt. Der größte Teil des Lösungsmittels wurde unter reduziertem Druck entfernt. EtOAc und Wasser wurden zu dem Rückstand gegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde mit Zitronensäurelösung und zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung extrahiert. Nach der Entfernung des Lösungsmittels blieb ein farbloses Glas mit einer Masse von 1,44 g zurück. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie auf Silicagel 60, Elution mit 98:2 CH₂CI₂=MeHO, gereinigt. Die zuerst eluierende Komponente war das gewünschte Produkt; reine Fraktionen ergaben 0,53g; eine weitere Fraktion von 0,32g, die eine leichte Verunreinigung enthielt, wurde gewonnen. Die 0,53g des gereinigten, geschützten Tetrapeptidamids wurden mit 1 ml Ameisensäure in 20ml MeOH über Palladiumschwarz hydriert. Nach einer Stunde wurde das Gemisch durch Celite filtriert und mit Wasser gewaschen. Das MeOH wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt und lyophilisiert, die Produktmenge betrug 280mg. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf SP-Sephadex, Elution mit 0,3OM NH₄OAc, pH 5, gereinigt. Die die Mitte des Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen wurden zusammengenommen und lyophilisiert und ergaben 190mg amorphes, festes Arg-Pro-Asp-Val-Isopropylamid.

Aminosäureanalyse: Asp 1,01; Pro 1,03; VaI 0,97; Arg, 1,00; Peptidgehalt 96%. Dünnschichtchromatographie (Silicagel 60) R₁(I) = 0,44(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10) R₁(II) = O.eSfEtOAciPyrHOAc^O/öiBMiS) R₁(III) = 0,16(n-BuOH:HOAc:H₂O/3:1:1)

Beispiel 2: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-Cyclohexylamid Zu einer Lösung aus BOC-(Bzl)Asp-Val-ONp (1,09g, 2,00mmol) und Cyclohexylamin (0,27ml, 1,2Äqu.)inTHF(10ml) wurde HOBt

(0,27p) gegeben. Die entstandene gelbe Lösung wurde 24 Stunden gerührt und unter reduziertem Druck eingedampft. Das

restliche Öl wurde mit EtOAc verdünnt und mit gesättigtem NaHCO₃, H₂0,10%iger Zitronensäure und gesättigter Salzlösunggewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, um das geschützte Dipeptidamid zuergeben.

Zu einer gerührten Lösung aus 4,2M HCI-Dioxan (10ml) wurde das geschützte Dipeptid (0,71 g, 1,4mmol) gegeben. Nach

60 Minuten wurde die Reaktion unter reduziertem Druck eingedampft, und es ergab sich ein farbloser Feststoff als das HCI-SaIzdes Dipeptids.

Zu einer gerührten Lösung aus dem HCI-SaIz des Dipeptids, (CBZlsArg-fCBZl-Lys-ONp (1,34g, 1,4mmol) und HOBt (0,19g,

1,0Äqu.) in DMF (10ml) wurde NMM (0,18ml) gegeben. Nach 16 Stunden hatte sich ein gelatinöser Niederschlag gebildet. Das

Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt, filtriert und mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen. Die Rekristallisation aus 4%;ger HOAc/EtOAc ergab (CBZljArg-ICBZl-Lys-IBzD-Asp-Val-Cyclohexylamid als

einen farblosen Feststoff, 136g, 73%.

Dem Tetrapeptid (1,33g) wurde In HF/Anisol (30ml/8ml) 60 Minuten lang bei O⁰C die Schutzgruppe entfernt. Der Rückstand

wurde in Et₂O abgeschreckt und Filtriert. Die gesammelten Feststoffe wurden in 10%iger HOAc gelöst und lyophilisiert, um

Arg-Lys-Asp-Val-Cyclohexylamid, 460mg, zu gewinnen. Das Peptid wurde durch HPLC gereinigt: Whatman M-20 10/50 ODS-3 Säule, Durchflußgeschwindigkeit 10,0ml/min, 10%iges CH₃CN, 0,01 M NH₄OAc, pH5. Es erfolgten 3 Einspritzungen von 150mg in 3ml Puffer, und die zwischen 35,0 und 51,6min

eluierende Fraktion wurde gesammelt. Die teilweise Eindampfung unter reduziertem Druck und die Lyophilisierung ergaben das

Tetrapeptidamid Arg-Lys-Asp-Val-Cyclohexylamid als einen farblosen Feststoff, 410mg. Aminosäureanalyse: Arg 1,00; Lys 1,00; Asp 1,00; VaI 0,85. Dünnschichtchromatographie (250μ Silicagel G) R,(l) = O^in-BuOHiHOAci^OiEtOAc/iiiiliD R₁(II) = 0,61(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10) R₁(III) = 0,90(EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

Beispiel 3: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-Plperldlnamld

Zu einer gerührten Lösung aus BOC-(Bzl)-Asp-Val-ONp (2,72g, 5,00mmol) und Piperidin (0,6ml, 1,2Äqu.) InTHF (1OmI) wurde

HOBt (0,68g, 1,0 Äqu.) gegeben. Nach 48 Stunden wurde die gelbe Lösung unter reduziertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in EtOAc gelöst und je einmal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, kaltem 2 M NaOH, zweimal mit H₂O, einmal mit 10%iger Zitronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, um ein

farbloses Öl, BOC-IBzD-Asp-Val-Piperidinamid, 2,36g, zu ergeben.

