DD298275A5 - Verfahren zur reindarstellung von protein a - Google Patents
Verfahren zur reindarstellung von protein a Download PDFInfo
- Publication number
- DD298275A5 DD298275A5 DD34415788A DD34415788A DD298275A5 DD 298275 A5 DD298275 A5 DD 298275A5 DD 34415788 A DD34415788 A DD 34415788A DD 34415788 A DD34415788 A DD 34415788A DD 298275 A5 DD298275 A5 DD 298275A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- protein
- eluates
- trichloroacetic acid
- lyophilization
- added
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 14
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AEDZKIACDBYJLQ-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;hydrate Chemical compound O.OCCO AEDZKIACDBYJLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von chemisch reinem Protein A, vornehmlich aus Kulturfiltraten von Fermentationsbruehen bakterieller Produzenten dieses Proteins. Als Anwendungsgebiete des verfahrensgemaesz hergestellten Produkts kommen die Biotechnologie (z. B. Isolierung von Antikoerpern) sowie die Humanmedizin (Therapeutikum; Diagnostikum) in Betracht. Die Erfindung verfolgt das Ziel, fuer diese Verwendungszwecke chemisch reines Protein A bereitzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem man in einem 3-Schritt-Verfahren mit den Stufen{Gewinnung von chemisch reinem Protein A; bakterielle Produzenten; Kulturfiltrate von Fermentationsbruehen; 3-Schritt-Verfahren; Einsatz von Trichloressigsaeure; UEberstand; Ammoniumsulfat-Zugabe; Dialyse; Lyophilisation}
Description
zelluläres Protein, welches spezifisch Immunglobuline vom IgG-Typ an ihrem jeweiligen Fc-Abschnitt (Fc- fragment crystalline)zu binden vermag.
kovalent gebundenes Protein A Antikörper - auch monoklonal - zu isolieren. Schließlich liegen auch Ansätze zurtherapeutischen Nutzung von trägerfixiertem Protein A bei Autoimmun-Erkrankungen vor.
verfahrensgemäß hergestellten Produkts kommen die Biotechnologie (z. B. bei der Isolierung von Antikörpern) sowie die
Verfahren zur Herstellung von Protein Asind seit 1971 bekannt (siehe A. Arvidson et al., ActaPathol.Microbiol.Scand., 798,1971, 399). Als native Protein Α-Bildner wurden hierbei Staphylococcus aureus-Stämme eingesetzt, und zwar zunächst solche Produzenten, in denen das Produkt nahezu vollständig zellwandgebunden vorliegt. Sehr bald konnte für die Biosynthese aber auch S. aureus-Stammaterial eingesetzt werden, welches das Protein A in das Kulturmedium sezerniert (A. Forsgren et al., J. Bacteriol. 107,1971,245; G.Masuda et al., Infect. Immun. 2,1975,245).
M't der Arbeit von S. Löfdahl, M. Uhlen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80,1983,697 wurde erstmals ein Verfahren bekannt gemacht, in dem rokombinante Mikroorganismen-Stämme, und zwar zunächst E. coll-Stämme, zur mikrobiellen Herstellung von Protein A herangezogen worden sind. Inzwischen sind jedoch auch weitere Verfahrenslösungen zur Produktion dieser Substanz unter Rückgriff auf rekombinante Bakterienstämme, so unter Rückgriff auf Bacillus subtills-Stämme, angegeben worden (S. R. Fahnenstock & K. E. Fisher, Appl. Envir. Microbiol., 53,1987,379).
In allen bisherigen Verfahren zur Gewinnung von Protein A werden im Aufarbeitungs- bzw. Reinigungsabschnitt ausschließlich affinitätschromatographische Methoden verwendet, wobei die Zielsubstanz an Gamma-Globulin, jeweils fixiert an einen festen Träger, im Neutralbereich gebunden wird und anschließend durch Aziditätserniedrigung aufwerte um pH 3,0 eluiert wird (Feinreinigung mittels Affinitätschromatographie an immobilisiertem Gamma-Globulin).
