DD298948A5 - Neue cytokine - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Polypeptide mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefaehr 160 kD, die Entzuendungsvermittler oder Vorlaeufer davon sind, Derivate der Polypeptide, beispielsweise Mutanten und Fragmente, Verfahren zu ihrer Herstellung, Desoxyribonukleinsaeure (DNA) und Hybridvektoren, die fuer die genannten Polypeptide und Derivate kodieren, Wirtszellen, die mit solchen Hybridvektoren transformiert sind, polyklonale und monoklonale Antikoerper, die fuer die genannten Polypeptide oder deren Derivate spezifisch sind, und Antikoerper-Derivate sowie diagnostische und therapeutische Methoden fuer Entzuendungs-Zustaende und Hodgkin Lymphoma.{Polypeptide; Entzuendungsvermittler; Polypeptid-Mutanten; Polypeptid-Fragmente, DNA (Desoxyribonukleinsaeure); Hybridvektoren; Wirtszellen; polyklonale Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Entzuendung; Hodgkin Lymphoma}

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide mit einem scheinbaren Molokulargowicht von ca. 16OkD(ID = 1 Dalton = 1,66 x 10"^Mg),die Entzündungsüberträger oder Vorläufer von Entzündungsüborträgorn sind, deren Derivate wie z. B. Mutanten und Fragmente, Prozesse zu ihrer Herstellung, DMAs und Hybridvektoren, wolcho die genannten Polypeptide und Derivato kodieren, und Wirtszellen, die mit derartigen Hybridvektoren transformiert sind, polygonale und monoklonal Antikörper, die für die genannten Polypeptide oder ihre Derivate spezifisch sind, und Antikörper-Derivate sowie diagnostische und therapeutische Methoden für Entzündungszustände und Hodgkinsche Lymphome.

Cytokine sind biologisch aktive, lösliche Polypeptid-Üborträget (Mediatoren), welche die Differenzierung, Aktivierung und Vermehrung verschiedener Zelltypen des Immunsystems kontrollieren, zum Beispiel die Induktion oder Modulation von Makrophagenfunktionen. Beispiele für Cytokine sind die gut charakterisierten Interferone, Interleukine und der das Koloniewachstum stimulierende Faktor sowie der Makrophagenmigrationshemmfaktor (MIF) und der Makrophagenaktivierungsfaktor (MAF), die Makrophagenhemmungs- bzw. -aktivierungseigenschaften aufweisen. Cytokinen sind zahlreiche Aktivitäten zugeschrieben worden, obwohl wenige davon auf einzelne Moleküle zurückgeführt werden können. Beispielsweise wird der humane MIF, den man sich als aus oincr Gruppe von Polypeptiden bostohend denkt, in vitro in einem Test definiert, der die Hemmung der zufälligen Makrophagenmigration mißt. In vivo spielt der humane MIF eine wichtige Rolle im Frühverlauf zellulärer Immunreaktionen („verzögerte Überempfindlichkeit") durch seine Übertragung von Makrophagenfunktionen. Im allgemeinen führt die erste Einwirkung eines Antigens auf einen Patienten zu keiner merklichen Veränderung, aber der Immunstatus des Empfängers verändert sich deutlich. Nach dem zweiten Kontakt mit dom Antigen zeigt sich die verzögerte Überempf'indlichkeitsroaktion durch die Infiltration von Zellen, beginnend mit einer perivaskulären Akkumulation von Lymphozylon und Monozyten an der Stelle, wo sich das Antigen befindet. Einiijo dieser Zellen sind infolge des ersten Kontakts mit dem Antigen spezifisch sonsibilisiort. Diese Zellen reagieren mit dom Antigen, was zur Freisetzung von Lymphokinen und zur Anziehung und Retention großer Mengen nichtsonsibilisierter Zellen führt. Insbesondere nimmt man an, daß die Produktion von MIF zur Anziehung von Monozyten führt, die durch das Endothol der Blutgefäßwand hindurch in das umgobende Gewebe eintreten. Gleichzeitig mit dieser Infiltration differenzieren sich die Monozyten zu Gewebemakrophagen. Das makroskopische Erscheinungsbild, das bei verzögerter Überempfindlichkeit zu beobachten ist, besteht in einer Schwellung am Kontaktort mit dom Antigen und einer Rötung, die durch die Erweiterung der darunterliegenden Blutgefäße verursacht wird. Unter normalen Bedingungen klingt die Entzündungsreaktion nach etwa zwei bis drei Tagen ab, wenn mögliche Gewebeschäden repariert worden sind. Aus unbekannten Gründen können jedoch Entzündungen chronisch werden und zu ausgedehnten Gewebeschäden führen, z. B. zu Rheumatoidarthritis. Eine mögliche Erklärung für die Entstehung einer chronischen Entzündung könnte sein, daß am Anfang die Differenzierung der infiltrierten Makrophagen außer Kontrolle geraten ist.

Ziel der Erfindung

Ein Ziel der Erfindung bostoht darin, Polypeptide, insbesondere humnno Polypeptide, dio Entzündungsüborträgür odor Vorläufer von Entzündungsüborträgorn sind, und ihre Dorivato in hohor Rolnhoit und ausrolchondor Mongo zu erzougon sowio Vorfahren zu ihrer Herstellung boroitzustellen. Das Problem der industriellen Polypeptidsyntheso läßt sich durch dio Methoden dor DNA-Rekombinationstechnik lösen. Ein weltoros Ziel dor Erfindung ist dahor dio Erzeugung von DNAs und Hybridvuktoren, wolcho din gewünschton Polypeptide und ihre Dorivato kodieren, sowio von Wirton, dio mit dorortigon Vektoren transformiert sind. Weitero Ziele 3ind Produktionsverfahren für dio genannten DNAs, Voktoron und transformierten Wirtszollon. Die erfindungsgomäßon Polypeptide sind verwendbar, um zu oinom besseren Verständnis dos mononuklearon Phagozytonsystoms in klinisch wichtigonGobieton zu gelangen, wie z. B. dor Widerstandsfähigkeit gegen Infoktion, dor Kontrollo von Metastasen, Entzündungsprozesson, und der Wiederherstellung von Gewebe. Dementoprochond sind ein weiteres Ziel der Erfindung pharmazeutische Präparate, die Polypeptide oder deron Dorivato enthalten, sowio Vorfahren zu ihrer Herstellung. Außerdem sind die orfindungsgomäßon Polypeptide und Dorivato für dio Untersuchung, Identifikation und Produktion von Antagoniston verwendbar, die als Modikamento gegon Entzündungen oingosotzt worden könnon.

Ein weiteres Ziel dor Erfindung bostoht in dio Entwicklung spezifischer Antikörper gogon dio orfindungsgemäßon Polypeptide bzw. Derivate. Solcho Antikörper können zur Diagnose von Entzündungszuständon und zur Überwachung el or Behandlung solcher Zustände eingesetzt wordon. Forner sind dio Antikörper für dio Diagnose und Behandlung Hodgkinschor Lymphomo verwendbar.

Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft Polypeptide, insbesondere humane Polypeptide, mit oinom schoinbdren Molekulargewicht von ca. 16OkD

(1D = I Dalton = 1,66 x 10~²⁴g), die Entzündungsüberträgor oder Vorläufer von Entzündungsüborträgern sind, sowie ihreDerivate.

Überträger (Mediatoren) von Entzündungen sind chemische Signaimolekülo, die Entzündungsreaktionen induzieren. Vorläufer von Polypeptid-Überträgern sind Vorstufen von Überträgern, d. h. Polypeptide, dio nach ihrer Produktion verarboitet

oder beschnitten werden, z. B. durch Abschneiden bestimmter torminalor Aminosäuresequenzen und/oder durch

Glycosylierung, und dadurch in die aktiven Überträger umgewandelt wordon odor, falls der Vorläufer selbst ein aktiver Überträger ist, ihre Überträger-Aktivität beibehalten. Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Derivate spielen eine wichtige Rollo in don immunologischen Prozessen, die an Entzündungszuständen beteiligt sind. Die Entzündungsüberträger-Aktivität der beanspruchten Polypeptide kann zum Boispiel

durch ihre Fähigkeit zur Induktion einer örtlichen Entzündung, beispielsweise bei einem normalen Meerschweinchen,nachgewiesen werden.

Im allgemeinen läßt sich das scheinbare Molekulargewicht oinos Polypeptide unbekannter Struktur nach herkömmlichen Methodon bestimmen, z. B. durch Sedimentationsanalyse und Bestimmung des Diffusionskooffizicnten oder durch

golelektrophoretische Methoden, insbesondere durch Polyacrylamidgoloktrophorose in Gegenwart von Natriumdodocylsulfat(SDSPAGE).

Im besonderen betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit der Bezeichnung MRP-160, das ein Entzündungsüberträger oder Vorläufer eines Entzündungsüborträgers ist, mit der in SEQ ID NO: 1 angogebonen Aminosäuresequenz, oder Derivate dieses Polypeptide. Das berechnete Molekulargewicht vom MRP-160 beträgt 160989. Erfindungsgemäße Derivate sind Mutanten der erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere Mutanton der Polypeptide mit

dor in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz, wobei eine oder mehrere einzelne Aminosäuren, insbesondere nichtmehr als 10% der Aminosäuren, doletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt odor zusätzliche Aminosäuren inseriertwerden.

Weiterhin sind erfindungsgemäße Derivate Fragmente eines erfindungsgemäßen Polypoptids oder einer seiner Mutanten,

insbesondere Fragmente eines Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 1 rngegobenen Aminosäuresequenz oder einer Mutantedavon, die mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren enthalten.

Bevorzugt wird ein Fragment, das die Aminosäuren 878 bis 1427 der in SEQ ID NO: ι angogobonen Aminosäuresequenz enthält,

wobei das N-terminalo Ende Wassors'.off, Acyl, die Aminosäuresequenz Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly oder die

Aminosäuresequenz Mot-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly ist. Das Fragment, das die N-terminale Aminosäuresequenz Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly enthält, wird mit rMRP-70 bezeichnet. Das vorausgesagte Molekulargewicht des Fragments mit der Bezeichnung rMRP-70 ist 64714, aber bei der Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese wandert dieses Peptid wie ein Peptid mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 7OkD im Vergleich zu den Standard-Markerproteinen. Außerdem sind erfindungsgemäße Derivate Verbindungen, die aus oinem Polypeptid, einer Mutante oder einem Fragment

gemäß der Erfindung abgeleitet sind, insbesondere aus MRP-160, einer Mutante oder oinem Fragment davon, wobei funktionell

Gruppen, z. B. Amino-, Hydroxyl-, Mercapto- oder Carboxylgruppen, dorivatisiert, z. B. glycosyliert, acyliert, amidiert oder

verestert werden. In glycosyliorten Derivaten wird ein Kohlenwasserstoffrest oder ein Oligosaccharid mit Asparagin, Serinund/oder Threonin verbunden. Acylierte Derivate worden an Aminogruppen, besonders an der N-terminolen Aminogruppe,oder an Hydroxylgruppen, besonders von Tyrosin oder Serin, durch die Acylgruppe einer natürlich auftretenden organischenoder anorganischen Säure substituiert, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure. Bevorzugt werdenglycosylierte erfindungsgemäße Dorivate.

Weitere erfir.:' jngsgemäße Derivate sind Salze, insbesondere pharmazeutisch akzoptierbare Salze, zum Beispiel Metallsalze wie Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, etwa Natrium-, Kalium-, Ma jnesium-, Kalzium- oder Zinksalze oder Ammoniumsalze, die

mit Ammoniak oder einem geeigneten organischen Amin gebildet werden, wie z.B. mit einem niederen Alkylamin, etwa

Triethylamin, einem niederen Hyroxyethylamin, etwa 2-Hydroxyethylamin u.ä.

Bevorzugt wordon Dorivoto von erfindungsgomäßon Polypoptldon mit oinom scholnbaron Molokulargowicht von 19OkD odor mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 14OkD, die duich transfiziorto Zellon oder natiii liehe Zollon wlo Endotholzollon produziert werden. Sio können mittols Standardvorfahron, wie z. B. Wostorn Blots, boobachtot worden. Die Erfinduno betrifft außordom Horstollungsprozosso für Polypoptido, dio Entzündungsüborträgor odor Vorläufoi von Entzündungsüborträgern sind, d. h. natürliche, rokomblnanto odor synthotischo Polypoptido und Derivate gomäß der Erfindung. In einer Ausführungsform der Erfindung werdon dorartigo Verbindungen nach oinom Verfohron horgostollt, boi dem oino Lösung, die orfindungsgomäße Polypeptide oder Derivato onthält, z. B. oinen wahlweise vorgoroinigton Zolloxtrakt, Zellonüberstand oder ein Kulturfiltrat von stimulierton normalen monschlichon Leukozyten oder von gentechnisch boarboitoton Mikroorganismen oder kontinuierlichen Siiugotiorzollinlen, mittols chromatographischor Methoden goroinigt, und nötigenfalls wordon dio Verbindungen isoliert und in Ihre Derivate umgewandelt.

Zolloxtrakto, Zollenüberstände und Kulturfiltrato stimuliortor normaler menschlicher Loukozyten, dio natürliche orfindungsgomäßo Polypeptide onthalton, worden horgostollt, wio boispiolswoiso in dor Europäischen PA 0162812 für MIF beschriobon. Im einzolnon worden normalo humano mononuktoaro Zollon durch gooignoto Zusätze, z.B. Concavalin A odor Phytohämagglutinin, zur Produktion von Lymphokinon angoregt und nach üblichen Vorfahren kultiviert. Wahlweise könnon dann Zollextrakte, ZollonüborstSndo oder Kulturfiltrato durch Immunoaffinitätschromatographie vorgoroinigt werdon. Chromatographischo Methoden, dio zur Präparation dor gowünschton Verbindungen in Betracht gozogon wordon, sind dio lonenaustauschchromatographio, dio Umkehrphason-Hochloistungsflüssigkoitschromatographio, die Gelfiltration, die Ausschlußchrornatographio, die (Immuno·) Affinitätschromatographio, dio Chromatographie auf Hydroxylapatit, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und dorgloichon.

Ein geeignetes Trägormatorisl für dio lononaustauschchromatogrophio kann organischen oder anorganischen Ursprungs soin, z.B. vernetzte Agaroso, Dextran, Polyacrylamid, Styrol-/Divinylbenzol-Misc» polymerisat, Zelluloso o.a. Dieses Trägermaterial trögt basische funktionolle Gruppen, z. B. tortiäro Aminofunktionen, quatornäro Ammoniumgruppen, odor saure funktionell Gruppen, z.B. Carbonsäure- oder Sulfonsäureroste. Beispiele für bovorzugto Ionenaustauscher sind diejenigen mit Diethylaminoothyl- (DEAE) oder Diethyl-2-hydroxyethyl-ammonioothyl-Funktionsgruppen und diejenigen mit Sulfopropyl-(SP-) oder Carboxymothyl- (CM-) Funktionsgruppen, die an geoignete Träger für normale Flüssigkeitschromatographio, schr.ello Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gebunden sind. Die Trennungen und Reinigungon mittels lonenaustauschchromatographie worden nach foststohendon Verfahrensweisen durchgeführt, z.B. in wäßrigen Pufferlösungen von pH5 bis pH9, die variable Salzmengen enthalten, z.B. Natriumchlorid. Die Umkehrphasonchromatographio wird in Trägermaterial auf Siliziumdioxidbasis durchgeführt, das hydrophobe Gruppon trägt, z. B. Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4,8,12 oder 18 Kohlenstoffatomen, oder Mischungen von Alkylgruppen mit 1 und 3 bzw. 12 und 18 Kohlenstoffatomen, odor Phonylgruppon. Mit dieser Methode vorwandt ist die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, bei der Agarose oder ein verwandtes Material eingesetzt wird, das mit Alkylgruppen bis zu 12 Kohlenstoffatomen und/oder mit Phonylgruppon beschichtet ist. Diese chromatographischen Techniken werden unter Verwendung dor FPLC oder dor HPLC eingesetzt. Lösungsmittel zur Verarbeitung der erfindungsgomäßon Polypeptide auf Umkehrphasenmatorial auf Siliziumdioxidbasis sind wäßrige Säuren, z.B. wäßrige Trifluoressigsäuro, die ansteigende Mengen eines polaren, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels enthält, z. B. Acetonitril, niedere Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol oder Propanol, Tetrahydrofuran und dergleichen, vorzugsweise aber Acetonitril. Die Affinitätschromatographie wird ebenfalls für die Reinigung der erfindungsgomäßon Polypeptide ins Auge gefaßt, wobei ein geeignetes Trägermaterial verwendet wird, z. B. vernetzte Agarose, Dextran oder Polyacrylamid, die Moleküle mit hoher Affinität zu einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Derivat, zu Mutanten, Fragmenten oder deren Derivaten tragen, beispielsweise Antikörper, insbesondere polygonale oder monoklonal Antikörper (MAbs), wie z. B. spezifische MAbs gegen humanen MIF. Die bevorzugten chromatographischen Methoden sind die Immunoaffinitätschromatographie, die lonenaustauschchromatographie mit Trägern, die Sulfonpropylgruppen tragen, und die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch die üblichen Verfahron isoliert, beispielsweise durch Filtration odor Ultrafiltration, Dialyse, Auflösung und Wiederausfällen in geeigneten Salz- oder Pufferlösungen und Lösung:.·..ittolgemischen, Eindampfen von Lösungsmitteln, Lyophilisierung und dergleichen.

Erfindungsgemäße Mutanten entstehen durch spontane oder chemisch induzierte Mutationen auf der DNA-Ebene oder durch Austausch von Aminosäuren mittels chemischer Synthese.

E rfindungsgemäße Fragmente entstehen durch spontane oder chemisch induzierte Mutationen auf der DNA-Ebene, wodurch ein Triplett, das eine Aminosäure kodiert, in ein Stoppcodon umgewandelt wird, odor auf der Peptid-Ebene durch chemische oder enzymatischo Bindungsaufspaltung. Geeignete Enzymo für die Herstellung erfindungsgemäßer Fragmente sind zum Beispiel Proteasen. Beispielsweise können Papain, Trypsin, α-Chymotrypsin, Thermolysin, Pepsin, Subtilisin, Endoproteinaso Lys-C von Lysobacter enzymogenos, V8-Protoase von Staphylococcus aurcus oder verwandte Proteasen einor Lösung einou erfindungsgemäßen Polypeptids zugesetzt und das entstehende Fragmentgemisch kann durch chromatographischo Methoden getrennt werden, z. B. durch Gelfiltration und/oder UmkehrphasonHPLC.

Extrakte, Zellenüberstände und Kulturfiltrate von gentechnisch bearbeiteten Mikroorganismen odor kontinuierlichen Säugetierzellinien, die erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide oder deren Derivate gemäß der Erfindung enthalten, werden durch DNA-Rekombinationstechniken gewonnen und, wie oben erörtert, vorgereinigt. Im einzelnen können erfindungsgemäße Polypeptide und deren Derivate hergestellt werden, indem transformierte Wirtszellen, die erfindungsgemäße Polypeptide oder deren Derivate exprimieren, unter Bedingungen kultiviert werden, welche die Expression heterologer Polypeptide erlauben, und nötigenfalls die gewünschten Verbindungen isoliert und/oder in ihre Derivate umgewandelt werden. Die Schritte, die mit der Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und Derivate durch DNA-Rekombinationstechniken verbunden sind, werden weiter unten ausführlicher diskutiert.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Polypeptide und deren Derivate, insbesondere Fragmente, durch chemische Methoden synthetisiert, z. B. durch Kondensationsreaktionen, wie sie beispielsweise von M. Bodanszky, in „Principles of Peptide Synthesis" (Prinzipien der Peptidsynthese, Springer 1984) beschrieben wurden. Fragmente werden z. B. durch eine Festphasenmethodo synthetisiert, wobei eine N-geschützte Aminosäure an ein geeignetes Harz gekoppelt, die Schutzgruppe entfernt, eine zweite N-geschützte Aminogruppe an die erste Aminosäure ankondensiert und

der Zyklus von Schutzentfernung/Kondenentloi* mit weiteren N-geschützten Aminosäuren so lange wlodorholt wird, bis der Peptidrest der gewünschton Verbindung vollständig Ist, und schließlich dloser Peptidrost vom Harz abgospalten und soln Schutz antfornt wird, In ähnlicher Woiso können anstelle elnzolnor N-goschütztor Aminosäuren kurzo N-goschützte Oligopeptulo eingesetzt worden. Goelgnoto Harzo, Schutzgruppon, Kondonsationsroagonzion und Roaktionibedingungon sind dom Fachmann gut bekannt.

Die Erfindung betrifft außerdem DNAs, die ein erfindungsgemäßos Polypoptld odor desson Dorivate kodieren, Mutanton solchor DNAs, zum Beispiel DNAs, bei denen oln oder mehrere, Insbesondere oin, zwei, drei oder vier Nuklootlde mutlort sind, sowie Fragmente dorartigor DNAs, die aus mindestens 15 Nukloo'.idon bestehen.

Doiinitionsgomäß umfosson solche DNAs kodierende olnzolstänglge DNAs, doppolsträngigo DNAs, die aus don genannton kodierenden DNAs und aus dazu komplementären DNAs bostohon, oder dioso komplementären (oinzolstränglgon) DNAs solbst.

Im bosondoron betrifft die Erfindung eine DNA, die MRP-160 mit dor in SEQ ID NO: 1 nngegobenon Nuklootidsoquonz kodiert, sowie Mutanton und Frogmonto einer solchen DNA.

Im besonderen betrifft die Erfindung oin DNA-Fragment, das die Nuklootlde 2765 bis 4414 oinor DNA mit dor in SEQ ID NO: 1 angogebonon Nuklootidsoquonz umfaßt.

Dio Erfindung betrifft auch DNAs, dio mit oinor DNA, einer Mutanto odor olnom Fragmont davon gemäß dor Erfindung hybridisieren.

Weiterhin betrifft die Erfindung DNAs, deren Mutanten odor Fragmente gemäß dor Erfindung, dio gonomlschen Ursprungs sind.

Dio erfindungsgemäßen DNAs können beispielsweise durch Kultivierung eines transformierten Wirts und nötigenfalls Isolinron der gewünschton DNA aus diosom Wirt odor durch chemische Synthoso mittols Nukleotidkondonsation hergestellt wordon.

Insbesondere können solche DNAs wio folgt hergestellt wordon:

a) Isolierung von mRNA aus goeignotun Zollen, zum Boispiel aus menschlichen einkornigen Leukozyten oder menschlichen embryonalen Lungenopitholzollon, Selektion dor gewünschten inRNA, zum» Uoispiol durch Hybridisierung mit einer DNA-Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Exprossionssystom und Auswahl nach dor Expression des gewünschten Polypeptids, Herstellung einor zu dieser ηιΠΝΛ komplementären oinzolstränglgon cDNA und danach einor doppolsträngigen cDNA aus dor einzolsträngigon cDNA oder

b) Isolierung von cDNA aus oinor cDNA-Bibliothok und Soloktion der gewünschten cDNA, zum Boispiel durch Verwendung einer DNA-Sondo oder durch Vorwondung einos geeigneten Exprossionssystems und A iswohl nach der Expression des gewünschten Polypeptids oder

c) Isolierung oinor genomischen DNA aus geeignetem menschlichem Gewebe, zum Beispiel aus dor Plazenta oder aus fötalen Leborzüllen, und Selektion der gewünschten DNA, zum Boispiel durch Anwendung einer DNA-Sonde oder durch Verwendung eines geeigneten Exprossionssystems und Auswahl nach der Expression dos gowünschton Polypeptids und

d) Einbau der doppelsträngigen DNA von Schritt a), b) oder c) in oinen geeignoton Exprossionsvektor, o) Transformation geeigneter Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor,

f) Seioktion tr insformierter Wirtszellon, welche die gewünschte DNA enthalten, aus untransformierton Wirtszellen und, falls erforderlich,

g) Isolierung der gewünschten DNA und/oder Umwandlung der DNA in eine Mutante oder oin Fragment dieser DNA. Polyadenylierte Mossenger-RNA (Schritt a) wird nach bekannten Methoden aus den geeigneten Zellen isoliert, zum Beispiel aus menschlichen einkernigen Leukozyton oder aus menschlichen embryonalen Lungenepithelzollen. Beispielsweise können die Leukozyten aus frischem monschlichom Blut gewonnen werden, zum Beispiel aus hautartigen Schichten, die aus weißen Blutkörperchen bestehen, oder aus Leukozyten einer bestehenden kontinuierlichen Zellinie, die in Kultur entwickelt wordon kann. Die Isolationsvorfahren umfassen zum Beispiel die Homogenisierung stimulierter Loukozyten in Goqenwart eines Detergens und eines Ribonukleasehemmstoffs, z.B. Heparin, Guanidinisothiocyanat oder Mercaptoethanol, Extraktion der mRNA mit geeigneten Chloroform-Phenol-Mischungon, wahlweise in Gegonwart von Salz- oder Pufferlösungen, Dotergenzion und/oder kationischen Chelatbildner^ und das Ausfällen der mRNA aus der verbleibondon wäßrigen, salzhaltigen Base mit Ethanol, Isopropanol odor dergleichen. Die isoliorto mRNA kann durch Zentrifugieren in einem Cäsiumchloridgradienten mit anschließender Ethanol-Ausfällung und/odor durch chromatographische Mothndon woitor goreinigt werden» zum Beispiel durch Affinitätschromatographie, etwa Chromatographie an Oligo(dT)-Zellulose oder an Oligo(U)-Sepharose. Vorzugsweise wird eine solche gereinigte Gesamt-mRNA durch Gradientenzentrifugation nach der Größe fraktioniert, zum Beispiel in einem linearen Saccharosegradienten, oder durch Chromatographie an geeigneten Größenfraktionierungssäulen, z.B. an Agarosegelen.

Die gewünschte mRNA wird durch direkte Klassierung der mRNA mit oinor DNA-Sonde oder durch Translation in geeigneten Zellen oder zellfreien Systemen und Klassierung der erhaltenen Polypeptide selektiert.

Die Selektion der gewünschton mRNA wird vorzugsweise unter Verwendung einer DNA-Hybridisiorungssonde erreicht, wodurch der zusätzli ;ho Translation3schritt vermieden wird. Geeignete DNA-Sonden sind DNAs mit bekannter Nukleotidsequenz, die aus mindestens 17 Nukleotiden bestehen, zum Beispiel synthetische DNAs, cDANs, die aus einer mRNA abgeleitet sind, wel:he dio gowünschton Polypeptide in einer Tierart kodiert, deren DNA Sequenzhomologien mit der menschlichen ONm aufweist, oder genomische DNA-Fragmente, die zum Beispiel aus benachbarten DNA-Sequenzen bestehen, die aus einer natürlichen Quelle oder aus einem gentechnisch veränderten Mikroorganismus isoliert werden.