Die Reinigung durch Flash-Chromatographie mittels MeOH/CH₂CI₂ ergab das geschützte Dipeptidamid als einen farblosen Feststoff, 1,65 g, 67%.

Zu 4,2M HCI-Dioxan (10ml) wurde das geschützte Dipeptidamid (1,06g, 2,17 mmol) gegeben. Nach 1 Stunde wurde die Lösung unter reduziertem Druck eingedampft, in CH₂CI₂ gelöst und erneut eingedampft, um das HCI-SaIz als ein farbloses Öl zu ergeben.

Zu einer gerührten Lösung aus (CBZ)₃ArQ-(CBZ)-LyS-ONp (2,08g, 2,17 mmol), dem oben beschriebenen farblosen Öl und HOBt (0,29g) in DMF(IOmI) wurde NMM (0,29ml) gegeben. Nach einer Stunde begann sich ein Niederschlag zu bilden. Nach 1 δ Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser abgestreckt. Das Produkt wurde mit EtOAc extrahiert und mit gesättigter NaHCOj-Lösung, H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen. Die Rekristallisation aus HOAc/EtOAc/Et₂O ergab (CBZ)₃Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-Piperinamid als einen farblosen Feststoff, 2,40g, 91 %.

Das geschützteTetrapeptid (1,87g, 1,55mmol) wurde in Nj-gespülter10%iger HOAc (100ml) aufgeschlämmt, dazu wurde 10%iges Pd/C (0,8g) gegeben. Das Gemisch wurde auf einem Parr-Hydrogenator (500-ml-Gefäß, 43,5 psi) bewegt. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgemisch durch ein 0,45-Nylonfilter filtriert, teilweise eingedampft, mit H₂O verdünnt und lyophilisiert, um das Rohtetrapeptid als einen farblosen Feststoff, 890mg, zu ergeben.

Das Peptid wurde durch HPLC gereinigt: Whatman M-20 10/50 ODS-3 Säule, Durchflußgeschwindigkeit 10,0ml/min, 10%iges CH₃CN, 0,01 M NH₄OAc, pH5. Es erfolgten 3 Einspritzungen von 300mg in 3ml Puffer und die zwischen 23,0 und 44,0min eluierende Fraktion wurde gesammelt. Die teilweise Eindampf ung unter reduziertem Druck und die Lyophilisierung ergaben das gewünschte Tetrapeptidamid Arg-Lys-Asp-Val-Piperidinamid als einen farblosen Feststoff, 510mg.

Aminosäureanalyse: Arg 0,95; Lys 1,00; Asp 1,02; Va11,00;

Peptidgehalt54,2%.

Dünnschichtchromatographie (250 μ, Silicagel G)

R₁(I) = 0,3Kn-BuOHiHOACiH₂OiEtOAc/!:!:!:!)

Ri(II) = 0,53(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/l5:3:l2:10) · "

R₁(III) = 0,61 (EtOAc: HOAc: H₂O:Pyr/5:1:3:5)

Beispiel 4: Synthese von Arg-Pro-Asp-Val-N-Methylamid

Zu einergerührten Lösung aus BOC-VaI (10,86g,50,0mmol) und DIEA(8,70ml, 1,0Äqu.), Methylamin · HCI (3,38g, 1,0Äqu.) und

HOBt (7,66g, 1,0Äqu.) in 12:5 CH₂CI₂:DMF (85ml) wurde DCC (10,32g, 50,0mmol) gegeben. Es bildete sich ein Niederschlag.

Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in EtOAc gelöst und dreimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, H₂0,10%iger Zitronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Na₂SO₄ wurde die organische Phase filtriert und eingedampft und ergab einen farblosen Feststoff. Pulverisieren in heißem Hexanen ergab das gewünschte Amid, BOC-Val-Methylamid, 7,98g, 69%, Schmelzpunkt

Zu diesem Amid (4,60g, 20,0mmol) wurde 50%ige TFA/CH₂CI₂ (20ml) gegeben. Nach 30minütigem Rühren wurde die Lösung bei einer Temperatur unter 30⁰C eingedampft, der ölige Rückstand wurde in CH₂CI₂ aufgelöst, zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft und ergab Val-Methylamid,

Zu einer gerührten Lösung aus BOC-Bzl-Asp (4,72g, !4,6mmol), Val-Methylamid (1,90g, 14,6mmol), HOBt (2,24g, 1,0Äqu.) in DMF (20ml) wurde DCC (3,01 g, 14,6mmol) gegeben. Nach 5 Minuten bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde mit halbgesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt.

Die gewonnenen Feststoffe wurden gesammelt, mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen und an der Luft getrocknet, um einen farblosen Feststoff zu ergeben. Die Rekristallisation aus EtOAc ergab das gewünschte Dipeptidamid, 5,85g, 92%,BOC-(Bzl)-Asp-Val-Methylamid.

Zu dem Dipeptidamid (3,94g, 9,05mmol) wurde 50%ige TFA/CH₂CI₂ (20ml) gegeben. Nach 30mlnütigem Rühren wurde die Lösung bei einer Temperatur unter 3O⁰C eingedampft und mit Et₂O pulverisiert, um das TFA-Dipeptid, 4,10g, 100%, als ein farbloses Glas zu ergeben.

