DD298276A5 - Verfahren zur herstellung von cyclosporin a - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A, einem mikrobiellen Wirkstoff, der als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden hat. Die Erfindung verfolgt das Ziel, das Produkt auf mikrobiellem Wege mit erhoehten Ausbeuten herzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird in der Weise geloest, dasz der neue Mikroorganismus Tolypocladium inflatum SF 136 aerob auf einem Medium fermentiert wird, welches organische Stickstoff-Substrate sowie Glukose oder Maltose und Salze enthaelt, und das gebildete Cyclosporin A aus Biomasse und Kulturfiltrat durch Extraktion mit organischen Loesungsmitteln isoliert sowie nachfolgend durch Chromatographie und Umkristallisation gereinigt wird.{Cyclosporin A; Immunsuppressivum; Stamm Tolypocladium inflatum SF 136; Fermentation; Isolierung; Reinigung; Biomasse; Kulturfiltrat}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege. Dieser mikrobiell gebildete Wirkstoff hat als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes dar Technik

Mikrobielle Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege, nämlich durch die Kultivierung ausgewählter pilzlicher Mikroorganismen, sind seit 1975 bekannt (vgl. die Patentschriften CH 589716, CH 603790, DD 115695, DE 2455859 und AT 350716).

Als wichtigste Mikroorganismen werden Stämme aus den Arten Tolypocladlum Inflatum sowie Cyllndrocarpon lucldum eingesetzt, die emers oder submers auf flüssigen komplexen Medien bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 2O⁰C bis 30°C kultiviert werden, wobei das gebildete Produkt aus der gewonnenen Biomasse wie auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit Methanol gewonnen wird. Ausgedehnte screening-Untersuchungen führten zur Auffindung zahlreicher weiterer pilzlicher Spezies mit Cyclosporin-Bildungsvermögen, die jedoch biotechnologisch bislang nicht genutzt werden, so unter anderen Tolypocladitim geodes, Fuearlum solanl, Trlchoderma vlride, Neoeosmospora vaslnf ecta, Isaria fellna, Vertlclllium spec, Paecllomyces spec, Acremonlum spec. (s.a. Anlage 1).

Die beschriebenen Kultivierungsbedingungen erlauben gemäß der Fachliteratur nach 10- bis 15tägiger Fermentation Leistungen von 250Mg Cyclosporin A/ml, durch gezielte Mediumsveränderungen auch Werte bis zu 600pg/ml (Symp. on Overproduction of Microbial Products, Budejovice, Juli 1988).

Entwicklungen in Richtung Festbett-Fermentation tragen bislang nur Prinziplösungscharakterohne biotechnologische Relevanz. Charakteristisch für das verwendete biologische Material ist die Bildung von 4cm bis 4,5cm großen, weißen, ungefalteten Kolonien in der Oberflächenkultur. Diese morphologische Eigenart muß in Verbindung mit dem relativ geringen biosynthetischen Leistungsvermögen als Nachteil für eine ökonomisch effektive Herstellung von Cyclosporin A angesehen werden, da die geringe morphologische Differenzierung eine umfangreiche Wertbestimmung in der Selektion urforderlich macht und die Wachstumsintensität des stammspezifischen Mycels besondere Prozeßanforderungen wegen der Rheologie der Fermentationslösung stellt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, Cyclosporin A auf mikrobiellem Wege in erhöhten Ausbeuten herzustellen.

-2- 298 276 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, gestützt auf den Einsatz eines neuen pilzlichen Mikroorganismus ein technologisch

effektives mlkrobielles Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe Cyclosporin A in guten Ausbeuten hergestellt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst: Unter aeroben und sterilen Fermentationsbedingungen wird der Mikroorganismus Tolypocladlum Inflatum SF136 in einem flüssigen Submersmedium, welches eine organische Stickstoffquelle, Glukose oder Maltose sowie Mineralsalze enthält, bei Temperaturen von 20°C bis 3O⁰C sowie einer AcicMät von

pH 3,2 bis pH 7,5 für die Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen kultiviert.

Der Stamm SF136 ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und

experimentelle Therapie der AdW, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer IMET 43868 hinterlegtworden.

Die Fermentation erfolgt in den Stufen der Vorzucht und der Hauptkultivierung. Sporensandkonserven des genannten Stammes werden auf einem Agar-Nährmedium, welches Glukose als Kohlenstoffquelle

und (NH₄I₂SO₄ als Stickstoffquelle enthält, ausgeplattet und für die Dauer von 10 Tagen bis 12 Tagen bei 24 "C bis 25°C bebrütet.