Synthetische DNA-Sonden worden nach bekannten Methoden synthetisiert, wie sie im folgenden ausführlich beschrieben werden, vorzugsweise durch schrittweise Kondensation unter Anwendung der Festphasen-Phosphotriester-, Phosphittriester- oder Phosphoramidit-Mothode, zum Beispiel Kondensation von Dinukleotid-Knnplungsoinhoiton nach der

Phosphotriestermethode.

Diese Methoden werdsn an die Synthese von Gemischen der gewünschten Oligonukleotide angepaßt, indem Mischungen von zwei, drei oder vier Nukleotiden dA, dC, dG und/oder dT in geschützter Form oder die entsprechenden Dinukleotid-Kopplungseinhoiten in den passoidon Kondensationsschritt eingesetzt werden, wio von Y. Ike u. a. (Nucleic Acids Research 11, 477,1983) beschrieben.

Zur Hybridisierung werden die DNA-Sonden markiert, z. B. werden sio durch die gut bekannte Kinasereaktion radioaktiv markiert.

Die Hybridisierung der größenfra<tionierten mRNA mit don DNA-Sondon, die eino Markierung enthalten, wird nach bekannten

Vorfahronswoison durchgeführt, d.h. in Puffer- und Salzlösungon, dio Zusätze enthalten, beispielsweise Calciumcholotbildnor, viskositatsroguliorende Verbindungen, Protoine, irrolovante DNA und dorgloichon, bei Tomporoturon, wolclio die soloktivo Hybridisiorung bogünstigen, etwa zwischon OXund 8OX, boispiolswoiso zwischon 25⁰C und 5OX oder hol etwa 6IiX, vorzugsweise boi einor Tomporatur, die um 2OX untor dor Schmolztomporatur dor hybriden doppolsträngigon DNA liegt. Fraktioniorto mRNA kann in Zollen translation worden, z.B. in Froschoizollon, odor in zollfroio Systomo, zum Boispiol in Retikulozytonlysato odor Weizonkeimextrakte. Die erhaltenon l'olypoptide worden nach dor Übcrträgoraktivität odor nach dor Reaktion mit Antikörporn ausgelesen, dio gegon den nativon Üborträgor gobildot worden, zum Boispiol in oinom Immuntost mit Fluoreszonzmarkorri. Solcho Immuntoste und die Herstellung polyklonalor und monoklonalor Antikörper sind dom Fachmann gut bekannt und werden dementsprechend angewondot.

Die Herstellung einor einzelstrflngigon komplementären DNA (cDNA) aus der soloktiorton mRNA-Matrizo ist dem Fachmann gut bokannt, dosgloichon die Horstollung oiner doppelsträngigon DNA aus ainor oinzolsträngigon DNA. Dio niRNA-Motrizo wird mit oiner Mischung aus Desoxynukleosidtriphosphaton, wahlwoise roadioaktiv markiorton Dosoxyr.ukloosidtriphosphaton (um das Reaktionsorgobnis klassioron zu könnon), einor Startorsoquonz, wio z. B. oinom Oligo-dT-Rost, dot mit dem Poly(A)-Schwanz dor ηιΠΝΑ hybridisiert, und oinem gooignoton Enzym, wio otwa einor Umkohrtranskriptaso, z.B. von oinom Vogolmyoloblastosovirus (AMV), inkubiort. Nach dom Abbau Jor Matrizun-mRNA, z. B. durch nlkalischo Hydrolyso, wird die cDNA mit einor Mischung aus Dosoxynukloosidtriphosphaton und oinom gooignoton Enzym inkubiort, um eine dopprlsträngigo DNA zu erhalten. Gooignoto Enzymo sind boispielswoiso oino Umkohrtranskriptaso, das Klonow-Fragmont von E.coli-DNA-Polymoraso I odor T 4 DNA-Polymoraso. Gowöhnlich wirkt oino Haarnadolstruktur, dio opontan von dor einzolsträngigon cDNA gebildet wird, als Startor für die Synthoso des zwoiton Strangs. Dioso Haarnodolstruktur wird durch Aufschluß mit S1 -Nukloase entfernt. Ersatzweise wim das 3'-En(Io der cinzolsträngigon DNA vor der Hydrolyso der mRNA-Matrizo und dor anschließenden Synthoso dos zweiton cDNA-Strangs zunächst durch homopolymer») Dosoxynuklootid-Schwänzo orwoitort. Als Alternative dazu wird doppelsträngigo cUNA aus oinor cDNA-Biblithok isoliert und dio gowünschto cDNA wird ausgosondort (Schritt b). Dio cDNA-Bibliothok wird aufgebaut, indom mRNA aus gocignolon Zollon, z.B. aus menschlichen oinkornigen Leukozyton oder menschlichen embryonalen Lungenopitholzollon, isoliert und entsprechend dor obigon Boschreibung daraus einzelsträngigo und doppelsträngigo cDNA horgostollt wird. Dioso cDNA wird mit gooignoton Rostriktionsondonukloason aufgeschlossen und nach feststehenden Vsrfahron in einen Lambda-Phngon eingebaut, z.B. in Lambdd-Charon 4 A oder Lambda-gt 11. Dio nn Nitrozellulosomombranon replizierte cDNA-Bibliothok wird untor Vorwondung oinor DNA-Sondo aussortiert, wio woitor oben beschrieben, odor in einom geoigneton Exprossionssystom exprimiort, und die orhaltonon Polypeptide werden nach dor Reaktion mit einem für die gowünschton Verbindungen spezifischen Antikörper aussortiert, z.B. mit einem für Human-MIF spezifischen Antikörper.

Als weitere Möglichkeit kann gonomische DNA isoliert und die gewünschto DNA kann daraus aussortiort werden (Schritt c). Genomische DNA wird nach dem Fachmann bekannton Methodon aus geeignetem menschlichen Gowobo isoliort, vorzugsweise aus menschlicher Plazenta oder menschlichen fötalon Loborzollen. Daraus wl·d durch Aufschluß mit gooignoton Restriktionsendonukleasen, z.B. AIuI und Haolll und Einbau in einon Lambria-Phagen, z.B. in Lambda-Charon 4A oder Lambda-gt 11, nach fostgostehenden Verfahren eine genomischo DNA-Bibliothek hergestellt. Die on Nitrozellulosemembranon replizierte genomische DNA-Bibliothek wird mit einer DNA-Sondo aussortiort, wie weitor oben boschriobon, odor in einem geeigneten Exprossionssystom exprimiort, und die erhaltenen Polypeptide worden, wie weitor obon boschriobon, aussortiort. Dom Fachmann ist eine Vielzahl von Methoden zum Einbau doppolstrangigorcDNA oder gonomischor DNA in einen gooignoton Vektor bokannt (Schritt d). Zum Boispiol könnon durch Inkubation in Gegenwart der entsprechenden Desoxynukloosidtriphosphate und eines Enzyms wie zum Beispiel torminalor Dosoxynukleotidyltransferase komplementäre homopolymero Stränge an die doppolsträngige DNA und dio Voktor-DNA angelagert werdon. Die Vektor-DNA und die doppelsträngigo DNA werden dann durch Basonpaarung zwischen den komplementären homopolymoren Schwänzen miteinander verbundon und schließlich durch spozifische Vorbindungsonzyme, wio z.B. Ligasen, ligiort. Andere Möglichkeiten sind die Anlagerung von synthetischen Linkern an die Enden der doppolsträngigen DNA odor der Einbau dor doppelsträngigen DNA in don Vektor mittels Ligation stumpfer odor versetzter Enden. Geeignete Vektoren werden woitor unten ausführlich diskutiert.

Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit dom erhaltenen Hybridvoktor (Schritt e) und dio Selektion transformierter Wirtszellen (Schritt f) sind dem Fachmann gut bokannt und werdon weitor unten ausführlich beschrieben. Hybridvoktoren und Wirtszellen könnon für die Produktion von DNA oder auch für die Produktion dor gewünschten Polypeptide besonders geeignet soin.

Die Isolierung der gewünschten DNA, ihrer Mutanten und Fragmente gomäß der Erfindung wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren erreicht, z. B. durch Extraktion mit Phenol und/oder Chloroform. Wahlweise kann die DNA weitor manipuliert werdon, z.B. durch Behandlung mit Mutagonen, um Mutanten zu erhalten, oder durch Aufschluß mit Restriktionsonzymen zur Bildung von Fragmenten, Modifikation eines oder beider Enden, um den Einbau in don Vektor zu erleichtern, Entfernen der dazwischenliegenden Sequenzen und dergleichen.

Die Nukleotidsequenz einer erfindungsgemäßen DNA kann durch Mothodon bestimmt werden, die an sich bokannt sind, z. B. durch die Maxam-Gilbert-DNA-Sequenziorungsmsthode unter Verwendung von ondmarkiortor DNA oder durch die Didosoxy-Kettenterminationsmethode von Sangor.

Die Herstellung einer DNA, ihrer Mutanto oder ihres Derivats gemäß dor Erfindung kann auch mit Hilfo oinor chemischen Synthoso erfolgen. Geeignete Synthesemothodon für DNA sind zusammenfassend von S.A. Narang (Tetrahedron 39,3,1983) dargestellt wordon. Die bekannten Synthesoverfahren gestatten dio Herstellung von Polynukleotidon von bis zu 40 Basen Länge mit guter Ausbeute, hoher Reinheit und in relativ kurzor Zeit. Geeignet geschützte Nukleotide worden nach der Phosphordiostermethodo (K. L. Agarwal u.a., Angow. Chemie 84,489,197?), der leistungsfähigeren Phosphortriestormothodo (C. B. Reeso, Tetrahedron 34,3143,1972) der PhosphiUriestormethodo (R. L. Letsinger u.a., J. Am. Chem.Soc. 98,3655,1976) odor der Phosphoramiditmethodo (S.L.Beaucage und M.H.Carruthers, Tetrahedron 22,1859,1981) miteinander verbunden. Eino Vereinfachung der Synthese der Oligonukleotide und Polynukleotide wird durc'.i das Festphasenverfahron ermöglicht, bei dem diu Nukleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. H. Rink u.a. (Nucl. Acids Research 12,6369,1984) verwenden Trinukleotide anstelle einzelner Nukleotido und verbinden sie nach der Phosphotriostermethode in der Festphasensynthese. Auf diese Weise kann innerhalb kurzer Zeit und mit guter Ausbeuten ein Polynukleotid mit bis zu 67 Basen hergestellt wordon. Dio

eigontlicho doppolstriingigo DNA wird enzymatisch aus chnmlkch präpariorten überlappenden Oligonuklootldon von boi Jen

DNA-Strängon aufgobaut, dio durch Bosenpaorung In der richtigen Anordnung zusammengeholten und dann durch das Enzym DNA-Ligoso chemisch vorbundon wordon. Elno woltoro Möglichkeit umfaßt die Inkubation üborlappondor olnzolner Oligonuklootido aus don beiden DNA-Strängun In Gogonwa.t dor vier orfordorlichon Desoxynukloosidtriphosphato mit oinor DNAPolymoraso, z. B. mit DNA-Polymorase I, dom KlonowFragment dor Polymoraso I odor dor T 4 DNAPolymoraso odor mit AMV-tVogoliviyoloblastosovirus-) Umkohrtranskriptasu. Dio boidon Oligonuklootido wordon dadurch In dor richtigon Anordnung

durch Basonpaarung zusammongohalton und durch das Enzym mit don orfordorlichon Nukleotidon orgönzl, um oinovollständige doppolströnglgo DNA zu liefern (S.A. Norang u.a., Anal. Blochom. 121,356,1982).

Dio Erfindung betrifft ferner Hybridvoktoron, dio, wio woiti ι obon definiert, aus einer DNA, oiner Mutanto odor oinom Fragmont

einer DNA bostohon, wolcho(s) oin orfindungsgomtlßos Polypoptld oder Derivat kodieren, dos oporativ mit

Exprossionskontrollsoquonzon vorbundon 3t. Besondors bovorzugt sind Hybridvoktoron, dio oino DNA ontsprochond SEQ ID NO: 1, oino Mutonto odor oin Dorivauliosor DNA odor oin DNA-Fragment umfassen, das aus don Nuklootiden 2765 bis

4414 oinor DNA noch SEQ ID NO: 1 bosteht und operativ mit Exprossionskontrollsoquonzon vorbundon ist.

Dio orfindungsgemäßen Hybridvoktoron sorgen für dio Ropllkation und Expression der gowünschton DNA in elnom goeignoton Wirt, ontwodor als oxtrachromosomalos Elomont odor durch Integration In das Wirtschromosom. Für die Integration und Expression dor orfindungsgemäßon kloniorten DNA stohon mohroro mögliche VoI torsystomo zur Vorfügung. Im Prinzip sind ollo Voktoron gooignot, dio dos gowünschto Polypeptidgol gomäß dor Erfindung in dom gowa'hlton Wirt ropliiioron und oxprimioron. Dor Vektor wird in Abhängigkeit von don für dio Transformation ms Augo gefaßton Wirtszellon ausgewählt. Im allgemeinen

können solche Wirtszellon prokaryotlsche odor eukaryotlsche Mikroorganismen sein, wie z. B. Bakterien oder Hofon, oder Zollonvon höherer eukaryotischor Herkunft, wie z. B. Wirboltlor-, Insbesondere Söugotierzollen, Gooignote Wirtszellen wordon woitoruntun ausführlich erörtert. Im Prinzip umfasson dio erfindungsgomäßon Hybridvoktoren dio DNA, wio sie woitor oben definiertwurde, oinon Roplikationsstartpunkt odor oino autonom replizierende Soquonz, dominantu Morkierungssoquonzon,

Exprossionskontrollsoquonzon, dio für die Transkription und Translation der gewünschton DNA wesentlich sind, und wahlwoiso Signalsequonzen und zusätzliche Rostriktionsstellon. Ein Roplikationsstartpunkt oder eino autonom roplizieronde Sequenz (oin DNA-Element, dos extrachromosomalon Elementen Fähigkeiten zur autonomen Roplikation verleiht) entsteht ontwodor, indem dor Vektor so konstruiert wird, daß or oinon exogenen Ursprung onthält, wio or z. B. aus dom Affonvirus (SV40) odor oinor anderen viralen Quello abgoloitot wird, oder durch don

chromosomolon Mechanismus der Wirtszolle.

Dio Markör erlauben dio Soloktion von Wirtszellon, dio don Voktor enthalten. Soloktionsmarker enthalten Gone, dio Resistenz

gogon Schwormetalle wio Kupfer oder gogon Antibiotika wie Tetracyclin, Ampicillin, Goneticin (G-418) oder Hygromycinverleihen, odor Gene, die einen gonotischon Schaden der Wirtszellen orgänzon, wio z.B. das Fohlen von Thymidinkinoso,

Hypoxanthinphosphoryltronsforaso, Dihydrofolatroduktasoo.ö. Als Exprossionskontrollsequenzon umfaßt dio Voktor-DNA oinon Promotor, d. h. eino DNA-Sequenz, dio bewirkt, daß die RNA-Polymorose sich an dio DNA bindet und dio RNA-Synthoso startot, Ribosomon-Bindungsstellen, d. Ii. Sequenzen, dio für die Auslösung von Translations-, Transkriptions- und Translationsstoppsignalen notwendig sind, und Sequenzen, die zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind, und wahlweise Vorstärker und woitoro Regulationssoquenzon. Es kann eine breite Vielfalt von Promotionssequenzon eingesetzt werden, in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszello. Starke

und gleichzeitig gut roguliorto Promotoren sind besonders brauchbar. Sequenzon fi'r don Translationsstart sind z.B. Shino-

Dalgarno-Sequonzon. Sequenzen, die für den Start und Stop der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig

sind, stehen normalerweise in den nichtkodierendon 5'-Bereichen bzw. 3'-Boreichen viraler odor oukaryotischer cDNAs zur

Verfügung, z. B. aus dem Exprossionswirt. Verstärker sind transkriptionsstimulioronde DNA-Sequenzon viraler Herkunft, z. B.

abgoloitot vom Affenvirus, Polyomavirus, Rindorpapillomvirus odor Mononeyschon Sarkomvirus, oder sie sind genomischenUrsprungs.

Signalsequonzen können zum Beispiel oine Präsequenz oder eine sektretorische Leader-Soquenz sein, welche die Sekretion des Polypeptide, Spleißsignale o.a. lonkt. Die verschiedenen DNA-Segmente der Vektor-DNA sind operativ miteinander vorbundon, d. h. sio grenzen anoinandor und

stehen in einem funktionollen Zusammenhang miteinander.

Beispiele von Voktoren, dio sich für die Roplikation und Expression In oinom E.coli-Stamm eignen, sind Bakteriophagen, z. B. Abkömmlinge von Lambda-Bakteriophagen, oder Plasmide wio z.B. insbesondoro das Plasmid CoIE 1 und seine Abkömmlinge,

etwa pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322 und von pBR322 abgeleitete Plasmide, etwa pUC9, pUCKO, pHRM48 un i pLc24.

Geeignete Voktoren enthalten ein vollständiges Roplikon. ein Marker-Gen, Erkennungssequenzen für Rostriktionsendonukleasen, so daß dio Fremd-DNA und ggf. die Expressionskontrollsequenz an diesen Stellen eingefügt wordon

können, und wahlwoiso Signalsoquonzen und Verstärker.

Mikrobiollo Promotoren sind beispielsweise der Links-Promotor Pi des Bakteriophagen Lambda, der durch einen

temperaturempfindlichen Ropressor kontrolliert wird. Ebenfalls geeignet sind E.coli-Promotoren wio der Iac (Lactose) -

Promotor, der durch den lac-Ropressor reguliert und durch Isopropyl-ß-D-thiogalactosid induziert wird, der trp (Tryptophan) - Promotor, der durch den trp-Roprossor reguliert und z. B. durch Tryptophan-Aushungerung induziert wird, und der tac (Hybrid-

trp-lac) - Promotor, der durch den lac-Ropressor reguliert wird. Bevorzugt sind Voktoren, die den P_L-Promotor des

Bakteriophagen Lambda enthalten. Vektoren, die für die Replikation und Expression in Hefen geeignet sind, enthalten einen Hofo-Replikationsstart und oin selektives Markierungsgen für Hefe. Eino Gruppe derartiger Vektoren umfaßt sogenannto ars-Sequenzon (autonomo Replikationssoquenzen) als Roplikationsstartpunkt. Diese Vektoren werden nach der Transformation innerhalb dor Hofezelle

extrachromosomal zurückgehalten und autonom repliziert. Forner können Vektoren verwendet wordon, welche die2 μ-12-Mikron-) Plasmid-DNA aus Saccharomyces cerevisiae ganz oder teilweise enthalton. Solche Vektoren werden durch

Rekombination in μ-Plasmide eingebaut, die in der Zelle schon vorhanden sind, oder replizieren sich autonom. 2p-Sequenzen

sind besonders geeignet, wenn eine hohe Transformationshäufigkoit und hohe Kopienzahlen erzielt werden sollen.

Für die Expression in Hofo geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise die Kontrollsequenzen von stark

exprimierten Hefegonn. So können die Promotoren für das TRP 1-Gen, das ADHI- oder ADHII-Gen, das Gon für saure

Phosphatase (PH03- oder PHO 5-Gen), das Isozytochrom-Gen, oder ein mit dem glycolytischen Wog verbundener Promotor, wie

-9- 298 9-18

z.B. dor Promotor der Enolaeo-, Glycoraldehyd-3phosphatklna«o(PGK)· ,Hoxokinase-, Pyruvatdecarljoxylaso-, Phosphofructokinase-, Triosophosphatisomoraso , Phnsphoglucosolsomorose· und Glucoklnase-Gono verwendet wordon. Für dio Roplikation und Expression In SSugotiorzollon goolgnoto Voktorcn worden vorzugswolco mit Pfomotorsoquonzon goblldel, die aus DNA vlralor Herkunft abgololtot sind, z. B. aus dom Affonvlrue 40 (SV40), dom Rousschon Sorkomvlrus (RSV), dom Adonoviris 2, dom Rindorpapillonwlru» (BPV), dor BK-Mutanto dos Popovavlrus (OKV), odor dom Maus- odor Human-Zylomogalovirus (CMV). Ersntiwoiso könnan dio Voktoron Promotoren aus Säugotior-Exprossionsprodukton onthalton, wio z.B. Aktin, Kollagen, Myosin usw., oder dio nativon Promotor- und Kontrollsoquonzon, dio normalorwoiso mit dor gewünschten Cionsoquenz verbundon sind. Bolsplolswolso kann das l'lasmld dio Vorstärkorolnhoit dos primär-frühen Houptgens Os Mnusodor Human-Zytomogalovirus, die SV40-Vor&tärkorolnliolt In Kombination mit dom humanen a-Globin-Promotor und/odc r zusätzlich Induzlorbaro Promotoron onthalton, wio z.B. dio aus don Hitzoschock- odor Motallothionoin-Gonon abgolcitotoii Promotoren. Bevorzugt wordon Voktoron, dio don Mous-Zytomogolovirus-Promotor ontholton.

Bevorzugto orfindungsgomößo Hybrldvoktoron sind Hybridvoktoron, dio aus dom Plasmld pUCKO odor aus dem Plasmld pPimu-bio abgoloitot sind. Ebonfalls bevorzugt sind dio Voktoron mit don Bozoichnungon pMRP 160, pMRP 1G0„ und pMRI'70p_L. Weiterhin betrifft die Erfindung tronsfoi niorto Wirtszollon, wolcho dio orflndungsgomäßon Polypoptido und Dorivato oxprimioron, insbesondoro Wirtszollon, dio mit oinom orfindungsgomäßon Hybridvoktor transformiert sind. Solcho Wirtszellon sind gonotisch stabil und könnon aus tiofgokühlton Kulturen durch Auftauen und erneutes Klonloren aktlviort wordon. Boispiolo gooignotor Wirte sind Mikroorganismen, die frei von oder arm an Rostriktionsonzymon odor Modifikationsonzymon sind.wioz.D.Oaktorion, insbosondoroStiimmovonE3chorichincoli,z.B.E.coliX1770, E.COÜY1090, E.collHUIOI.E.coliWaHO, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA221, E.coli DH 5a odor E.coli K12, Bacillus subtilis, Bacillus stoarothormophilus, Psoudomonas, Haomophilus, Streptococcus und andere, sowie Hofon, zum Boispiol Saccharomycos corevisiae wio otwo S.",orovisiao GRF 18. Weitere gooignete Wirtszollon sind Zollon höhorer Organismen, insbesondere bostehondo kontinuierliche menschliche odor tierische Zollunion, z. B. menschliche embryonale Lungonfibroblasten L132, Bowos-Zellon von menschlichen malignen Melanomen, HeLa-Zollon, mit dom SV40-Virus transformierte Niorenzellon dor afrikanischen grünon Moorkotzo (COS-7) oder Ovarzollen dos chinesischen Hamsters (CHO).

Dio obenerwähnten Stämme von E.coli, Insbesondoro E.coli K12 und Ovarzollen dos chinesischen Hamstere (CHO) werden als Wirtszollon bevorzugt.

Die Erfindung betrifft außordem Verfahren zur Herstellung transformlortor Wirtszollen, wobei eine geeignete Wirtszelle, wie slo weiter obon beschrieben wurde, mit oinom orfindungsgomäßen Hybridvektor transformiert wird und die transformierten Zellen soloktiertwerdon.

Die Transformiition von Mikroorganismen wird oiisgoführt, wio in dor Litora'.ur boschrieben, boispiolswoiso für S.corovisiao (A.Hinnon u. a., Proc. Notl. Acad. Sei. USA75,1929,1970), für B.subtilis (Ana(,nostopoulos u.a., J.Bactoriol. 81,741,1961) und für E.coli (M.Mandel u.a., J. Mol. Biol. 53,159,1970).

Dementsprechend umfaßt das Transformationsverfahren für E.coli boispiolswoiso die Ca'*-Vorbohandlung der Zollen, um die DNA-Aufnahmo zu ermöglichen, und dio Inkubation mit dem Hydridvektor. Die nachfolgende Seioktion der transformierten Zollon kann zum Boispiol durch Übertragen der Zollon auf oin seloktives Wochstumsmedium orroicht werden, das dio Trennung dor transformiorton Zollon von don Eltornzollon In Abhängigkeit von dor Natur dor Markiorungssoquonz dor Voktor-DNA gestattet. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwondot, das kein Wachstum von Zellen erlaubt, die den Voktor nicht enthalten. Die Transformation von Hefe umfaßt beispielsweise Schritte zur enzymatischen Entfernung der Hefezollwand mit Hilfe von Glucosidason, dio Behandlung dor erhaltenen Sphäroplasten mit dom Vektor In Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²*-lonen und die Regeneration der Zollwand durch Einbettung der Sphäroplaston in Agar. Vorzugsweise wird der Regonorationsagar so hergestellt, daß er die oben beschriebene Regeneration und Selektion dor transformierten Zollon gleichzeitig zuläßt.

Die Transformation von Zollen höheren eukaroyotischon Ursprungs, wie z. B. von Säugotlorzollinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Die Transfoktion wird nach herkömmlichen Techniken ausgeführt, wie z. B. durch Phosphatausfällung; Mikroinjektion, Protoplustenfusion, Elektroporation, d.h. Einführung der DNA durch oinon kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Permeabilität der Zollmembran erhöht, oder in Gogonwnrt von Helferverbindungen wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerol oder Polyethylenglycol und dergleichen. Nach dem Transfektionsverfahren werden transfiziorte Zollon Idontifiziort und selektiert, z. B. durch Kultivieren in einem selektiven Medium, das in Abhängigkeit von der Natur dos Solektionsmarkers ausgewählt wird, z. B. Standardkulturmedien wie das Dulbeccosche modifizierte Eagle-Medium (DMEM), Minimalmedium, RPMI 1640-Medium und dergleichen, die z.B. das entsprechende Antibiotikum onthalton.

Die transformierten Wirtszellen werden nach dem Fachmann bekannton Mothodon in einem flüssigen Medium kultiviert, das assimilierbare Kohlenstoffquellon, z. B. Kohlenwasserstoffe wio Glucose odor Lactose, Stickstoffquollen, z. B. Aminosäuren, Peptide, Proteine oder ihre Zersetzungsprodukte wie Peptone, Ammoniumsalze o.a., und anorganische Salze wie z. B. Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium enthält. Das Medium enthält ferner zum Beispiel wachstumsförderndo Substanzen wie Spurenelemente, etwa Eisen, Zink, Mangan und dorgleichnn.

Das Medium wird vorzugsweise so gewählt, daß es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum von Zellen verhindert, die nicht transformiert worden sind oder den Hybridvektor verloren haben. So wird zum Beispiel dem Medium ein Antibiotikum zugesetzt, wenn der Hybridvoktor als Marker ein Antibiotikaresistenzgen enthält. Wenn zum Beispiel eine Wirtszelle verwendet wird, die in einer essentiellen Aminosäure euxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen enthält, das oin Enzym kodiert, welches den Wirtsdefokt ergänzt, dann wird zur Kultivierung der transformierten Zollen ein Minimalmedium verwendet, dem die genannte Aminosäure fohlt.