Zu einer gerührten Lösung aus BOC-Pro (1,95g, 9,05mmol), dem TFA-Dipeptid (4,10g, 9,05mmol), DIEA (1,73ml, 1,1 Äqu.), DMAP (0,12 g, 0,1 gq) in DMF (20ml) wurde DCC gegeben (1,87 g, 9,05 mmol). Nach 5 Minuten bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde mit halbgesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt. Der entstandene Feststoff wurde gesammelt, mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen und an der I uft getrocknet, um das gewünschte Tripeptidamid, 4,15g, 86%, zu gewinnen. Dies wurde ohne weitere Reinigung weiterverwendet.

Zu diesem Amid (4,15g, 7,78mmol) wurde 50%ige TFA/CH₂CI₂ (15ml) gegeben. Nach 30minütigem Rühren wurde die Lösung bei einer Temperatur unter 30°C eingedampft und mit Et₂O pulverisiert, um das TFA-Tripeptid, 4,25g, 100%, als einen farblosen Feststoff zu gewinnen.

Zu einer gerührten Lösung aus 86,9 AOC-Tos-Arg (39,7g, 7,78 mmol), dem Tripeptidamid (4,25g, 7,78mmol), NMM (0,86ml,

1,1 Äqu.) und HOBt (1,19g, 1,0Äqu.) in DMF (15ml) wurde DCC (1,61 g, 7,78mmol) gegeben. Nach 10 Minuten bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde mit halbgesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt.

Der entstandene Feststoff wurde gesammelt, mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O-Ether gewaschen und an der Luft getrocknet, um das geschützte Tetrapeptidamid, 4,82g, 72%, zu gewinnen.

Der Hälfte des Feststoffs wurde in 50%iger TFA/CH₂CI₂ (10ml) 30 Minuten lang der Schutz entzogen, dann wurde er unter reduziertem Druck eingedampft und mit Et₂O pulverisiert. Der entstandene Feststoff wurde mit HF/Anisol (30 ml/8 ml) 60 Minuten lang bei O⁰C gespalten. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgeschlämmt und zweimal mit 10%iger HOAc (50ml) extrahiert. Die wäßrigen Extrakte wurden lyophilisiert und ergaben rohes Arg-Pro-Asp-Val-Methylamid.

Das Rohprotein wurde auf SPC-25 Sephadex (Säule 2,6 χ 83cm), 0,05 bis 0,3 M NH₄OAc, pH6,5; Gradient:

Durchflußgeschwindigkeit 100ml/h, 9,5ml/Fraktion, Detektor 206nm) gereinigt. Diese Fraktionen 113-128 wurden gesammelt und lyophilisiert, um 925mg Tetrapeptidamid, Arg-Pro-Asp-Val-Mothylamid zu gewinnen.

Aminosäureanalyse: Arg 1,06; Pro 0,99; Asp 0,95; Va11,00;

Peptidgehalt 54%.

Dünnschichtchromatographie (250μ Silicagel G)

Ri(I) = 0,20(n-BuOH:HOAc:H₂O:oberePhase/4:1:5)

Ri(II) = 0,26(n-BuOH:HOAc;H₂O:Pyr/15:3:12:10)

Ri(III) = 0,26(EtOAc:HOAc:HJO:Pyr/5:1:3:5)

Beispiel 5: Synthese von N-Forrnyl-Arg-Pro-Asp-Val-Metylamld

Zu AOC-(Tos)-Arg-Pro-(Bzl)-Asp-Val-Methylamid (1,00g, 1,17mmol) wurde4,5M HCI-Dioxan (10ml) gegeben. Nach60 Minuten wurde die Reaktionsmasse eingedampft, mit H2O verdünnt und lyophilisiert, um das HCI-Tetrapeptid als einen farblosen, pulverförmigen Feststoff, 0,92g, 100%, zu ergeben.

Die Feststoff wurde in DMF (10ml) gelöst und DIEA (0,93ml, 4,0Äqu.), DMAP (0,08g) und p-Nitrophenylformiat (200mg,

1,02Äqu.) wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit 10%iger Zitronensäure behandelt. Der entstandene Feststoff wurde filtriert, mit H]O gewaschen und an der Luft getrocknet, um das formylierte Peptidamid, 0,41 g, zu ergeben.

Der Feststoff wurde mit HF/Anisol (30 ml/8ml) 60 Minuten lang bei O⁰C gespalten. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgeschlämmt und zweimal mit 1 %igom NH₄OH (50ml) extrahiert. Die wäßrigen Extrakte wurden lyophilisiert und ergaben das Rohpeptid, N-Formyl-Arg-Pro-Asp-Val-Methylamid.

Das Rohpeptid wurde auf DEAE-Sephadex (Säule 2,6 χ 90cm, 0,1 M NH₄HCO₃, ungepuffert; Durchflußgeschwindigkeit 100ml/h, 10ml/Fraktion, Detektor 206nm) gereinigt. Die Fraktionen 38-43 wurden zusammengenommen und lyophilisiert, um das amidierte Peptid (80mg) zu ergeben.

Aminosäureanalyse: Arg 1,00; Pro 1,00; Asp 1,00; Va11,00; Peptidgehalt 50%.

Dünnschichtchromatographie (250μ Silicagel G)

R₁(I) =0,32(n-BuOH:HOAc:HjO:oberePhase/4:1:5)

R₁(II) =0,38(EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

R₁(III) =0,34(Trifluorethanol:NH₄OH/1:1)

Beispiel β: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-2-Phenyldrazld

Zu einer gerührten Lösung aus BOC-VaI (4,34g, 20,0mmol) in THF (40ml) wurde bei -15°C NMM (2,30ml) und anschließend iPuOCOCI (2,64ml) zugefügt. Die entstandene Aufschlämmung wurde 15 Minuten gerührt und anschließend wurde tropfenweise Phenylhydrazin (1,98ml) zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 1 Stunde lang bei -10°C bis O⁰C gerührt, anschließend ließ man sie auf Raumtemperatur erwärmen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und mit gesättigter NaHCO₃-LOsUrIg, H₂O und gesättigter Salzlösung gewaschen.

Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft und ergab einen gelb-orangen Feststoff. Die Rekristallisation aus CH₂CI₂/Petroleumether ergab BOC-Val-2-Phenylhydrazid als einen farblosen Feststoff, Schmelzpunkt 140-141⁰C, 4,96g, 74%.

Zu einer gerührten Lösung aus 4,2M HCI-Dioxan (10ml) wurde BOC-Val-2-Phenylhydrazid (1,13g, 3,68mmol) gegeben. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck eingedampft, in Et₂O pulverisiert und filtriert und ergab Val-2-Phenylhydrazid Di-HCI-SaIz aus einen farblosen Feststoff, 1,03g.

Zu einer gerührten Lösung des Di-HCI-Salzes (1,03g, 3,68mmol), BOC-(Bzl)-Asp (0,88g) und HOBt (0,37g) in THF (10ml) wurde NMM (0,60ml) und anschließend DCC (0,56g) gegeben. Fast sofort bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst, mit gesättigtem NaHCO₃ und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über NaSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Rekristallisation aus EtOAc/Hexanen ergab BOC-(Bzl)-Asp-Val-2-Hhenylhydrazid als einen farblosen Feststoff, 1,07 g, 64%.

Zu einer gerührten Lösung des 4,2M HCI-Dioxan (10ml) wurde das BOC-Dipeptid-Phenylhydrazid (1,07g, 1,75mmol) gegeben.

Nach 60 Minuten wurde die Lösung unter reduziertem Druck eingedampft und ergab ein farbloses Öl, (Bzl)-Asp-Val-2-Phenylhydrazidhydrochlorid.

Zu einer gerührten Lösung aus (CBZ)₃Arg-(CBZ)Lys-ONp (1,68g), dem Öl und HOBt (0,24g) in DMF (6ml) wurde NMM (0,6ml) gegeben. Nach 16 Stunden hatte sich ein gelatinöser Niederschlag gebildet. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt, und die Feststoffe wurden gesammelt, mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen. Die Rekristallisation aus 2%iger HOAc/EtOAc ergab (CBZhArg-ICBZl-Lys-fBzO-Asp-Val^-Phenylhydrazid als einen farblosen Feststoff, 2,15g, 92%.

Das geschützte Peptid (1,88g) wurde in HF/Anisol (30 ml/8 ml) 60 Minuten lang bei O⁰C gespalten. Der Rückstand wurde in Et₂O abgeschreckt und filtriert. Die Feststoffe wurden mit 10%iger HOAc (100ml) 1 Stunde lang extrahiert, filtriert, und das Extrakt wurde lyophilisiert, um Arg-Lys-Asp-Val-2-Phenylhydrazid als einen farblosen Feststoff, 890 mg, zu ergeben.

Das Rohpeptid wurde auf CM Sephadex (Säule 2,6 χ 88cm, 0,3M NH₄OAc, ungepuffert; Durchflußgeschwindigkeit 100ml/h, 12,5ml/Fraktion, Detektor 225 nm) gereinigt.

Die Fraktionen 270-310 wurden gesammelt und lyophilisiert, um 390mg des Endproduktes, Arg-l.ys-Asp-Val-2-Phenylhydrazid, zu ergeben.

Aminosäureanalyse: Arg 0,98; Lys 1,03; Asp 1,00; VaI 0,99; Peptidgehalt 83%.

Dünnschichtchromatographie (250μ Silicagel G)

Ri(I) = 0,39 (n-BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc/1:1:1:1)

Ri(II) =0,51 (n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12;10)

Ri(III)

Beispiel 7: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-Anllinamld Zu einer gerührten Lösung aus BOC-VaI (4,35g. 20,0mmol), Anilin (3,0ml, 1,05Äqu.) und HOBt (3,09g, 1,0Äqu.) in DMF (20ml)

wurde bei Raumtemperatur OCC (4,12g, 20,0 mmol) gegeben. Innerhalb von 5 Minuten bildete sich ein dicker Niederschlag.

Nach 4 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde in halbgesättigtes NaHCO₃ (500ml) gegossen. Es

bildete sich ein Niederschlag, der gesammelt wurde. Die Feststoffe wurden mit H₂O (1:1) gewaschen und an der Luft getrocknet.

Die Rekristallisation aus Hexanen/Isopropanol ergab das farblose feste Anilid BOC-Val-Anilinamid, 3,76g, 64%. Das BOC-Val-Anilinamid (2,50g, 8,55mmol) wurde in 50%iger TFA/CH₂CI₂ (10ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft, und der Rückstand wurde in CH₂CI₂ gelöst. Die Lösung wurde zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, um Val-Anilinarnid als ein hellgelbes Öl, 1,42g, 88%, zu ergeben. Zu einer Lösung aus BOC-(Bzl)-Asp (2,38g, 1,0Äqu.), dem Val-Anilinamid und HOBt (1,13g) in DMF (7,5ml) wurde DCC (1,52g,

1 ,OÄqu.) gegeben. Es bildete sich ein Niederschlag, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang gerührt. Das Gemischwurde filtriert, und das Filtrat wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung abgeschreckt. Die entstandenen Feststoffe wurdengesammelt, mit H₂O gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Rekristallisation aus EtOAc/Petrolether ergab das farblose

BOC-Dipeptidamid, Schmelzpunkt 121-122⁰C, 1,74g 46%, BOC-(Bzl)-Asp-Val-Anilinamid. Das BOC-Dipeptid (1,71 g, 3,44mmol) wurde in 50%iger TFA/CH₂CI₂ (10ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft, und der Rückstand wurde in Ether

pulverisiert, filtriert und an der Luft getrocknet.