Diese Aufarbeitungslösungen sind vergleichsweise uneffekf/, da die in ihnen benutzten Träger erst nach einer speziellen Modifizierung, d. h. nach einem Aktivtorungsschritt, einsetzbar sind, weiterhin lediglich eine beschränkte Lebensdauer aufweisen, schwer zu sterilisierer: sowie durch bakterielle Verunreinigungen zerstörbar sind. Außerdem ist ihre
Bindungskapazität nicht sehr hoch (1 mg Gamma-Qlobulin kann theoretisch nur 0,3mg Protein A binden; nach der Immobilisierung des Globulins kann häufig nur noch ein Bruchteil dieser theoretischen Kapazität genutzt werden), und bei wiederholter Verwendung der Träger ist ein beständiger Schwund ihrer Bindungskapazität zu registrieren. Weiterhin sind bislang keine 3-Schritt-Aufarbeitungsprozeduren mit den Stufen
- Abtrennung eines Rohprodukts aus einer Ausgangslösung durch Bindung an ein Adsorbermaterial,
- Ablösung des Zielprodukts vom beladenen Adsorber unter Einsatz von wenigstens einem · ι ganischen Lösungsmittel sowie
- Isolierung von reinem Protein A aus den erhaltenen Eluaten
bekannt, bei denen in der letzten Stufe Einzelverfahren angewendet werden, welche in markanter Weise von Besonderheiten im Löslichkeitsverhalten von Protein A (im Vergleich zu dem anderer bisher untersuchter Proteine) ausgehen.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die erwähnten Verwendungzwecke chemisch reines Protein A in effektiver Weise herzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein physikalisch-chemisches Aufarbeitungsverfahren zu beschreiben, mit dem aus Protein A-haltigen Ausgangslösungen in technologisch unkomplizierter Weise ein chemisch reines Zielprodukt gewonnen werden kann
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug in einem 3-Schritt-Verfahren mit den Stufen
- Abtrennung eines Rohprodukts aus Ausgangslösungen obiger Kennzeichnung, vornehmlich aus Kulturfiltratcn von Fermentationsbrühen bakterieller Protein Α-Produzenten, durch Bindung an ein Adsorbormaterial,
- Ablösung des Zielprodukts vom beladenen Adsorber unter Einsatz von wenigstens einem organischen Elutionsmittol sowie
- Isolierung von hochreinem Protein A aus den erhaltenen Eluaten
in der Weise gelöst, daß den im Mittelabschnitt der Gesamtprozedur gewonnenen Eluaten in der letzten Verfahrensstufe zunächst Trichloressigsäure zugesetzt und der nach Abschluß der (nach dieser Zugabe einsetzenden) Fällungsreaktion entstehende Niederschlag abgetrennt wird. Aus dem nach diesem Abtrennschritt verbloibonden Überstand wird anschließend durch Zugabe von Ammoniumsulfat (Teilschritt a), durch Dialyse des hierbei erhaltenen Präzipitats gegen Ammoniumbikarbonat-Puffer (Teilschritt b), gefolgt von einer Lyophilisation (Teilschritt c), dann chemisch reines Protein A isoliert.