Zellen höheren eukaryotischen Ursprungs wie z. B. Säugetierzellen werden unter Gewobekulturbedingungen unter Verwendung handelsüblicher Medion vermehrt, z.B. mit Dulbeccoschem modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), Minimalmedium, RPMI 1640-Medium und dergleichen, wie oben erwähnt, die wahlweise mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugotiersoren ergänzt werden. Verfahren zur Zellkultiviorung unter Gowobekulturbedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen die homogene Suspensionskultur, z. B. in einem Airlift-Reak'.or oder in einem Reaktor mit kontinuierlich arbeitendem Rührwerk, oder die Kultur von immobilisierten oder fixierton Zollon, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikroperlen, porösen Glasperlen, Keramikhülsen oder anderen Mikrotr.igern.

Dio Kultiviorung erfolgt nach Vorfahren, dlo dom Fachmann bekannt sind. DIo Kulturbodingungon wio Tomporatur, pH-Wort Ί09 Mediums uiid Fermentitionszoit wordon so gewählt, daß oln maximaler Titor dos orfindungsgomäßon Polypeptide odor Dorivats oriiolt wird. So wird 011E.coil· odor Hofestamm vorzugswolso untor oerobon Dedingungon im Submorsvorfohron kultiviert, mit Schüttoln odor fUiluon >el olnor Tompcraturvon otvvn 2O⁰C bis 40'C, vorzugswolso boi otwo 30°C, und olrium pH-Woti von 4 bis 8, vorzugswoiso von etwa pH7, übor olno Dauor von 4 bis 30 Stunden, vorzugsweise so lange, bis m.ixlmalo Ausbouton des orfindungsgomäßcn Polypeptide odor Dorivats orrolcht woidon.

Wonn dio Zolldichto oinon ausroichondon Wort orrolcht hat, wird dlo Kultur unterbrochen und das Polypoptid odor Dorivat kann isoliert werdon. Wonn dor Hybridvoktor oino goignoto Sokrotloneslgnalsequonz enthält, wird das Poly peptid oder Dorivat vo .i do, transformierten ZoIIo dirokt in das Kulturmedium ebgosondort. Sonst müsson dio Zollon zerstört, belspiolswolee durch Behandlung mit oinom Detorgons wie SDS, NP-40, Triton odor Dosoxycholsäure, mit Lysozym odor olnom ähnlich wirkondon Enzym lysiort oder mit Ultraschall zertrümmert werdon. BoI Verwendung von Hefo als Wirts-Mikroorgnnlsnvjs kann dio Zollwand durch onzymatischon Aufschluß mit olnor Glucosldaso entfernt wordon. Ersatzweise oder zusätzlich können zum Auf brechon dor Zollon mochanischo Kräfte angowondet wordon, wie etwa Scherkräfte (z. B. Fronch-pmss, Dynomill o.a.) oder Schüttoln mit Qlasporlen oder Aluminiumoxid, odor abwochselndos Einfrieren, z.B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauon, z.B. bei 3O⁰C bis 40^eC, sowio Ultraschall.

Der Zollonüborstand oder dio Lösung, dio man nach dom Zentrifugieren dor nach dom Aufbrechen dor Zollon gewonnonon Mischung orhält und dio Protoine, Nukloinsäuron und ondore Zollbestandteilo onthttlt, wird in einor an sich bokannton Woiso mit Protoinon angoroichort, oinschlioßlich dor orfindungsgomäßon Polypeptide. So worden zum Boispiol die molston Nichtprotoin-Bestandteile durch PolyothyloniminDohandlung onlfornt und dio Protoine einschließlich der erfindungsgomäßon Polypeptide und Dorivato werdon ausgofällt, boispiolswoiso durch Sättigung dor Lösung mit Ammoniumsulfat odor mit andoron Solion. Sonst wir J dor Zellcnüborstand bzw. das Lysat untoi Anwendung chromatogrnphischor Mothodon, wio woitor obon beschrieben, dirokt vorgeroinigt.

Din erfindungsgomäßon Polypoptido tind ihro Derivate sind nützlich, um zu olnom bossoron Vorständnis dor Rollo dos mononukloaron Phagozytonsystoms zu golangon, das hoißt um das lyphokino Signal und dio Notur dor zelluläron Reaktion darauf in Makrophagonpopulationon zu dofinioron.

Aufgrund ihrer Aktivität als Entzündungsüborträgor können dio otfindungsgomäßen Polypoptide und ihro Derivate zur Beeinflussung von Entzündungsprozossen eingesetzt werdon. Sio sind daher brauchbar für die Thorapio chronischor Entzundungszustände.

Außordom sind dio orfindungsgemäßon Polypoptide und ihro Dorivato vorwondbar für dio Untersuchung, Identifikation und Produktion von Antagoniston, dio als Modikamonte gogon Entzündungen angowondot wordon können. Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Präparate, die sich aus oinor therapeutisch wirksamen Menno eines orfindungsgemäßon Polypeptlds odor Derivats und oinom pharmazeutisch akzoptiorbaron Träger, z. B. einem anorganischen oder organischen, fosten oder flüssigon Trägor, zusammensetzen.

Dio erfindungsgomäßon pharmazeutischen Präparato sind Präparate zur intostinolon, z. B. roktalon odor oralen Applikation und vorzugsweiso zur porentoralon, z. B. intranasalen, intramuskulären, subkutanen odor intravenösen Applikation bei warmblütigen Tieren einschließlich dos Menschen. Je nach der boabsichtigton Applikationsmethodo können dio pharmazeutischen Präparate in Form von Dosisoinheiton vorliogon, z. B. in Form von Ampullon, Fläschchen, Zöpfchon, Dragoos, Toblotton, Kapseln oder Nasonsprays in fostor odor (lüssigor Form.

Die zu vorabreichondo Monge der thorapoutisch wirksame η Verbindung hängt vom Zustand des Pationton ab, wie z. B. dem Körpergewicht, der Art und Schwere der Krankheit und d6m Allgomoinzustand, sowio auch von der Applikationsart, und die Applikation erfolgt entsprechend dor Einschätzung des behandolnden Arztos. Dio wirksame Dosis oinos orf indungsgomäßen Polypeptide oder Derivats liegt in der Größenordnung von 0,001 \ig bis 1 \ig pro :g Körpergewicht und Tag. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate enthalten dio üblichen anorganischen oder organischen, fosten oder flüssigen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wahlweise zusammen mit anderen thorapoutisch wirksamen Verbindungen und/oder Zusätzen. Es gibt bevorzugt vorwendete Lösungen oder Suspensionen dos Wirkstoffs, insbesondere isotonische wäßrige Lösungen oder Suspensionen, odor auch lyophillsierte Präparate, dio kurz vor Gobrauch In Wasser aufgelöst werden. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert werdon und/oder Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Lösungsvormittler, Viskositätserhöhende Substanzen, Salze zur Regulierung dos osmotischon Drucks und/oder Puffer sowie auch andere Proteine enthalten, zum Boispiol Humansorumalbumin oder menschliche Blutplasmapräparato. Bevorzugt wordon pharmazeutische Präparato in Form von Liposomen in wäßriger Dispersion, die eino therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptide oder Derivats davon enthalten. Es gibt geeignete Liposome, insbesondere solche, die eine möglichst homogene Größenverteilung und einen Durchmesser von ca. 0,2 x 10"' bis 5,0 χ 10"^β aufweisen und aus einor oder mehreren Schichten von Lipidkomponenten bestehon, z. B. aus amphipatischon Lipidon, etwa Phospholipiden wie Lecithin, Cephalin oder Phosphorsäure, und wahlwoiso aus neutralen Lipidon, z.B. Cholesterin, die oin wäßriges Innoros umschließen, das ein orfindungsgemäßes Polypoptid oder Dorivat enthält. Bevorzugt werden Liposome, dio aus oinor Mischung von synthetischem Phosphatidylserin und Phosptiaiidylcholin bostohon.

Die Erfindung betrifft ferner ;jolyklonale und monoklonal Antikörpor, die für dio orfindungsgomäßon Polypeptide odor für Derivate gemäß der Erfindung spezifisch sind, insbesondere Antikörper, dio für MRP-160, rMRP-70 odor für Fragmente von MRP-160 spezifisch sind, oder Derivate solcher Antikörper, welche die Spezifität des Antikörpers, aus dom sio abgeleitet sind, bewahren.

Polygonale Antikörper gemäß der Erfindung stammen aus Säugetieren, z. B. aus Mäusen, Ratten, Kaninchen, Eseln, Ziegen, Schafen, Schweinen, Schimpansen oder vom Menschen, oder sio stammon aus Vögeln, z. B. vom Huhn. Bevorzugt werdon Maus-, Ratton-, Kaninchen-, Ziegen-, Schaf- oder Huhn-Antikörper, besonders Kaninchen-Antikörper odor ihre Dorivate. Bevorzugte polygonale Antikörper sind spezifisch für MRP-160, für rMRP-70 odor für Fragmente von MRP-160, die 12 bis 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 enthalton. Besonders bevorzugt werden polygonale Antikörper, die spezifisch für MRP-160, rMRP-70 oder für dio Fragmente von MRP-160 sind, dio don Aminosäuren 1189-1204,1242-1255, 1409-1427 bzw. 162-177 von SEOID NO:1 ontsprechon. Am stärksten bevorzugt werdon polyklonale Kaninchen-Antikörper, die für rMRP-70 spezifisch sind.

Bovonugt worden monoklonnlo Antikörper, die spezifisch für dlo oifindungigomäßen Polypoptldo oder für Dorlvoto gomäß dor Erfindung sind, Insbosondoro monoklonnlo Antikörper, din spezifisch (ür MHP-100 odor für rMRP-70 odor (Or Frogmonto von MRP-160 sind, odor Oorivato solchor Antikörper. Erfindungsiiomtlße monoklonnlo Antikörper stammen aus Säugotioron, z. B.

aus Mausen, Ratton, odor vom Monschon, vorzugsweise abor aui Mäuson. Bovorzugt wordon monoklonnlo Mous-Ai.tikörpor,dio fur rMRP-70 spezifisch sind.

Dio Spozifilät oinos Antikörpors gogonübor olnom oiiindungsgomäßon Colypoptid odor Oorivat kenn qualitativ in oinem Enzym· Immuntost nachgowioson worden, wobol dio Roaktlonsvortlofungen (Wells) olnor Mikrotitarplotto mit dom Polypoptlo

ausgostrichon, dann mit dem zu prüfende»! Antikörper bohandolt worden, und dor gobundonu Antikörper mit einom markierten

Antisorum gogon den Antikörper nachgowioson wird. Zum Bolsplol wird die Spozifltät oinos orf indungsgemäßon monoklonolon Maus-Antikörpers in einem Enzynvlmmuntost vom Sandwichtyp bestimmt, bei dom die Vortiofungon einer Mikrotitorplelto mit

einom für oin orflndungsgomäßes Polypoptld spozifischen polyklonalen Kanlnchon-Antikörpor ousgostrlchon werdon. erfolgtvon dom Polypoptld selbst, dann mit dom zu prüfenden Antikörper bohandolt wordon, und dor gobundono mo>-jklonalo

Antikörper mit markiertem Antisorum gogon don konstanten Teil dor Maus-Antikörpor nachgowioson wird. Derivnto oinos orfindungsgomäßon Antiköipors bowahron dio Spozifität dos Antikörpors, von dom sie abgoloitot sind, d h. sio

bohnlton das charakteristische Bindungsmustor dos Eltorn-Antikörpors boi. Bolsplolo für solche Dorivflto sind

Antikörperfragmonto, Konjugato dor Antikörper mit einom Enzym, ein Fluoroszonzmarker, oin Chomolumineszonzmarkor, ein Motallcholat, paramognotlscho Toilchon, Avidin, Biotin und dergleichen, odor radioaktiv markiorto Antikörper. Erfindungsgomaßo Fragmonto sind zum Beispiel dia einwertigen Fragmente Fob odor Fab' odor das zwoiwortlge Fragment Enzyme», die für orfindungsgomäßo Antikörperkonjugate vorwondot werdon, sind zum Beispiel Moorrottichporoxidaso,

alkalischo Phosphatase, β D-Galactosidaso, Glucosooxidase, Glucoamylaso, Carboanhydraso, Acotylcholinesterase, Lysozym,

Malatdohydrogonaso odor Glucoso-e-phosphotdohydrogonase. Zu erfindungsgomitßon Antikörpern konjugiorte Fluoroszonzmarkor könnon Fluoros^oin, Fluoroszonzfarbstoff, Rhodcviiii und

dergleichen sein.

Chomolumineszonzmarkor sind z.B. Acridinostor von Luminol. In solchen Konjurjaton ist (tor AnlJkörpor direkt odor ühor oino Abstands· odor Vorbinduncjsgruppo an don Konjugntionsportnor

gebunden.

Beispiele für Metallcholatblldner sind Ethylendiamintetraessigsäure (EOTA), Diothylontriaminpontaossigsäure (DPTA), 1.4,8,11-

totraazatotradecan, 1,4,8,1 i-touaazatotradocan-IAe.U-toUaoeelgeauro, 1-oxa-4,7,12,IS-tetraazahoptadocan-'l,7,12,15-tetraossigsäure oder dergleichen.

Radioaktiv markierte erfindungsgemäße Antikörper ontholton z. B. radioaktives Jod (¹¹³I, '"1,¹¹¹I), Tritium (³H), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwofol ("S), Yttrium (⁴⁰Y), Tochnotium (""¹Tc) oder dorgloichon. Erfindungsgomaßo polygonale Antikörper und deren Derivate werdon durch an sich bokannto Verfahren gowonnon, zum Beispiel durch oin Verfahren, bei dem oin geeignetes Säugetier oder ein geeigneter Vogel mit einom erfindungsgomäßon Polypoptid odor dosson Dorivat, wie z.B. mit MRP-160, rMRP-70 odor Fragmenten von MRP-160 immunisiort wird, wahlweise in Gegonwart eines Adjuvans; das Blutserum dos immunisierten Säugetiers odor Eier dos immunlsiorton Vogels wordon

gosnmmolt, und wonn erfordorlich, wordon dio Antikörper isoliert und/odir in ihro Dorivato umgewandelt.

Goeignote Säugotiore sind diejenigen, dio das Antigen, d.h. das orfindungsgomäße Polypeptid odor dosson Dorivat, als Fremdmolekül orkonnnn, z.B. Mäuso, Ratton, Kaninchen, Esel, Ziegen, Schafo, Schwoino oder Pfordo. Geoignoto Vögel sind

Hühner.

Die Immunisiorungswege sind untor andorom intradormalo, subkutano, intramuskuläre, intraporitonoalo, Intravaskuläre und

intrakranialo Injoktionon. Da hoho Antikörportitor orwünscht sind, wird gewöhnlich oino Sorio von Injektionen gogobon. Dio

Immunisierung orfolgt zum Beispiel durch zwei, drei, vior odor mohr parontoralo, d. h. intraporitonoalo und/odor subkutane Injektionen des Antigens in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen von einigen Tagen, z. B. von drei bis sieben Tagen,

bis zu mehnron Monaten, zum Beispiel vier Wochen.

Das Antigen kann für das Immunisiorungsvorfahron mit Adjuvanzien vermischt werdon, d. h. mit Mitteln, wnfche die Immunreaktion woitor verstärken. Mögliche Adjuvanzien sind das vollständige Freundscho Adjuvans (Emulsion von Minoralöl, Wasser und Mykobakterionoxtrakten), das unvollständige Froundsche Adjuvans (Emulsion aus Wossor und öl allein), Aluminiumhydroxidgele usw. Doi Immunantwo't dos Säugotiors wird vorzugsweise durch oinen geeigneten Antikörpertest überwacht, z.B. durch einen Enzym-Immuntest, wie er weiter oben boschriobon wurde. Das Blut des Säugotiors wird wonige Tage, z. B. zwei bis fünf Tage

nach dor letzten Injektion, gesammelt. Ebenso wird die Immunantwort dos Vogels durch Untersuchung von Eiern überwacht, dioeinige Wochen, z. B. vier bis sechs Wochen nach dor letzton Injektion gologt worden. Dio Antikörper wordon nach bekannten

Verfahren isoliert. Sio werdon zunächst konzentriert, zum Beispiel durch Ausfällung mit A.' moniumsulfat, Dialyse gegen

hygroskopisches Material wie Polyethylenglycol (PEG), Filtration durch selektive Membranen o.a., und wenn nötig und/odererwünscht, werdon die konzentrierten Antikörper durch übliche chromatographischo Methoden goreinigt, z. B. durch

Hydroxylapatitchromatographie, Immunoaffinitätschromatographio, Gelfiltration, lononaustauschchromatographio oder Chromatographie über DEAE-Zelluloso odor Protein A. Fragmonto der Antikörper, z. B. Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmonte, können aus den gemäß dor obigen Beschreibung

hergestellton Antikörpern nach an sich bekannten Methoden gewonnen werden, z.B. durch Aufschluß mit Enzymen wie Papainoder Pepsin und/odor Aufspaltung von Disulfidbindunnen durch chemische Reduktion.

Konjugate von erfindungsgemäßon Antikörpern werden nach dom Fachmann bekannten Methoden hergestellt, z.B. indem ein

ς,? τι aß der obigen Beschreibung horgestelltor Antikörper in Gegenwart eines Kopplungsmittols, z. B. Glutaraldohyd, Perjodat,

N,N' o-phenylendimaleimid, N-(m-maleimidobflnzoyloxyIsuccinimid, N-(3-|2'-pyridyldithiol-propionoxy)-succinimid, N-othyl- N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder dergleichen, zur Reaktion gebracht wird. Konjugate mit Biotin werden z.B.

hergestellt, indem Antikörper mit oinem aktivierten Ester von Biotin, wie ar. B. Biotin-N-hydroxysuccinimidoster, zur Reaktiongebracht wird. Konjugate mit Fluoreszenz- oder Chemolumineszonzmarkern wordon in Gegenwart eines Kopplungsmittels, z. B.

der oben aufgeführten, odor durch Reaktion mit einem Isothiocyanat, vorzugsweise mit Fluoresceinisothiocyanit, hergestellt.

Antikörper, dio mit radioaktivem Jod markiert sind, erhält man aus den orfindungsgomäßen Antikörpern durch das an ι ich bekannte Jodieron, zum Beispiel mit radioaktivem Natrium· oder Knllumjodid und einem chemischen Oxidationsmittel wie z.B. Natriumhypochlorit, Chloramin T o. ä. oder einem enzymatlschen Oxidationsmittel wlo Lactoperoxldase oder Qlucoseoxidase und Glucose Eriindungegemäße Ai .!körper vvordon bolsplolswelso durch Dlothylontrlamlnpontaesslgsäuro (DPTA)-Cholatbildung mit Yarium gokoppolt. Mit Tochnotium-99m markierto Antikörp&r werden durch Ligandonaustauschprozosso horgostollt, z. 8. durch Reduktion von Portechnat (TcOD mit Zinn(ll)-Ionenlösung, Chelatbildung des reduzierten Technotlums auf einor Sophadox-Säulo und Einbringen der Antikörper In dioso Säule, oder durch dlrokte Moikierungsverfahron, z.B. durch Inkubation von Portochnat, einom Reduktionsmittel wie SnCI], elnor Pufferlösung wie Natrlum-Kaliumphlhalat-Lösung und dor Antikörper.

Dio orfindungsgomäßon Antikörper und doron Dorivoto erhält man durch on sich bokannto Prozosso, bot donon Zollon einer Hybridomzollinio, wolche dio g iinschton monoklonalen Antikörper absondern, in vitro odor in vivo vermehrt werdon und, wenn orfordorlich, dio orhaltonon Antikörper isoliert und/odnr in ihro Derivate umgowandolt werden. Die Vormohrung in vitro erfolgt In geoignoton Kulturmedien, woboi os sich um die gebräuchlichen Standardkulturmedion handelt, zum Beispiel Dulboccosches modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) oder RPMI 1640-Medium, wahlweise ergänzt durch oin Säugotiersorum, z.B. fötales Kälbersorum, oder Spurenolomento und wachstumsunterstützendo Zusätze, z. B. Futterzellen wio normalo Poritonoaloxsudatzollon dor Maus, Milzzollen, Knochonmark-Makrophagon, 2-Aminoothonol, Insulin, Transferrin, Lipoprotoin goringor Dichte, Oloinsäuro odor dergleichen.

Dio in-vitro-Produktion liefert relativ reine Antikörporpräparato und gostattet eine Vergrößerung, um große Mengen der gewünschton Antikörper zu orzougen. Vorfahron zur Kultivierung von Säugotiorzellen unter Gowebekulturbedingungen sind dom Fachmann bokannt und ι imfoeson dio homogene Susponsionskultur, z. B. in einom Airlift-Roaktor oder einem Reaktor mit kontinuierlich arbeitendem Rührwork, odor die Kultur von immobilisierton oder fixierten Zollon, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, uuf Agarüsomikroporloii oder Koramikhülsen.

Große Mengon dor gewünschten monoklonalen Antikörper kann man auch durch Vormehrung der Zellen in vivo erhalten. Zu diesem Zwock worden Hybridomzollon, wolche die gewünschton Antikörper produzieren, histokompatiblen Säugetieren injiziert, um das Wachstum von antikörperproduziorondon Tumoren zu bewirken. Wahlweise werden dio Tiere vor der Injektion mit oinem Kohlenwasserstoff vorbehandelt, insbesondere mit Minoralölen wio Pristan (Tetramethylpontadecan). Nach einer bis drei Wochen wordon dio Antikörper aus don Körperflüssigkeiton dieser Säugetioro Isoliert. Boispielsweiso worden aus Balb/c· Mäusen gewonnene Hybridomzollon, welche diu gewünschten monoklonalen Antikörper produzieren, Balb/c-Möuson, dio wahlweise mit Pristan vorbehandelt wordon, intraperitoneal injiziert und nach einor bis zwei Wochen wird den Tioron Aszitosflüssigkeit entnommon.

Dio Isolierung, Reinigung und Dorivatisiorung der monoklonalon Antikörper wird ausgeführt, wio oben für polyklonalo Antikörper beschrieben. Radioaktiv markierto monoklonal Antikörper könnon auch horgostollt wordon, indum den Kulturmodion der in-vitro-Kultiviorung radioaktiv markierte Nährstoffe zugesetzt werden. Solche markierten Nährstoffe enthalten z. B. radioaktiven Kohlenstoff.

Die Erfindung betrifft ferner Hybriclomzollinion, welche dio erfindungsgemäßon monoklonalon Antikörper absondern. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybridomzellinion, die Hybriden von Myelomzollon und B-Lymphozyten eines Säugetiers sind, das mit sinem erfindungsgemäßen Polypeptid odor dessen Derive* immunisiert wurde. Vorzugsweise sind dioso Zollinien Hybriden von Maus-Myelomzollen und B-Lymphozyten einer syngenen Maus, die mit rMRP-70 immunisiert wurde. Die erfindungsgemäßen Hybridomzellinion sind genetisch stabil, sondern erfindungsgemäßo monoklonal Antikörper mit konstanter Spezifität ab und können in tiefgekühlten Kulturen gehalten und durch Auftauen und wahlweise erneute Klonierung reaktiviert worden.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Gewinnung von Hybridomzellinion, wolcho die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper absondern, wobei ein geeignetes Säugetier mit einom erfindungsgemäßon Polypeptid oder dessen Derivat immunisiert wird, antikörper-produziorendo Zellen dieses Säugetiers mit Zellen einer kontinuierlichen Zellinio fusioniert werden, die bei der Fusion erhaltenen Hybridzellen Moniert und Zollklone, welche dio gewünschten monoklonalen Antikörper absondern, selektiert werdon.

Die Immunisierung wird ausgeführt, wie weiter obon für die Herstellung polyklonalor Antikörpor beschrieben wurde. Antikörperproduzierondo Zellen der immunisierten Säugetiere, vorzugsweise Lymphoidzollon wie z. B. Milzlymphozyten, die beispielsweise einen bis fünf Tage nach der letzten Injektion entnommen wordon, worden mit don Zellen einer kontinuierlichen Zellinio fusioniert, d.h. mit einem sich ständig replizierenden Zellklon, der diese Replikationsfähigkeit auf die Hybridzellen überträgt, dio aus der Fusion entstehen. Ein Beispiel für eine derartigo Zollinie ist eino Tumorzellinie (Myelom), die nicht selbst wirklich Immunglobuline oder deren Fragmente produziert, aber die Fähigkeit zur Produktion und Absonderung großer Antikörpermengen besitzt und dio ein Markierungsgen trägt, so daß die Hybridzollen von nichtfusioniorten Elternzellen durch Selektion getrennt werden können. Mehrere geeignete Myelomzellinien sind dom Fachmann bekannt. Bevorzugt worden Myelomzellinien, denen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) oder das Enzym Thymidinkinase (TK) fehlt und die daher in einem selektiven Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (HAT-Modium), nicht überleben Besonders bevorzugt werdon Myelomzollon und abgeleitete Zellinien, dio in HAT-Medium nicht überleben und keine Immunglobuline oder deren Fragmente absondern, wie z.B. dio Zellinien P3x63Ag8.653 oder Sp2/0-Ag14. Die Fusion erfolgt in Gegenwart eines Fusionspromotors, z. B. des Sendai-Virus oder anderer Psramyxoviren, wahlweise in UV-ina'.'tiviertor Form, oder chemischer Fusogene, wie z.B. Calciumionen, oberflächenaktiver Lipide, z. B. Lysolecithin, oder Polyethylonglycol (PEG). Vorzugsweise werden die Myelomzellen mit einem drei- bis zwanzigfachon Überschuß von Milzzellen aus immunisierten Säugetieren in einer Lösung fusioniert, dio etwa 30% bis etwa 60% Polyethylenglycol mit oinem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000 enthält.

Nach der Fusion worden dio Zellen wiederaufgeschwomrnt und in einem selektiven Medium kultiviert, das in Abhängigkeit von dem genetischen Selektionsmarker ausgewählt wird, z. B. in HAT-Medium. In diesem Medium überleben nur Hybridomzellen, da sie die Wachstums- und Replikationsfähigkeit in vitro der Myelom-Elternzellen mit dem Fohlen der für das Überleben im HAT-Medium wesentlichen HGPRT- oder TK-Geno kombinieren, das sio von den antikörporproduziorenden Milzzollen der immunisierten Säugetiere geerbt haben.