Zu einer gerührten Lösung aus BOC-(CBZ)-Lys (1,33g, 3,50mmol) in DMF (10ml) wurde bei -20°C NMM (0,46ml, 1,2Äqu.) und

anschließend IBuOCOCI (0,46ml, 1,01 Äqu.) gegeben. Die entstandene Aufschlämmung wurde 30 Minuten lang gerührt, unddann wurden das Dipeptid-TFA-Salz und anschließend NMM (0,46ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt, dannließ man es auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch in halbgesättigtes NaHCO₃ (20OmI)gegossen. Es bildete sich ein farbloser Feststoff. Dieser wurde gesammelt und an der Luft getrocknet. Die Rekristallisation aus

EtOAc/i-Pr₂O ergab das BOC-Tripeptidamid, 2,05g, 78%, Schmelzpunkt 164-167⁰C. Das BOC-Tripeptidamid (2,00g, 2,63mmol) wurde in 50%iger TFAz¹CH₂CI₂ (6ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde in Ether

pulverisiert, filtriert und an der Luft getrocknet, um das TFA-SaIz zu ergeben.

Zu einer gerührten Lösung aus (CBZ)₃ArQ (1,52g, 2,63 mmol) in DMF wurde bei -20°C NMM (0,35ml, 1,2Äqu.) und anschließend

iBuOCOCI (0,35ml, 1,01 Äqu.) gegeben. Die entstandene Aufschlämmung wurde 30 Minuten lang gerührt. NMM (0,35ml) undanschließend TFA-SaIz wurden zugesetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang auf Raumtemperatur erwärmen. Das

Gemisch wurde ingesättigte NaHCO₃-Lösung gegossen und die gewonnenen Feststoffe wurden filtriert, mit H₂O gewaschen und

an der Luft getrocknet. Die Pulverisierung in heißem EtOH ergab das geschützte Tetrapeptid BOC-(CBZ)-LyS-(BzI)-ASp-VaI-

Anilinamid, 2,55g, 78%. Zu oiner gerührten Aufschlämmung des Tetrapeptide (2,30g, 1,89mmol) in Trifluorethsnol (50ml) und Ameisensäure (97%ig,

5 ml) wurde Palladiumschwarz (0,95g) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde kräftig gerührt. Nach einer Stunde wurde die

Lösung durch Celite filtriert und mit H₂O gewaschen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck teilweise eingedampft, und der Rückstand wurde lyophilisiert, um einen farblosen Feststoff, 0,89g, zu ergeben. Das Rohpeptid wurde auf SPC-25 Sophadex gereinigt (Säule 2,6cm χ 89cm, Gradient 0,1 bis 0,3 M NM₄OAc, pH G; Durchflußgeschwindigkeit 100ml/h, 15ml/Fraktion, Detektor 106nm). Die Fraktionen 253-285 wurden zusammengenommen

und lyophilisiert, um 680mg Arg-Lys-Asp-Val-Anilinamid zu ergeben. Aminosäureanalyse: Arg 1,00; Lys 0,98; Asp 1,00; VaI1,01; Peptidgehalt 100%.

R₁(I) =0,42(EtGAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5) R₁(II) = 0,32 (n-BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc/1 -.1:1:1) R₁(III) =0,54(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10) Beispiel 8: Biologische Aktivität: Tost auf Cyclisches GMP Bei diesem Test wird die Fähigkeit eines erfindungsgemäß hergestellten Peptids zur Bindung an den Zellmembranrezeptor einer

intakten CBM-ZeIIe und zur selektiven Stimulierung der Produktion von cyclischen GMP, wie dies bei Human-Thymopentingeschieht, gemessen.

Die CEM-Zellinie wurde von American Type Culture Collection of Rockville, Md. bezogen. Die CEM-Zellen wurden frisch geimpft

und 3 Tage lang gezüchtet und dann wie inT.Audhya u.a., Arch.Blochem.Biophys., 234:167-177 (1984) beschrieben geerntet.

Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und in RPMI bei einer Konzentration von 1,0 χ 10⁷ Zellen/ml erneut aufgelöst und

dann 30 Minuten bei 37⁰C äquilibriert, bevor die Testpeptide (25ul) und die Kontrollpeptide zugegeben wurden. Die Inkubationerfolgte in einem Schüttel-Wasserbad 4-5 Minuten lang und wurde dann durch Zugabe von 1 ml eiskalter TCA (10%ig) beendet.