Das voranstellend offenbarte Aufarbeitungsverfahren zu chemisch reinem Zielprodukt stützt sich auf den überraschenden Befund, daß Protein Avon wäßrigen Lösungen der allgemein als Eiweiß· und Proteinfällungsmittel bekannten Halogenfettsäure Trichloressigsäure (CCI3COOH) im Unterschied zu allen anderen bisher untersuchten Proteinen nicht zur Sedimentation gebracht worden kann. Die letzte Stufe des o.g. 3-Schritt-Verfahrens hat zuzüglich zur Entfernung der zuvor eingesetzten Elutionsmittel die Abtrennung eventuell noch verbliebener Fremdprotein-Restverunreinigungen zu leisten. Zu diesem Zweck kann in der offenbarten Weise vorteilhaft auf Trichloressigsäure-Zusätze zurückgegriffen werden, denn im Ergebnis des beschriebenen Aufarbeitungsverfahrens wird das Zielprodukt Protein A als weiße Substanz erhalten, welche in der SDS-Elektrophorese eine Bande für ein relatives Molekulargewicht von ca. 50000 zeigt (also frei von Verunreinigungen ist). Die bevorzugten Ausftihrungsformen der Erfinduno sinci zusätzlich zunächst dadurch gekennzeichnet, daß den im Mittelabschnitt der gesamten Aufarbeitungsvorschrift gewonnenen Eluaten in der letzten Verfahrensstufe unter Rühren und/ oder Schütteln Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2% bis 5% zugesetzt wird; dabei kann frühestens 30 Minuten nach Prozeßanfang mit der Abtrennung des sich bildenden Niederschlags begonnen werden. Aus den jeweils verbleibenden Überständen wird anschließend gemäß dem oben dargelegten Schlußschritt (Ammoniumsulfat-Zugabe, gefolgt von einer Dialyse gegen Ammoniumbikarbonat-Puffer und einer Lyophilisation) das chemisch reine Zielprodukt erhalten. Gute Aufarbeitungsergebnisse konnten insbesondere dann erreicht werden,
- wenn den genannten Eluaten Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt und dem nach der Fällungsreaktion verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugegeben sowie das hierbei erhaltene Präzipitat gegen 0,01 M Ammoniumbikarbonat-Puffer dialyisiert bzw.
- wenn den genannten Eluaten Trrhloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5% zugesetzt und dem nach der Fällungsreaktion verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugegeben sowie das hierbei erhaltene Präzipitat gegen 0.02M Ammoniumbikarbonat-Puffer dialysiert
wurde.
Weiterhin konnten auffallend gute Aufarbeitungsergebnisse dann erzielt werden, wenn für das verfahrensgemäße Vorgehen auf Protein A-haltige Eluate zurückgegriffen werden kann, die nach dem Verfahren einer prioritätsgleich patentierten Erfindung des Zentralinstituts herstellbar sind. Hierbei wird in der Startstufe des o.g. 3-Schritt-Verfahrens die Protein Α-Fraktion mit weitporigen Kieselgelen (mit Porengrößen im Bereich von 10nm bis 50nm) aus den jeweiligen Ausgangslösungen adsorbiert, und von den beladenen Adsorbentien dieser Spezifität wird, erforderlichenfalls nachdem in einem Waschgang im alkalischen Milieu Fremdproteine eliminiert worden sind, mit einer Lösung eines ein- oder mehrwertigen Alkohols, eines Ketons, eines Amins oder eines Amids für die weitere Aufarbeitung ein Protein A-halliges Rohprodukt eluiert.
In den einzelnen Schrittan des Verfahrens wurde die Protein Α-Konzentration dabei jeweils mittels Mancini-Technik unter Verwendung eines 0,5% Schweinenormalserum enthaltenden Agars ermittelt.
Mit der Anwendung der Erfindung werden zusätzlich zum o.g. Hauptbefund die nachstehenden Vorteile gesehen:
- Mit dem dargelegten Verfahren können Protein A-haltige Kulturüberstände bzw. Eluate aller Art (ob trüb, verfärbt oder mit Bakterien verunreinigt) sowie in Volumina aller Größenklassen behandelt werden.
- Das verfahrensgemäß hergestellte Protein A ist insbesondare auch so arm an Spaltprodukten dieser Substanz, daß die Nachschaltung einer Gelfiltration nicht erforderlich ist.