Gooignoto Kulturmodion für dio Vormohrung von Hybridomzollon sind dio Stondardkulturmodion vvlo z.B. Dulbocco ichos modifiziortes Eoglo-Modium (OMEM), Minimalmedium, RPMI ΙΟΊΟ-Modlum und dergleichen, wahlwolso ergänzt durch ein Säugetlorsorum, z. B. durch 10 bis 16% fötales Kälbersorum. Vorzugsweise werden zu Beginn des Zellwachstums unmittelbar nach dem Fusionsschritt Futtorzellen zugesetzt, z.B. normale MausPorltonooloxsudatzellen, Mllzzellon, Knochenmark-Makrophagon odor dergleichen, um die Hybrldzollon zu ornöhron und ihr Wachstum, bosondors bei niodrigon Zolldichten, durch Boroitstollung von Wachstumsfaktoren o. ä. zu fördern. Wonn phagozytischo Zollon wie ^m Boispiol Makrophagen oder Monozyten verwondot worden, könnon sie bei der Beseitigung dor Trümmor von toten Myelomzollen, die nach olner Aminoptorinbehandlung stets zu finden sind, oinon nützlichen Dienst lolston. Die Kulturmndion worden mit selektivem Modium ergänzt, um zu verhindern, daß Myolomzollen die Hybridomzollon üborwuchom.

Aus den Überständon dor Hybridomzellkultur worden die gewünschten monoklonalon Antikörper ausgelesen, vorzugsweise mit einem Enzymimmuntest oder einem Radioimmuntost. Positive Hybridomzollon werden Moniert, z. B. durch Qrenzvordünnung odor in Wolchagar, vorzugsweise zweimal odor mehrmals. Wahlwoiso orfolgt oino f'aseago der Hybridomzollon durch Tioro, z. B. Mäuse, mittels intraporitonoalor Injektion und Sammlung von Aszitosflüssigkoit, wodurch die Hybridomzollen stabilisiert und ihre Wachstumseigonschaften verbessert werden. Die klonlertenZellinien können in Ii. ι kömmlicher Weise eingefroren worden. Die erfindungsgomäßon polyklonalon und monoklonalon Antikörper oder ihre Derivate sind brauchbar für dio qualitative und quantitative Bestimmung der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. ihrer Derivate. Dioee Polypeptide und Derivate sind Markör für Entzündungszuständo und gleichzeitig für Hodgkinsche Lymphomo.

Zum Boispiol könnon dio Antikörper odor ihre Dorivato in jedem bekannten Immuntest eingesetzt worden, dor auf der Bindungswochselwirkung zwischon den antigenon Determinanten der orfindungsgomäßen Polypeptide oder ihrer Derivate oder den Markorn für Hodgkinscho Lymphome und den Paratopon dor Antikörpor beruht. Ueispielo für solche Tests sind Enzym-, Radio-, Fluoreszonz-, Chemolumineszenz-, Immunpräzipitations-, Latexagglutinations-, Hämagglutinations-Immuntests und Immunfärbung.

Dio erfindungsgemäßon Antikörpor könnon als solche odor in Form von enzymkonjugierten Dorivaten in elnom Fnrymimmuntest eingesetzt worden. Es kann jedo bekannte Modifikation eines Enzymimmuntests vorwendet worden, z. B. der (homogene) Enzymimmuntost in löslicher Phase, dor (heterogene) Fostphason-Enzymimmuntost, der Einzol-Enzymimmuntest odor dor Doppol-fSandwich-lEnzymimmuntrst mit direktor oder indirekter (kompetitivor) Bestimmung dor erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Dorivato.

Ein Beispiel für einen solchen Enzymimmuntost Ist ein Sandwich-Enzymlmmuntest, bei dom ein geeigneter Träger, z.B. dio Plastikoborflächo einer Mikrotiterplatte oder eines Prüfröhrchens, z. B. aus Polystyrol, Polypropylen odor Polyvinylchlorid, Glasoder Kunststoffperlon, Filterpapier, Dextran usw., Zelluloseazetat- odor Nitrozelluloseplatten, magnetische I oilchon oder dergleichen durch einfache Adsorption oder wahlweise nach Aktivierung des Trägers, beispielsweise durch Glutaraldehyd oder Bromcyan, mit einem erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpor überzogen werden. Es werden die Probelösungen zugesetzt, welche dio erfindungsgemäßen Polypeptide oder Derivate oder Marker für Hodgkinsche Lymphome enthalten, und schließlich polygonale Antikörper, die ebenfalls mit dem Antigen reagieren und enzymmarkiert sind, z. B. mit alkalischer Phosphates© oder Meorretu hperoxidase konjugiert. Die Menge der erfindungsgemäßen Polypeptide odor ihrer Dorivato oder der Markör für Hodgkinscho Lymphome in der Testlösung ist direkt proportional zur Menge der gebundenen polyklonalon Antikörper und wird durch Zusetzen einer Enzymsubstratlösung bestimmt. Die Reaktion mit dem Enzymsubstrat führt z.B. zu einer Farbänderung, dio visuell oder mit optischen Meßgeräten beobachtet werden kann. Die enzymmarkieiten polyklonalen Antikörper könnon durch erfindungsgemäße enzymmarkierte monoklonal Antikörper ersetzt werden, die ein anderes Epitop des Antigens als die trägergebundonen Antikörper erkennen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper könnon als solche oder in Form von radioaktiv markierton Derivaten in einem Radioimmuntest (RIA) eingesetzt werden. Wie oben für Enzymimmuntests boschrieben, kann jode bekannte Modifikation eines Radioimmuntests angewendet worden.

Die Tests worden analog zu den oben beschriebenen Enzymimmuntests unter Verwendung einer radioaktiven Markierung, z. B. '"I, anstelle einer Enzymmarkiorung ausgeführt. Die Menge des gebildeten Immunkomploxos, die der in der Testlösunq vorhandenen Menge der erfindungsgemäßon Polypeptide oder Derivate oder Marker für Hodgkinscho Lymphome entspricht, wird durch Messung der Radioaktivität des Immunkomplexes bestimmt.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können als solche odor in Form von Derivaten, dio mit Chomolumineszenzmarkern konjugiert sind, in einem Chomoluminoszenz-Immuntest eingesetzt werden. Die Tests werden analog zu den oben beschriebenen Enzymimmuntests unter Verwendung einer Chemolumineszenzmarkierung anstelle einer Enzymmarkierung ausgeführt. Die Menge dos gebildeton Immunkomplexes, die der in den Testlösungon vorhandenen Menge der orfindungsgemäßen Polypeptide oder ihrer Dorivato oder der Marker für Hodgkinsche Lymphomo entspricht, wird durch Zusetzen einer lumineszonzauslösonden Verbindung, z.B. H₂O₂ und NaOH, und Messung dor Lichtemission mit optischen Meßgeräten bestimmt.

Für dio Immunfärbung werden Kryoschnitto von kältekonsorviertem Biopsiematerial oder in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte mit einer Lösung behandelt, die einen erfindungsgemäßon Antikörpor enthält, danach gewaschen und mit einem zweiten Antikörpor, dor cino Bindung mit dom erfindungsgemäßen Antikörper oingoht, entwickelt; dieser zweite Antikörper kann durch eine radioaktive Markierung, oin mit ihm konjugiertes Enzym, einen Fluoroszenzmarker oder durch Biotin nachgewiesen werden. Sonst wird der Kryoschnitt oder das eingebettete Gewebe mit einer Lösung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Derivats in der oben beschriebenen Weise zur Reaktion gebracht, z. B. mit einem mit ¹²⁶I radioaktiv markierten Derivat, einem Konjugat mit einem Enzym, etwa mit Moerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder ß-D-Galactosidaso, einem Konjugat mit einem Fluoreszenzmarker, etwa mit Fluorescein, odor einem Konjugat mit Biotin. Gebundene radioaktiv markierte Antikörper werden durch Messung dor Radioaktivität der Gewebeschnitte nachgewiesen. Gebundene Antikörperkonjugate mit Enzymen werden nach Behandlung mit einem geeigneten Enzymsubstrat nachgewiesen, vorzugsweise mit einem Enzymsubstrat, das am Ort des Antikörpers oder am Ort dos zweiten Antikörpers, dor eine Bindung mit dem erfindungsgemäßon Antikörpor eingeht, zu einer festen Ablagerung (Färbung) führt. Anstelle von Antikörperkonjugaten mit Enzymen können Antikörperkonjugate mit Biotin und eine Lösung von Avidin-Enzym-Konjugat vorwendet werden, was zu einer höheren Enzymkonzentration am Ort des Antikörpers und damit zu einer höheren Empfindlichkeit der Immunfärbungsmethode

führt. Die fosto Ablagerung dos (Inzymsubstrats wird durch Betrachtung untor dom Mikroskop odor durch Mussung dor optischem Dichte bei dor Wellenlänge dor Färbung nachgowioson. Dio Färbung durch Antikörporkonjugato mit Fluoroszonzmmkorn wird ebonso nachgewiesen.

Die erfindungsgemäße Anwendung von Antikörpern und Ihron Derivaten entsprechend dor obigon Beschreibung zur Bestimmung von erfindungsgomäßen Polypeptiden odor ihren Derivaten odor von Markorn für Hodgkinscho Lymphomo umTaßt auch andere Immuntests, dio an sich bokannt sind, z. B. Immunfiuoroszonztosts, Latoxagglutination mit nntikörporboschichtoton oder antigenbeschichtoton Latoxtoilchen, Hftmagglutination mit antikörporboschichtoton odor antigonboschichtoton roton Blutkörperchen, Lichtoxtinktionstests untor Verwendung oinor antikörporboschichtoton I ichtloitfoser und woitoro direktwirkondo Immunsensoron, die das Bindungsereignis in ein elektrisches odor optisches Signal o.a. umwandeln. Die Erfindung betrifft außardom Testsätze zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von orfindungsgemäßon Polypeptiden odor ihren Derivaten odor von Mdrkern für Hodgkinsche Lymphome, dio orfindungsgomäßo polyklonalo und/oder monoklonalo Antikörper und/odor dor on Dorivato und wahlwoiso andoro polyklonalo odor monoklonal Antikörpor und/odor Zusätze enthalten.

Erfindungsgemhße Tostsätzo für oinon Enzymiummuntost oder Enzymimmunfärbungstost onthalton z. B. oinon gooignoten Träger, wahlweise gofriergotrocknoto Lösungen oines oder mehrerer polyklonalor und/odor monoklonalor Antikörpor, wahlweiso gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines enzym- oder biotinkonjugiorten Antikörpors, Lösungen oinos Enzym-Avidin-Konjugats, falls ein biotinmarkiorter Antikörpor vorwondet wird, Enzymsubstrat in fostor oder golöster Form, Standardlösungon eines orfindungsgomäßen Poiypoptids odor oines Derivats davon, Pufforlösungon und wahlweiso Polypeptide oder Petergenzion zur Verhinderung unspozifischor Adsorption und Aggregatbildung, Pipetten, Roaktionsgcfäßo, Eichkurven, Bedienungsanweisungen _un() dergleichen. Ein oder mohroro Antikörper dos Testsatzos sind orfindungsgomäßo Antikörper.

Die erfindungsgemäßen Antikörper und Antikörperdorivato können zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von orfindungsgemäßon Polypeptiden odor ihron Dorivaton eingesetzt worden. Aufgrund dor Tatsache, daß diese Polypeptide odor Derivate Entzündungsüborträger oder Vorläufer von Entzür.dungsüberträgern sind, sind dio erfindungsgomäßen Antikörpor und Antikörperderi /ate somit für dio einfache und zuverlässige Diagnose von Entzündimgszuständon insbesondere von Spätallergiereaktionon brauchuar. Das Vorhandensein oder die Menge der orfincluruisgoii'.ißon Polypeptide odor ihrer Dorivato kann in biologischen Flüssigkeiten wie Humanserum, Gelonkflüssigkoit oder Plasma, in Gewobeschnitton und Zellon nach diagnostischen Standardverfahren bostimnit wordon, z.B. durch die oben beschriebenen nmuntests, vorzugsweise durch Enzymimmuntests.

Die Bestimmung orfindungsgomäßer Polypeptide und ihrer Derivate kann ai.-h zur Übruwachung dor Behandlung von Entzündungszustandon während der Therapie ungewondet werden, da man d ich O'a Mossung dor Konzentration der "olypeptide und ihrer Doiivato die Effektivität der Therapie einschätzen kann.

Weiterhin sind die erfindungsyemäßon Antikörpor und Antikörperdorivate als Antagonisten zum natürlichen Uborträgor verwendbar und können daher zur Bekämpfung von Entzündungsprozesson eingesetzt werden. Die orfindungsgomäßen Antikörper und Antikörperderivate können zur Isolierung und Roindarstallung der erfindungsgomäßon Polypeptide oder Derivate aus natürlichen Quellon oder aus transformierten Wirtszellon durch Immunoaffinitätschromatographie oingosotzt werden.

Außerdem können die orfindungsgemäßen Antikörpor und Antikörpordarivate zur Lokalisierung oinos Hodgkinschen Lymphoms bei einom Patienten untor Anwendung von Strahlungsmoßverfahren eingesetzt werdon. Dazu werden radioaktiv markierte Derivate von Antikörpern, die eine Bindung mit MRP-160, rMRP-70 oder MRP-160-Fragmenton eingehen, dom Patienten injiziert und der Patient wird mit einem Gamma-Abbildungsdetektor in regelmäßigen Zeitabständon abgetastet. Zellen, die Marker für das Hodgkinsche Lymphom exprimieren, nehmen mehr radioaktive Antikörper auf als anderes Gewebe und worden durch die Gamma-Abbildungskamera deutlich erkannt. Für die Strahlungsmessung werden vorzugsweise mit ¹³¹I oder mit ^e>lmTc markierte monoklonalo Antikörpor in Mengen von 3 bis 8 pg verwendet, die 15 bis 3OpCi pro kg Körporgewicht entsprechen.

Ferner können die Antikörper selbst und insbesondere ihre Derivate, wie z. B. Konjugate mit zytotoxischen und karzinostatischen Verbindungen zur Behandlung des Hodgkinschen Lymphoms eingesetzt werden. Die therapeutische Dosis für Säugetiere liegt zwischen otwa 10 Mg 'ind 1 mg pro kg Körporgewicht für dio Antikörpor selbst und zwischen 1 ug und 100pg pro kg Körporgowicht für Konjugate mit zytotoxischon Medikamenten, in Abhängigkeit vom Zustand des Patienten und von der Applikationsart. Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Präparato, die Antikörper enthalten, welche eino Bindung mit MRP-160, rMRP-70 oder mit MRP-160-Fragmenten bzw. Derivaten dieser Substanzen eingehen, in therapeutisch wirksamor Menge zusammen mit einem festen oder flussi jon, organischen oder anorganischen pharmazeutischen Träger, zur Behandlung des Hodgkinschen Lymphom?. Geeignete pharmazeutische Prcparate sind die obon beschriobonon, dio jedoch erfindungsgemäßo Antikörper anstelle des Poiypeptids oder der Polypeptid-Derivate enthalten,

AbkQrtungen	Rinderserumalbumln
BSA	5-bromo-4-chloro-3indolylphosphat
BCIP	alkalische Kälbordarm-Phosphatase
CIAP	Dosoxyribonucloosldtriphosphai
dNTP	(N «· Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymln)
	Dithlotluoitol
DTT	schnelle Protoln-Flüseigkeltschromatographle
FPLC	Isopropyl-ß-U-thlogalactosld
IPTG	Luria-Nährboulllon
L-Nährbouillon	monoklonalor Antikörper
MAb	Nitroblau-Totrazol
NBT	optischo Dichte
OD	pNpNpNpNpNpN(N = Desoxynuclootid), zufallsverteiltes e-moros(Ribo)adonosin-5'-triphosphat
pclN6	Raumtomporatur
RT	Natriumdodocylsulfat
SDS	Tris-EDTA-Puffer
TE-Puffor	Einhoit(en)
U

Belsplole

Beispiel 1 Konstruktion der Human-cDNA-Bibliotheken L132 und MMC

1.1 Isolierung von mRNA aus humanen L 132-Zellen

1.1.1 Isolierung dor Gosamt-RNA

Ein 5-ml-Pollet von 8 χ 10* 1132-Zollen (ATTC CCL5, monschliclio ombryonale Lungonepitholzollen) wird In 20ml GuSCN-Lösung, dio durch ein O,8pm-Filter passiort wurde und 4M Guanidinisothiocyanat, 25mM Natriumacetat, pH6, sowie 12OmM P-Mercaptoethanol enthält, aufgelöst. Nach kräftigem Schütteln wird die DNA durch zehn aufeinanderfolgende Passagen durch eine 22G-Nadol teilweise abgeschnitten. Die Lösung wird In Polypropylonröhrchon über drei CsCI-Polster geschichtet, die aus 4 ml einer Lösung von 5,7 M CsCI in 25mM Natriumacetat mit einem pH-Wert von β bostehen, und 16 Stunden lang bei 20"C mit 29000 U/min in einem TST41 -Rotor (Kontron) zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig onlfo' '. und die Pellets werden in 1,5ml 0,2% SDS wiederaufgelöst und mit 1,5ml Chloroform extrahiert. Die RNA wird aus dor wäßrigen Phase durch Zusatz von zwei Volumteilen Ethanol ausgefallt, in 1,5ml 0,2% SDS wioderaufgolöst und durch Zusatz von Natriumacetat, pH6, bis zum Erreichen von 0,15 M sowie von zwei Volumteilen Ethanol wiedurausgefällt.

1.1.2 Isolierung der mRNA

Das RNA-Pollet, das 14mg Gesamt-RNA enthält, wird in 5ml Elutionspuffer (1OmM Tris-HCI, pH7,5; 1 mM EDTA und 0,2% SDS) aufgelöst, 2 Minuten lang auf 65⁰C erhitzt und schnell auf Raumtomperatur abgekühlt, Nach Zusatz von 0,55ml 5 M NaCI wird di? Lösung dreimal einer Säule mit 0,5g Oligo-dT-Zelluloso (Typ 7, Pharmacia) zugeführt, die in Waschpufforlösung (0,5M NaCI, 1OmM Tris-HCI, pH7,5; 1 mM EDTA und 0,2% SDS) äquilibriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit 15ml Waschpufforlösung wird die gebundene RNA in 4 ml Elutionspuffer oluiert. Das eluierte Material wird zwei Minuten lang auf 65⁰C erhitzt, auf 0,5 M NaCI eingestellt und erneut der wieder äquilibriorten Säule zugeführt (dreimal). Nach dom Waschon mit 15ml Waschpufferlösung wird die mRNA in 4ml Elutionspuffer aus der Säule oluiert und nach Zugabe von 0,25ml 3M Natriumacetat, pH6und 10ml Ethanol über Nacht bei -2O⁰C ausgefällt. Der Niederschlag (275Mg) wird durch Zontrifugation (15min bei 16000g) gesammelt, in 0,4 ml H₂O aufgelöst und durch Zusatz von 25μΙ Natriumacetat (3M, pH6) und 1 ml Ethanol ausgefällt. Nach zehnminütigem Abschrecken in Trockeneis wird die RNA durch fünfminütige Zentrifugatlon in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt. Das Pellet wird an der Luft getrocknet und in 275μΙ H₂O wiederaufgelöst.

1.2 Synthese doppelstrfinglger cDNA zur Klonlerung Im Bakteriophagen Lambda gt 11

Zunächst wird unter Verwendung der mRNA L132 aus Beispiel 1.1.2 oder der RNA von einkernigen Leukozyten aus peripherem menschlichem Blut (MNC; hergestellt entsprechend dor Beschreibung in der Europäischen PA 0263072) als Matrizen einzelsträngige cDNA synthetisiert. Zwoi lOpgProben der L132 mRNA oder 20ug MNC-RNA werden eine Stunde lang bei 43'C in jeweils 50μΙ Lösung inkubiert, die 10OmM Tris-HCI (pH8,3; gemessen bei 43°C), 1OmMMgCIj, 14OmMKCI, 1OmMDTT ImM von jedem dNTP, lOOpg/ml Oligo-dT (17-18) (Pharmacia), 9OU RNasin™ (Promega Biotech), 40U AMV-Umkehrtranskriptase (Genofit) und 5uCi a-"P-dCTP (300Ci/mmol). Nach Vereinigung der beiden entsprechenden Proben werden die RNA-DNA-Hybridmoleküle wie folgt zurückgewonnen: die Probe wird auf oino Molaritöt von 2OmM in EDTA (pH 7,5) und auf 0,2% in SDS eingestellt, mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert (1:1, äquilibriert mit TNE: 10OmM NaCI, 1OmM Tris-HCI, pH8,0; 1mM EDTA) und ineino 1,5-ml-Säule mit Sopharose-4B (Pharmacia, äquilibriort in TNE mit einem Gehalt von 30OmM NaCI !insgesamt]) eingefüllt. Nach dem Auswaschen der Säule mit der gleichen Pufferlösung werden die Fraktionen, die mindestens 90% des Materials enthalten (beurteilt nach dem eingebauten "P) miteinander kombiniert (4-5 χ 50μΙ), und zwei Volumteile Ethanol werden zugesetzt. Nach zehnminütigem Abschrecken in Trockeneis wird der Niederschlag durch fünfminütiges Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge zurückgewonnen, mit 0,1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und an der Luft gotrocknot. Die RNA-DNA-Hybriden werden nochmals, wie oben beschrieben, eine Stunde leng bei 43⁰C in einer SOpJ-Reaktion unter Weglassung des Oligo-dT inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann in EDTA auf 2OmM eingestellt und es werden 3,8 μ11N NaOH zugesetzt. Dann wird das Reaktionsgemisch 20 Minuten lang bei 75⁰C inkubiert, abgekühlt, durch Zusatz von 25μ11M Tris-HCI, pH8, und 6μ11N HCI neutralisiert und die einzolsträngige cDNA wird zurückgewonnen, wie oben für die RNA-DNA-Hybriden beschrieben.

Zur Synthese des iwolton Strangs worden 5pg olnzelstränglgo cDNA 30 Minuten lang bol 37⁰C In ΙΟΟμΙ Pufferlösung Inkublorl, clio 33mM Tris-Acotat, pH7,9; 66mM Kaliumacotat, 1OmM Magno9lumacetat, 0,6mM DTT, 1 mg/ml DSA (Ponlax-Fraktion V, Calbiochom), 10ng/ml pdN6 (Pharmnclo), 1 mM von |odom dNTP, 10μΰί a-"P-dCTP ßOOOCi/mmol) und 500U/ml T4 DNA-Polymorase (FPLC-rein, Pharmocia) onthält. DIo doppolsträngigo cDNA wird zurückgowonnon, wio obon für dio RNA-DNA-Hybridon beschrieben.

Im nächsten Schritt wird die cDNA mit S 1-Nukloaso nach dem Im folgondon boschrlebenon Vorfahren aufgeschlossen. 6gg cDNAwerdon 5 Mi >uton lang bei 37°C in 60μΙ einor Lösung inkubiort, dio 20OmM NaCI, 5OmM Natriumacotat, pH4,5; 1 mM ZnSO₄ und 0,5% Qlycorol enthält. 2,5U S 1-Nuklonso (Pharmacia) wordon zugesetzt und dio Inkubation wird 10 Minuton lang fortgosotit. Die DNA wird zurückgowonnon, wio weitor obon für die RNA-DNA-Mybridon boschriobon.

Dann wird oino EcoRI-Mothyliorung wio folgt ausgeführt. 4 pg doppelsträngigo cDNA wordon 20 Minuton lang boi 37 ⁰C in 60 μΙ Lösung inkubiort, die 10OmM Tris-HCI, pH8,5mM EDTA, 0,4mg/ml BSA (Pentax-Fraktion V, Calbiochom), 15μΜ S-Adonosylmothionin (Biolabs) und 100U EcoRIMethylaso (Promoga Biotech) enthält. Die Roaktion durch eine zohnminütigo Inkubation boi 65⁰C gottoppt. Nach Zusatz von 4μΙ 0,5M EDTA, 100μΙ TNE und 1 μΙ 2O%igom SDS wird dio Lösung mit Phenol-Chloroform extrahiert 'inel die DNA wird, wio oben beschrieben, durch Ethanolausfällung zurückgowonnon. Zur Behandlung mitTt-Polymerase (Boohringor) wordon 3μς cDNA 15 Minuton lang boi 37⁰C In 50 μΙ einer Lösung inkubiort, wio sie obon für dio Synthoso dos zweiton Strangs boschriobon wurde, jodoch ohne pdN β, und die DNA wird zurückgowonnon, wie oben für die RNA-DNA-Hybridon boschriobon.

Dann worden synthetische Oligonuklootid-Linkor mit ΤΊ-Ligase an dio stumpfen Endon dor DNA-Fragmonto ligiort, wie im folgenden boschriobon. 2,5pg cDNA wordon über Nacht boi 15⁰C in 30μΙ Lösung inkubiort, dio 2OmM Tris-HCI, pH 7,8,1OmM MgCI₂,1 mM DTT, 1 mM rATP, 3A,_M U/ml EcoRI-Linkor (pCCGGAATTCCGG, Biolabs) und 800U ΤΊ-Ligase (Biolabs) enthalt. Dio Reaktion wird durch oino zehnminütige Inkubation boi 65⁰C gestoppt. Nach Zusatz von 60μΙ H₂O wordon 10μΙ einer Lösung zugesetzt, die 1M NaCI, 0,bM Tris-HCI, pH7,5,0,1 M MgCl₂,1OmM DTT und 9OU EcoRI (Boohringor) onthält, und das Roaktionsgemisch wird drei Stunden lang boi 37⁰C inkubiort. Dio cDNA wird zurückgewonnen, wio für RNA-DNA-Hybridon boschriobon, außor daß noch dor Ausfällung mit Ethanol die DNA nochmals auf einer zwoiton Sopharoso 4 B-Säulo chromatographiort wird.

1.3 Klonlorung von cDNA In LAMBDA gt 11

Jo 25ng dor cDNAs L132 und MNC von Beispiel 1.2 werdon über Nacht boi 15⁰C an 0,5μg dephosphorylierte, mit EcoRI aufgeschlossene LAMBDA gt 11-Arme (Promoga Biotech) in 10μΙ Lösung ligiort, die 2OmM Tris-HCI, pH 7,8,1OmM MgCI₂,1 mM DTT, 1 mM rATP und 400U T4-Ligaso (Biolabs) onthält.

Die ligierton DNAs werden unter Verwendung von Gigapack Gold™ Vorpackungsoxtrakten (Strotagone) verpackt und zwoi Stunden lang boi 2O⁰C inkubiort, wie vom Hersteller beschrieben. 0,5ml SM-Puffer (Phagenverdünnungspuffer, der aus 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH7,5; 8mM MgSO₄,0,01 % Golatine besteht) und 20μΙ Chloroform wordon zugesotzt und die Phagensuspension wird bei 4°C gelagert.