Die Zellen in TCA wurden homogenisiert und beschallt, um das cyclische Nucleotid freizusetzen. Die Suspension wurde

20 Minuten lang bei 4⁰C und 300Ox g zentrifugiert. Das gewonnene Präzipitat wurde in 0,1 N NaOH gelöst, um den Proteingehaltfestzustellen. TCA wurde aus der überstehenden Fraktion durch viermaliges Extrahieren mit 5ml wassergesättigtem Et₂Oentfernt. Nach der letzten Extraktion wurden die verbliebenen Etherspuren durch lOminütiges Erhitzen in einem Wasserbad von5O⁰C entfernt. Nach der Lyophilisierung wurde die Probe in 5OmM Acetatpuffer (pH6,2) zum Radioimmuntest auf cyclisches

GMP rekonstituiert. Beispielsweise wurden dosenabhängige Kurven von 1 bis 1000 Mikrogramm/ml Peptid für jede Verbindung bewertet. Fig. 1

zeigt typische dosenabhängige Kurven (zusammengenommen aus 6 Experimenten) für die aktiven Peptide Arg-Pro-Asp-Val-

Isopropylamid, Arg-Lys-Asp-Val-Anilinamid, Arg-Lys-Asp-Val-Cyclohexylamid, Arg-Lys-Asp-Val-Piperidinamid und Arg-Lysj- Asp-Val-Phenylhydrazid im Vergleich mitThymopentin und den inaktiven Peptiden Arg-Lys-Asp-Val-Dimethylamid und Arg-Lys- Asp-Val-2-Naphthylamid in CEM-Zellen. Bei jedem getesteten Peptid wurde eine Schwellenaktivität festgestellt. Diese ist als die

niedrigste Konzentration des Testpeptids definiert, die noch einen intrazellulären Wert von cyclischem GMP induzierte, dergrößer als 2 Standardabweichungen über der Kontrolle war. Die Kontrollen hatten intrazelluläre cyclische GMP-Werte unter0,9 Picomol/ml (mittlere ± Standardabweichung). Die Testergebnisse wurden als positiv angesehen, wenn der Wert für

cyclisches GMP doppelt so groß war wie der für die negative Parallelkontrolle bestimmte Wert. Die aktiven Peptide wiesen Aktivitätsschwellen zwischen 1 bis 10pg/l auf.

Die Ergebnisse des Tests auf cyclisches QMP sind in Fig. 1 dargestellt, wobei repräsentative erfindungsgemäß hergstellte Peptide im Vergleich mit Thymopentin und Kontrollpeptiden getestet wurden. Diese Ergebnisse zeigen die biologische Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Peptide bei der Stimulierung der T-Zellen-Suppressoraktivität in CEM-Zellen.

Beispiel 9; Enzymatlsche Stabilität

Zur Darstellung der Stabilität eines erfindungsgemäß hergestellten Peptids gegen den Abbau durch Verdauungs- und Serumenzyme kann ein als Beispiel dienendes Peptid Arg-Pro-Asp-Val-Isopropylamid bei 37⁰C in Rattendarmsaft und Humanserum bis zu 120 Minuten inkubiert werden. Die Peptide Arg-Lys-Asp-Val-Dimethylainid und Thymopentin werden zu Vergleichsfzwecken in gleicher Weise behandelt. Die HPLC soll zeigen, daß das Arg-Lys-Asp-Val-Dimethylamid nach nur wenigon Sekunden vollkommen aufgelöst wurde. Thymopentin wird unter diesen Bedingungen in etwa 20 Sekunden zu 50% abgebaut. Von den erfindungsgemäß hergestellten Peptiden wird erwartet, daß sie sowohl in Serum als auch im Darmsaft für einen beträchtlich längeren Zeitraum als das Thymopentin oder ein Kontrollpeptid im wesentlichen unzersetzt bleiben.

Beispiel 10: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-Methy!amid A. Na-t-Butyloxycarbonyl-lN-benzyloxycarbonyO-Lysyl-lp-benzyD-Aspartyl-Vallnmethylamid

In 50ml 85%iger Essigsäure wurden 3,21 g Na-t-Bdtyloxycarbonyl-(N-benzyloxycarbonyl) (Lysyl-(ß-benzyl)Aspartyl-Valinphenylester gelöst. Zinkstaub, 5,2g, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, das Filtrat wurde mit Wasser verdünnt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert und anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der Lösungsmittelentfernung blieb ein Öl zurück. Der Zusatz von Ether und anschließend Hexan erzeugte einen gummiartigen Niederschlag. Dieses Material wurde mit Hexan pulverisiert, bis es ein trockener weißer Feststoff mit einer Masse von 1,75g war. Das Produkt wurde in 14ml Ethylacetat und 1 ml Dimethylformamid gelöst.

Nach dem Abkühlen der Lösung auf -2O⁰C wurden 0,30ml N-Methylmorpholin und anschließend tropfenweise 0,36g Isobutylchloroformiat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei -15⁰C gerührt, dann wurden 0,29ml N-Methylmorpholin und eine gekühlte Lösung aus 0,18g Meth/Iaminhydrochlorid in 10ml 95%igom Ethanol zugegeben. Es bildete sich ein dicker Niederschlag. Es wurden 5ml DMFzugesetzt, um das Rühren zu ermöglichen, und das Gemisch wurde bei 0°C 90 Minuten lang und anschließend bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zu 75ml Wasser gegeben.

Beim Rühren des Gemische wurde die organische Phase zu wachsartigen festen Kugeln. Der Feststoff wurde filtriert, und dns Filtrat wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der Rest aus der Eindampfung der organischen Phase wurde mit dem festen Produkt zusammengenommen und wurde aus Ethylacetat-Isopropylether kristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,53g, der Schmelzpunkt 183,5-184,5⁰C. Elementaranalyse: C 61,57 (61,96), H 7,21 (7,37), N 9,81 (10,04).

B. Tribenzyloxycarbonyl-Arginyl-fN-benzyloxycarbonyllLysyl-lß-benzyllAsp-artyl-Vallnmethylamld Zu 1,46g des Produktes aus Teil A oben wurden 50ml 50%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gegeben. Nach

25mihütigem Rühren wurde das Lösungsmittel verdampft, und Ether wurde zu dem Rückstand gegeben, wodurch ein weißer

Feststoff entstand. Dieses Material wurde filtriert und mit Ether gewaschen. Tribenzyloxycarbonyl-Arginin, 1,33g, wurde in 10ml DMF gelöst. Die Lösung wurde auf -2O⁰C abgekühlt, und 0,25ml N-Methylmorpholin und anschließend 0,31 g Isobutylchloroformiat in 2 ml DMF wurden zugegeben. Das Gemisch wui-do bei

-20°C 20 Minuten lang gerührt, dann wurden 0,26ml N-Methylmorpholin und eine gekühlte Lösung des Tripeptidtrifluoracetatsin 10ml DMF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei -20"C bis -1O⁰C 30 Minuten lang und anschließend bei

Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach 16 Stunden wurde das Gemisch zu 125 ml Wasser gegeben. Der Niederschlag wurde

durch Filtration gesammelt und mit warmem Methanol und Ethylacetat gewaschen. Die Ausbeute betrug 1,74g mit einem

Schmelzpunkt von 118-12O⁰C. Aminosäureanalyse: Asp 0,99; Va11,03; Tyr 0,99; Lys 0,98; Arg 1,00; Peptidgehalt 67,7%. C. Arginyl-Lysyl-Aspartyl-Valin-Methylamld Die Entfernung der Schutzgruppe aus 1,72g des Produktes aus Teil B oben erfolgte durch Reduktion mit 2ml Ameisensäure über

1 g Palladiumschwarz in 40ml Trifluorethanol. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang schnell in einem mit einem Ballonverschlossenen Kolben gerührt. Das Palladium wurde durch Filtration durch Celite entfernt und mit Wasser gewaschen. Dergrößte Teil des Tnfluorethanols wurde durch Drehverdampfung aus dem Filtrat entfernt. Der Rückstand wurde mit 5%iger

Essigsäure verdünnt und lyophylisiert. Das Produkt wog 676mg. Das Peptid wurde durch Chromatographie auf einer SP-Sephadex-Säule von 2,6cm x 85cm gereinigt, wobei mit einem Gradienten von 0,20-0,5ON NH₄OAc pH5,5 über 3L eluiert wurde. Fraktionen von 10ml wurden gesammelt und nachgewiesen

bei 206nm. Der Hauptpeak erschien in den Fraktionan 185-220; es würden drei Fraktionen genommen: 185-190,191-205 und206-220. Die Lyophilisierung ergab 21 mg, 497 mg bzw. 235mg. Die erste Fraktion enthielt eine Verunreinigung, die anderenbeiden hatten eine Reinheit über 99,5.

HPLCμ-BiOndapakC₁₈: rt = 8,5min mit0,01 M NH₄OAcpH5 Dei 2,0ml/min. Aminosäureanalyse: Asp 1,01; VaI 0,95; Lys 1,01; Arg 1,02; Peptidgehalt 56%. Dünnschichtchromatographie (Silicagel 60) R, =0,19(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyridin/1b:3:12:10) R, =0,15(EtOAc:Pyr:HjO/5:5:1:3)

R₁ =0,45(TFA:NH₄OH/2:1)

Beispiel 11: Synthese von Arg-Lys-Asp-Val-2-Propylamld A. a-Boc-e-fCbzl-Lys-lß-BzllAsp-Val

Zu einer schnell gerührten Lösung eines o.-Boc-E-i.Cbzl-Lys-lß-BzOAsp-Val-Phenylacylesters (8,02g, 10,0mmol) in 85HOAc (100ml) wurde bei Raumtemperatur säuregeätiter Zinkstaub (12,4g) gegeben. Nach einer Stunde wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum eingedampft. Der entstandene ölige Rückstand wurde in Et₂O pulverisiert. Die gebildeten Feststoffe wurden gesammelt, mit Et]O und H₂O gewaschen, unter Vakuum bei 40⁰C getrocknet, um 4,95g, 72% zu ergeben.

B. a-Boo-e-(Cbz)Lys-(ß-Bzl)-Asp-Vat-NHCH(CH3)₂

Zu einer gerührten Lösung aus Boc-Tripeptid (1,00g, 1,46mmol) in THF (5ml) wurden bei -15°C NMM (170μΙ, 1,06Äqu.) und IBuOCOCI (195 μΙ, 1,03Äqu.) gegeben. Die entstandene schwach trübe Lösung wurde 15 Minuten lang gerührt und anschließend wurde 2-Propylamin (150μΙ, 1,1 Äqu.) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf -5⁰C erwärmt. Es bildete sich ein gelatinöser Kaststoff, und dann ließ man das Reaktionsgeminch auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 16 Stunden wurde das Re&ktionsgemisch unter Vakuum bei 30°C eingedampft, und der feste Rückstand wurde mit 10%iger Zitronensäure, H₂O₁ gesättigter NaHCOyLösung und H₂O gewaschen und an der Luft Getrocknet. Es ergab sich das farblose Boc-Tripeptidamid, 2,58g, 55%.

C. (Cbz)jAra E-(CbZ)LyS-(Ii-BzI)ASP-VaI-NHCH(CHj)₂

Das Boc-Tripepüdamid (0,55g, 0,76mmol) wurde in 4,4 M HCI-Dioxan (5 ml) gelöst und 45 Minuten lang gerührt. Die Lösung wurde unter Vakuum eingedampft, und der Feststoff wurde in Et₂O pulverisiert. Die Filtration ergab das farblose HCI-Tripeptidamid, 0,51 jj. 100%.

Zu einer gerührten Lösung aus HCI-Tripeptidamid, (Cbz)₃-Arg-p-niirophenylester (0,53g, 1,0Äqu.) und HOBT (0,12g, 1,0Äqu.) in DMF wurde bei Raumtemperatur NMM (92 μΙ, 1,1 Äqu.) gegeben. Im Verlaufe von 16 Stunden bildete sich langsam ein Niederschlag. Das gelatinöse Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gerührt und filtriert. Der feste Rückstand wurde mit H₂0,10%iger Zitronensäure, H₂O und Et₂O gewaschen. Das entstandene geschützte Tetrapeptidamid wurde aus 1 HOAc/EtOAc rekristallisiert und srgab einen farblosen Feststoff, 743 mg, 83%.

D. Arg-Lys-Asp-Val-NHCH(CH,)₂

Das geschützte Tetrapeptid (0,70g, 0,59 mmol) wurde in 90%iger HOAc (50ml) aufgeschlämmt. Das Gemisch wurde mit N₂ gespült und mit 10%igem Pd-C (0,4g) beladen. Die Hydrierung in einem Parr-Schüttelapparat (250-ml-Gefäß, p₀ = 52,0psi) über 64 Stunden, die Filtration durch ein 0,45-p-Nylonfilter, die teilweise Eindampfung und Lyophilisierung ergaben das fiohteirapeptid, 365 mg.

Das Rohpeptid wurde auf CM Sephadex (Säule 2,6 cm x 93cm, 1,71,0,2M, dann 0,3MNH₄OAc, ungepuffert; Durchflußgeschwindigkeit 100 ml/Stunde, 10ml/Fraktion, Detektor 225nm). Die Fraktionen 335-370 wurden zusammengenommen und lyophilisiert und ergaben 231 mg.

Aminosäureanalyse.· Arg 1,00; Lys 1,02; Asp 0,98; Va11,00; Peptidgehalt 80,3%.

Dünnschichtchromatographie (250μ, Silicagel G)

R₁ = 0,24 (n-BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc/1:1:1:1)

Ri =0,52(n-BuOH:HOAc:H₂O:Fyiidin/15:3:12:10)

R, = 0,61 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyridin/5:1:3:5)

Die oben genannten Beispiele wurden ausschließlich zu Illustrationszwecken vorgestellt und schränken in keiner Weise den erfindungsgemäßen Umfang ein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit der Fähigkeit, die cGMP-Aktivität in der Human-T-Zellinie CEM zu erhöhen, und das die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz der Formel

R-Arg-X-Asp-Y-NR¹R²

besteht, worin

R H, niederes Alkyl, Acetyl, Formyl, niederes Alkanoyl ist;

X Pro, Dehydro-Pro, Hydrox/I-Pro, D-Lys, Aib oder Lys ist; Y GIy oder eine D- oder L-Form einer unter VaI, Ala, lie, Leu, Asp, GIu, Gin oder Lys ausgewählten Aminosäure ist;

R¹ H ist und R² niederes Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, cyclisches Alkyl oder Alkenyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, Aryl oder NHR₃, worin R₃ ein niederes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, cy :ches Alkyl oder Alkenyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder Aryl ist;

oder R¹ und R² zusammen eine Methylenkette mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen umfassen, wobei das Verfahren umfaßt

(a) schrittweises Anfügen jeder geschützten Aminosäure der Formel an eine wachsende Peptidkette, die durch kovalente Bindung an Festharzpartikel gebunden ist; Entfernen von Reagenzien und Nebenprodukten durch Filtration; Entfernen der geschützten Peptide von dem Harzpartikel; und Abspalten der Schutzgruppen; oder

(b) Durchführen der Peptid-Synthese in Lösung einschließlich schrittweises oder blockweises Kuppeln von Aminosäuren oder Peptidfragmenten, die unter die obige Formel fallen, und Verbinden der Fragmente durch Ausbilden von Amidbindungen dazwischen, wobei das Verfahren zu dem Peptid der Formel führt.

2. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Pro oder Lys ist und Y VaI ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Pro ist, Y VaI ist und NR¹R² Isopropylamid ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Anilinamid ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Formyl ist, X Pro ist, Y VaI ist und NR¹R² Methylamid ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Pro ist, Y VaI ist und NR¹R² Methylamid ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Methylamid ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Phenylhydrazid ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Piperidinamid ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Cyclohexylamid ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne., daß R H ist, X Lys ist, Y VaI ist und NR¹R² Isopropylamid ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Acetyl ist, X Pro ist, Y VaI ist und NR¹R² Hexylamid ist.

13. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eins der nach den Verfahren der Ansprüche 1-12 hergestellten Peptide mit einem pharmazeutischen Trägermittel in an sich bekannter Weise gemischt wird.

14. Verwendung eines Peptids, hergestellt nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Regulierung des Immunsystems des Menschen eingesetzt wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß dieT-Zellenfunktion des Menschen reguliert wird.