Von den entstandenen Einzelkolonien werden die 0,5cm bis 1,0cm im Durchmesser großen, an der Unterseite dunkelbraun

pigmentierten Exemplare entnommen und nach Übertragung auf Mineralsalz-Glukose-Agar zur Ausbildung von mindestens4cm großen Einzelarealen in die erste Vorzuchtpassage übertragen. Diese besteht aus 100-ml-Steilbrustflaschen oder 500-ml-

Erlenmeyerkolben, die 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inoculummedium enthält Glukose oder Maltose

als Kohlenstoffquelle, organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach der Beimpfung für die Dauer von48 Stunden bis 72 Stunden bei 24⁰C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger mit 180rpm bis 240rpm geschüttelt. Nach Ausreifen des

Inoculums erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung der zweiten Anzuchtpassage in einer Menge von 10% des Mediumvolumens. Diese Vorzuchtstufe besteht aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die wiederum 20% ihres Volumens als Medium enthalten. Nach 48stündiger Kultivierung unter den o.a. Bedingungen wird das Hauptkulturmedium mit 5% bis 10% der Anzuchtkultur

beimpft und für die Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen unter Rundschütteln oder Rühren und Belüften kultiviert. Während des

Fermentationsprozesses erfolgt zunächst die Bildung der Biomasse, der die Synthese des Cyclosporins A folgt. Aus dem ausgetragenen Fermentationsahsatz wird das Produkt -.wie nachstehend noch detaillierter dargestellt - durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und nachfolgender adsorptive* Anreicherung und Reinigung gewonnen. Unter den

angeführten Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze in der genannten Zeit Leistungen von 800 bis 1200 pg/ml

Cyclosporin A, welches analytisch durch Einsatz der HPLC erfaßt wird. Die Fermentationslösung weist zum Erntezeitpunkt eine

rötlich-braune bis schwarz-braune Färbung bei pH-Werten von über 5,0 auf.

Die Isolierung des Cyclosporin A wird in der Weise durchgeführt, daß das Peptid aus dem Kulturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln und aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der vereinigten Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel

reextrahiert, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne gebracht wird. Bevorzugtkommen in dieser Extraktionsstufe die Lösungsmittel Aceton, Essigester und/oder Butylacetat zur Anwendung. Anschließendwird das Rohprodukt in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wieder aufgenommen und säulenchromatographischunter Verwendung von Aluminiumoxid als Adsorbens und Chloroform als Eluent gereinigt.

Aus dem kristallinen Reinprodukt, das nach Abdestillieren des Lösungsmittels der vereinigten Cyclosporin A-Frak(ionen der Säulenchromatographie resultiert, wird das Cyclosporin A durch Umfallen bzw. Umkristallisieren als kristalline Reinsubstanz

erhalten.

Eigenschaften des Cyclosporin A: Farblose, mikrokristalline Substanz aus Ether/Hexan, [al⁰ - -244 ± 4° (CHCI₃) Elementaranalyse: C 61,9; H 9,5; N 12,6; Summenformel: C₆₂Hi₁INn. Die Identität des Produktes wurde des weiteren durch vergleichende spektroskopische (IR, MS, ¹H-, ¹³C-NMR) Messungen sowie

durch vergleichende chromatographische (DC, HPLC) Untersuchungen mit authentischem Cyclosporin A bzw. durch Vergleichmit den entsprechenden Daten in der Literatur (E.Rüegger et al. 1976, HeIv. Chim. Acta 59, S. 1075) gesichert.

Die Vorteile des hier beschriebenen Herstellungsverfahrens für Cyclosporin A werden zusammenfassend gesehen

- in der Bereitstellung eines neuen Mikroorganismus, der neben dem Cyclosporin A keine weiteren, von diesem Wirkstoff schwer abtrennbaren Substanzen ins Fermentationsmedium abgibt bzw. in der Biomasse anreichert;

- in den erzielbaren hohen mikrowellen Ausbeuten;

- in der einfachen Isolierung des Cyclosporin A in nahezu quantitativen Ausbeuten sowie

- in der einfach durchzuführenden Reinigung, die bei nur geringen Ausbeuteverlustan an Wirkstoff leicht zugängliche und billige Einsatzstoffe erfordert.

Ausführungsbolspiele Beispiel 1 Sporensandkonserven des Stammes Tolypocladlum Inflatum SF136 werden auf Glukose-Mineralsalzagar aufgebracht, der

folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):

Glukose 40, (NH₄J₂SO₄ 3, KH₂PO₄1, KCI 0,25, MgSO₄ · 7H₂O 0,25, CaCO₃ 3,5, Agar 20; pH 5,3 bis 5,6(Sterilisation 30min 12O⁰C). Nach Bebrütung der Petrischalen bei 24°C bis 25⁰C für die Dauer von 10 Tagen bis 12 Tagen werden von den entstandenen Einzelkolonien 0,5cm bis 1,0cm große Exemplare ausgehoben, sofern sie eine bis zu 5cm große Aufhellungszone im Agar

aufweisen und auf Petrischalen mit gleichartigem Agar übertragen. Auf diesen entstehen innerhalb von 10 Tagen bis 15 Tagen

Einzelareale von mindestens 4cm Durchmesser, von denen die Randgebiete als Impfmaterial für die Anzucht dienen. Durch Übertragung eines ca. 1,0cm² großen Rasenstückes werden die Anzuchtkolben beimpft, die in 100-ml-Steilbrustflaschen 20ml

des folgenden Mediums enthalten (g/l):

Glukose 50, Kaseinpepton 10, KH₂PO₄1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6 (Sterilisation 30min 12O⁰C).

Nach 72stündiger Kultivierung bei 24⁰C bis 25°C auf einem Rundschwingtisch (180 rpm bis 220rpm) dient die Anzuchtpassage der Beimpfung der Hauptkultur. Diese enthält in E j-ml-Erlenmeyerkolben Jeweils 100ml des nachfolgenden Mediums (g/l): Maltose 75, Kaseinpepton 25, KH₂PO₄1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dost, sowie 1,2-Propandiol 0,5% v/v; pH 5,3 bis 5,C (Sterilisation 30min 12O⁰C). Die Vorkultur wird in einer Menge von 5% auf die Hauptkultur übertragen. Die Kultivierung erfolgt 15 Tage lang bei 24⁰C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger (180rpm-220rpm). Nach Beendigung der Fermentation wird die entstandene Biomasse durch Zentrifugation von der Kulturlösung abgetrennt und im Verhältnis 0,5:1 (v/v) mit Aceton versetzt. Nach gründlichem Aufrühren wird mindestens 24 Stunden lang die Biomasse im Aceton belassen und dann zur Wertbestimmung verwendet. Diese erfolgt in an sich bekannter Weise nach Überführung des Produktes in Chloroform, Entwässerung, Trocknung und Wiederaufnahme in Acetonitril zwecks Beschickung der HPLC-Säulen. Die Leistung derartiger Fermentationsansätze beträgt 800 Mg/m| bis 1200 Mg/ml Cyclosporin A.

Beispiel 2 Nach Selektion des Leistungsmaterials gemäß Beispiel 1 und analoger Anzucht werden Hauptkulturen in 500-ml- Erlenmeyerkolben beimpft, die jeweils 100ml des nachfolgenden Mediums enthalten (g/l): Maltose 80, Kaseinpepton 20, (NH₄J₂SO₄ 5, KH₂PO₄1, KCI 0,5, MgSO₄ · 7H₂O 0,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6 (Sterilisation

3OmIn 12O⁰C).

Die Kulturbrühe weist nach 11 tägiger Kultivierung und analytischer Bestimmung gemäß Beispiel 1 einen Gehalt von 1150pg/ml Cyclosporin A auf.

2 Liter der auf diese Weise gewonnenen Kulturbrühe werden separiert; hierbei werden 120g Biomasse und 1,81 Kulturfiltraterhalten. Die Biomasse wird 2mal mit je 0,31 Aceton 12 Stunden unter Rühren extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und das

Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C bis zur wäßrigen Phase abdestilliert. Das Kulturfiltrat wird 2mal mit je 200ml CHCI₃ extrahiert,

die vereinigten Chloroformextrakte werden im Vakuumrotationsverdampfer bet 3O⁰C eingedampft, mit dem Extrakt der

Biomasse vereinigt und nach Zusatz von 0 S I Wasser 2mal mit je 200ml Chlorofom reextrahiert. Die vereinigten Reextrakte

werden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuumrotationsverdampfer bei 30°C abdestilliert, derdunkelgefärbte ölige Rückstand in wenig Chloroform aufgenommen und an Aluminiumoxid (neutral AK St. I) mit Chloroformchromatographiert. Fraktionen, die DC-einhei\liches Cyclosporin A enthalten, werden vereinigt, im Vakuumrotationsverdampferbei 30°C eingedampft, der schwach gelb gefärbte ölige Rückstand in wenig Chloroform aufgenommen und ein zweites Mal an

Aluminiumoxid mit Chloroform chromatographiert. Die Fraktionen, die DC-einheitliches Cyclosporin A enthalten, werden

vereinigt, im Vakuumrotationsverdampfer bei 30°C eingedampft, und der nahezu farblose ölige Rückstand wird mit 40ml Hexanverrührt, wobei sich das Cyclosporin A in kristalliner Form abscheidet. Man beläßt die Cyclosporin A-Hexansuspension12 Stunden bei -5⁰C, saugt anschließend das Cyclosporin A ab, wäscht das Produkt mit kaltem Hexan und trocknet 5 Stundenbei 5O⁰C im Hochvakuum.

Ausbeute: 2,20g Cyclosporin A (94%iges Produkt) & 2,09g Cyclosporin A (100%iges Produkt) ^ 87% Ausbeute, bezogen auf

den analytisch bestimmten Gehalt von 1,2 g Cyclosporin A/I KB in der Kulturbrühe.

Zur Feinstreinigung (100%iges Produkt) wird das Cyclosporin A aus Ether/Hexan umgefällt oder aus Aceton umkristallisiert und im Hochvakuum bei 5O⁰C getrocknet.

Beispiel 3

2 Liter der nach Beispiel 2 gewonnenen Kulturbrühe (mit 1,2g Cyclosporin A/l) werden auf 20°C abgekühlt und separiert. Manerhält 250g feuchte Biomasse, die dreimal mit Essigester (2 χ 11 und 1 χ 200 ml) jeweils 1 Stunde ausgerührt wird. Dieabdekandierten Extrakte werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das so erhaltenebraungefärbte ölige Rohprodukt (8,9g) enthält 2,11 g Cyclosporin A (88% Ausbeute). Die Ausbeuten der e'nzelnen

Extraktionsstufen betragen bei der 1. Extraktion 75% (1,8g CyA), bei der 2.Extraktion 12%(u,3g CyA) unr ^: der 3.Extraktion

0,5% (0,01 g CyA).

Zur weiteren chromatographischen Reinigung des Cyclosporins A werden 60g Kieselgel (Korngröße 0,062 mm bis 0,2 mm) in Chloroform eingeschlämmt und in eine Säule (2,5cm x 50cm) eingefüllt. 1,5g des erhaltenen Rohproduktes werden in 15ml Chloroform/Methanol (99:1, v/v) gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem

durchgeführt. Die einzelnen Fraktionen zu jeweils 10ml werden dünnschichtchromatographisch überprüft. Die Cyclosporin A-enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.

Ausbeute: 422mg (80%CyA = 338mg CyA) £ 95%Ausbeute. Zur Feinreinigung erfolgt eine nochmalige Chromatographie an Kieselgel mit dem Elutionssystem Essigester/Isopropanol (95:5,

v/v). Fraktionen, die DC-einheitliches Cyclosporin A enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Derverbleibende farblose Rückstand wird mit η-Hexan verrührt und über Nacht im Kühlschrank belassen. Das Cyclosporin A wirddann abgesaugt, mit kaltem Hexan gewaschen und über Calciumchlorid getrocknet; man erhält 95%iges Cyclosporin A.

Anlage 1

Species von cyclosporinbildenden Pilzen: Acremonium sp. S 42160/F Paecilomycessp.S 84-21622/F Verticilliumsp.85-22022/F . hrcvciiqc μ μ iqqr

Isariafelina(DCperFR) ?!ί^4'«^

Fr.,S249/F Sydowia 39,12-36

Neocosmosporavasinfecta E.F.Smith Tolypocladium geodes GAMS CBS 723.70

Trichodermaviride GAUZE, G. F., et al. 1983, Antibiotiki 28,243-245 Fusariumsolani SAWAI etal. 1981, Agric. Biol. Chem. 45,5,

1223-1228

JP-138523

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A durch sterile aerobe Fermentation eines Mikroorganismus über eine Dauer von 10 Tagen bis 15 Tagen auf einem Medium mit organischem Stickstoff-Substrat, Kohlehydraten und Mineralsalzen bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 2O⁰C bis 30⁰C sowie durch Gewinnung des Produkts aus Biomasse und Kulturfiltrat, gekennzeichnet dadurch, daß man

- für die über die Stufen der Vor- und Hauptkultur geführte Fermentation den Stamm Tolypocladlum Inflatum SF136 einsetzt sowie

- im Aufarbeitungsteil des Verfahrens an eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln eine Reinigung durch Chromatographie und gegebenenfalls durch Umkristallisation anschließt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Vorkultivierungsstufe dunkelbraun pigmentierte Einzelkolonien von Stamm T.inflatum SF136, erhalten nach emerser Kultivierung auf Mineralsalzagar mit Ammoniumsalz als einziger Stickstoff- sowie Glukose als einziger Kohlenstoffquelle, einsetzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Vorkultivierungsstufe dunkelbraun pigmentierte Einzelkolonien von Stamm T.inflatum SF136, erhalten nach emerser Kultivierung auf Mineralsalzagar mit Ammoniumsalz als einziger Stickstoff- sowie Maltose als einziger Kohlenstoffquelle, einsetzt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Extraktion des Cyclosporin A aus der Biomasse Aceton, Essigester und/oder Butylacetat verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man zur chromatographischen Reinigung des Cyclosporin A Aluminiumoxid als Adsorbens und Chloroform als Eluent verwendet.