Zur Präparation kompetenter Zollen, dio mit Lambda gt 11 transformiert werden könnon, worden 2ml einer übor Nacht angesetzten Kultur von E. coli Y1090 (Promega Biotech) einer Menge von 200ml TY-Medium (8g/l Trypton, 5g/l Hofeextrakt, 2,5g/l NaCI) zugesetzt, das mit 0,2% Maltose und 50μg/ml Ampicillin ergänzt wurde, und bei 37⁰C inkubiert. Wenn die OD₆Oo eine ι Wort von 0,7 erreicht, werden dio Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in 50ml 5OmM MgSO₄ wiederaufgeschwommt.

10μΙ Reihenverdünnungen der obon beschiiobenon Phagensuspension werdon 100μΙ einer Suspension von kompotonten Y 1090-Zollen zugesetzt, 30 Minuton lang bei 37⁰C inkubiort, einer Menge von 4ml geschmolzenem Top-Agar (55⁰C) zugesetzt, der 20μΙ einer Lösung von 20 mg/ml IPTG in H₂O und 20μΙ einer Lösung von 20mg/ml Blu-gal™ (BRL) in N,N-Dimethylformamid enthält, und auf TY-Platten ausgestrichen. Nach einer Inkubation übor Nacht bei 37⁰C wird der Titor für die Phagensusponsion, die L132-CDNA enthalt, zu 10^?/ml berechnet; 4% davon sind Wildtyp-Phagen. Der Titer für die Phagensusponsion, welche die einkernige Leukozyten-cDNA onthält, wird zu 2 χ 10* berechnet, wovon 30% zum Wildtyp gohören.

Beispiel 2 Auslese von cDNA, die das Molekül kodiert, das mit dem monoklonalen Antikörper 1C5 reagiert, aus Lambda-gt 11· Maus· und -Human-cDNA-Expresslonsblbllotheken

Eine cDNA-Bibliothek von linolsäureinduzierten Maus-Peritonealmakrophagon (ML 1005B) und eine cDNA-Bibliothok von nichtinduzierten humanen U937-Zellon (HL 1029B), die beido Lambda-gt 11-Expressionsbibliotheken sind und von der Firma Genofit erworben wurden, werden unter Anwendung einor Immunoperoxidasetechnik gesichtot. Die Sichtung erfolgt, um die cDNA zu identifizieren, die das Molekül kodiert, das eine Bindung mit dem monoklonalen Antikörper 1C5 (MAb 1C5) eingeht. Dieser monoklonal Antikörper wird in der Europäischen PA 0162812 beschrieben. Er wird von der Maus-Hybridomzellinie mit der Bezeichnu'ig 1C5 (CNCM-Hinterlogungsnummer 1-316) produziert und ist spezifisch für oinon humanen Makrophagonmigrationshemmfaktor (MIF).

Die cDNA-Bibliotheken werden auf einen Titer von 2 χ 10⁹ Phagen pro ml eingestellt, im Verhältnis 1:1000 mit SM-Puffer verdünnt, und für jede Bibliothek werden zehn aliquote Teile (20 μΙ) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit zehn aliquoten Teilen (1 ml) einer Suspension kompetenter Y 1090-Zellen aus Beispiel 1.3 inkubiert. 10ml geschmolzener TY-Top-Agar (60⁰C) werden jeder Probe zugesetzt, die auf 15cm TY-Agarplatton ausgestrichen wird. Nach 10 Minuten werden die Platten 3,5 Stunden lang bei 42°C inkubiort.

Bei Raumtemperatur wird eino O,45pm-Nitrozellulosemcmbran (Schleicher und Schuoll) auf jedo Platto aufgesetzt, die man sich anfeuchten läßt und dreimal mit einem Flüssigkeitsfilm von 1,35g/l IPTG in H₂O einsprüht. Nach 10 Minuten werden die Platten 3,5 Stunden lang bei 37⁰C inkubiert. Nach Positionsmarkierung worden die Filter in TBST-Pufferlösung (15OmM NaCI, 1OmM Tris-HCI, pH8, und 0,05%Tween* 20) gespült, anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der gleichen Pufferlösung, die mit 1 % entfettetem Milchpulver ergänzt wird, I ingsam hin- und herbewegt, und nochmals in TBST-Pufferlösung gespült.

Die 2 x 10-Filtor werden über Nacht bei Raumtomperatur langsam In 2 χ 200ml TBST-Pufforlösung hin- und horbowegt, die mit 1 % entfottotem Milchpulver und 20mg/ml MAb 1CB ergänzt wurdo, Dio Filtor wurdon droimnl 15 Minuton long mit TUST gowaschon und 30 Minuten lang bei Raumtomporatur mit 2 χ 200ml alkalischer Phosphatase konjuglertom Ziegon-Antl-Mous-IgG (Dianova) Inkubiort, das im Verhältnis 1:2500 mit TDST, ergänzt mit 1 % entfottotem Milchpulver, verdünnt ist. Die Filtor worden dreimal 15 Minuton lang mit TBST gowaschon.

Die Filtor worden durch Zusatz einos Farbreagens entwickelt, das dio folgonde Zusammensetzung hat: 10OmM Tris-HCI, pH9,5; 10OmM NaCI, 5mM MgCI₁,0,5% einer Lösung von 75 mg/ml NBT (Biorod) In 7O%igom Dimethylformamid und 0,33% olnor Lösung von 50mg/ml BCIP (Biorad) in 100%igem Dimethylformamid. Pro Filtor wordon 10ml Farbroagens zugosotzt, und man läßt die Reaktion bo) Raumtemperatur ablaufen, bis deutliche Signale aufgotroton sind (bis zu 4 Stunden), wonach dio Reaktion gestoppt wird, indem dio Filtor in eine Lösung gebracht wordon, dio 2OmM Tris-HCI, pH8, und 5mM EDTA enthalt. Positive Plaques werden gesammelt und eine Stundo lang boi Raumtomporatur in 1 ml SM-Pufforlösung goschüttolt, die 20μΙ Chloroform enthält. Reihonvordünnungon in SM worden, wio oben boscluiobon, ausgestrichen und mit MAbiCSausgoloson. Der Prozeß wird solange wiedorholt, bis allo Plaquos positiv roagioron. Aus joder cDNA-Bibliothok wordon zwei positive Plaquos isoliert: M9 und M10 aus der Maus-Bibliothek ML1005 B, und H31 sowie H35 aus der Human-Bibliothek HL1029B.

Beispiel 3 Isolierung von cDNA-Elnschüben der rekomblnanten Phagen-UNA M9, M10, H31 und H35

3.1 Isolierung der rokomblnanten PhagervDNA

ΙΟΟμΙ der Phagensusponsionon von Beispiel 2 und oino Suspension kompotentor Y 1090-Zellon von Beispiel 1.3 werden vormischt, 20 Minuton lang boi Raumtemperatur stehengelassen und einer Mengo von 100ml TY-Medium zugesetzt, das mit 1OmM MgSO₄ ergänzt ist. Nachdom dio Mischung übor Nacht in einem 1-l-Kolbon boi 37⁰C mit 250U/min geschüttelt wurde, wordon 1 ml Chloroform und lOOpg RNnso A zugesetzt. Nach 30min boi Raumtemperatur wird NaCI zugosotzt, so daß oino Molarität von 1M erreicht wird, und noch 1 h auf Eis wird die Lösung durch Zentrifugioron (20min boi 2000 U/min In ainem H6000 Sorvall-Rotor) geklärt. Dom Überstand wird Polyethylonglykol 6000 zugesetzt, so daß sich eine Endkonzontration von 10 ergibt, die Mischung wird 1 h lang auf Eis stehengolassen und dor Phago wird durch Zentrifugieren (20min boi 3000U/min in oinom H60C0 Sorvall-Rotor) pollotiort. Das Phagenpellel wird in 2 ml SM-Pufforlösung, dio mit 10Opg RNnso A und 50 pg DNase I ergänzt ist, wiederaufgoschwemmt. Nach 30min bei Raumtemperatur wird dio Lösung mit 4 ml Chloroform oxtrahiort und anschlinßend zentrifugiert (5min boi 1 500g). Die wäßrige Phase wird auf 1OmM EDTA, 0,1% SDS und 200pg Pronase eingestellt, boi Raumtomporatur 15 Minuten lang stehengelassen und mit 4 ml Chloroform extrahiert und anschließend zentrifugiert (5min bei 1500g). Die wäßrige Phase wird auf 0,5M NaCO₄ und 33% 2-Propanol eingestellt. Nach 1 h auf Eis wird die DNA durch Zentrifugation (10min bei 10000g) zurückgewonnen. Die DNA wird in 200μΙ TE (1OmM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA) aufgelöst und durch Zusatz von 200μΙ 5M Ammoniumacotat und 0,8ml 2-Propanol, gefolgt von einer Zentrifugation (10 min boi 10000g) wiederausgofäUt. Nach Waschen mit 70%igem Ethanol wird die DNA in 200μΙ TE aufgelöst.

3 2 Isolierung von cDNA-Elnschübon

10pg Phagon-DNA werden 1 h lang bei 37⁰C in 100μΙ Lösung aufgeschlossen, die 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, 1OmM MgCI2, 1 mM DTT und 5OU EcoRI enthält. Die cDNA-Einschübe wordon durch präparative Agarosegeleloktrophorese mit anschließender Elektroelution isoliert. Dio Größen dor rokombinantonPhagen-DNA-EinschüboM9, M10, H31 und H 35 von Beispiol 2ergobon sich alle mit 2,3kb.

3.3 Subklonierung dor Isoliorten cDNA-Elnschübe

Die EcoRI cDNA-Einschübo werden in den Vektor pBLUKSP™ (Strategono) subkloniort, wobei bestohendo Verfahren angewendet werdon (T. Maniatis u.a., „Molecular cloning, a laboratory manual" (Molokularo Kloniurung, ein Laborhandbuch], Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Beispiel 4 Identifikation der gowOnschton cDNA-Sequonzon In den Human-Lambda-gt 11-cDNA-Bibliothoken L132 und MNC

durch Kreuzhybrldisierung

Die cDNA, die das Molekül kodiert, aas mit dem MAb 1C5 reagiert, wird in den monschlichon Lambda-gt 11 -cDNA-Bibliothoken L132 und MNC von Beispiel 1.3 durch sukzessive Auslese unter Verwendung von MAb 1C5, der cDNA-Einschübe von Beispiel 3.2 und ihrer Teilfragmente identifiziert.

Je 5 χ 10⁵ Plaques aus den cDNA-BiWiotheken L132 und MNC (konstruiert entsprechend der Beschreibung in Beispiol 1.3), den handelsüblichen cDNA-Bibliotheken ML1005B und HL1029B (Beispiol 2) und der nichtinduzierten, aus menschlichen Leukämiezellen abgeleiteten HL 60-Bibliothok HL1020B (Genofit) werden auf zehn 15-cm-Platten ausgestrichen, wio oben in Beispiel 1.3 beschrieben, jedoch unter Weglassung von IPTG und BIu gal™. Aus jedor Platto werden nach feststehenden Verfahren (T. Maniatis u. a., „Molecular cloning, a laboratory manual" (Molekulare Klonierung, ein Laborhandbuch], Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) zwei Replika-Filter hergestellt (NEF-978A, NEN). Mit den in Tabelle 1 weiter unten aufgeführten radioaktiv markierton Sondon worden mehrere Hybridisierungon ausgeführt, wie im folgenden beschrieben. Das Hybridisierungsverfahren wird wie folgt ausgeführt. Die Filter werdon zwei Stunden long boi S5°C in einer Lösung (10ml/ Filter) vorhybridisiert, die 2x Denhardtsche Lösung, 6x SSC (physiologische Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Puffor, siehe T. Maniatis u.a., ebenda), 0,2% SDS und 50μg/ml denaturierte Kalbsthymus DNA enthält. Die Hybridisierung wird über Nacht boi 65⁰C in der gleichen Lösung durchgeführt, welcho dio hitzedenaturierte oligo-markierto cDNA-Sonde (3-6x 10^edpm pro Filter) gemäß der untenstehenden Tabelle 1 enthält. Die Oligo-Markierung der entsprechenden cDNA-Fragmente wird wie folgt durchgeführt: 0,1 μg DNA in 13μΙ werden 5 Minuten lang aui 95⁰C gebracht, abgekühlt und kurz zentrifugiert. Nach Zugabo von 2μΙ 10x NT-Puffor (0,5M Tris-HCI, pH7,2,0,1 M MgSO₄,1 mM DTT und 0,5mg/ml BSA (Pentax-Fraktion V, Calbiochem]), 1 μΙ einor Lösung, die jeweisl 2OmM dGTP, dTTP und dATP, 3μΙ 0.-³²PdCTP dOmCi/ml, 3000Ci/mmol), 1 μΙ pdN6 (1 mg/ml, Pharmacia) und 1 μΙ DNA-Polymerase I (5υ/μΙ, Boehringer) enthält, wird die Mischung 30 Minuton lang bei 37°C inkubiert. Dio markierte DNA (5x 10'dpm^g) wird zurückgewonnen, wie in Beispiel 1.2 für RNA-DNA-Hybriden boschrieben. Nach der Hybridisierung werden die Filter 15 Minuten lang bei 65⁰C in den folgenden, zweimal gewechselten Lösungen gewaschen: 2x SSC, 0,2% SDS; 1 χ SSC, 0,2% SDS und 0,5x SSC, 0,2% SDS. Positive Plaques werden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Die bei don Hybrldisiorungsoxporimenten in den elnzolnon Bibliothoken identifizierten cDNA-Subfragmonte sind in dor folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Von jedem Sondon-cDNA-Fragmont sind dor Nome ues Kloiis sowio der rolalivo nöhorungswelse Ort der Sequenz von MRP-160 angegeben (sloho Belsplol 5.2).

Tabelle 1: cDNA-Klone, die zur Hybrldlflorung verwendet werden Zur Identifikation dos Bezeichnung dos in jodor cDNA-Bibliothok idontifizierton cDNA-Subfragments

cDNA-Subfragmonts

vorwondotoSondo/Ort ML1005 B HL1020 B HL1029 B L132 MNC

1C5 M9.M10 H31.H35

M 10-Einsthub M 10.1 H25 (H35)· M10.1kloinos H 23 H12 EcoRI-Fragment H 23 Hindlll- H 70 H67.H69 EcoRI-Fragmont H23Pstl tcoRI- ΗΊ,Η5

Fragment

H4EcoRIKpnl- L4,L7

Fragment

pMRP-160 BgIII- N 2, N

Fragment

pMRP-160 BgIII- N1.N10

Fragmont

* Reiner Phago ausgestrichen.

Beispiel 5 Isolierung und Bestimmung von Nukleotldsoquenzen der Oberlappenden cDNA-Subfrngmonto

5.1 Plaque-Reinlgung

Positive Plaques, die durch Plaque-Hybridisiorung gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 identifiziert wurden, werden gesammelt, und Reihonverdünnungen werden ausgestrichen, wie weiter oben in den Beispielen 1.3 und 2 beschrieben. Der Reinigungszyklus wird so lange wiederholt, bis nllo Plaques positiv sind. Es wird PhagenDNA präpariert und die cDNA-Einschübo (siehe Tabelle 1) werden isoliert und subkloniert, wie weiter oben in Beispiel 3 beschrieben.

5.2 Sequenzbestimmung

Die Restriktionsonzymanalyso dor cDNA-Subfragmento wird unter Anwendung von Standardvorfahren durchgeführt. Passende Restriktionsfragmente aus den cDNA-Subfragmenten sind in den Vektoren pBLUSCRIPT™ bzw. pUCKO kloniert (K. Odink u.a., Nature 330,80,1987).

Die cDNA-Sequenzbestimmung wird nach der Didosoxy-Nukootid-Kottonabbruchreaktionsmothodo unter Verwendung von doppelsträngiger DNA und des Sequenase™-Satzes und -Protokolls durchgeführt (United States Biochemical; M. Haitiner u. a., Nucl. Acids Res. 13,1015,1985). Universelle Startor wordon von Stratagene bezogen. Für don internon Start und Sequenznachwois wordon die in Tabella 2 aufgeführten Startor synthetisiert (Y. Iko u. a., Nucl. Acid Research 11 477,1983). Die Sequenz wird in beiden Richtungen bestimmt, und wenn in der ScquonzstrategieRostriktionsstellon verwendet worden, wordon sie unter Verwendung der überlappenden Fragmente und internen Starter von Tabelle 2 bestätigt.

Tabelle 2: Zur Sequenzierung verwendete Ollgonuklootld-Starter

1. H 0263 s ACTCCATCATCTGAGAC

2. H 031Or ACTCGAAAGTCATCCAC

3. H 060Or ATGCTGGCCGTAGAAGT

4. H0621S CCTTCAAACATCCCTCA

5. B 0793 s TGGTGGCACTAAGGCTG

6. B 0865 r CACGCCACACCACTCCC

7. H 0883 s GAAGAATGATGGCGCTG

8. H 0900r CAGCGCCATCATTCTTC

9. B1190 s TCCAGGAGGCCCTGAAG

10. H 145Or AGGTCCTCAACCTTCCT

11. H1601 s GGTGGCTACAGTTTCAG

12. H 165Or GGTCTTTCTCCAGTTCC

13. B1782 r GCTTCTAGCTTTTCTTG

14. B 1855s GAAGGAGATAAAGGCTC

15. H 2053 s GAGACGGCAGAATTTGC

1β. H 2379 β ACATCACAQCTCAAGQC

17. H 2513 r TTTAATCTQTTTCTCAQ

18. H 2610 s AQTGAAAQAGACTrTGQ

19. H 2884 β ATGTCAQGAGATAACTC

20. H 31118 GAAATTGTCGGACCTQG

21. H3157S QCCAGGTATQAGAQAQC

22. H 3476 s ATGTGGAAGAGCTGAAC

23. H 3492 r GTTCAGCTCTTCCACAT

24. B 3605 r ACTTCTGAGCTGCTGCC

25. H37318 CCAAGTTCATAAAAGAC

26. Η4111Γ CCACCTTCATCTTGAGQ

27. H 4200 β CAGTCCAAGAAGAAACC

28. H425Or TCTGTGTCQTGGAGATC

29. H 4400 β CCTCCAGTGQAGAACTG

30. pUCKOr CAGTGAGCGAGQAAQCQ

Die Zahl gibt don ungofähron Ort auf dor Soquonz von MRP-160 an (sioho SEQ ID NO: 1). Ein H bedeutet, daß das Oligonukleotid auf der Humansoquonz vorausgesagt wird, ein B bedeutot, daß das Oligonuklootid sowohl auf dor Human· als auch auf dor Maus-Sequenz startot. Einige Oligonukleotido passen nicht vollständig in die MRP-160-Soquonz. Nummer 30 ist oin universeller Starter für pUCKO.

Die cDNA von 6kb Länge kodiert oin Vorläuferprotein von ca. 16OkD (1D = 1 Dalton ~ 1,660 x 10'" kg) mit dor Bezeichnung MRP-160. Die vollständige Soquonz dor cDNA MRP-160 und dio vorausgosagto Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: dargestellt. Es erwoist sich, daß eine Soquonz von 105 Nukleotidon, die wahrscheinlich ein Exon repräsentiert, in den Klonen H und N 2 fohlt. Die Positionen dor cDNA-Subfragmonto von Boispiol 4 auf dor MRP-160-Soquonz sind in Tabelle 3 angegoben.

Tabelle 3: Positionen der überlappenden cDNA-Subfragmente

cDNA-Subfragmont	Position auf MPR-160
H4	140-3330
H5	1280-3680
H23	2740-4 720
H 70	3580-5830
L4	1—*
L5	1-·
L7	400-3640
N3	1-2000"*
N2	7-3050
N10	2 229-5822
N1	4065-5852

' abweichende 3'-Enden; vollständige Sequent nicht bekannt " exaktes 3'-Ende nicht bekannt

Beispiel β Konstruktion von pMRP160 Ein riybridvektr der die MRP-160 kodiorende DNA enthält, wird wie folgt konstruiert.

5pg des Vektor* pUCKO wcrdon mit EcoRI aufgeschlossen, mit CIAP dephosphoryliort und durch Agaroscolektrophorose und

Elektroelution gereinigt (Fragment a). 5pg des cDNA-Subfragments H23 werden mit EcoRI und Pstl aufgeschlossen. Das 1,4-kb- Fragment, welches das C-Ende von MRP-160 kodiert, wird durch Agarosegolelektrophorose und Eloktroolution gereinigt

(Fragment b). 5pg des cDNA-Subfrogments L7 worden mit Pstl und Kpnl aufgeschlossen. Das 2,1-kb-Fragmont, das den Mittolto'ivon MRP-160 kodiert, wird durch Agarosegelelektrophorese und Eloktroolution goreinigt (Fragment c). 5pg des cDNA·

SubfraomentsL4 werden mit EcoRI und Kpnl aufgeschlossen, und das 1,2-kb-Fragment, das den N-torminalen Teil von MRP-160

kodiert, wird durch Agarosegeleloktrophorose und Elektroelution goreinigt (Fragment d).

0,1 Mg der Fragmente a und c und 0,05pg der Fragmente b und d werden ligiert und in kompotento DH5a-Zollon (Gibco)transformiert. Die rekombinanto DNA wird isoliert und durch Rostriktionsanalyso analysiort. Ein Plasmid, das ein 4,7-kb-EcoRI-

Fragment sowie 1,2- und 3,5-kb-EcoRI-Kpnl-Fragmente und 0,5- und 2,7-kb-Pstl-EcoRI-Fragmente liefert, wird mit pMRP160

bezeichnet.

die Sequenz dos MRP-160-kodierendon Bereichs wird durch Sequenzanalyso unter Verwendung von Oligonukteotid-Starterngemäß dor obigen Beschreibung bestätigt.

Beispiel 7 Konstruktion von pMRP70_n Ein Hybridvektor, der den kodierenden Teil der DNA des H 23-Subfragments enthält, wird wie folgt konstruiert. Subklone des H23-cDNA-Einschubs ind pBLUKSP™ werden durch Rostriktionsanalyse analysiert. Ein Klon, der ein 1,2-kb-Xhol- Fragment liefert, wird mit pH23 bezeichnet.

10pg von pH 23 werden mit Hincll aufgeschlossen und mit Klenow-Polymorase repariert. Das 1,8-kb-Fragment, das denkodierenden Teil von H23 sowie 33 Nukleotide eines Linkers enthält, wird durch Agarosegelelektrophorese und Elektroelutionisoliert (Fragment a). 10pg des Vektors pP_Lmu-bio (bezogen von Biogen, abgeleitet aus pP_tmuSMCori (G. Buoll u. a., Nucl. Acids

Research 13,1923,19851 durch Austausch des Ncol-Hindll-Fragments durch den pUC9-Polylinkor) werden mit Ncol

aufgeschlossen. Die klobrigon Enden werden mit Klenow-Polymorase aufgefüllt und die DNA wird mit CIAP dephosphoryliert.

Der 3-kb-Vektor wird durch Agarosegoleloktrophoroso und Elektroelution isoliert (Fragment b).

0,1 μο dor Fragmente a und b werden llglert und In den kompetonton lytogenon E.coll-Stamm K12 Lambda transformiert. Die rokomblnanton Plasmide wordon Isoliert und durch Restriktionsaufschluß annlyslort. Ein Plasmld, das oln BamHI-XholFragment von 0,0kb llofort, wird mit pMRP70_Pl bezolchnot. Öle korrekte Konstruktion von ρΜΠΡ70_Ρι. wird durch Sequenzanalyso bestätigt. pMRP70_Pl wird In kompetonto LC137-Zollen zurücktransformlort (SC936; Q.Buoll, obenda, und S. Golf u.a., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 81,6647,1984), dio das Plasmld pCI857 einhalten, das oin tomporaturompfindlichos CIGon trägt (E.Romout u.a., Gono 22, 103,1983). Dio Transformanton wordon nach Kanamycin- plus Amplcicillinreslstonz selektiert. Zellen, die pMRP70u onthalton, wordon als Gylcorolkultur bot -70°C gospoiehort.

BoUpIeI 8 Fermentation von rMRP-70 Das pMRP70pL kodierte Peptid rMRP-70 wird In E.coil oxprlmlort, wio Im folgondon boschrlobon. Zollon, dio pMRP70_pl onthalton, werdon aus olnor Glycorolkultur auf oino Kanamycln/Ampicillln-Platto ausgestrichen und bol

3OX inkubiert. Aus einer Einzolkolonio wird im Verlauf von β SUindon bei 30⁰C olno 12-mlKultur in LDMKA gezogon (L-

Nährbouillon, die BOpg/ml Ampicillin und 40pg/ml Kanamycin enthält) (Kultur o). Zohn 20OmI-LDMKA in 2-l-Kolben wordon mit

1 ml Kultur a beimpft und über Nacht boi 30°C goschüttolt. Die Kulturen wordon mit 800ml LDM bol 30⁰C vordünnt und weitere droi Stunden lang zur Vermehrung stohongolasson (Kulturon b). Dio Synthoso von rMRP-70 wird durch schnelles Erhitzon dor Kulturon b auf 42⁰C in oinom Wassorbad von 5O⁰C induzlort und anschlioßond zwol Stundon lang bei 42⁰C goschüttolt (Kulturon c). Die Zollon aus don Kulturon >: wordon durch Zontrifugation gosammolt.

Beispiel 9 Reinigung und Charakterisierung von rMRP-70

9.1 Zollextraktion

E.coli-Zollon, die rMRP-70 exprimioren und aus lOLitor Formontatlonsbrüho von Boispiel 8 bis auf oino optische Dichte von 1,2OD-Einhoiton/ml vermehrt wurdon, werdon mit 250ml 8M Guanidinhydrochlorid, BOmM Tris-HCI, 3OmM NaCI, pH 8,0, dio 6ml 10OmM Phonylmothylsulfonylfluorid (PSMF) in 2-Propanol onthalton, aufgespalten. Dio Suspension wird 60 Minuten lang mit 20000g bei 4°C zentrifugiert. Dor Üborstand wird in Dithiothroitol (DTT) auf 0,1 % eingestellt und bei 4⁰C gegen 1OmM Tris-HCI, 0,01 % DTT, pH 8,0; dialyslort (Spoctrapor-Mombron Nr.3; 3,5kD Abschoidogronzwort; Spectrum Medical Industrios). Dor entstohondo woißo Niederschlag wird durch Zontrifugation von 30 Minuten mit 20000g bei 4⁰C ontfernt.