-3- 298 275 Ausführungsbeispiele
40 Liter einer nach Fermentation in Hefedialysat-Pepton-Nährboden erhaltenen Kultur von Staphylococcus aureus Cowan l/M werden zur Abtötung für" ü Minuten auf 80°C erhitzt. Anschließend wird im Separator die Biomasse abgetrennt. In den Protein A-haltigen Kulturüberstand werden 600g trockenes weitporiges Kieselgel der Sortenklassifizierung B1 (Feuchtgewicht 1550g) bei Zimmertemperatur gegeben und für 30 Minuten bis 60 Minuten eingerührt. Nach dem Abstellen des Rührers setzt sich das baladene Kieselgel B1 in ca. 5 Minuten quantitativ ab. Der Überstand wird verworfen; das beladene Kieselgel wird intensiv mit Wasser gewaschen und in ein 6-l-Gefäß (etwa Becherglas o.a.) gegeben. Anschließend wird in 3 Portionen nochmals mit je 2 Liter einer 1%igen Soda-Lösung in 15%igem ethanolischem Wasser bei pH 9,0 ± 0,5 unter Rühren gewaschen. Die Protein A-Gesemtmenge bleibt dabei gebunden.
Die so erhaltenen 1650g an beladenem, feuchtem, gewaschenem weitporigem Kieselgel obiger Sortenklassifizierung werden mit 5 Liter 0,05 M Glycin in 50%igem Ethylenglykol-Wasser bei pH 10,5 auf einer Fritte eluiert, und der Durchlauf wird in Portionen zu je 500 ml aufgefangen (das Protein A befindet sich hierbei in den Eluaten 2 bis 5, die anschließend vereinigt werden). Zu 100ml des so erhaltenen Glykoeluats, welches 0,4mg/ml Protein A enthielt, wird Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt. Der anfallende Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit Wasser auf das 4fache Volumen verdünnt, sein pH-Wert danach auf pH 5,1 eingestellt und dieser Lösung Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugesetzt. Das Präzipitat wird nach 24 Stunden bei 4°C zentrifugiert, in 10ml 0,01 M Ammoniumbikarbünat aufgenommen sowie gegen diesen Puffer gemäß Standardverfahren dialysiert. Nach einer abschließenden Lyophilisation erhält man 30mg Protein A. Das Produkt war SDS-elektrophoretisch einheitlich bei einem relativen Molekulargewicht von ca. 50000.
100g beladenes, feuchtes Kieselgel B1, welches wie in Beispiel 1 gewonnen worden war und an das 0,29g Protein A gebunden
sind, werden mit 3 Portionen (zu je 100ml) 0,1 M Glycin-Puffer; pH 2,0; enthaltend 6M Harnstoff, ausgerührt; und die Überständewerden vereinigt.
3fache Volumen Ammoniumsulfat bis zur 70%igen Sättigung zugegeben. Das hierbei entstandene Protein A-haltige Präzipitatwird gegen 0,02 M Ammoniumbikarbonat dialysiert. Nach der abschließenden Lyophilisation wurden 206mg chemisch reines
Claims (4)
1. Verfahren zur Reindarstellung von Protein A, ablaufend in den Schritten
a) Abtrennung eines Rohprodukts aus Protein A-haltigen Ausgangslösungen, vornehmlich aus den Kulturfiltraten mikrobiologischer Fermentationen, durch Bindung an ein Adsorbermaterial,
b) Ablösurrfl"des Zielprodukts vom beladenen Adsorber unter Einsatz von wenigstens einem organischen Elutionsmittel sowie
c) Abtrennung des Zielprodukts aus den erhaltenen Eluaten, gekennzeichnet dadurch, daß man
- den genannten Eluaten Trichloressigsäure zusetzt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt sowie
- aus dem verbleibenden Überstand nach Ammoniumsulfat-Zugabe, nach Dialyse gegen Ammoniumbikarbonat-Puffer und nach Lyophilisation chemisch reines Protein A isoliert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den genannten Eluaten Trichloressigsäure unter Rühren und/oder Schütteln bis zu einer Endkonzentration von 2% bis 5% zusetzt sowie frühestens 30 Minuten nach Prozeßbeginn den sich bildenden Niederschlag abtrennt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man
- den genannten Eluaten Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5% zusetzt und
- dem verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugibt und aus dem hierbei gewonnenen Präzipitat nach Dialyse gegen 0,01 M Ammoniumbikarbonat-Puffer sowie nach Lyophilisation das Zielprodukt isoliert.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man
- den genannten Eluaten Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5% zusetzt und
- dem verbleibenden Überstand Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% zugibt und aus dem hierbei gewonnenen Präzipitat nach Dialyse gegen 0,02M Ammoniumbikarbonat-Puffer sowie nach Lyophilisation das 7ielprodukt isoliert.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34415788A DD298275A5 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur reindarstellung von protein a |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34415788A DD298275A5 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur reindarstellung von protein a |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD298275A5 true DD298275A5 (de) | 1992-02-13 |
Family
ID=5620509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD34415788A DD298275A5 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur reindarstellung von protein a |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD298275A5 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
-
1988
- 1988-05-30 DD DD34415788A patent/DD298275A5/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2322533C2 (de) | Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens | |
| DE69726285T2 (de) | Isolierung von immunglobulinen | |
| DE2430356C2 (de) | ||
| DE3218348C2 (de) | Verfahren zur Extraktion von Lactoferrin aus Lactoserum | |
| DE69332268T2 (de) | Verfahren zur herstellung von rekombinant mhcii protein in mikroorganismen | |
| DE2840503C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatographische Zwecke | |
| DE2322552C2 (de) | Verfahren zum Abtrennen von Protein A aus Staphylococcus aureus aus einer Flüssigkeit | |
| JP5271354B2 (ja) | 水性二相系中での組換えタンパク質の分離方法 | |
| DE3877547T2 (de) | Basisches protein phospholipase a2 aus dem gift der schlangen aus der familie der elapiden, deren aminosaeuresequenz, derivate und fragmente dieses proteins, verfahren um es zu erhalten, therapeutische kompositionen und diagnosemittel, alle dieses protein enthaltend und/oder dessen derivate und/oder dessen fragmente. | |
| DE68907388T2 (de) | Gereinigte Protein A-Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung. | |
| DE69219015T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Peptids in hoher Reinheit und im grossen Masstab | |
| DE2640387C3 (de) | Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung | |
| EP1012191A1 (de) | VERFAHREN ZUR GEWINNUNG VON HOCHREINEM vWF ODER FACTOR VIII/vWF-KOMPLEX | |
| DE3587391T2 (de) | Verfahren zur Rückgewinnung von gereinigten Wachstumshormonen aus genetisch modifizierten Mikro-organismen. | |
| EP0207402A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinen und Polypeptiden | |
| DE69511392T2 (de) | Verfahren zur trennung von protektiven verbindungen aus bordetella pertussis | |
| EP0362520A2 (de) | Ein neues Antibiotikum, Mersacidin, ein Verfahren zur seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel | |
| DE69925870T2 (de) | Verfahren zur bereitstellung von wachstumsfaktozubereitungen (tgf-beta und igf-1) mit niedriger gegenseitiger verunreinigung aus milchprodukten | |
| DE2457047C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dessen Verwendung zur Tetanusprophylaxe | |
| DE69025375T2 (de) | Verfahren | |
| DD298275A5 (de) | Verfahren zur reindarstellung von protein a | |
| DE3687469T2 (de) | Reinigung von dem wachstumshormon angehoerenden stoffen. | |
| DE3809796A1 (de) | Verfahren zum reinigen eines 168 kd-proteins von mycoplasma pneumoniae | |
| DE69120409T2 (de) | Verfahren zur reinigung von rekombinanten proteinen und dafür nützliche produkte | |
| DE3779914T2 (de) | Neue lectine, abgeleitet von bakteriellen haaren. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |