DD298821A5 - Wirts-vektor-system und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung auf dem Gebiet der Biotechnologie betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Wirts-Vektor-Systems aus einem Wirts-Mikroorganismus-Stamm der Art Arxula adeninivorans und einem Plasmidvektor mit einem Selektionsmarker, um ein industriell verwendbares Genprodukt herstellen zu koennen, wobei verschiedene bereits bekannte Vorteile der genannten Hefe-Art ausgenutzt werden koennen: hohe Zelltiter, niedriger Aufwand fuer das Kuehlen beim Fermentieren usw. Dazu wird als Selektionsmarker ein homologes Gen aus Arxula adeninivorans oder ein heterologes Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder einer anderen Hefe verwendet; fuer beide Arten wurde ein passendes Gen LYS2 gefunden. Weil dabei der p H-Wert der Gen-Produkte herabgesetzt wird, ist ein Wachstum fast aller Bakterien ausgeschlossen, was vor allem bei der Einhaltung von Stabilitaetsbedingungen vorteilhaft ist.{Wirts-Vektor-System; Hefe; Selektionsmarker; Transformation; screening; Plasmidvektor; Strukturgen; Genprodukt}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Wirts-Vektor-Systems, das aus einem Wirts-Mikroorganismus-Stamm der Art Arxula adeninivorans (zeitweilig als Art „Trichosporon adeninovoians" bezeichnet) und einem Plasmidvektor mit einem DNS-Fragment besteht, welches einen Selektionsmarker enthält,
Stand der Technik
Die Verwendung von Hefestämmen, vor allem der Art Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung beispielsweise von menschlichem Lysozym /1/, Interleukin 2121, Antithrombin III 131, alpha-Amylase aus Weizen /4/, dor Maus /5/ oder Bacillus amyloliquefaciens 161, Glukoamylase aus Aspergillus awamori 171 oder Rhizopus oryzae 181, beta-Glukanase aus Bacillus subtilis 191, Bacillus macerans /10/ oder Trichoderma reesei /11/, Chymosin /12/ oder Azetolaktat-Dekarboxylase aus Enterobacter aerogenes /13/ ist bekannt.
Dabei zeigte es sich, daß nicht jeder dieser Produkte in der für eine industrielle Ausnutzung erwünschten Art und Menge in einem Hefestamm erzeugt werden kann. Durch unterschiedliche Glykolisierung, ungenaues Abspalten von Sekretions-Sequenzen oder fehlenden oder eingeschränkten Transport des Produktes innerhalb einer Hefezelle und aus einer Hefezelle heraus werden die Eigenschaften des als Produkt beabsichtigten Proteins von dem Wirt selbst nämlich negativ beeinflußt.
Deshalb sind auch außerhalb von Saccharomyces cerevisiae eine ganze Reihe von (unterschiedlich gut funktionierenden) Wirts-Vektor-Systemen entwickelt worden, so von Candida albicans (US 4735901; EP 173668), Candida maltosa /14/; /15/, Pichia pastoris (EP 312934; DD 255544); /16/, Pichia quilliermondii /14/, Kluyveromyces lactis /17/; /18/, Hansenula polymorpha /19/; /20/, Yarrowia lipolytica (DD 267997; DD 267998; DD 269397); /21/ oder ScHzosaccharomyces pombe /22/. Alle diese Wirts-Vektor-Systeme sind jeweils für ein bestimmtes Genprodukt gut, für andere heterologe Genprodukte meist weniger geeignet.
Will man ein mit dem gewünschten (natürlichen) Protein möglichst identischen Protein (gleiche primäre, sekundäre und tertiäre Struktur, gleiche Eigenschaften) durch genetic engineering in einer Hefe herstellen, dann ist deshalb ein Test in jeweils ganz unterschiedlichen Wirts-Vektor-Systemen erforderlich, da beispielsweise der Grad und die Art der Glykosilierung oder die Ausbildung entsprechender räumlicher Strukturen wirtsspezifisch sind.
In jüngster Zeit ist auch die Art Arxula adeninivorans näher untersucht worden; vor allem einige biochemische Eigenschaften wie beispielsweise die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung einer Glukoamylase und einer beta-Glukosidase sind bereits beschrieben worden, und molekularbiologisch konnte etwa die ungefähre Größe des Genoms bestimmt werden (DD 265163; DD 268254; DD-Patentanmeldung WP C12N/327536); /23/.
Als Wirts-Vektor-System konnte Arxula adeninivorans bisher aber noch nicht benutzt werden, obwohl es gegenüber den bereits in der industriellen Verwendung befindlichen Hefen eine Reihe von Vorteilen hat, die seinen Einsatz als äußerst wünschenswert erscheinen lassen. So gestattet ein schnelles Wachstum seinen Einsatz in der „single cell production". Es handelt sich zudem um eine toxikologisch unbedenkliche Hefe, die auch in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden darf. Ferner gewährleistet das Erreichen von sehr hohen Zelltitern in der stationären Wachstumsphase eine hohe Ausbeute von intra- oder extrazellulär gebildeten Genprodukten. Schließlich ist ein Wachstum auch bei einer Temperatur bis zu 450C möglich, ganz im Gegensatz zu anderen Hefen (3O0C), so daß unter Umständen ein bei der Fermentation allgemein üblicher Kühlaufwand verringert oder weggelassen werden kann.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, bestimmte Proteine und dgl. als Genprodukte mittels Hefestämmen der Art Arxula adeninivorans zu gewinnen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Es ist demzufolge die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Wirts-Vektor-System anzugeben, in dem sowohl ein geeigneter Selektionsmarker als auch bestimmte Produktgene oder regulatorische DNS-Sequenzen untergebracht werden können.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß als Selektionsmarker ein homologes Gen aus Arxula adeninivorans oder ein heterologes Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder einer anderen Hefe verwendet wird. Der Plasmidvektor enthält dabei ein DNS-Fragment, das vorzugsweise ein Gen LYS 2 (Fig. 1) aus Arxula adeninivorans oder ein Gen LYS 2 (Fig. 2) aus Saccharomyces cerevisiae oder einer anderen Hefe besitzt. Besonders günstig ist es, wenn das Gen LYS2 aus Arxula adeninivorans durch Hybridisierung gegen das Gen LYS 2 aus Saccharomyces cerevisiae isoliert und a) ein Plasmidvektor mit einem der beiden Gene LYS2 in entsprechenden lys 2-Mutanten des Wirts-Mikroorganismus-Stammes transformiert wird, b) durch screening diejenigen Transformanton daraus ermittelt werden, die Plasmide mit dem Gen LVS 2 oder DNS aus diesen Plasmiden enthalten, und c) die Transformanten durch teilweise autonom replizierende und teilweise in das Genom des Wiris Mikroorganismus-Stammes integrierte Plasmide charakterisiert werden. Es ist denkbar, daß der Plasmidvektor ein weiteres DNS-Fragment aufweist, das oin fremdes Gen, beispielsweise ein für die Produktion ve ,i Proteinen kodierendes Strukturge/!, *-;sfweist, und daß auf dem Plasmidvektor weitere Gene oder Genabschnitte, beispielsweise zur Steuerung der Expression, vorgesehen sind.
Durch die Erfindung ist ein Wirts-Vektor-System geschaffen, bei dom auf eine Fermenterkühlung während der industriellen Vermehrung völlig verzichtet oder bei dem diese vermindert werden kann. Oberhalb 420C sind andere industriell genutzte Hefen nicht mehr lebensfähig bzw. sind sie (bei sporenbildenden Hefen) auf Sporelierung beschränkt. Weil ferner durch Stoffwechselprodukte der pH-Wert der Produkte herabgesetzt v/ird, ist ein Wachstum fast aller Bakterien ausgeschlossen, was vor allem bei der Einhaltung von Stabilitätsbedingungen vorteilhaft ist.
Damit ist aber das erfindungsgemäße Wirts-Vektor-Systcm vergleichbaren anderen Lösungen bei der praktischen Ausnutzung im Produktionsprozeß überlegen.
Ausführungsbeispiel
Weitere Vorteile und die näheren Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen '
Fig. 1: die Restriktionskarte des LYS2-Gens aus Arxula adeninivorans Ls3,
Fig. 2: die Restriktionskarte des LYS2-Gens aus Saccharomyces cerevisiae,
Fig. 3: ein Plasmid Yep 13/chromosomale DNS Ls3 (in den unikalen BamHI-Restriktionsort des Plasmids Yep 13 wurden mit der
Restriktionsendonuklease Sau3A geschnittene Fragmente chromosomaler DNS eingebaut),
Fig.4: die Restriktionskarte des ILV1 -Gens von Arxula adeninivorans Ls3 (mittels Komplementation der ilvA-Mutation in
Escherichia coli Cu 106 kann 'υ genaue Länge des ILWGens bestimmt werden),
Fig. 5: ein Planmid pTALa 2,
Fig.6: ein Plasmid pBaoi,
Fig.7: ein Plasmid ρίΙνΊ (LYS2),
Fig.8: ein Plasmid püv 1/3,
Fig.9: ein Plasmid pDP 12,
Fig. 10: ein Plasmid pDP 13 und
Fig. 11: ein Plasmid pLYS2.
Bei den Darstellungen der DNS in den Plasmiden bedeutet eine einfache dünne Linie Herkunft aus Escherichia coli, eine doppelte dünne oder breite Linie Herkunft aus Saccharomyces cerevisiae und eine e'nfache oder kreuzförmig geschaffte Linie Herkunft aus Arxula adeninivorans.
1. Herstellung von Genbanken von Arxula adenlnivorans Ls3
1.1. Isolierung von chromosomaler DNS von Arxula adenlnivorans Ls3
Die Hefe A.adeninivorans Ls3 wird für 18h in 300ml Hefe-Vollmedium (HVM) bei 370C inkubiert, welches 1 % Glukose, 0,5% Pepton und 0,5% Hefeextrakt enthält. Nachdem die Hefezellen mit 5000g 10min lang abzentrifugiert und zweimal in einer Lösung von 2 mM Tris und 5OmM EDTA, 2,5% SDS mit pH = 8,0 gewaschen worden sind, werden sie bei -20°C eingefroren. Die Hefezellen werden mechanisch durch Zerreiben mit Trockeneis aufgeschlossen und anschließend in einer Lösung von 6,4ml TE (d.i.10mMTrisund1mMEDT,\mitpH = 8,0),0,6mlO,5molaremEDTA,0,6m;imolaremTrismitpH = 7,4und0,3,2ml10%igem SDS suspendiert und 30min lang unter Schütteln bei 650C inkubiert. Nach Zugabe von 4ml 4molarem Natriumazetat von pH = 7,0, einstündiger Inkubation bei 0°C rnd 15minütiger Zentrifugation bei 15000g verden die Nukleinsäuren mittels 2,5VoI Ethanol ausgefällt, bei ebenfalls 15000g abzentrifugiert und in 4 ml TE gelöst. Die noch vorhandene RNS wird durch Zugabe von 0,3ml RNase auf eine Endkonzentration von 0,1 g/l und 30minütiger Inkubation bei 370C abgebaut, die Proteine durch weitere Zugabe von 0,25ml Pronase N (Vertrieb: SERVA Feinbiochemica GmbH & Co.) auf eine Endkonzentration von 1 g/l und nachfolgender abermaliger 30minütiger Inkubation bei 370C. Ein vollständiger Abbau der Proteine in der Nukleinsäure-Lösung findet nach dreimaligem Zufügen von Phenol/Chloroform (im Verhältnis 1:1) und anschließender einmaliger Chloroformbehandlung statt. Danach werden Vio Volumen 3molares Natriumazetat und 2 Volumen Ethanol zugesetzt und die DNS bei -2O0C für 18h ausgefällt. Die isolierte DNS wird abschließend in einem möglichst kleinen Volumen (<5ml) gelöst.
1.2. Herstellung von Genbanken der Gattung Arxula adenlnivorans
Mit Hilfe der unter 1.1. beschriebenen Methode wird eine chromosomale DNS mit einem Molekulargewicht von 8OkBp isoliert. Nach partieller Spaltung dieser DNS mit der Restriktase EcoRI und Isolierung von 10 bis 15kBp großen, restriktase-erzeugten DNS-Fragmenten /24/ werden diese in den Phagen Charon 4 A eingebaut, und man erhält so eine Genbank von etwa 400000 rekombinanten Phagen.
Zusätzlich werden die 8OkBp großen chromosomalen DNS-Fragmente partiell mit der Restriktase Sau 3 A gespalten. Man isoliert 5 bis 8kBp große DNS-Fragmente und baut sie in den unikalen Restriktionsort BamHI eines Hybridplasmids Yep 13, bestehend aus DNS von E.coli und S.cerevisiae /25/ ein (Fig.3).
2. Screening der beiden Genbanken aus 1.2.
Aus den ca. 400000 rekombinanten Phagen (Charon 4A/Ls3) werden mittels DNS-Hybridisierung Gene wie folgt isoliert und identifiziert.
Mit dem Phagen Charon 4A/Ls3 infizierte Zellen von E.coli LE392 (supE supF hsdR" M+S+ met trpR Iac) werden auf NBY-Agar-Platten durch Überschichtung des Grund-NBY-Agars aufgetragen und 18 h bei 370C inkubiert. Nach Bildung von Phagen-Plaques werden diese auf Filter aus Nitrozellulose überführt, durch zweimaliges, 5 min währendes Waschen mit einer 0,5molaren NaOH-Lösung lysiert und deren DNS denaturiert und anschließend durch wiederum zweimaliges und 5 min währendes Waschen in imolarorTris-HCI von pH = 7,4 und 5min Behandlung in 1,5molarer NaCI mitO,5molarerTris-HCI vonpH = 7,4 wieder neutralisiert.
Die Filter mit der nunmehr fest adsorbierten einzelsträngigen DNS der Phagen Chargon 4A/Ls3 werden jotzt 2h bei 8O0C inkubiert und anschließend 5min in einer 6 χ SSC-Lösung(10 χ SSC bestehen aus 1,5MNaCI, 0,15M Natriumzitrat; pH = 7,0) bei Raumtemperatur behandelt. Noch vor der „Vorhybridi Jerung" sind die Filter 1,5h bei 5O0C in einer Vorwaschlösung aus 5OmM Tris mit pH = 8,0,1 M NaCI, 1 mM EDTA und 0,5% SDS inkubiert worden, und danach ist dann bei 5O0C einer Lösung von 0,25% Magermilchpulver, 0,1 % SDS und 0,1 g/l Kalbsthymus-DNS 4 h lang vorhybridisiert worden.
Für die Hybridisierung wird die gleiche Lösung verwendet, die aber zusätzlich eine radioaktiv markierte DNS /26/ enthält; sie wird bei 50°C 20h lang vorgenommen.
Danach werden die Filter je einmal in einer 2 χ SSC-Lösung mit 0,1 % SDS bei Raumtemperatur und bei 500Q gewaschen, und zwar jeweils 30 min lang, und schließlich noch einmal in einer 1 χ SSC-Lösung mit 0,1 % SDS bei wiederum 5O0C für 1 h. Nach Abtrocknung werden durch Autoradiographie die DNS-Stränge der hybridisierten Phagen-Plaques sichtbar.
In derTabelle 1 ist das Ergebnis der Hybridisierung von Genen bzw. Promotor- und Terminatorsequenzen von S.cerevisiae, Bacillus und E.coli mit 32P-markierter chromosomaler DNS aus A.adeninivorans Ls3 aufgelistet.
Organismus DNS-Fragment Hybridisierung
S.cerevisiae LYS2 +
LEU 2 ARG4 URA3 TRP1 HIS3
AROM +
CEN6 +
CEN5 +
CUP1 +
SUP4 TY96
GAL1 Promotor GAP Promotor -
Organismus DNS-Fragment Hybridisierung
ADH1 Promotor/Terminator -
PHO 5 Promotor/Terminator -
CYC1 Promotor/Terminator -
Neurosporacrassa BmI" - '
E.coli aroA +
B.amyloliquerfac'ens amyA
B.macerans bglM —
Ist in Tab. 1 ein „+"-Zeichen eingetragen, dann konnte die Hybridisierung im Kontrollversuch nachgewiesen werden.
Durch Hybridisierung der DNS dor LYS2-Region von S.cerevisiae gegen die DNS der rekombinanten Phagen (Charon 4A/Ls3) ist es möglich, ein DNS-Fragment von A. adeninivorans zu isolieren, dessen DNS-Sequenz derjenigen der LYS 2-Region sehr ähnelt bzw. das zugehörige Gen kodiert. Durch verschiedene Restriktions-Spaltungen kann davon die Restriktionskarte der Fig. 1 ermittelt werden.
Das screening aller Yep 13/chromosomale DNS-Klon§,erfolgt durch Komplementation der entsprechenden E. coli-Mutanten.
Das Ergebnis zeigt Tabelle 2.
Tab. 2
| Gen | Komplementation | Gen | Komplementation |
| argH | - | ilvA | + |
| aroA | - | aroB | - |
| aroC | _ | aroD | — |
| aroE | — | sroFGH | — |
| trpE | - | pyrF | - |
| pyrC | - | pro | - |
Es gelingt also, die ilvA-Mutation zu komplementieren und von den entsprechenden Ls3-DNS-Fragmenten eine Restriktionskarte aufzustellen. Durch Umklonierung dieser (und noch kleinerer) DNS-Fragmente in E.coli-Plasmido pAT153 /24/) und in „bluescribe"-Vektoren der Fa. Stratagene und darauffolgende Überprüfung der erhaltenen Klone auf Komplementation der ilvA-Mutation von E.coli Cu 106 (ilvAgalT) gelingt es, die Länge dieses DNS-Fragments auf 1,6kBpzu verringern (siehe Fig.4).
3. Transformation von Arxula adenlnivoran Ls3
Voraussetzung für die Transformation ist, daß neben den entsprechenden Genen auch die zugehörigen Mutanten verfügbar sind. Mittels Mutagenese mit Nitrosoguanidin wurden die folgenden A.adeninivorans-Mutanten isoliert:
A.adeninivoransl266 ade lys2/5
A. adeninivorans 1317 nie Iy s 2/5
A. adeninivorans 1704 cys Iy s 2/5
Weil das Gen LYS2 und das Gen LYS5 ein Protein, das Enzym Aminoadipat-Reduktase kodieren, ist es nicht möglich, mittels biochemischer Untersuchungen zu klären, ob die oben angegebenen Mutanten 1266,1317 oder 1704 Iys 2- oder lysS-Mutanten
Es kann nun versucht werden, in diese Mutanten Plasmide zu transformieren, die bei erfolgreicher Transformation eine phänotypische Komplementierung der Iys2-Mutation erreichen. Dabei zeigt es sich, daß dies bei A.adeninivorans 1704 möglich ist. Deshalb wird diese Mutante als „I704 (cys Iys2)" bezeichnet. Wegen einer geringen Reversionsrate von < 10~8 ist ein solcher Stamm für die nachfolgend beschriebenen Transformationsexperimente besonders geeignet.
3.1. Optimierung derTransformanten Arxula adeninivorans/Ls3
Es wird eine bereits beschriebene Methode /27/ für die Transformation von A. adeninivorans/Ls3 modifiziert.
Besonders günstig ist es, wenn wie folgt verfahren wird.
A.adeninivorans-Zellen werden in MVM bis zu einer Zelldichte von etwa 5 x 108-Zellen/ml kultiviert. Daraus werden 10B-Zellen entnommen, abzentrifugiert und in 1 x TE (1OmM Tris und 1 mM EDTA mit pH = 8,0) gewaschen. Die 5min lang mit 5000g bei 20°C zentrifugierten Zellen werden in einer Lösung von 2OmM Tris mit pH = 7,5,2mM EDTA und 0,2M LiCI suspendiert und 1 h bei 3O0C langsam geschüttelt. Anschließend werden Aliquote (0.1 r,il entsprechend 107-Zellen) abgenommen, und dazu werden 0,001 mg Plasmid-DNS gegeben. Nach abermaliger 30minütiger Inkubation bei 300C und bei langsamem Schütteln wird ein gleiches Volumen 70%iges Polyethylenglykol (PEG 4000) zugegeben. Nun werden die Proben erneut 1 h lang bei 300C inkubiert; anschließend wird eine Hitzebehandlung während 5min bei 370C vorgenommen und nach wiederum 5minütiger Inkubation im Eisbad werden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit destilliertem Wassergewaschen und in 0,2ml SOS (1M Sorbit, 1OmM CaCI2 und 33% HVM mit pH = 6,0) 1 h lang bei 3O0C unter leichtem Schütteln suspendiert. Anschließend werden in bekannter Weise /28/ entsprechende Aliquote auf Hefe-Minimalmedium HMM /29/ mit den entsprechenden Supplementen ausplattiert und 3d bis 5d bei 300C inkubiert.
Es wurde ohne Erfolg versucht, bessere Ergebnisse durch Veränderung des zur Transformation gehörigen Zelltiters, der Konzentration von LiCI und PEG und der Temperatur während des Hitzeschocks zu erzielen.
3.2. Transformation In A. adenlnlvorans 1704
Für alle weiteren Transformationen wird als Selektionsmarker das LYS2-Gen sowohl von A. adeninivorans (Fig. 1) als auch von S.cerevisiae (Fig. 2) benutzt. Beide Gene sind in den gemäß Fig. 5 bis Fig. 11 konstruierten Plasmiden vorhanden. Es wird versucht, die Transformation gemäß 3.1. in A. adeninivorans 1704 auszuführen. Das Ergebnis zeigt Tabelle 3.
Tab. 3
| Plasmid | Transformations | Anzahl der Transfor- |
| frequenz | manten/0,001 mg DNS | |
| pDP12 | 1,8 x 10"e | 18 |
| pDP13 | 7,0 x 10"7 | 7 |
| pLYS2 | 2,0 x 10"7 | 2 |
| pTALa2 | 9,0 x 10"7 | 9 |
| pBao2 | 2,0 x 10"7 | 2 |
| pilv1(LYS2) | 3,0 x 1G"7 | 3 |
| pilv1/3 | 0 | 0 |
Der Versuch wurde also belohnt: es konnten Transformanten nachgewiesen werden, sowohl bei Verwendung des S. cerevisiae-LYS2-Gens als auch des A.adeninivorans-Ls3-Gens als Selektionsmarker. Das Plasmid pilv1/3, das keinen dieser beiden Selektionsmarker enthielt, diente als Kontroll-Plasmid.
3.3. Charakterisierung der Transformanten
Die oben isolierten A. adeninivorans-Transformanten weisen auch bei Wachstum unter nicht-selektiven Bedingungen eine hohe mitotische Stabilität auf (90% bis 95% nach 16 Generationen), deren Ursache die Integration der Plasmide in das Hefegenom ist. Mittels Retransformation der Gesamt-DNS /30/ in E.coli DH 5 /31/ gelingt es, Plasmide zu isolieren, die neben dom beta-Laktmase-Gen (Ampizillin-Resistenz) das entsprechende LYS2-Gen enthalten, sich hinsichtlich ihres Molekulargewichtes jedoch vom jeweiligen Ausgangsplasmid unterscheiden. Ursache hierfür ist möglicherweise die Integration in das und anschließende Wiederfreisetzung aus dem Genom von A. adeninivorans, ein Phänomen, das auch bei anderen Hefearten wie Candida maltosa schon bekannt und beschrieben /15/ ist.
Literatur
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Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung eines Wirts-Vektor-Systems, das aus einem Wirts-Mikroorganismus-Stamm der Art Arxula adeninivorans (zeitweilig als Art „Trichosporon adeninovorans" bezeichnet) und einem Plasmidvektor mit einem DNS-Fragment besteht, welches einen Selektionsmarker enthält, dadurch gekennzeichnet, daß als Selektionsmarker ein homologes Gen aus Arxula adeninivorans oder ein heterologes Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder einer anderen Hefe verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Fragment ein Gen LYS 2 (Fig. 1) aus Arxula adeninivorans oder ein Gen LYS2 (Fig. 2) aus Saccharomyces cerevisiae oder einer anderen Hefe enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen LYS2 aus Arxula adeninivorans durch Hyb;idisierung gegen das Gen LYS 2 aus Sacharomyces cerevisiae isoliert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
a) ein Plasmidvektor mit einem dor Gene LYS2 in entsprechenden Iys2-Mutanten des Wirts-Mikroorganismus-Stammes transformiert wird,
b) durch screening diejenigen Transformanten ermittelt werden, die Plasmide mit dem Gen LYS2 oder DNS aus diesen Plasmiden enthalten, und
c) die Transformanten durch teilweise autonom replizierende und teilweise in das Genom des Wirts-Mikroorganismus-Stammes inteqrierte Plasmide charakterisiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor ein weiteres DNS-Fragment aufweist, das ein fremdes Gen, beispielsweise ein für die Produktion von Proteinen kodierendes Strukturgen, aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Plasmidvektor weitere Gene oder Genabschnitte, beispielsweise zur Steuerung der Expression, vorgesehen sind.
Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33979790A DD298821A5 (de) | 1990-04-17 | 1990-04-17 | Wirts-vektor-system und verfahren zu seiner herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33979790A DD298821A5 (de) | 1990-04-17 | 1990-04-17 | Wirts-vektor-system und verfahren zu seiner herstellung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD298821A5 true DD298821A5 (de) | 1992-03-12 |
Family
ID=5617876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD33979790A DD298821A5 (de) | 1990-04-17 | 1990-04-17 | Wirts-vektor-system und verfahren zu seiner herstellung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD298821A5 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE10022334A1 (de) * | 2000-05-08 | 2002-01-10 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Proteinproduktion in der Hefe Arxula |
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| DE102007027619A1 (de) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Biosensor |
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1990
- 1990-04-17 DD DD33979790A patent/DD298821A5/de unknown
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| WO2001085925A3 (de) * | 2000-05-08 | 2002-07-11 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Verfahren zum herstellen von proteinen in einer hefe der gattung arxula und dafür geeignete promotoren |
| DE10060133B4 (de) * | 2000-11-27 | 2006-07-13 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Wirts-Vektor-System für die heterologe Genexpression in der Hefe Debaryomyces |
| DE102007027619A1 (de) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Biosensor |
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Legal Events
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| RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| ASS | Change of applicant or owner |
Owner name: ERNST-MORITZ-ARNDT-UNIVERSITAET GREIFSWALD Effective date: 19940316 Owner name: INSTITUT FUER PFLANZENGENETIK UND KULTURPFLANZENFO Effective date: 19940316 |
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| IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20100418 |