9.2 DEAE-Ionenaustauschchromatographle

Dor Üborstand von Beispiel 9.1 wird in oino DEAE-Trisacryl M (LKBI-Iononaustouschsüulo (5 x 10cm) gopumpt, die mit dom Dialysopuffor äquilibriort ist. Nach dom Laden dor Probe wird dio Säulo mit Diatysopuffor gowaschon, bis dio UV254-nm-Absorption auf Grundlinionniveau abfällt. Die an die Säule gobundonen Protoine worden untor Anwendung eines linearen NaCI-Gradionten von O₁OM bis 0,2M NaCI im Dialysepuffer (600ml) elulort, gofolgt von Dlalysepuffer/0,2M NaCI (200ml) und Dialysopuffer/0,1 M NaCI (200ml) mit einer Durchflußgoschwindigkoit von 4ml/min. Einzelne 12-ml-Fraktionen worden gesammelt und mittels SDS-PAGE (U.K. Laemmli, Nature 22/, 680,1970) auf 15%-Polyacrylamid-Plattengelen analysiert (Faiuung mit Coomassieblau) und entsprechend ihrem rMRP-70-Gohalt gepoolt. Fraktionen von 0,12 bis 0,2 M NaCI werden gepoolt, gegen Dialysepuffor dialyslert und nochmals untor Anwendung des gloichon Verfahrens Chromatographien, mit Ausnahme der Säuionabmessungen (2,6 χ 10cm), der Puffevolumina (50%) und der Durchflußgoschwindigkeit (2ml/mln). Fraktionen von 0,16 bis 0,2 M NaCI werden gepoolt und durch Ultrafiltration In einer Zelle mit Rührwerk (YM-10-Mombran, Amicon) um don Faktor 10 konzentriert.

9.3 Ausschlußchromatographie

2 ml dos konzentrierten Pools nach der Ultrafiltration von Beispiol 9.2 (Proteinkonzontration 14 mg/ml) wordon auf einor UltroPac TSK-G2000 SWG (LKB) - Säule (21,5 χ 600mm) in 2OmM Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 7,0; bei einer Durchflußgoschwindigkoit von 3 ml/min sopariert. Die UV-Absorption wird boi 280 nm boobochtot und oinzelne 6-ml-Fraktlonon worden mittels SDS-PAGE analysiert, wio In Beispiel 9.2 boschrieben. Fraktionen, die 32 bis 36 Minuten nach der Injektion der Probe entnommen werdon, worden gepoolt und durch Ultrafiltration in einor Zolle mit Rührwerk (YM-10-Mombran, Amicon) um den Faktor 7 konzentriert.

9.4 lonenaustauschchromatographle auf FPLC-Mono Q™

4 ml des konzentrierten Pools nach der Ultrafiltration von Beispiel 9.3 (Protoinkonzentration 4,9 mg/ml) werden in eine Mono Q™ HR "Vio-Säule (10mm χ 100mm) (Pharmacia) geladen, die in 2OmM Dietharolamin/HCI, pH 8,6; (Startpuffer) äquilibriert wurde. Dio Säule wird mit einer Durchflußgoschwindigkeit von 4 ml/min 10 Minut n lang mit Startpuffer gespült. Die Proteine werden dann 20 Minuten lang unter Anwendung eines linearen Gradienten eluiert, der mit Startpuffer/0,1 M NaCI endet. Die Extinktion des Eluats wird bei 280 η m beobachtet. rMRP-70 wird in der Zeit zwischen 21 und 23 Minuten nach Injektion der Probe eluiert (ca. 0,55 bis 0,65MNaCI).

9.5 Umkehrphasen-HPCL

Als Alternative zu der in Beispiel 9.3 beschriebenen Ausschluß-HPLC oder zu dor in Boispiel 9.4 beschriebenen FPLC an Mono Q wird der konzentrierte Pool nach der Ultrafiltration von Beispiel 9.2 mit Vw des Volumens 10%iger Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert und auf einor Vydac 214TP510 HPLC-Säule (10 χ 250mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) gereinigt. Die Säule wird in einer Mischung aus 70% TFA, 0,1 % in Wasser und 30% TFA 0,08% in Acetonitril äqi ilibriert und das Produkt wird 24 Minuten lang mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min durch einen linearen Gradienten eluiert, der mit einer Mischung von 50% TFA 0,1 % in Wasser und 50% TFA 0,08% in Acetonitril endet. Die Extinktion des Eluats wird bol 220nm beobachtet und dio einzelnen Peaks werden entsprechend der UV-Extinktion manuell aufgenommen. Man erhält zwei Hauptpeaks bei 15min bzw. 16,5 min, die analysiert werden, wie im folgenden Boispiel 9.6 beschrieben.

9.6 Analyse durch SDS-PAGE

Aliquote Teile der Fraktionen aus der Umkehrphasen-Säule von Beispiol 9.5 werden unter Vakuum getrocknet, in Dissoziationspuffer aufgelöst, 2 Minuten lang auf 96°C erhitzt und auf ein 15%iges Polyacrylamidgel aufgebracht (Färbung mit

Coomnssloblnu R-250). Dor 15-mlrvPoflk von Ooisplol 9.5 enthält mehroro verkürzte Vorsionon von rMRP-70 mit angonähorton scheinbaren Molekulargowlchton von 65kD, 44kD, 38kD bzw. 33kD (1D <= 1 Dalton = 1,6001 χ 10 "kg). Das Material dos 16,6· minPooks bostoht ous roinom rMRP-70, das in olnor Eimolbondo mit oinom Molokulargowicht von co. 7OkD wandert.

9.7 Anilnos&uresequenianalyie

Das goreinigto rMRP-70 von Doispiol 9.6 wird oinor Soquonzonalyso dor N-torminolon Aminosäuren untorworfon, wobei ain GasphasonCciiuonzanalysator (Modoll 470, Appliod Biosystoms) nach dor Mothodo von M.W. llunkepillar und L. E. Hood (Methods In Cnzymol. 91,399,1983) oingosotzt wird. Die Anillnothlozolinon-Dorlvoto worden durch Behandlung mit 25%igor wäßriger TFA bei 50⁰C zu Phonylthlohydantoln (PTH)-Amlnosäuron umgolagort. Die PTHAminosäuron worden auf olnor Zorbox™ CN HPLC-Söulo (DuPont; 200 χ 4,6mm) nach R.Knecht u. a. (Anal. Blochom. 130,65,1983) analysiert. Ee wird dlo folgendo N-torminalo Aminosäuroso<|uonz gefunden: Mot-Asp-Gly- Ilo-Asp-Lys-Lou-Asp-Ilo-Glu -Pho-Gly-Asn-Mot-Lou-Sor. Dio AminosHurosoquonz entspricht gonau dor Soquonz, dio ous dor In Beispiel 6.2 boschriobonon Konstruktion vorausgesagt wurdo.

9.8 Immunfluoroszenzanalyso

Monozyton in Tollonboutoln worden nach dreitägiger Kultur in Mc Coyschom Modlum (Biocluom, Berlin, BRD), das mit 20% Humansorum orgänzt Ist, durch zehnminütigos Zentrifugloronbei 150ggeerntet, in PuSgewaschen und 30 Minuten lang bol 4³C in 1 % QSA, 1 pg/ml Maus-lgG in 1 ml PBS/1 χ 10' Zollon inkubiort. Dio Zollon wordon zweimal in PBS gewaschen und in aliquote ToMo zu 1 χ 10' Zollon pro TostpunVt in i.e-ml-Eppondorf-Fläschchon aufgotoilt. Dio Inkubation in geoignotor Vordünnung von rMRP-70 oder natürlichem Humon-MIF (Europäische PA 0162812) (100μΙ/1 x 10' Zollon In PBS) wird zohn Minuten long boi 4'C ausgeführt. Dio Zollon wordon zwoimol in PBS gowoschon und 45 Mlnuton lang enlwedor mit biotinyliortom monoklonalem Antikörper 1C5 (Maus, sioho EP 0162812) odor AntirMRP-70-Sorum (Kanlnchon) inkubiert. Als Kontrollen worden biotinyliertos Maus-lgG bzw. Kaninchen-Normal-lgG vorwondot. Noch zwoimoligom Waschon In PBS/0,05% BSA wordon dio Zollon mit Stoptovidin-FITC (Sigma, München, BRD) für dio biotinyliorton antikörporbohondolton Sondon und mit Ziogo-Anti-Koninchon-F(ob'))-FITC (Dianova, Hamburg, BRD) für dio mit Kaninchon-Antisorum bohondolton Sondon 45 Minuton long bei 4⁰C inkubiort. Die Zellon wordon zweimal in PBS/0,05% BSA gowaschon. Vor dom lotzton Waschon wordon dio Zollon in ΙΟΟμ11 πιΜ Propidiumjodid In PBS wioderaufgeschwommt, 5 Minuten lang bol 4*C inkubiert, gowaschon, und in oinem EPICS™-Zollsortiorer (Coulter Electronics, Hlaloah, Fla., USA) analysiert. Rot fluorosziorendo Zellon werden oloktronisch aus dor Messung dor grünen Fluoroszonz dor Zollon ausgeschlossen. Der prozentuale Anteil grün fluorosziorondor positiver Zollon wird mit dom von Coultor Electronics gelioforton Immunprogramm borochnot.

Dor relative Anteil der fluoreszierenden Zellon ist ähnlich für rMRP-70 und natürlichem MIF. Dios zoigt, daß sowohl natürlicher MIF als auch rMRP-70 eine Bindung mit kultivierton Monozyten olngohon.

9.9 Migrationshemmtest

Monozyton aus Loukozytonschichten, dio oinon Tag lang in Djlbeccoschom Medium, orgänzt mit 10% FCS (Biochrom, Borlin, BRD), auf Toflonmombranon kultiviort wurden, worden durch zehnminütigos Zentrifugieren bei 150g goorntet, zweimal in Dulboccoschor.i Modium ohno FCS gowoschon und in aliquote ToMo von 2 x 10' Zollon/Testpunkt in 1,5-ml-Eppondorf- Flaschchon uufgotoilt. Dio Zellon worden wiedoraufgoschwommt und zohn Minuton lang boi 4⁰C mit 200μΙ PBS r lit jdor ohno

eine geeignoto Verdünnung von rMRP-70 oder natürlichem MIF (EP 0162812) inkubiort. Die Zollen werden fünf Minunntong boi150g zentrifugiert, gewaschon, in 200μΙ PBS wiodoraufgeschwemmt und 30 Mir.u'gn lang bei 37⁰C inkubiert.

Nach dom Waschen mit PBS werden die pollotierton Zollon in 4μΙ Dulbeccoschorr Odium, das 0,2% niedrigschmelzende Agaroso (Miles, Frankfurt, BRD) enthält, boi 37°C wiodoraufgeschwommt. Ein μΙ du iollsusponsion wird in eine der innoron

60 Vortiofungon einor Platte mit 96 Roaktionsvortiofungon pipottiert. Jedo Probe wir J doppelt gotostot. Dio Platte wird10 Minuten lang bei 4°C gehalten. Die Reaktionsvertiefungen wordon mit ΙΟΟμΙ/Vortlofung Dulbeccoschom Medium, 10% FCSgefüllt und 16-24 Stunden lang boi 37X in feuchtor Luft mit oinom COj-Gehalt von 7% inkubiert.

Nach der Inkubation wird die Wandorung dor Monzyten aus don Agarosetröpfchon horatis mit Hilfo eines Strichgitters mit Skalenteilung im Okular oines Mikroskopsgemossen. Dio Migration der Zollon in der Kontroilösung wird gleich 100% Migration

oder gleich 0% Migrationshommung gosetzt. Die Migrationsentfornung wird in % Migrationshemmung ausgedrückt. Eine

Substanz wird als biologisch aktiv betrachtet, wenn sie eine Migrationshommung von mehr als 30% bewirkt. Die Ergebnisse des Migrationshemmungstests mit rMRP-70 sind in der untonstehendon Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4: Migrationshommung kultivierter Monozyten durch rMRP-70

Konzentration von rMRP-70	Migrationshommung
pg/ml
0,001	15%
0,01	24%
0,1	50%
1	57%
10	43%

Beispiel 10: Konstruktion des Expresslonsvoktors pCDEX

10pg pSVOd-DNA (P.Mellon u.a., Cell 27,279,1981) worden mit Hindill aufgeschlossen. Dio klebrigen Enden werden mit Klenow-Polymera&e aufgefüllt, und nach der Hitzeinaktivierung der Polymerase wird die DNA mit Neel aufgeschlossen. Das 2,2-kb- Vektorfragment, das den SV40-Replikationsstartpunkt trägt, wird durch Agarosegelolektrophorose und Elektroelution isoliert (Fragment a). 10pg pCGA28-DNA (Europäische PA 0305967) worden mit BamHI aufgeschlossen. Die klebrigen Enden werden mit Klenow-Polymeraso aufgefüllt und die DNA wird mit Kalbsdarm-Phosphataso dephosphoryliert. Das 3,9-kb-Fragnont, das don Maus-Zytomogalovirus (MCMVl-Promotor/VerstHrkor, dio tPA-cDNA und einen ß-Globin-Spleißdonor·/ ak/op'or-und-polyadditionsort trägt, wird durch Agarosegolelektrophoreso und Eloktroelution Isoliert (Fragment b). Etwa 5üng dei Fr jgmonto a und b werden ligiert und in kompetente DH5a-Zollen transformiert. Dio rokombinanton Plasmide v/erden isoliert

-22- 2S8 948

und durch Aufschluß mit t'vul und Hindlll annlysiort. Ein l'lnsmid, (Ins oin 1,4-kb- und oin 4,8kbFron,mont liofort, wird mitpCONIO bozoichnot. 5μο von pCONiO worden mit Xmnl nufyoschlosson und mit CIAP dophosphoryliort (Frogmont d). Dio DNAwird durch Agarosegololoktrophoroso und Eloktroolution goroinigt.

1 ps oinos Adaptors (Biolabs ♦ 1101) mit dor Soquonz 5'-GATCCCCGGGa' wird mit T4-PolyMuklootielkinoso bohandolt und mit

T4-Ligaso ligiort. Mach dor HiUoinnktiviorung dor Lignso wird dio DNA mit Xmal aufgeschlossen. Nach Extrn^tion mit Phenol/ Chloroform wild dio DNA mit Ethanol ausgofallt (Adaptor ο).

50ng dos DNA-Fragments d worclon mit 50 ng dos Adaptors ο ligiort und in kompetente DH5a-Zollon transfiziert. Diorokombinante DNA wird isoliort und durch Aufschluß mit OninHI und Hindlll analysiert. Ein Plasmid, das Fragmonlu von 1,7 kbund 4,4 kb liofott, wird mit pCDEX hozoichnot.

Beispiel 11: Konstruktion von pMRP180„

5pg pMRP160 worden mit EcoRI aufgeschlossen und die klobrigon Endon worclon mit Klen^ ./-Polymoraso nufgofüllt: Das 4,7-kb-Fragmont, das MRP-160 kodiort, wird durch Agorosogoloktrophoroso und Eloktroolution isoliort (Fragment o). 5pgpCDEX worden mit Hindlll und BamHI aufgeschlossen. Dio klobrigon Endon wordon mit Klonow-Polymoraso aufgofüllt und dio DNA wird mit CIAP dophüsphoryliort. Dos 4,5-kb-Voktorfragmont wird durch Agarosogololoktrophoroso und tloktroolution isoliort (Fragment I)). 0,1 pg dur Fi igmonto a und b wordon ligiort und in kompotonto DH5a-Zollon tronsformiort. Dio rokombinonte DNA wird isoliort und durch Rostriktionsanalyso analysiert. Ein Plasmid, das oin Kpnl-Fragment von 0,6kb sowio ein Xhol-Frogmont von 4,1 kb liofort, wird mit pMRP160„ bozoichnot.

Uio Soquoni dos MRP-160-kodiorondon Borolchs wird durch Soquonzanalyse unter Vorwondung von Oligonuklootid-Startorn bestätigt, wio woitor obon boschriobon.

Beispiel 12: Expression von pMRP160„ In Ovariellen des chinesischen Hamster·

12.1 Trnnsfüktlon von CHO-Zollen mit pMRP160„ und Seloktlon dor traniflzlorton Klone

Das Plasmid pMRPI60,» wird in Ovarzollon dos chinosischon Homstors (CHÜ-Zollon) dor Linio DUKXD1 oxprimiort, oinor Mutanto, dor das Enzym Dihydrofolatroduktaso fohlt (G.Urlaub u. a., Proc. Noil. Acad. Sei. USA 77, 4.116,1980). Dio Zollon wordon in α-MEM (Minimalmedium) kultiviert, das Nukleosido und 5 % fötales Kalberserum enthält (sämtlich von Gibco). Dio Zollon wordon mit einor Dichto von 1OVcm' in Mikrotiterplatton mit jewoils 6 Vortiofungon (3,4cm' Durchmossor; Nunc) ausgestrichen und mit 4 Mg DNA dos Plasmids pSV2-noo (P. Southern und P. Borg 1,327,1982) noch Stanrlardvorfahron kotransf iziort, wie ausführlich im US-Patent 4399216, von R. J. Kaufman und P.A. Sharp (J. Mol. Biol. 159,601,1982) und von Assolborgs u.a. (J. Mol. Biol. 189, 401,1986) beschrieben. In einom zwoiton Exporimont woiclon 0,4 μ ρ. DNA dos Plasmids pND2 (DHFR) mit 0,4 yg DNA von pMRP160,,und0,4pg von pSV2-noo kotransfiziort (Assolborgs u.a., obonda).

48 Stunden später wordon dio transfiziorton Zollon trypsiniort und auf drei Potrischalon (8,0cm' Durchmesser, Nunc) übortragcn. Am nächsten Tag wird das nichtsoloktivo Medium durch oin solektivos Modium orsotzt (α-MEM ohno Nukleosido, dos 5% (v/v) dialysiortos fötales Kälborsorum und 1,0mg/ml Genoticin IGibco) enthält).

Nach zwoi Wochon wordon 18 gonoticinresistonto Klone isoliort und in oinom Einzolzolltost untor V' rwondung dor affinitätschromatographisch goroinigton Kaninchon-anti-rMRP-70-Antikörpor von Boispiol 14.2 nach foststohondon Protokollen (Sutor u.a., Cancor Immunol. Immunothor. 1β, 53,1983) auf dio Expression von MRP-160 untersucht. Vior Klone zoigon mit dom Anti-rMRP-70-lgG eine solf.ktive Färbung. Sio wordon mit 1B8, 2A2, 2B1 und 2B3 bozoichnot. Von dioson Klonon sind 2A2,2B1 und 2B3 mit dom Plasmid pND2 kotransfiziort wordon.

Durch Immun-Blotting (H.Towbinu.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA76,4350,1979) mit Zollysaton dieser Transfoktantonzeigt sich, daß unter roduzioronden Bedingungen (U.K. Laemmli, Naturo 227,680,1970) die Kaninchon-anti-rMRP-70-Antikörpor mit Spezies mit Molekulargewichton von 120 und 14OkD reagieron.

12.2 Solektlon von Klonen, die amplifizlerto MRP-160-Soquonzen mit Mothotrexat exprimleron

bino subkonfluento Kultur dos CHO-Klons 2B1 wird mit 2OnM Methotroxat (MTX, Sigma) 24 Stunden lang vorbehandelt und dann 1:20 in Petrischalen von 8cm Durchmesser (Nunc) vorteilt. Dio Zollon wordon in dem soloktiven Modium α-MEM ohno Nukleosido, das mit 5% dialysiertom fötalem K.ilborsorum undO,05mg/mlGontamycin (sämtlich von Gibco) (R.Kaufman und P.A. Sharp, obonda) ergänzt ist, vormehrt. Dio Soloktion wird nach 24 Stundon bogonnon, indem dor Potrischale 2OnM MTX zugesetzt worden. Nach 14 Tagen worden die resistonton Kolonion in Pools gosammelt und durch Gronzvordünnung in Platton mit 96 Roaktionsvortiofungon (Falcon) in Soloktionsmedium kloniort, das 50 nM MTX enthält. Von 16 isoliorten Klonon orwoison sich drei mit den Kaninchen-anti-rMnP-70-Antikörporn als stark positiv. Der mit 2B1-B4 bozeichnoto Klon wird ernout durch Grenzverdünnung in Selektionsmedium kloniert, das 10OnM MTX enthält. Es worden 8 resistento Klono selektiert, die sämtlich mit Kaninchon-anti-rMRP-70 reagieren. Dio mit 2B1-B4C2 und 2Β1-ΒΊΕ3 bezeichneten Klone werden oinor schrittweise bis auf 50OnM erhöhton ΜΓΧ-Konzontration ausgosotzt.

12.3 MRP-160-Konzentratlonon In Zollysaten und KulturOberstlndon der amplifUierton CHO-Klono

Zur quantitativen Bestimmung von rMRI -70 und MRP-160 in Zollysaton und Kulturüberständen der amplifizierton CHO-Klono 2B1-B4C2 und 2B1-B4E3 wird eine onzymverbundene Immunadsorptionsbostimmung (ELISA) an zwei Stollon durchgeführt.

12.3.1 Präparation der Zellysate und Kulturüberstande

Zur Produktion des Kulturüberstands werden die CHO-Klono 2B1,2B1B4C2,2B1-B4E3 und der scheintransfizierto CHO-Klon 3AB

(Beispiel 12.1) bis zur Subkonfluenz vermehrt und 48-72 Stunden lang mit α-MEM inkubiert, das mit 5% dialysiortom fötalem

Kälbersorum ergänzt ist. Don Klonon 2B1-B4C2 und 2B1-B4E3 wurden zusätzlich 20OnM MTX zugesetzt. Nach der Ernto worden

die Überstände 15 Minuten lang bei 2000g, danach 15 Minutonbei 12000g zentrifugiert und bei -8O⁰C gelagert.

Die Präparation der Zellysate erfolgt nach Standardprotokollon. Kurz zusammengefaßt, worden die trypsinierten Zellen (2 x 10⁷/

ml) 15 Minuten lang auf Eis mit Lysopuffor behandelt (10OmM Tris, 10OmM NaCI, 1 mM EDTA, 0,1 %SDS [alle von Biorad), 1,0%

Nonidet P40 [Shell]. 1,OmM Phonylmothylsulfonylfluorid [Boehringor Mannheim), pH 7,5; RJ. Kaulman und P.A. Sharp,

obondo). Nachdom die Zelltrümmor 16 Minuten lang mit 2000g abgeschleudert worden lind, wird der Überstand 16 Mlnuton lang mit 12000g zentrifugiert und bei -80'C getagort. DIo Geeomtprotolnkonzontratlon wird nach dor Mothodo von Lowry u.a. (J. BIoI. Chem. 193, 265,1951) bestimmt.

12.3.2 Zweistollen-ELISA

Aliquote Toilo dor Zollysote und Kulturüborständo dor Schulntransfoktonto 3AB, der Eltorntransfoktanto 2B1 und dor MTX-bohanu'olloo Klono 2B1B4C2 und 2B1-B403 wordon mit dor Im (olyondon boschriobonon onzymvorbundonon Immunadsorptionsbostimnuing (ELISA) an iwol Stollen duf Ihro Konzentration on rMRP-70 und MRP-160goprü(t. Dor ELISA-Tost wird unter VorwoiuKing dor offinitiltschromatographlsch gorolnlgten Kanlnchon-anti-rMRP-70-Antikörpor von Boisplol 14.2 unter Einhaltung von Stondardprotokollon durchgeführt (E.Engvoll und P. Porlman, Immunochem. 8,871,1971; J.Bruoggon ii.a., Cancer Immunol. Immunothor. 15, 200,1983). Koninchen-anti-rMRP-70-lgG (1,0pg/ml) in 0.05M Carbonatpuiler, pH 9,6; wird mit ΙΟΟμΙ/Roaktionsvortiofung auf Platten mit 90 Vortlofungon (Nunc Fl) ausgostrichon und übor Nacht bol <1'C Inkublort. Nachdem dio unspczifischon Stollen mit Trisgopuffortor physlotogischor Kochsalzlösung (TBS, 0,05 M, pH 7,4), die 0,2% Gelatine (Biorad), 1,0% Rindersorumalbumin (Serva) und 0,05% Twoon*20 (Biorad) enthält, eine Stunde lang bol Raumtomporntur blockinrt wurden, wordon die Tostprobon (5OpI), rokombinonto rMRP-70-Standards (1,9-260ng/ml, siohe Boispiol 9) und in Blockiorungspuffor vordünnto Kontrollprobon zugosotzt und olno Stundo lang bol 37'C gohalten. Dio Plntton wordon 30 Minuten lang bol 37 ⁰C mit TBS, das biotlnyliortos AntirMRP-70-lgG enthält (50μΙ, Ο,δμο/ml, Blotlnyliorung nach einommodifiziorton Protokoll von Lornor u.o, J. fc'xp. Mod. 152,1085,1980), gowaschen (Skatron Microwashll). Nach dom Waschen wordon 30 Minuten lang bei 37⁰C 50μΙ Konjugat aus Strcptavidin mit alkalischor Phosphataso (Gibco BRL) zugosotzt. Das gebumlono Enzym wird 30 Minuton lang boi Umgobungstomporotur mit 100μΙ p-Nitrophonylphosphot (1,0mg/ml in Diothanolominpuffor 1 M, μ\{ 9,8; Sigma) Inkublort und dann mit 0,5 N HCL gostoppt. Dio Extinktionsworte werden bol 405nm abgeloson (Multiscan MCC, Flow). Dio Daton wordon untor Vnrwondung >inos loylstlschon 4-Paramotor-Kurvononpassungsprogramms (Flow) aufbereitet

Dio Ergobnisso dos ELISA-ToMs sind in dor folgenden Tabollo b zusammongofaßt.

Tabelle 5: rMRP-70- und MRP-160-Koiuentratlonen In Zellysaton und Überitlnden der trantflilerten CHO-Zellen*

Zollinio	Zellysat"	Kulturüborstande
	(ng MPiP-70/mg Protoin)	(ngMRP-70/ml/IO'Zol'on)
2U1	23,0	0,0
(Eltornzollo)
2B1-B4C2	1 250,0	56,0
(MTX-bohandolt)
2B1-B4E3	892,0	ee,o
(MTX-bohanclolt)
3AB	0,0	0,0
(Scheinkontrollo)

a) Zwoistellen-EUSA; Kaninchen-anti-rWHP-70 gegen biollr.ylierten Kaninchen-anti-fMnP-70; die Werte sind in ng/nil angegeben, bezogen auf don rekombinanten rMRP-70-Standard; die Nachweisgrenze ist 1.0ng/nil.

b) Gezogen auf mg Gosamt-ZeHprotein.

c) Überstunde weiden nach 72h geerntet, beginnend mit subkonfluenten Zellkulturen.

Die MTX-behandolton Klono oxprimioron izollulärca. 50mal mohr rMRP-70-vorwandtes Protoin als die Elternzolle 2B1. Die Überstände dor MTX-Klono onthaltcn 50-60ng/ml/10* Zollon immunro.iktivos Protoin, währond dio Eltornzollo 2B1 negativ ist.

Beispiel 13: Induktion einer Entzündungsreaktion In der Hout von Meerschweinchen MRP-160 wird in oinom Test untor Vorwondung normaler Meorschwolnchon auf dio Fähigkeit zur Induktion von Hautreaktionon

goprüft.

Normale Meerschweinchen werdon rasiert, anästhesiert und orhalton eine Intradormalo Injektion von jo ΙΟΟμΙ des Überstonds

verschiedener mit MRP-160 amplifizior'er CHO-Zellinien. Die Hautroaktion wird nach 24 h und nach 48Ii bostimmt. Positive

Reaktionen führen zu einer signifikanten Rötung in elnom Boroich von ca. 5-12mm Durchmossor. Es zoigt sich, daß mehrere MRP-160-amplifmerto CHO-ZoII'\iion Hautreaktionen induzieren, während wodor die kultivierton und untor identischen Bedingungen injizierten Kontrollzollon noch das Kulturmedium selbst irgondolnon Effokt hervorrufen. Beispiel 14. Präparation polyklonalrr Antikörper

14.1 Präparation von Kanlnchon-antl-rMRP-70-Serum

0,5mg rMRP-70 (hergestellt nntsprochond der Beschreibung in don Boispiolon 8 und 9) in vollständigem Froundschom Adjuvans (Gibco) wordon Kaninchen injiziort, gofolgt von oinor Auffrischungsinjektion von 0,5mg rMRP-70 in unvollständigem Froundschem Adjuvans (Gibco) nach 20 Tagen. Der Titor des Koninchensorums wird durch eino onzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) in Mikrotitorplattcn, die mit rMRP-70 ausgestrichen sind, nach feststehenden Protokollen beobachtet (E. Engvall und P. Pcrlmann, Immunochem. 8,871,1971). Die Untersuchung von Western-Blots zeigt, daß nach erschöpfender Adsorption mit Lysaton nichtlransfizicrtor E.coli-Zellen die einzige im Serum verbleibende Aktivität gegen rMRP-70 gerichtet ist.

14.2 Isolierung rMRP-70-spezifltcher polyklonaler Kaninchen-Antikörper durch ImmunoafflnltaUchromatographle Elno rMRP-70-Aifigol-lmmunab8orbonssäulo wird präpariert, Indom 4-5mg gorolnlgtor rMRP-70 nach dom vom Horstollor (Bio-Rad) angegebenen Verfahren mit 1 ml Afflgol* 10 kombiniert werden. Immunglobulin G (IgG) aus dom monospozifischon Kanlnchen-antl-rMnP-70-Sorum von Bolsplol 14.1 wird durch Ammoniumsulfat boi 50% Sättigung ausgefällt. Dor Nioclorschlog wird in PBS aufgelöst und gogen PBS dialyslort. 15ml dor dialyslorton Lösung, die ca. 100mg IgG enthält, worden mit olnor Durchflußgoschwindigkeit von 10-12ml/h durch dio Immunoaffinitätssäule gopumpt. Unspozifisch gobundones Matorial wird durch Waschon dor SiIuIo mit PBS/0,4 M Natriumchlorid entfornt. Spezifisch gobundonos IgG wird mit 0,1 M Glycinhydrochlorid, pH 2,5; oluiort. Fraktionen, wolcho dio Antikörpor enthalten, wurdon gopoolt, durch Zusatz von 1M Tris noutralisiort und gogon PBS dialysiert. Man orhält ca. 4mg rMRP^Ospozifischos IgG.

14.3 Preparation von Ollgopeptldin, die Fragmonte von MRP-160 reprSsontleren

Unter Anwondung der in H. Rink u. a., Poptidos: Chemistry, Structure and Biology (Poptido: Chomlo, Struktur und Biologie) (Hrsg.

J.E. Rivior und G.R. Marshall), ESCOM; Leidon 1990, S. 1041, beschriobonon Mothodo worden durch schrittweise Festphasensynthese mit 9-fluoronylmothoxycarbonyl (Fmoc) - goschützten Aminosäuren als ihron vorgobildoton 1 Hydroxybonzotriazolostern in N-mothylpyrrolidon die folgonden Oligopoptido synthotisiort.

MRP-160-Frogment 1: Glu-Glu-Glu-Arg-Sor-Val-Leu-Asn-Asn-Gln-Lou-Leu-GluMot-Mot-Lys-Lys, ontsprechond don Aminosäuren 1189-1204 von SEQID NO:1

MRP-160-Fr.igmont 2: Arg-Asn-Glu-Val-Thr-Val-Lou-Arg-Gly-Glu-Asn-Ala-Ser-Ala, entsprechend don Aminosäuren 1242-1255 von SEQ ID NO: 1

MRP-160-Fragmont 3: Glu-llo-Cys-Glu-Mot-PhoGly-His-Trp-Ala-Thr-Asn-Cys-Asn-Asp-Asp-Glu-Thr-Pho, ontsprochond don Aminosäuren 1409-1427 von SEQ ID NO:1

MRP-160-Fragmont 4: Sor-Thr-Pro-Sor-Asn-llo-Pro-üln-Lys-Pro-Sor-Gln-Pro-Ala-Ala-Lys, ontsprochond don Aminosäuren 162-177 von SEQIDNOM

14.4 Kanlnchen-Antlseren, die gogen dio MRP-160-Fragmonte 1,2,3 und 4 gerlchtot sind

Von jodem der vier Oligopoptide von Boispiol 14.3 wordon 0,5 mg in vollständigem Froundschom Adjuvans (Gibco) vier verschiedenen Kaninchen injiziert, gefolgt von oinor Auffrischungsinjoktion in unvollständigem Freundschem Adjuvans (Gibco) nach 20 Tagon. Dor I lter der Kaninchonseron wird durch enzymverbundono Immunadsorptionsbostimmung (ELISA) in Mikrotitorplatten (Nunc), die mit don jowoiligen Poptidon ausgostrichon sind, wie in Beispiel 14.1 üborwacht. Immunglobulin G (IgG) wird aus don Soren mit 50% Ammoniumsulfat ausgofällt.

Eine Affigel 10 - Immunoadsorbenssäulo wird präpariert, indem 4-5mg dos jeweiligen MRP-160-Frogments 1,2,3 bzw. 4 nach dem vom Hersteller.(Bio-Rad) angegebenen Verfahren mit 1 ml Affigel" 10 kombiniert worden. Die vier Niederschläge von IgG wordon jeweils in PBS aufgelöst und gegen PBS dialysiort. 15ml dor dialysierten Lösungen IgG-Niederschlägo für das jeweilige Anti-MRP-160-Fragment, die ca. 100mg IgG enthalten, werden miteiner Durchflußgeschwindigkeit von 10-12ml/h durch die Immunoaffinitätssäule gepumpt. IgG wird isoliert, wie in Beispiel 14.2 beschrieben. Man erhält ca. 4 mg des für das jeweilige MRP-160-Fragment 1,2,3 bzw. 4 spezifischen IgG.

Beispiel 15: Preparation von Hybridomzellen, die monoklonal Antikörper gegen rMRP-70 produzieren

15.1 Immunisierungsprotokoll

Drei weiblichen Balb/c-Mäusen wird jowoils 0,1 mg rMRP-70 In vollständigem Froundschon Adjuvens (Gibco) intraporitoneal injiziert, gefolgt von zwei Auffrischuncjsinjoktionon von 0,05mg rMRP-70 in unvollf tändigom Freundschem Adjuvans (Gibco) in Abständen von je 14 Tagen. Nach 6 Wochon werden 0,05mg rMRP-70 in physiologischer Kochsalzlösung injiziert und dio Mäuso werden vier Tage später getötet.

15.2 Zellfusion und Selektion von Hybridomen

Alle Fusionen werden unter Einhaltung der folgenden Protokolle durchgeführt (G.Köhlor und C. Milstoin, Nature 256,495,1976), wobei die nichtabsondernde Myolomzellinie P2 x 63Ag8.653 (ATCC-Nr. CRL1580) verwendet wird. 10' Milzzellen werden mit 10⁷ Myolomzellen in Gegenwart von 35% (Gew./Vol.) Polyethylonglycol (PEG 4000, Morck) und 15% Dimothylsulfoxid (Merck) fusioniert. Das Fusionsgemisch wird in Standard-HAT-Selektionsmedium, das mit 20% FCS (Gibco) ergänzt ist, auf 1200 Reaktionsvertiefungen von Mikrotiterplatten (Falcon) verteilt, die Maus-Peritonealexsudatzollen als Futterzellen enthalten. Nach 10-14 Tagon werden die Überstände wachsender Hybridomo mit einem Sandwich-ELISA-Test (Beispiel 16) auf die Bindung von rMRP-70 geprüft. Positive Hybridoma werden mindestens zweimal durch Grenzverdünnung nachkloniert.

15.3 Entwicklung von Hybridomen und Isolierung rMRP-70-speziflscher monoklonaler Antikörper

8-10 Wochen alte Balb/c-Mäuse werdon intraporitonoal (i.p.) mit 0,3ml Pristan (Aldrich) vorbehandelt. 2-3 Wochen später werden 5-10 χ 10* Monierte Hybridomzellen und 0,2ml Prostan i.p. injiziert. Nach 8-10 Tagen wird Aszitesflüssigkeit gesammelt, bei 800g zentrifugiert und bei -80°C gelagert.

Als Alternative werden die Hybridorne in vitro unter Verwendung von Hybridom-Medium (Gibco) in großem Maßstab vermehrt. Der Überstand wird boi 800g zentrifugiert, mit einem 0,45-pm-Nalgene^R-Filtor filtriert und bei -80"C gelagort. Roh-Immunglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0,9 Volumäquivalenten gesättigtem Ammoniumsulfat boi O⁰C ausgefällt, dann in 2OmM Tris-HCI, 5OmM NaCI, pH 7,9; aufgelöst. Eine IgG-Fraktion wird unter Anwendung des Affigel"-Protein A MAPS-Satz-Verfahrens von Bio-Rad gowonnen. Die oluierte IgG-Fraktion wird wieder mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in PBS bei einer Konzentration von 10mg/ml aufgelöst und gegon den gleichen Puffer dialysiert.

-25- 298 948 Beispiel 16: Enzymlmmunteit ium Nachwelt von MRP-160, rMRP-70 odor MRP-160-Ftagmonten

16.1 Blotlnyllorung polyklonaler und monoklonalor Antikörper

1 mg polyklonaler Kaninchon-anti-rMRP-70- oder -SnHMnP-IeOFrBOmOiU 1-, 2-, 3- bzw. 4- Antlkörpor von Boleplol 14 odor monoklonaler Antl-rMRP-70-Antikörpor von Bolsplol 16 und 0,1 mg Diotin-X-NHS^R (Calblochom) worclon in 1,0ml 0,1 M Hopos-Pu(for, pH 8,0; 4 Stunden lang bol 4⁰C noch dom vom Horetollor vorgoschlagonon Verfahron zur Roaktlon gobrocht. Dio biotlnyliorton Antikörpor werden bei 4⁰C gogon PBS dlolysiort und bol -80°C golagort.

16.2 SandwlchELISA

MRP-160, rMRP-70 und MRP-160-Fragnionto wordon durch oinon in Beispiel 12.3.2 boschriobonon Zwoistollon-Sandwich-F.LUiA-Test nachgewiesen.

Der Test weist rMRP-70 in transformlorton Zellen oder MRP-160 in Zollysaton humaner Monozyton, in transformierton Zollen und in Körporflüssigkoiton monschlichor Pationton bis zu oinor untoron Gronzo von 1,0ng/ml nach,

16.3 Testsatz !Or SandwlchELISA

Ein Tostsatz für don Sandwich-ELISA-Tost von Beispiel 16.2 enthält boispiolswoiso:

- Mikrotiterplatten(NuncFI)

- 20ml affinitätschromatographisch goroinigto polyklonalo Anti-rMRP-70-Kaninchon-Antikörper (1 Mg/ml) in 0,05M Carbonatpuffor, pH 9,6

- 1,0ml rokombinantorMRP-70-Standardlösung(1 mg/ml) in TBS, das 0,05% Twoon 20onthält

- 10mlbiotinylierteKaninchen-anti-rMRP-70-An..körpor(0,5Mg/ml) in TBS, pH 7,4,0,2% Golatino, 1% BSA, 0,05% Twoon 20

- 10ml Stroptavidin/alkalischo Phosphatase (BRL) 1:5000 in TBS, pH 7,4,0,2% Golatino, 1 % BSA, 0,05% Twoon 20

- 200ml TBS, 0.05% Twoon 20

- 200ml TOS, pH 7,4,0,2% Gelatine 1 % BSA, 0,05% Twoon 20

- 20ml p-Nitrophenylphosphot (1,0mg/ml) in Diothanolaminpuffor (1 M, pH 9,8)

- Eichkurvo

- Bodionungsanloitung.

Beispiel 17: Nachwels dos Hodgkinschen Lymphoms durch Immunfarbung

Lymphknotenbiopsion, Hautbiopsion oder andere Gowebobiopsion worden in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan schnellgofrjronundboi -75⁰C gelagert. 5-Mm-Gewoboschnltte wordon angefertigt, 15min lang in Aceton fixiert und übor Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Die Schnitte wordon 10min lang in PBS wiodor oingowoicht, dann in einer 1:100-Vordünnung von polyklonalon Kaninchen-anti-rMRP-70-Antikörporn von Beispiel 14.2 30 min lang inkubiert, 10min lang in PBS gespült, dann in oinor 1:400-Verdünnung von monoklonalen Maus-anti-Kaninchon-Antikörporn (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark)30min lang inkubiort. Die Schnitte wordon 10min lang in PBS gespült und mit ABCompiex™ (mit biotinylioiter Poroxidase komploxiertes Avidin, Dakopatts) nach den Anweisungen des Herstollors behandelt. Das Roaktionsprodukt wird mit dem chromogenen Substrat AEC/Wasserstoffporoxid 150mg Aminoethylcarbazol, 33μΙ 30%igos H₁O₂,5ml Dimethylformamid, 100ml Acetatpuffer 0.05M, pH 6,9) entwickelt. Die Schnitte werdon 5min in Acotatpuffer gespült, mit Mayorschom Hämatoxylin gegengofärbt, mit Glyceringolee montiert und untoi einem Mikroskop untersucht.

Die Ergebnisse, die mit Biopsiematerial aus verschiedenen Quellen gewonnen wurden, sind in Tabelle β zusammengestellt. Dio Immunfärbung unter Verwendung von Anti-rMRP-70-Antisoren ist deutlich auf die Hodgkinsche Krankheit und die verwandton anaplastischen großen Zellymphome beschränkt.

Tabelle 6: Immunfarbung des Hodgkinschen Lymphoms und anderer Gowebeschnitto

Gewebequolleund	Zahl der	Zahl der Anti-MRP-70-
Diagnose	Fälle	Färbungen
Lymphknoten
Hodgkinscho Krankheit	36	31
Lymphknoten
Anaplastische große
Zellymphome (Ki-1-positiv)	4	4
Lymphknoten
andere als Ho Igkinscho
Lymphome	10	0
Lymphknoten
unspezifische
Lymphadenitis	4	0
Haut
Entzündungszuständo	4	0
Adenokarzinom	2	0
Plattenepithelkarzinom	1	0
Weichteilkarzinom	3	0

Beispiel 18: Pharmaieutliche· Prlparat (Or parenteral· Applikation

200pg rMRP-70 oder MRP-160 werden in 3ml 5N Humanserumelbumln aufgelöst. DIo ontstohende Lösung wird durch oin bakteriologisches Filter passiort und dio filtrierte Lösung wird unter asoptlschon Bedingungen auf 10 Fläschchon vortoilt. Dio Fläschchon werden vorzugsweise in dor Kälte gelagert, zum Boisplol bni -2O⁰C.

Ebenso werden pharmazeutische Präparate hergestellt, die u,5mg, 1 mg, 2 mg und 6mg polyklonale oder monoklonalo Antikörper nach den Beispielen 14 und 15 in 3ml BN Humanserumalbumin enthalten. Pharmazeutische Präparate von höhoror Konzentration erhalt man durch Auflösen von 10mg monoklonalem Antikörper gegen rMRP-70 (Beispiel 15) Io 2 ml sterilisator physiologischer Kochsalzlösung.

Sequenzlitte

SEQIDNO.-1 (Sequonzbezolchner Nr. 1)

SEQUENZTYP: Nukleotid mit entsprechendem Protein

SEQUENZLÄNGE: 5858 Basonpaaro/1427 Aminosäuren

URSPRÜNGLICHER QUELLORGANISMUS: Mensch

DIREKTE EXPERIMENTELLE QUELLE: cDNA-Bibllothokon in Lambda gt 11 EIGENSCHAFTEN: Markör für Entzündung und Hodgkinsches Lymphorn

GCGGCGCAGG	CGGCGGCGTC	CGAGGAGATT	TAATCCAGAG	ACTGACTTCA	50
CTATAGAACC	CACAGTTGTA	TCAATGGTTG	GGGAAAGATA	GTGGCAACAG	100
GCAAAGGAGA	AACAGCTCTG	ACATACAAAG	AAA ATG AGT Mot Sor 1	ATG CTA Mot Lou	145

AAG CCA AGT GGG CTT AAG GCC CCC ACC AAG ATC CTG AAG CCT

Lys Pro Sor GIy Lou Lys AIa Pro Thr Lys Ho Leu Lys Pro

5 10 15

GGA AGC ACA GCT CTG AAG ACA CCT ACG GCT GTT GTA GCT CCA

GIy Ser Thr AIa Lou Lys Thr Pro Thr Ala VaI VoI AIa Pro

20 2b 30

GTA GAA AAA ACC ATA TCC AGT GAA AAA GCA TCA AGC ACT CCA

VaI GIu Lys Thr He Sor Ser GIu Lys AIa Ser Sor Thr Pro

35 40 45

TCA

TCT

GAG

ACT

CAG

GAG

GAA

TTT

GTG

GAT

GAC

TTT

CGA

GTT

Ser

Sor

GIu

Thr

GIn

GIu

GIu

Phe

VaI

Asp

Asp

Hhe

Arg

VaI

50

55

60

GGG

GAG

CGA

GTT

TGG

GTG

AAT

GGA

AAT

AAG

CCT

GGA

TTT

ATC

GIy

GIu

Arg

VaI

Trp

VaI

Asn

GIy

Asn

lys

Pro

GIy

Phe

He

65

70

CAG

TTT

CTT

GGA

GAA

ACC

CAG

TTT

GCA

CCA

GGC

CAG

TGG

GCT

GIn

Pho

Leu

GIy

GIu

Thr

GIn

Phe

AIa

Pro

GIy

GIn

Trp

AIa

75

80

85

GGA

ATT

GTT

TTA

GAT

GAA

CCC

ATA

GGC

AAG

AAC

GAT

GGl

TCG

GIy

Ue

VaI

Leu

Asp

GIu

Pro

He

GIy

Lys

Asn

Asp

GIy

Ser

90

95

100

GTG

GCA

GGA

GTT

CGG

TAT

TTC

CAG

TGT

GAA

CCT

TTA

AAG

GGC

VaI

AIa

GIy

VaI

Arg

Tyr

Phe

GIn

Cys

GIu

Pro

Leu

Lys

GIy

105

110

115

ATA

TTT

ACC

CGA

CCT

TCA

AAG

TTA

ACA

AGG

AAG

GTG

CAA

GCA

He

Phe

Thr

Arg

Pro

Ser

Lys

Lou

Thr

Arg

Lys

VaI

GIn

AIa

120

125

130

GAA

GAT

GAA

GCT

AAT

GGC

CTG

CAG

ACA

ACG

CCC

GCC

TCC

CGA

GIu

Asp

GIu

AIa

Asn

GIy

Leu

GIn

Thr

Thr

Pro

AIa

Ser

Arg

135

140

GCT

ACT

TCA

CCG

CTG

TGC

ACT

TCT

ACG

GCC

AGC

ATG

GTG

TCT

AIa

Thr

Sor

Pro

Leu

Cys

Thr

Ser

Thr

AIa

Ser

Met

VaI

Ser

145

150

155

TCC

TCC

CCC

TCC

ACC

CCT

TCA

AAC

ATC

CCT

CAG

AAA

CCA

TCA

Ser

Ser

Pro

Sor

Thr

Pro

Sor

Asn

Ho

Pro

GIn

Lys

Pro

Ser

160

165

170

SEQ ID NO: 1, Fortsetzung CAG CCA GCA GCA AAG GAA CCT TCA GCT ACG CCT CCG ATC AGC Gin Pro Ala Ala Lye GIu Pro Sor AIa Thr Pro Pro Ho Sor

175 180 185

AAC CTT ACA AAA ACT GCC mGT GAA TCT ATC TCC AAC CTT TCA Asu Lon Thr Lye Thr AIa Sor GIu Sor Ho Sor Asu Lou Sor

190 195 200

GAG GCT GGC TCA ATC AAG AAA GGA GAA AGA GAG CTC AAA ATC GIu Ala GIy Sor Uo Lye Lys GIy GIu Arg GIu Lou Lys Ho

205 210

GGA GAC AGA GTA TTG GTT GGT GGC ACT AAG GCT GGT GTA GTC GIy Asp Arg VaI Lou VaI GIy GIy Thr Lys Ala GIy VaI VaI

215 220 2?5

CGG TTT CTT GGG GAG ACC GAC TTT GCC AAG GGG GAG TGG TGT Arg Pho Lou GIy GIu Thr Asp Pho AIa Lys GIy GIu Trp Cys

230 235 240

GGC GTG GAG TTA GAT GAG CCA CTT GGG AAG AAT GAT GGC GCT GIy VdI GIu Lou Asp GIu Pro Lou GIy Lye Asn Asp GIy AIa

245 250 255

GTT GCT GGA ACA AGG TAT TTT CAG TGT CAA CCC AAA TAT GGC VaI Ala GIy Thr Arg Tyr Pho GIn Cys GIn Pro Lys Tyr GIy

260 265 270

TTG TTC GCT CCT GTC CAC AAA GTT ACC MG ATT GGC TTC CCT Leu Pho AIa Pro VaI His Lys VaI Thr Lys Ho GIy Pho Pro

275 280

TCC ACT ACA CCA GCC AAA GCC AAG GCC AAC GCA GTG AGG CGA 1027 Ser Thr Thr Pro AIa Lys AIa Lys AIa Asn Ala VaI Arg Arg

285 290 295

GTG ATG GCG ACC ACG TCC GCC AGC CTG AAG CGC AGC CCT TCT 1069 VaI Mot AIa Thr Thr Sor AIa Sor Lou Lys Arg Sor Pro Sor

300 305 310

GCC TCT TCC CTC AGC TCC ATG AGC TCA GTG GCC TCC TCT GTG 1111 AIa Ser Ser Leu Sor Sor Met Ser AIa Sor Ser VaI Sor Sor

315 320 325

AGC AGC AGG CCC AGT CGG ACA GGA CTA TTG ACT GAA ACC TCC 1153 Sor VaI Arg Pro Sor Arg Thr GIy Lou Leu Thr GIu Thr Ser

330 335 340

TCC CGT TAC GCC AGG AAG ATC TCC GGT ACC ACT GCC CTC CAG 1195 Ser Arg Tyr AIa Arg Lys Ho Sor GIy Thr Thr Ala Lou GIn

345 350

GAG GCC CTG AAG GAG AAG CAG CAG CAC ATT GAG CAG CTG CTG 1237 GIu AIa Leu Lys GIu Lys Gin Gin His Ho GIu Gin Lou Leu

355 360 365

GCG GAA CGG GAT CTG GAG AGG GCG GAG GTG GCC AAG GCC ACG 1279 Ala GIu Arg Asp Leu GIu Arg Ala GIu VaI AIa Lys AIa Thr

370 375 380

AGC CAC GTG GGG GAG ATA GAG CAG GAG CTA GCT CTG GCC CGG 1321 Sor His VaI GIy GIu Ho GIu Gin GIu Lou Ala Lou AIa Arg

385 390 395

GAC GGA CAT GAC CAG CAT GTC CTG GAA TTG GAA GCC AAA ATG 1363 Asp GIy His Asp Gin His VaI Leu GIu Leu GIu Ala Lys Met

400 405 410

GAC CAG CTG CGA ACA ATG GTG GAA GCT GCT GAC AGG GAG AAG 1405 Asp Gin Leu Arg Thr Met VaI GIu Ala Ala Asp Arg GIu l.ys

415 420

GTG GAG CTT CTC AAC CAG CTT GAA GAG GAG AAA AGG AAG GTT 1447 VaI GIu Leu Leu Asn GIn Leu GIu GIu GIu Lys Arg Lys VaI

425 430 435

CTC	TTT	GAA	AAG	ACC	AAA	GCT
Lou	Pho	GIu	Lye	Thr	Lye	Ala
	475					480

SEQ ID N0:1, Fortsetzung GAG GAC CTT CAG TTC CGG GTT GAA GAA GAA TCA ATT ACC ΑΛΑ 1489 GIu Asp Lou Gin Pits Arg VeI GIu GIu GIu Sor Ho Thr Lye

440 445 450

GGT GAT CTT GAG ACG CAG ACC AAA CTG GAG CAT GCC CGC ATT 1531 GIy Asp Lou GIu Thr Gin Thr Lye Lou GIu His Ala Arg Ho

455 460 465

AAG GAG CTT GAA CAG AGC CTG CTC TTT GAA AAG ACC AAA GCT 1573

Lys GIu Lou GIu Gin Ser Lou 470

GAC AAA CTC CAG AGG GAG TTA GAA GAC ACT AGG GTG GCT ACA 1615 Asp Lys Lou Gin Arg GIu Lou GIu Asp Thr Arg VeI Ala Thr

485 490

GTT TCA GAA AAG TCA CGT ATA ATG GAA CTG GAG AAA GAC CTA 1657 VaI Ser GIu Lye Sor Ai g Ho Mot GIu Lou GIu Lys Asp Leu

495 δϋΟ 505

GCA TTG AGA GTA CAG GAA GTA GCT GAG CTC CGA AGA AGG CTA 1699 Ala Lou Arg VaI Gin GIu VaI Ala GIu Lou Arg Arg Arg Lou

510 515 520

GAG TCC AAT AAG CCT GCT GGG GAT GTG GAC ATG TCA CTT TCC 1741 GIu Sor Asn Lys Pro Ala GIy Asp VaI Asp Mot Sor Lou Sor

525 530 535

CTT TTG CAA GAG ATA AGC TCT TTG CAA GAA AAG TTA GAA GTC 1783 Lou Lou Gin GIu Ho Sor Sor Lou Gin GIu Lys Leu GIu VaI

540 545 550

ACC CGT ACT GAC CAC CAG AGA GAA ATA ACT TCT CTG AAG GAG 1825 Thr Arg Thr Asp His Gin Arg GIu Ho Thr Ser Lou Lys GIu

555 560

CAT TTT GGA GCC CGG GAA GAA ACT CAT CAG AAG GAG ATA AAG 1867 His Pho GIy Ala Arg GIu GIu Thr His Gin Lys GIu Mo Lys

565 570 575

GCT CTG TAT ACC GCC ACG GAA AAG CTT TCC AAA GAG AAC GAG 1909 Ala Lou Tyr Thr Ala Thr GIu Lys Lou Sor Lys GIu Asn GIu

580 585 590

TCA TTG AAA AGC AAG CTG GAG CAT GCC AAC AAA GAG AAC TCA 1951 Sor Lou Lys Sor Lys Lou GIu His Ala Asn Lys GIu Asn Sor

595 600 605

GAT GTG ATA GCT CTA TGG AAG TCC AAA CTG GAG ACT GCC ATC 1993 Asp VaI Uo Ala Lou Trp Lys Sor Lye Lou GIu Thr Ala Ho

610 615 620

GCA TCC CAC CAG CAG GCG ATG GAA GAA CTG AAG GTA TCT TTC 2035 Ala Sor His Gin Gin Ala Mot GIu GIu Lou Lys VaI Sor Phe

625 630

AGC AAA GGG CTT GGA ACA GAG ACG GCA GAA TTT GCT GAA CTA 2077 Ser Lys GIy Lou GIy Thr GIu Thr Ala GIu Pho Ala GIu Lou

635 640 645

AAA ACA CAA ATA GAG AAA ATG AGA CTA GAT TAC CAA CAC GAA 2119 Lys Thr Gin lie GIu Lys Mot Arg Lou Asp Tyr Gin His GIu

650 655 660

ATA GAA AAT TTG CAG AAT CAA CAA GAC TCT GAA CGG GCT GCC 2161

lie GIu Asn Lou Gin Asn Gin Gin Asp S;r GIu Arg Ala Ala

665 670 675

CAT GCT AAA GAG ATG GAA GCC TTG AGG GCT AAA CTG ATG AAA 2203 His Ala Lys GIu Met GIu Ala Lou Arg Ala Lys Lou Mot Lys

680 685 690

GTT ATT AAA GAA AAG GAA AAC AGT CTG GAA GCC ATC AGG TCG 2245 VaI Ho Lys GIu Lys GIu Α·; η Sor Lou GIu Arg Ser Lys Leu

695 700

SEQ ID NO: 1, Fortsotzung AAA CTG GAC AAA GCA GAA GAC CAG CAT CTC GTA GAA ATG GAA 2 Ala Uo Asp Lye Ala GIu Asp Gin His Lou VaI GIu Mot GIu

705 710 715

GAC ACG TTA AAC AAA TTA CAG GAA GCT GAA ATA AAG GTA AAG 2 Asp Thr Lou Asn Lye Lou Gin GIu Ala GIu Ho Lye VaI Lye

720 725 730

GAG CTA GAG GTA CTG CAA GCC AAA TGC AAT GAA CAA ACC AAG 2 GIu Lou GIu VoI Lou Gin Ala Lys Cys Asn GIu Gin Thr Lys

735 740 745

GTT ATT GAT ΑΛΤ TTT ACA TCA CAG CTC AAG GCT ACT GAA GAA 2 VaI Uo Asp Asn Pho TIu Sor Gin Leu Lys Ala Thr GIu GIu

750 755 760

AAG CTC TTG GAT CTT GAT GCA CTT CGG AAA GCC AGT TCC GAA 2455 Lys Lou Lou Asp Lou Asp Ala Lou Arg Lys Ala Sor Sor GIu

765 770

GGT AAA TCG GAA ATG AAG AAA CTT AGA CAG CAG CTT GAG GCA 2497 GIy Lys Sor GIu Mot Lys Lys Lou Arg Gin Gin Lou GIu Ala

775 780 785

GCT GAG AAA CAG ATT AAA CAT TTA GAG ATT GAA AAG AAT GCT 2539 Ala GIu Lys Gin Ho Ly» His Lou GIu Ho GIu Lys Asn AIo

790 795 800

GAA AGT AGC AAG GCT AGT AGC ATT ACC AGA GAG CTC CAG GGG 2 GIu Sor Ser Lys Ala Ser Sor Ho Thr Arg GIu Lou Gin GIy

805 810 815

AGA GAG CTA AAG CTT ACT AAC CTT CAG GAA AAT TTG AGT GAA 2623 Arg GIu Lou Lys Leu Thr Asn Leu Gin GIu Asn Lou Sor GIu

820 825 830

GTC AGT CAA GTG AAA GAG ACT TTG GAA AAA GAA CTT CAG ATT 2665 VaI Sor Gin VaI Lys GIu Thr Lou GIu Lye GIu Lou Un Ho

835 840

TTG AAA GAA AAG TTT GCT GAA GCT TCA GAG GAG GCA GTC TCT 2707 Lou Lys GIu Lys Pho Ala GIu Ala Sor GIu GIu Ala VaI Sor

845 850 855

GTT CAG AGA AGT ATG CAA GAA ACT GTA AAT AAG TTA CAC CAA 2 VaI Gin Arg Sor Mot 3In GIu Thr VaI Asn Lys Lou His Gin

860 865 870

AAG GAG GAA CAG TTT AAC ATG CTG TCT TCT GAC FTG GAG AAG 2791 Lys GIu GIu Gin Pho Asn Mot Leu Sor Sor Asp Lou GIu Lys

875 880 885

CTG AGA GAA AAC TTA GCA GAT ATG GAG GCA AAA TTT AGA GAG 2833 Lou Arg GIu Asn Lou Ale Asp Mot GIu Ala Lys Pho Arg GIu

890 895 000

AAA GAT GAG AGA GAA GAG CAG CTG ATA AAG GCA AAG GAA AAA 2875 Lys Asp GIu Arg GIu GIu Gin Leu Ho Lys Ala Lys GIu Lys

905 910

CTG GAA AAT GAC ATT GCA GAA ATA ATG AAG ATG TCA GGA GAT 2917 Leu GIu Α«η Asp Ho Ala GIu Ho Mot Lys Met Ser GIy Asp

915 920 925

AAC TCT TCT CAG CTG ACA AAA ATG AAC GAT GAA TTA CGT CTG 2959 Asn Sor Sor Gin Lou Thr Lys Met Asn Asp GIu Lou Arg Leu

930 935 940

AAA GAA AGA GAT GTA GAA GAA TTA CAG CTA AAA CTT ACA AAG 3001 Lys GIu Arg Asp VaI GIu GIu Lou Gin Leu Lys Lou Thr Lys

945 950 955

GCT AAT GAA AAT GCA AGT TTT CTG CAA AAA AGT ATT GAG GAC 3043 Ala Asn GIu Asn Ala Sor Pho Lou Gin Lys Sor He GIu Asp

960 965 970

TCT	GAG	ACA	AAA
Sor	GIu	Thr	Lys
		1025

SEQ ID NO: 1, Fortsotiung ATG ACT GTC AAA GCT GAA CAG AGC CAG CAA GAA GCA GCT AAA 3085 Met Thr VoI Lye Ala GIu Gin Ser Gin Gin GIu Ala AIn Lye

975 900

AAG CAT GAG GAA GAA AAG AAA GAA TTG GAG AGO ΑΛΛ TTG TCG 3127 Lys His GIu GIu GIu Lye Lye GIu Leu GIu Arg Lys Lou Sor

985 990 995

GAC CTG GAA AAG AAA ATG GAA ACA AGC CAC AAC CAG TGT CAG 3169 Asp Lou GIu Lys Lys Met GIu Thr Sor His Asu Gin Cys GIn

1000 1005 1010

GAG CTG AAA GCC AGG TAT GAG AGA GCC ACl TCT GAG ACA AAA 3211 GIu Leu Lys AIa Arg Tyr GIu Arg AIa Thr

1015 1020

ACC AAG CAT GAA GAA ATC CTA CAG AAC CTC CAG AAG ACG CTG 32Γ.1 Thr Lys His GIu GIu Ho Leu GIn Asn Lou GIn Lys Thr Lou

1030 1035 1040

CTG GAC ACA GAG GAC AAG CTG AAG GGC GCA CGG GAG GAG AAC 3295 Lou Asp Thr GIu Asp Lys Lou Lye GIy AIa Arg GIu GIu Asn

1045 1050

AGT GGC TTG CTG CAG GAG CTG GAG GAG CTG AGA AAG CAA GCC 3337 Ser GIy Lou Lou Gin GIu Lou GIu GIu Lou Arg Lys Gin AIa

1055 1060 1065

GAC AAA GCC AAA GCT GCT CAA ACA GCG GAA GAT GCC ATG CAG 3379 Asp Lys AIa Lys Ala Ala Gin Thr Ala GIu Asp AIo Mot Gin

1070 1075 1080

ATA ATG GAA CAG ATG ACC AAA GAG AAG ACT GAG ACT CTG GCC 3421

lie Mot GIu Gin Mot Thr Lys GIu Lys Thr GIu Thr Leu Ala

1085 1090 1095

TCC TTG GAG GAC ACC AAG CAA ACA AAT GCA AAA CTA CAG AAT 3463 Sor Leu GIu Asp Thr Lys Gin Thr Asn Ala Lys Leu Gin Asn

1100 1105 1110

GAA TTG GAC ACA CTT AAA GAA AAC AAC TTG AAA AAT GTG GAA 3505 GIu Leu Asp Thr Lou Lys GIu Asn Asn Lou Lys Asn VoI GIu

1115 1120

GAG CTG AAC AAA TCA AAA GAA CTC CTG ACT GTA GAG AAT CAA 3547 GIu Leu Asn Lys Ser Lys GIu Lou Lou Thr VaI GIu Asn Gin

1125 1130 1135

AAA ATG GAA GAA TTT AGG AAA GAA ATA GAA ACC CTA AAG CAG 3589 Lye Met GIu GIu Phe Arg Lye GIu lie GIu Thr Lou Lys Gin

1140 1145 1150

GCA GCA GCT CAG AAG TCC CAG CAG CTT TCA GCG TTG CAA GAA 3631 Ala Ala Ala Gin Lys Sor Gin Gin Leu Sor Ala Lou Gin GIu

1155 1160 1165

GAG AAC GTT AAA CTT GCT GAG GAG CTG GGG AGA AGC AGG GAC 3673 GIu Asn VaI Lys Leu Ala GIu GIu Lou GIy Arg Sor Arg Asp

1170 1175 1180

GAA GTC ACA AGT CAT CAA AAG CTG GAA GAA GAA / ο A TCT GTG 3715 GIu VaI Thr Ser His Gin Lys Lou GIu GIu GIu Arg Ser VaI

1185 1190

CTC AAT AAT CAG TTG TTA GAA ATG AAA AAA AGA GAA TCC AAG 3757 Lou Asn Asn GIn Leu Leu GIu Met Lys Lys Arg GIu Sor Lys

1195 1200 1205

TTC ATA AAA GAC GCA GAT GAA GAG AAA GCT TCC TTG CAG AAA 3799 Phe He Lys Asp Ala Asp GIu GIu Lys AIa Sor Leu GIn Lys

1210 1215 1220

TCC ATC AGT ATA ACT AGT GCC TTA CTC ACA GAA AAG GAT GCC 3841 Ser He Ser He Thr Ser AIa Leu Lou Thr GIu Lys Asp AIa

1225 1230 1235

SEQIDNO:1,Fortsotiung

GAG GIu

CTG Leu

GAG GIu

AAA Lys 1240

CTG Lou

AGA Arg

AAT Asn

GAG GIu

GTC VaI 1245

ACA Thr

GTG CTC VaI Leu

AGG Arg

GGA GIy 1250

GAA GIu

AAC Asn

GCC AIa

TCT Ser

GCC AIq 1255

AAG Lye

TCC Sor

TTG Leu

CAT His

TCA Sor 1260

GTT GTT VeI VaI

CAG GIn

ACT Thr

CTA Leu 1265

GAG GIu

TCT Sor

GAT Asp

AAG Ly»

GTG VnI 1270

AAG Lys

CTC Lou

GAG GIu

CTC Lou

AAG GTA Lye VaI 1275

AAG Lys

AAC Asn

TTG Leu

GAG GIu 1280

CTT Lou

CAA Gin

CTC Lou

AAA Lys

GAA GIu 1285

AAC Asn

AAG Lys

AGG Arg

CAG CTC Gin Lou 1290

AGC Sor

AGC Sor

TCC Scr

TCA Ser

GGT GIy 1295

AAT Asn

ACA Thr

GAC Asp

ACT Thr

CAG GIn 1300

GCA AIa

GAC Asp

GAG GAT GIu Asp

GAA GIu 1305

AGA Arg

GCC AIn

CAG GIn

GAG GIu

AGT Ser 1310

CAG GIn

Απ Ho

GAT Asp

TTC Phe

CTA Lou 1315

AAT Asn

TCA GTA Sor VaI

ATA Me

GTG VaI 1320

GAC Asp

CTT Leu

CAA GIn

AGG Arg

AAG Lys 1325

AAT Asn

CAA Gin

GAC Asp

CTC Leu

AAG Ly8 1330

ATG AAG Met Lys

GTG VaI

GAG GIu

ATG Met 1335

ATG Met

TCA Sor

GAA GIu

GCA AIa

GCC AIa 1340

CTG Lou

AAT Asn

GGG GIy

AAC Asn

GGG GAT GIy Asp 1345

GAC Asp

CTA Lou

AAC Asn

AAT Asn 1350

TAT Tyr

GAC Asp

AGT Sor

GAT Asp

GAT Asp 1355

CAG GIn

GAG GIu

AAA Lys

CAG TCC Gin Ser 1360

AAG Lys

AAG Ly8

AAA Lys

CCT Pro

CGC Arg 1365

CTC Leu

TTC Phe

TGT Cys

GAC Asp

ATT Ho 1370

TGT Cys

GAC Asp

TGC TTT Cys Pho

GAT Asp 1375

CTC Lou

CAC His

GAC Asp

ACA Thr

GAG GIu 1380

GAT Asp

TGT Cys

CCT Pro

ACC Thr

CAG GIn 1385

GCA AIa

CAG ATG GIn Met

TCA Sor

GAG GIu 1390

GAC Asp

CCT Pro

CCC Pro

CAT His

TCC Ser 1395

ACA Thr

CAC His

CAT His

GGC GIy

AGT Ser 1400

CGG GGT Arg GIy

GAG GIu

GAA GIu

CGC Arg 1405

CCA Pro

TAC Tyr

TGT Cys

GAA GIu

ATC Me 1410

TGT Cys

GAG GIu

ATG Met

TTT Phe

GGA CAC GIy His 1415

TGG Trp

GCC AIa

ACC Thr

AAC Asn 1420

TGC Cys

AAT Asn

GAC Asp

GAC Asp

GAA GIu 1425

ACC Thr

TTC Phe

TGATGAAGCC

TCCAGTGGAG

AACTGGGCTT

GCTCAGACGC

ACTCGCATfG

ACACAACGTA

ACACCAGCAT

TGTGTGTGCA

GACTTCAGGA

GAACTCATGT

TATTTTTTAA

CCCCGTCAAC

/\AATCTAGGA

AAATATTTTC

ATCTTCAACA

AATTGCCCTT

TAGTCTCCCC

GTATGAGTTA

TATTTAGTAG

GTGAGTTTTC

acctcgaati

TTGTTTTCTT

GAATAATAAA

TTTGAAGACA

TTGCACC \G A

TGCCATTAC/S

TTTATTGGCC

gatttttacg

GTAGAAAAAC

CCCTACCCTC

ACAATACCTT

CCCCGACCT1

TGCCGTTACT

TTTCATATTT

«

C1TTAAATTA

ATATTTAGAT

TTTTTGGTTA

ATTTAAGTAA

CTGCATTTG7

GTGCCATTTT

GCATHTCAT

TATTTCCAGC

AAAGAAATAT

CTGAGCTCTT

i

»

TTCAGGCTTG

ATAATACTTA

CTGGMTGAG

AGGGAGGGGC

AAGCCCCAAA

GCACCTAAGA

AAAGTATTTI

AGCTTTGACA

TTGAAAAAAT

CTACTCATTT

GTTATCAGTA

ATTCTTATTC

TGCACTACCT

TAAAATCATG

GTGCCTTTAC

GGTGTGATTA

AAGCAGGTAA

3883 3925 3967 4009 4051 4093 4135 4177 4219 4261 4303 4345 4387 4424

4474 4524 4 574 4624 4674 4 724 4774 4824 4874 4924 4974 5024

	GACATTTTAT	AATCTATATG	CTGCACCCAC	TTAATCTACT	-32- 298 948
	GTTTATTAGT	tttgcataat	TTCAGCTTCT	ATATATTGTA
SEQ ID NO: 1, Fortsetzung	ΤΤΤΤΑΑΛΑΑΤ	CTATATTTTG	GGAAAAAAAC	ATACACAATG	5074
CTGCTQTGGQ	TTTGGACATT	TACCTTTTTQ	AAAAAGAAAA	CACTTAAAAT	5124
GTGGTGnTT	ACATAACAQA	CTAuGCCAGA	CATAGCATCT	TQTGGCTTTQ	5174
TGTATATATT	CATirCiTTTG	TTTTCCTTTT	ATTiCTTCAC	CAGATTTAAA	5224
TGTCTTTCTT	AATTTTCTCC	AATTTTTTTT	TCCTTCTCTG	CiCAGGTATCC	6 274
GATCATTAGG	ATTAACAATA	AGCCAGTATA	AAACACCTAA	ATAACCAATC	5324
CAACCATTTT	CTTCACAAGT	TTTTTTACTG	TTTTTAGATG	AATGTACGAT	5374
TAAAAGGAGG	ACGTTAATAA	TTCTGGATTT	TCTTATCACA	AAAAAGAAAA	5424
CCAGCAGTCA	CAAAGCACCT	GAACAQTTTA	TCGACCAGTT	TGAATCTATT	5474
TACAATCTCC	TGAATGTCrr	CTAGATATQT	AAAAAGTCAT	AAAATGTATC	5524
GAGAAATTCA	CATGTACAAT	AAGAACTTCT	ATAATTGTAT	ATATGCCTTT	5574
TGAAGGACCT	CCCCTCAAGA	TTATCAACTG	TGTGTTCGAC	AGTGAATATT	6624
TATCTTCATT	CCAGTTGAAA	TTTnGGTTA	TAAATGTAAT	ACGAATTGTT	5674
TTCCATGCTA	aaaacatgta	AAGCAOTATT	AAAATTTGGC	CAAACAAQTG	5724
ÜATGTATTTT	ACTTTTAATA	AATQQTTATT	CTTT		5774
CAATCTGGTA				5824
TCACAAACAG				5858
TTCTGTATCT

Claims (49)

1. Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, dadurch gekennzeichnet, daß es ein t-ntzündungsvermittlor oder ein Vorläufer eines Entzündungsvermittler ist, oder ein Derivat davon.

2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es menschlicher Herkunft ist, oder ein Derivat davon.

3. Polypeptid mit der Bezeichnung MRP-160 gernäß Ansprum 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist, oder ein Derivat davon.

4. Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fragment ist.

5. Fragment gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 878 bis 1427 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 i:mfaßt und der N-Torminus Wasserstoff, Acyl, die Aminosäuresequenz Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly oder die Aminosäuresequenz Met-Asp-Gly-Ile-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Glu-Phe-Gly ist.

6. Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung ist, worin Amino- und/oder Hydroxy-Funktionen glykosyliert oder acyliert sind.

7. Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein pharmazeutisch annehmbares Salz ist.

8. Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein scheinbares Molekulargewicht von 19OkD aufweist.

9. Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein scheinbares Molekulargewicht von 14OkD aufweist.

10. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden oder deren Derivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung eines solchen Polypeptide oder Derivates durch chromatographische Methoden gereinigt und, falls notwendig, die gewünschte Verbindung isoliert und/oder in ein Derivat davon umgewandelt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des Polypeptide oder Derivates ein gegebenenfalls vorgereinigter Zellextrakt, Zellüberstand oder Kulturfiltrat von stimulierten normalen menschlichen Leukozyten, menschlichen embryonalen Epithelzellen der Lunge, genetisch veränderten Mikroorganismen oder kontinuierlichen Säugetier-Zellinien ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des Polypeptids oder Derivates erhalten wird, indem man transformierte Wirtszellen, dio die gewünschten Verbindungen exprimieren, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression hetereologer Polypeptide ermöglichen.

13. Desoxyribunukleinsäure (DNA), dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid oder ein Derivat davon gemäß Anspruch 1 kodiert, oder eine Mutante oder ein Fragment einersolchen DNA.

14. DNA gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie für MRP-160 der Nukleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert, oder oine Mutanto oder ein Fragment einer solchen DNA.

15. DNA gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 2756 bis 4414 einer DNA der Nukleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfaßt.

16. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer DNA, Mutanto oder einem Fragment davon gemäß Anspruch 13 hybridisiert.

17. DNA gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie genomischen Ursprungs ist.

18. Verfahren zur Herstellung einer DNA, einer Mutante oder eines Fragmentes davon gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man transformierte Wirtszellon, die die gewünschten Verbindungen exprimieren, kultiviert und, falls notwendig, die gewünschte DNA daraus isoliert.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) aus geeigneten Zellen isoliert, die gewünschte mRNA auswählt, einzelsträngige komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA), die zu dieser mRNA komplementär ist, und dann doppelsträngige cDNA herstellt, oder

b) cDNA aus einer cDNA-Bibliothek isoliert und die gewünschte cDNA auswählt, oder

c) genomische DNA aus geeignetem menschlichem Gewebe isoliert und die gewünschte DNA isoliert, und

d) die doppelsträngige DNA aus Stufe a), b) oder c) in einen geeigneten Expi essionsvcktor einbaut,

e) geeignete Wirtszellen mit dem erhaltenen Hybridvektor transformiert,

f) transformierte Wirtszellen, die die gowünschtu DNA onthalton, auswählt und von nicht transformierten Wirtszellen abtrennt, und

g) gegebenenfalls die gewünschte DNA isoliert und/oder in eine Mutante oder in ein Fragment davon umwandelt.

20. Verfahren zur Herstellung einer DNA, )iner Mutante oder eines Fragmentes davon gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichne., daß die gowünschten Verbindungen chemisch synthetisiert werden.

21. Hybridvoktor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA, eine Mutante oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 13, die wirksam mit Expressions-Kontrollsequenzen verknüpft sind, enthält.

22. Hybridvektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA der Nuklootid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Mutante oder ein Fragment davon umfaßt.

23. Hybridvektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er die Nukleotide 2765 bis 4414 einer DNA der Nukleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfaßt.

24. Hybridvektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er der Vektor pMRP160 ist.

25. Hybridvektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß order Vektor pMRP16O_0x ist.

26. Hybridvektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er der Vektor pMRP70_PL ist.

27. Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid oder Derivat davon gemäß Anspruch 1 exprimiert.

28. Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sio mit einem Hybridvoktor gemäß Anspruch 21 transformiert ist.

29. Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Zelle des Genus Escherichla coil ist.

30. Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Säugetier stammt.

31. Wirtszelle gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Eierstock-Zelle des chinesischen Hamsters (CHO-ZeIIe) ist.

32. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man eine geeignete Zelle mit einem Hybridvektor durch Elektroporation, Kalziumbehandlung, Mikroinjektion oder Protoplastenverschmelzung, gegebenenfalls in Gegenwart von Hilfsstoffen, transformiert und die transformierte Zelle auswählt.

33. Verwendung eines Polypeptids oder Derivates davon gemäß Anspruch 1 für die Behandlung von Entzündungs-Zuständen.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Menge oines Polypeptids oder Derivates davon gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfaßt.

35. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, daduich gekennzeichnet, daß er für ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, das ein Entzündungsvermittler oder ein Vorläufer eines Entzündungsvermittlers ist, oder ein Derivat davon spezifisch ist, oder ein Derivat eines solchen Antikörpers, das die Spezifität des Antikörpers, von dem es abgeleitet ist, behält.

36. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß er für ΜΠΡ-160 spezifisch ist, oder ein Derivat davon.

37. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß er für rMRP-70 spezitiouh ist, oder ein Derivat davon.

38. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß er für ein Fragment von MRP-160 spezifisch ist, oder ein Derivat davon.

39. Polyklonaler Antikörper gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß er ein für rMRP-70 spezifischer Ratten-Antikörper ist.

40. Derivat eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, d^ß es ein Antikörperfragment, ein Konjugat des Antikörpers mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Markierstoff, einem chemilumineszierenden Markierstoff, einem Metallchelat, einem paramagnetischen Teilchen, mit Avidin oder mit Biotin, oder ein radioaktiv markierter Antikörper ist.

41. Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers oder Derivates da\/on gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß ein geeignetes Säugetier oder Vogel mit einem Polypeptid mit einem scheinbaron Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, das ein Entzündungsvermittler oder ein Vorläufer eines Entzündungsvermittlers ist, oder mit einem Derivat davon immunisiert, Blutserum des immunisierten Säugetiers oder Eier des immunisierten Vogels sammelt und, falls notwendig, den Antikörper isoliert und/oder in ein Derivat davon umwandelt.

-3- 290 948

42. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers oder Derivates davon gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridomazellen, die die genannten Antikörper ausscheiden, in vitro oder in vivo vermehrt worden und, falls notwendig, dor Ai tikörper isoliert und/oder in ein Derivat davon umgewandelt wird.

43. Hybridomazelle, dadurch charakterisiert, daß die Antikörper gemäß Anspruch 35 ausscheidet.

44. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomazelle gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß ein geeignetes Säugetier mit einem Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, das ein Entzündungsvermittler oder ein Vorläufer eines Entzündungsvermittlers ist, oder mit einem Derivat davon immunisiort, Antikörper-produzierende Zellen dieses Säugetiers mit Zellen oiner kontinuierlichen Zellinie verschmilzt, durch Verschmelzung erhaltene Hybridzellen kloniert und Zellklone, die die gewünschten Antikörper ausscheiden, auswählt.

45. Verwendung eines polyklonalen oder monoklonal Antikörpers gemäß Anspruch 35 für die qualitative und quantitative Bestimmung von Polypeptiden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, die Entzündungsvermittler oder Vorläufer eines Entzündungsvermittlers sind, oder von Derivaton davon.

46. Verwendung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 35 für die Diagnose von Entzündungs-Zuständen.

47. Verwendung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 35 für die Diagnose oder Behandlung von Hodgkin Lymphoma.

48. Prüfausrüstung für die qualitative und quantitative Bestimmung von Polypeptiden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16OkD, die Entzündungsvermittler oder Vorläufer eines Entzündungsvermittlers sind, oder von Derivaten davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie polygonale oder monoklonal Antikörper rjoniäß Anspruch 35 und gegebenenfalls andere monoklonal oder polygonale Antikörper und/oder Zusatzstoffe umfaßt.

49. Pharmazeutische Zusammensetzung, daclur-li (^kennzeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Menge eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers oder Derivates davon gemäß Anspruch 35 und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfaßt.