DD299043A5

DD299043A5 - Verfahren zur herstellung neuartiger oral wirksamer neuropsychopharmaka

Info

Publication number: DD299043A5
Application number: DD33557989A
Authority: DD
Inventors: Hans-Juergen Matthies; Gisela Grecksch; Holger Stark; Klaus Neubert; Alfred Barth; Christine Rauca
Original assignee: Berlin Chemie Ag
Priority date: 1989-12-13
Filing date: 1989-12-13
Publication date: 1992-03-26

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung und Anwendung neuartiger oral wirksamer Neuropsychopharmaka, die zur Therapie neuropsychiatischer Erkrankungen geeignet sind. Die erfindungsgemaesz entwickelten Substanzen enthalten als Wirkstoffe Peptide vom Des-Tyrosin1-b-Casomorphin-5-Typ und deren Derivate. Sie zeichnen sich im Vergleich zu den gegenwaertig eingesetzten Standardpraeparaten durch eine orale Anwendbarkeit, ein neuartiges Wirkungsspektrum, eine Langzeitwirkung und eine gute Vertraeglichkeit aus. Durch die Erfindung ist es moeglich, depressive Erkrankungen, solche des schizophrenen Formenkreises und Epilepsien, therapeutisch zu beeinflussen.{Neuropsychopharmaka; orale Anwendung; Peptide; Des-Tyrosin1-b-Casomorphin 5; Derivate; Herstellung; Verfahren; Wirkungsprofil; Langzeitwirkung; Nebenwirkungen; Vertraeglichkeit}

Description

Die Erfindung betrifft oral wirksame NeurODsychopharmaka, die als wirksame Komponente lineare oder cyclische Oligopoptide vom Des-Tyrosin¹-ß-Casomorphin-5-Typ mit der Grundstruktur Pro-Phe-Pro-Gly enthalten und die sich von bekannten oral wirksamen Neuropsychopharmaka durch ein neuartiges Wirkprofil auszeichnen, wodurch eine Behandlung von therapieresistenten Formen neuropsychiatrischer Erkrankungen und psychopathologischer Störungen ermöglicht wird.

Nouropsychiatrische Erkrankungen (z. B. Epilepsie, Erkrankung des schizophrenen Formenkreises, depressive Zustände) weisen eine beträchtliche gesundheitcpolitische Relevanz auf: etwa 3% der Gesamtbevölkerung sind von diesen chronischen und teilweise progredient verlaufenden Krankheiten, die mit großem persönlichem Leid und beträchtlichen gesellschaftlichen Auswirkungen verbunden sind, betroffen. Für die bis zum 45. Lebensjahr eintretende Invalidität stellen neuropsychiatrische Erkrankungen die Hauptursache dar.

Der gegenwärtige Stand der Pharmakotherapie erlaubt keine kausale, sondern lediglich eine symptomatische Behandlung, die zudem nur bei etwa zwei Drittel der Kranken zu einer befriedigenden Normalisierung führt. Ein Drittel der Patienten sind selbst bei der Beschränkung auf eine rein symptomatische Therapie als resistent einzustufen.

Die gegenwärtig einzusetzenden Neuropsychopharmaka (z.B. Antiepileptika, Neuroleptika und Antidepressiva) weisen beträchtliche Nebenwirkungen auf und zeichnen sich teilweise aufgrund ihrer hohen Toxizität nur durch eine gerinqe therapeutische Breite aus, so daß ihr» Anwendung mitunter nicht unbeträchtliche Risiken einschließt. Sie sind weiterhin nur sehr bedingt untereinander sowie mit weiteren Pharmaka zu kombinieren. Die teilweise recht kurze Wirkungsdauer zwingt zu häufigen, sowohl den Patienten als auch das medizinische Personal belastende Applikationen.

Hinsichtlich der chemischen Struktur sind die bekannten Nouropsychcpharmaka vorzugsweise heterozyklische Verbindungen unterschiedlicher Stoffklassen, die partial- oder vollsynthetisch gewonnen werden (vgl. E. RICHELSON, Pharmacology and Clinical Considerations of the Neuroleptics in Neuropharmacology of Central Nervous System and Behavioural Disorders, Chapter 6,123-147, Academic Press, 1981).

Psychopharmaka auf Peptidbasis wurden erstmals durch D. de Wied et al. (vgl. Europ. J. Pharmacol. 49 [1978], 424; Arch. Gen. Psychiatry 36 [1979), 294).

Life Sei 26 (1980), 1575; H.M. Greven et al. vgl. Reel. trav. Chim. Pays-Bas 99 (1980), 284 im Rahmen seiner Untersuchungen zur Verhaltensphysiologie von Des-Tyrosin'-y-Endorphin beschrieben.

Durch Wegfall der N-terminalen Aminosäure im γ-Endorphin, einem im Säugerorganismus endogenem Opiatpeptid, wird das Wirkungsspektrum des Moleküls verändert. Des-Tyrosin'-y-Endorphin ict im Gegensatz zum γ-Endorphin psychotrop wirksam, ohne daß es analgetische Effekte auslöst. Der Syntheseaufwand für Peptide dieser Kettenlänge ist aber trotz der in den letzten Jahren erzielten Fortschritte auf dem Gebiet der Peptidsynthese noch immer sehr hoch. Der daraus resultierende hohe ökonomische Aufwand erlaubt damit noch keine Anwendung dieser Des-Tyr¹-Y-Endorphin-Peptide in der Medizin. Außerdem ist das Des-Tyrosin'-Y-Endorphin nach oraler Applikation unwirksam, weil ai ifgrund der Kettenlänge der Aminosäuresequenz und der dadurch bedingten Struktur- und physikochemischen Eigenschaften die Permeation durch resorbierende Grenzflächen gering ist und durch vielfältige Angriffsmöglichkeiten seitens der Peptidasen eine rasche Degradation in der Darmschleimhaut und der Leber und damit eine intensive präsystemische Metabolisierung (first pass-effekt) resultieren.

Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von langwirksamen, oral applizierbaren neuartigen Neuropsychopharmaka für den Einsatz bei therapiere&istenten Formen nervaler und psychiatrischer Erkrankungen und psychopathologischen Störungen auf der Basis einfacher Oligopeptide und Peptidderivate des Des-Tyrosin'-ß-Cascmorphin-Typ, die sich gegenüber den gegenwärtig in der Therapie psychiatrischer Erkrankungen eingesetzten Standardpräparaten durch ein neut/tiges Wirkprofil, einen neuen Wirkungsmechanismus und ein breites, durch einfache Strukturmodifikation beeinflußbares Wirkungsspektrum auszeichnen und darüber hinaus eine hohe metabolische Stabilität und gute Verträglichkeit aufweisen.

Die Erfindung dient der Erhöhung von Qualität und Wirksamkeit der medizinischen Betreuung psychiatrischer Patienten und besitzt damit eine hohe gesundheitspolitische Bedeutung.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, oral wirksame Neuropsychopharmaka zu entwickeln und deren Anwendungsspektren zu erfassen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß lineare oder cyclische Oligopeptide der Grundstruktur Pro-Phe-Pro-Gly (Des-Tyr¹-ß-Casomorphin-5), deren Salze bzw. C- und/oder N-terminal modifizierte Derivate synthetisiert werden, wobei Prolin in einer oder beiden Positionen auch durch den entsprechenden optischen Antipoden beziehungsweise durch Hydroxyprolin, Dehydroprolin, Homoprolin, Pipecolinsäure, dsvon abgeleitete substituierte Verbindungen, 2,4-Diaminobuttersäure, Lysin, Ornithin, Arginin in der L- oder D-Konfiguration und Phenylalalin auch durch den entsprechenden optischen Antipoden beziehungsweise durch Homophenylalanin, N-Alkylphenyl-Analin (z.B. N-Methylphenylalanin),Tyrosin, N-Alkyltyr( jin (z.B. N-Methyltyrosin), analoge ringsubstituierte Verbindungen, Tryptophen, Tyrosin in der L- und D-Konfiguration ersetzt sein kann. Glycin kann vorhanden sein oder auch nicht, und wenn es vorhanden ist, so kann es durch alle Aminosäuren in der L- oder D-Konfiguration oder auch als Racemat ausgetauscht werden. Darüber hinaus kann die oben aufgeführte Grundstruktur auch auf Pro-Phe-Peptide, deren Salze und Derivate, bevorzugt die entsprechenden Dipeptidpyrrolidide und -piperidide, verkürzt werden. Die eingesetzten Oligopeptide besitzen als Wirkkomponenten u.a. folgende Vorteile:

1. Nichttoxische Strukturen

2. Extrem hohe Abbaustabilität gegenüber proteolytischen Enzymen

3. Wirkungspotenzierung und -Prolongierung u.a. durc : gezielte Strukturmodifikation

4. Günstige physikalisch-chemische Parameter im Sinne einer hohen Penetrierfähigkeit

5. Hohe Bioverfügbarkeit am Wirkort.

Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung ist H-Pro-D-Phe-Gly-OH.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen Peptidwirkstoffe erfolgt vorzugsweise durch schrittweise Verlängerung der Peptidkette vom C-terminalen Ende. Eine der bevorzugten Verbindungen ist, wie oben aufgeführt, das Peptid der Formel I

H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH (I)

Die strategische Variante der step-by-step-Kondensation zur Herstellung der Verbindung entsprechend Formel I ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Glycinderivat H-GIy-Z schrittweise mit X-Pro-Y, X-D-Phe-Y und X-Pro-Y nach den in der Peptidchernie üblichen Kupplungsmethoden (vgl. E.Wünsch: Synthese von Peptiden; in Houben-Weyl, Band 15/11, Methoden der organ. Chemie, Hgr. E. Müller, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, 1974) zu dem geschützten Tetrapeptid der Formel Il verlängert wird.

X-Pro-D-Phe-Pro-Gly-Z (II)

X für tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxy-carbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl, -Dimethyl-

3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenyl-sulfenyl, 9-Fluorenylmethyloxy-carbonyl Y für OH, Pentafluorphenyl-, Pentachloi phenyl-, Trichlorphenyl, 4-Nitrophenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester und Hydrazid

Z für OH, Methyl-, Ethyl-, tert.-Butyl-, 4-Nitrobenzyl- und Phenacylester steht.

Vorzugsweise erfolgte der schrittweise Aufbau des Peptides der Formel Il nach der Mischanhydridtechnik bzw. der ·> DCCI/ Additiva-Verfahren. Als Schutzgruppenkombination kommt bevorzugt tert.-Butyloxycarbonyl/Methylester zum Einsatz.

Die entsprechenden geschützten Peptide gemäß Formel Il werden mittels Adsorptionschromatographie an einer Kieselgel-Säule durch Chloroform/Methanol-Elution oder durch Gelfiltration an Sephadex LH 20 (Elutionsmittel: Methanol) oder auch durch Umkristallisation aus Essigester/Petrolether, Essigester/Diisopropylether or'er Chloroform/Diisopropylether gereinigt. Danach wird die jeweilige Amino- und Carboxylschutzgruppe gleichzeitig oder nacheinander mit den in der Peptidchemie üblichen Deblockierungsverfahren (vgl. Wünsch, s.o.), insbesondere mittels HCL/Dioxan, HCL/Eisessig.Trifluoressigsäure, HBr/Eisessig, katalytischer Hydrierung, Transferhydrogenolyse, Zink/Eisossig, Piperidin/Dimethylformamid oder alkalischer Hydrolyse entfernt. Das resultierende Peptid der Formel I wird bevorzugt als Hydrochlorid oder als freie Verbindung (Freisetzung aus dem Hydrochlorid mittels Triethylamin) isoliert und gegebenenfalls durch Gelfiltration an Gephadex G10 (Elutionsmittel: Methanol oder Wasser) gereinigt. Im Falle der freien Verbindung ist eine anschließende Umkristallisation am Ethanol vorteilhaft. Analytische Daten für H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH · HCI

Fp: 130"C-140°C (Zersetzung)

Ia]I²: -82,0° (c = 1, Essigsäure)

Chromatographisch einheitlich (s. Ausführungsbeispiel) Analytische Daten für H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH

Fp: 228°C-230°C

[all²: 105,0°(c= !,Essigsäure)

Chromatographisch einheitlich (siehe Ausführungsbeispiel)

Die erhaltenen Oligopeptide vom Des-Tyrosin'-ß-Casomorphin-5-Typ können in Form psychotrop- bzw. antikonvalsiv wirksamer Präparate als neuartige Pharmaka zur neuropsychiatrischen Behandlung nach oraler Applikation im Dosisbereich von 10 bis 500pmol/kg zur Anwendung kommen. Die Erfindung soll anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne sie einzuschränken.

Beispiele

Abkürzungsverzeichnis:

Aminosäuresymbole entsprechend IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol. Chem. 247 (1972) 977 Pip= Pipecolinsäure

AcOH	Essigsäure
BHS	Bluthirnschranke
Boc	tert.-Butyloxycarbonyl
CAIBE	Chlorameisensäureisobutylester
DC	Dünnschichtchromatogramm, -chromatographisch
EE	Essigsäureethylester
Fp	Schmelzpunkt
h	Stunden
i.Vak.	im Vakuum
LM	Lösungsmittel
MeOH	Methanol
min	Minuten
NEM	N-Ethylmorpholin
OMe	Methylester
PE	Petrolether
RT	Raumtemperatur
THF	Tetrahydrofuran
Zers.	Zersetzung

Unter „üblichen Aufarbeitung" versteht man: '

Nach beendeter Kupplungsreaktion wird das jeweilige Rohprodukt in Essigester aufgenommen und die Lösung nacheinander zweimal mit Wasser (NaCI-gesättigt), dreimal mit 5%iger KHSOHösung, dreimal mit Wasser, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet und das Rohprodukt durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum isoliert.

Folgende Laufmittelsysteme (in Volumenanteilen) zur Dünnschichtchromatgraphie auf Silicagel-Fertigplatten (Silufol UV254, CSSR) wurden verwendet:

BAE Benzol-Aceton-Essigsäure

50 + 20 + 1 BAW 2-Butanol-Ameisensäure-Wasi.er

75+13,5+11,5 BEWE 1 -Butanol-Essigsäure-Wasser-Essigester

20 + 20 + 20 + 20 BPEW I-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser

30 + 20 + 6 + 24 CM Chloroform-Methanol

90+10 EPEW Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser

90 + 15 + 4,5 + 8,3

Beispiel 1:

Synthese von H-Pio-D-Phe-Pro-Gly-OH · HCI

1.1. Boc-Pro-Gly-OMe

5,38g Boc-Pro-OH wurden in 50 ml THF gelöst und bei -15⁰C nacheinander mit 3,175 ml NEM und 3,25 ml CAIBE versetzt. Nach 10min gab man 3,14g H-GIy-OMe₁HCI und 3,175ml NEM zum Reaktionsansatz und ließ 1,5h bei -15⁰C und weitare 12h bei RT rühren. Der Ansatz wurde wie üblich aufgearbeitet und das Rohprodukt aus EE-PE und aus Diisopropyiether umkmtallisiort.

Ausbeute: 5,Cg (70% d. Th.)

Fp: 70,5 bis -'?^eC

[a]g²: -78,b (C= 1.AcOH)

DC: einheitlich in BAE, CM und EPEW

1.2. Boc-D-Phe-Pro-Gly-OMe

4,6g Boc-D-Phe-OH, 2,2ml NEM und 2,25ml CAIBE wurden bei-15°C in 40ml THFgelöst und nach 10min mit3,85g H-Pro-Gly-OMe HCI, erhalten durch Entacylierung von 1.1. mit 1.1N HCI/AcOH-ÖI: [a]g* -57.7° (c = 1. AcOH) und 2,3 ml NEM wie unter 1.1 beschrieben zur Reaktion gebracht. Man arbeitete wie üblich auf und kristallisierte das Rohprodukt üus EE-Diisopropylether um.

Ausbeute: 5,25g (70% d. Th.)

Fp: 138 bis 139⁰C

Mg²: -102,5° (c = 1.AcOH)

DC: einheitlich in BAE, CM und EPEW

1.3. Boc-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OMe

1,64g Boc-Pro-OH wurden bei -15⁰C in 20ml THFgelöst und mitO,97ml NEM und 0,99ml CAIBE versetzt. Nach 10min gab man 2,82 g H-D-Phe-Pro-Gly-OMe · HCI (erhalten durch Entacylierung von 1.2 mit 1.1 N HCI/AcOH - Fp: 123 bis 131 °C, [a]g²: -138,8° (c = 1.AcOH) und 0,97 ml NEM zum Reaktionsgemisch und ließ 1h bei-15⁰C und 4h bei RTrühren. Der Ansatz wurde wie üblich aufgearbeitet und das Rohprodukt aus EE/PE umgefällt.

Ausbeute: 3,2g (79% d. Th.)

Fp: 65 bis 71 °C (Zersetzung)

[a]g²: -117,9° (c = 1.AcOH)

DC: einheitlich in BAE, CM und EPEW

1.4. Boc-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH

3,18g Boc-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OMe wurden in 40ml Aceton gelöst und mit 6ml 1 N NaOH zur Reaktion gebracht. Nach einer Reaktionszeit von 5h bei RT wurde das organische LM i. Vak. abgedampft und der Rest in 40 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung gelöst.

Die wäßrige Phase wurde zweimal mit EE extrahiert und anschließend mit fester Zitronensäure auf pH 3 angesäuert.

Nach 5maligem Extrahieren mit EE wurden die vereinigten EE-Phasen mit Wasser neutral gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und i. Vak. eingedampft. Das Produkt wurde aus EE/PE und CHCL₃/Diisopropylether umgefällt.

Ausbeute: 2,76g (89%d.Th.)

Fp: ab 90°C Zersetzung

[a]g²: -113,5° (c = 1.AcOH)

DC: einheitlich in BAE, CM und EPEW

1.5. H-Pro-D-Phe-Pro-Gly-OH · HCI

2,7g Boc-Pro-D-Phe-Gly-OH wurden in 16ml 1,1 N HCI/AcOH gelöst. Nach 30min bei RT wurde das Produkt mit Ether ausgefällt, abfiltriert und mit Ether gewaschen. Umfallen aus MeOH/Ether lieferte das in BAW, BEWE und BPEW DC-einheitliche Produkt.

Ausbeute: 2,14g (90% d. Th.)

Fp: ab 130°C Zersetzung

[a]g²: -82,1°(c= 1.AcOH)

Pharmakologlsche Wirkungen

Die pharmakologische Wirkung der durch den Patentanspruch gekennzeichneten Peptide wurde in zahlreichen tierexperimentellen Untersuchungen ermittelt nach parenteraler und oraler Applikation überprüft. Sie sollen für [Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 nach subkutaner und oraler Applikation am Cxplorationsverhalten und der lokomotor. Aktivität sowie der Beeinflussung der durch Apomorphin induzierten Hypothermie (Test auf neuroleptische Wirkung), an den Wirkungen im Porsolt-Test (Prüfung auf potentielle antidepressive Wirkung) und der Beeinflussung des elektrokonvulsiven Schocks (antikonvulsiv-antiepileptische Wirkung) dargestellt werden

[Des-Tyrosin¹, D-Phe³l-ß-Casomorphin 5 zeigte in diesen phbrmakologischen Tests

- eine Wirksamkeit sowohl nach subkutaner als auch nach oraler Applikation,

- eine bis zu 24 Stunden anhaltende Wirkung nach einmaliger Applikation,

- eine von bisher bekannten Standard-Pharmaka abweichendes Wirkprofil,

- eine hohe metdbolische Stabilität im Dünndarm und in der Leber und somit keinen nennenswerten first-pass-Effekt. Daraus können sich neuartige Möglichkeiten für Pharmakotherapie neuropsychiatrischer Erkrankungen ergeben.

1. Exploratlonsverhalten und Spontanmotorik

Explorationsverhalten und Spontanmotorik von Ratten im OPEN FIELD wurden bei subkutaner Applikation von Ο,δμιτιοΙ · kg"¹ Peptid und nach oraler Applikation von 2,5μπιοΙ · kg~¹ gesteigert. Sedierende Wirkungen, die für einige Standard-Neuroleptika charakteristisch sind, wurden nicht beobachtet (siehe auch Tab. 1).

Tab.1:

Expiorationsverhaiten und Spontanaktivität im OPEN FIELD unter dem Einfluß von [Des-Tyrosin¹, D-Phe³-ß-Casomorphin 5 (Anzahl der passierten Felder; χ ± SEM)

	Kontrolle	Peptid
20min nach subkutaner Applikation 0,5	n = 12 37,0 ± 4,8 100%	n = 12 68,0 ± 7,9 183% *
2,5 μηιοΙ^"¹	n = 12 37,0 ±4,8 100%	n=12 31,0 ±5,4 84%
20 min nach oraler Applikation 0,5 μηιοΙ^"¹	n = 10 37,0 ± 6,6 100%	n = 12 43,0 ± 6,5 116%
2,5 μιηοΙ · kg"¹	n = 10 37,0 ±6,6 100%	n = 11 58,0 ± 4,7 157%

•: signifikanter Unterschied zur Kontrolle, ρ < 0,05

2. Beeinflussung der durch Apomorphin induzierten Hypothermie

Die durch Apomorphin ausgelöste Hypothermie wurde bei Ratten durch zentrale Messung der Körpertemperatur erfaßt. [Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 bewirkt eine partielle Inhibition der Temperatursenkung, ohns selbst die Körpertemperatur zu beeinflussen. (Tab.2)

Tab.2:

Einfluß von !Des-Tyrosin¹, D-Pho³l-ß-Casomorphin 5 auf die durch Apomorhin ausgelöste Hypothermie (Temperatursenkung in Grad C gegenüber Vormeßwert; χ ± SEM) Zeit nach Apomorphin-Applikation Peptid 60min vor Apomorphin Ο,ΙμηηοΙ · kg"¹ subcutan

Kontr. n = 14	5	10	5	10	15	20	25	30	35	40	45
	0,81 +0,09	1,15 ±0,13	0,66 +0,15	1,04 ±0,13	1,40 ±0,14	1,46 ±0,14	1,49 ±0,14	1,49 ±0,14	1,37 ±0,18	1,20 -0,17	1,10 ±0,18
Peptid n = 12	0,63 ±0,11 *	0,70 ±0,12 *	0,77 ±0,14	0,72 ±0,15	0,76 ±0,18	0,66 ±0,20 *	0,66 ±0,18 *	0,67 ±0,15	0,63 ±0,14 *
% Inhibit.	23	39	45	51	49	56	52	44	43
Peptid 60 min vor Apomorphin
Kontr. n = 7	15	20	25	30	35	40	45
	1,60 ±0,16	1,96 ±0,16	1,97 ±0,17	1,83 ±0,19	1,50 ±0,17	1,20 ±0,24	1,20 +0,23

Peptid n = 8	0,36 ±0,14	0,70 ±0,76 *	0,96 ±0,01	1,00 ±0,15	0,99 ±0,21 *	0,95 ±0,20 *	0,91 ±0,23	0,80 ±0,22	0,75 ±0,22
% Inhibit.	45	33	40	49	50	48	39	33	37

•: signifikanter Unterschied zur Kontrolle

Tob.3:

Einfluß von [Des-Tyrosin¹, D-Phe'l-ß-Casomorphin 5 auf die durch Apomorphin ausgelöste Hypothermie (Temperaursenkung in Grad Celsius 30min nach Apomorphin-Appl. im Vergleich zum Vormeßwert; χ ± SEM)

	Zeit nach 50 min	-	Peptid-Applikation 90 min	150 min	-	180 min	24 Std.	48 Std.
subkutane Applikation 0,1 μιηοΙ · kg"¹ ko	n = 12 1,82 ±0,20	-	n = 14 1,49 ±0,14	-	-	n = 6 1,70 ±0,18
	n = 12 1,29 ±0,15 *	-	n = 12 0,66 ±0,20 *	-		n = 8 1,46 ±0,23
% Inhibition	29	n = 6 1,26 ±0,21	56		-	14
0,5pmol-kg"'ko	n = ö 1,78 ±0,29	n = 6 1,45 ±0,37	n = 5 1,72 ±0,26	n = 9 1,34 ±0,22	-	-	n = 5 1,76 ±0,19	-
	n = 9 1,64 ±0,15	n = 8 1,57 ±0,14	n = 11 0,90 ±0,14 *	-	n = 6 1,86 ±0,22	-
% Inhibition	8	9	33	-	-6
orale Applikation 2,5pmolkg"'ko	n = 7 1,83 ±0,19	n = 6 2,21 ±0,14	-	n = 9 1,44 ±0,15
Peptid	n = 8 0,95 ±0,20 *	η = 5 1,14 ±0,19 *	-	n = 9 1,44 ±0,18
% Inhibition	48	48	~	0
5,0Mmol-kg~'ko	n = 8 1,83 ±0,09	η = 7 1,54 ±0,29	n = 8 1,83 ±0,23	n = 8 1,91 ±0,21
Peptid	n = 7 0,91 ±0,11 *	n = 6 0,73 ±0,17	n = 8 0,76 ±0,17 *	n = 8 1,77 ±0,22

% Inhibition

-15

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Die inhibierende Wirkung von [Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 setzt 50 bis 90 Minuten nach der Peptidapplikation ein und hält im Falle der oralen Applikation bis zu 24 Stunden an. Damit sind eine günstige Wirkungsdauer und günstige Applikationsbedingungen im Hinblick auf eine klinisch'. Nutzung gegeben (s. a. Tab.3).

3. Prüfung auf potentloll-antldepresslvo Wirkung Im PORSOLT-Test

Tab.4:

Antidepressive Wirkung von [Des-Typrosin¹, D-Phe'l-ß-Casomorphin 5 im PORSOLT-Test (Immobilitätsdauer in see; χ ± SEM, Applikation: 11 Tage, 1x tgl., Testung 20 min nach letzter Applikation)

Kontrolle	Peptid	Peptid	Peptid
	0,05μητιοΙ	0,5pmol	2,5μιηοΙ
	x kg"'	x kg"'	x kg"'
subkutan	subkutan	subkutan	subkutan
n = 10	n = 10	n = 10
230	204	197
±6	±14	±12
100%	89%	86%
	ρ < 0,05	ρ < 0,002
oral	oral	oral	oral
η--10		n = 10	n = 10
211		200	202
±3		±8	±7
100%		95%	96%
		ρ < 0,05	ρ < 0,05

Bei der Prüfung auf potentielle antidepressive Wirkungen an Mäusen im PORSOLT-Test zeigte sich, daß die Immobilisationszeit sowohl nach subkutaner als auch nach wiederholter Applikation des Casomorphin-Derivates verkürzt wurde (Tab.4). Damit konnte für ein weiteres klinisches Einsatzgebiet die Wirksamkeit der Verbindung nach oraler Applikation nachgewiesen werden.

4. Antikonvulsive Wirkungen von [Des-Tyrosln¹, D-Phe³]-ß-Casomorphln 5 Nach oraler Applikation von 2,5μηιοΙ · kg"¹ (Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 ist eine nahezu komplette Protektion gegen durch Elektroschock ausgelöste Konvulsionen zu beobachten (Tab.5).

Antikonvuisive Wirkung von [Des-Tyrosin', D-Phe³i-ß-Casomorphin 5 am Modell des elektrokonvulsiven Krampfes (ECS)

	Kontrolle Peptid	Zahl der nicht konvulsiven Tiere/gesamt	% Protektion
1,0pmolkg ' Peptid subkutan 20 min vor ECS	Kontrolle Peptid	4/12 9/12	33 75»
I^molkg-' Peptid oral 60 min vor ECS	Kontrolle Peptid	5/15 7/15	33 47
2,5pmolkg"¹ Peptid oral 60 min vor ECS	6/20 18/20	30 90»

*: signifikanter Unterschied zur Kontrolle, ρ < 0,05

5. Pharmakokinetik

Die Pharmakokinetik von [Des-Tyrosin', D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 wurde untersucht, indem nach subkutaner und oraler Applikation von tritium-markiertem Peptid bei Ratten Blutproben entnommen wurden, aus denen das markierte Peptid extrahiert und nach Trennung und Identifikation mittels HochleistungstiuSsigkeitschromatographie die Radioaktivität szintikationspektrometrisch gemessen wurde (Ergebnisse s. Tab. 6). Nach subkutaner Applikation wurde ein relativ rascher Abfall der Konzentration, nach oraler Verabreichung mit insgesamt niedrigen Blutspiegelwerten eine wesentlich langsamer verlaufende Abnahme beobachtet.

[Des-Tyrosin¹, D-Phe³l-ß-Casomorphin 5 im Plasma (Angaben in % der applizierten Dosis pro ml Plasma)

Zeitpunkt	subkutane Appl.	oraleAppl.
nach Applikation	0,5pmol-kg-'	5,0μιηοΙ^-'
20min	0,161	0,0025
40min	0,114	0,0032
60 min	0,081	0,0031
150 min	0,009	0,0019
240 min	0,003	0,0012

[Des-Tyrosin¹, D-Pho³]-ß-Casomorphin 5 wird in der Leber nicht abgebaut. Diese Feststellung kann aufgrund von Untersuchungen an Momogenaten von Rattenleber (20% in Tyrode-Lösung, pH 7,3) mit einem Peptidzusatz (Endkonz

1 χ 10~⁶mol Γ') getroffen werden, die bei oiner Inkubation bis zu 180Min. keine nennenswerte Degradation erkennen ließen. Die metabolische Stabilität von (Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 wurde geprüft, indem aus dem Darm eine Jejuno-Duodenal&chlinge als ex vivo-Pra'parat abgebunden wurde. In das Lumen wurde tritiertes Peptid appliziert. Nach 5 bzw. 60rnin wurden Proben zur Hochdruckflüssigkeitschromatographie und anschließenden Szintillationsmessung entnommen. Mit dieser Anordnung konnto gezeigt werden, daß eine komplette Abbauresistenz von [Des-Tyrosin¹, D-Phe³]-ß-Casomorphin 5 vorliegt. Die erfindungsgemäße Lösung zeigt, daß das Peptid im Magen-Darm-Trakt und in der Leber nicht degradiert wird, so daß bei oraler Applikation ein f irst-pass-Effekt ausgeschlossen werden kann. Der Abfall des Blutspiegelmaximums nach oraler Applikation erfolgt langsam, so daß eine Erklärung für die lange Wirkungsdauer des Peptide nach dieser Applikationsart gegeben ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung neuartiger oral wirksamer Neuropsychopharmaka, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff Peptide vom Des-Tyrosin¹-ß-Casomorphin-5-Typ und deren Derivate mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen in fester, halbfester und/oder flüssiger Form, bevorzugt in flüssiger Form, in eine orale Anwendungsform gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wirksame Komponenten lineare oder cyclische Oligopeptide vom Des-Tyrosin¹-ß-Casomorphin-5-Typ, d aren Salze bzw. C- und/oder N-terminal modifizierte Derivate zugesetzt werden, wobei durch Substitution von L-Aminosäuren ihrer Aminosäuresequenz durch D-Aminosäuren und durch KeUenverkürzung bis zu Dipeptiden und ihren Derivaten eine Resistenz gegen enzymatischon Abbau als auch die Passage durch biologische Membranen, wie die des Magen-Darm-Traktes und der Blut-Hirnschranke, erreicht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Grundstruktur Pro-Phe-Pro-GIy Prolin in einer oder beiden Positionen auch durch Hydroxyprolin, Hornoprolin, Dehydroprolin, Pipecolinsäure, davon abgeleitete substituierte Verbindungen, Alanin, Phenylalanin, Valin, Serin, Ornithin Lysin, 2,4-Diaminobuttersäure, Arginin, Cystein und Methionin und Phenylalanin auch durch Homophenylalanin, N-Alkylphenylalanin, Tyrosin, N-Alkyltyrosin analoge ringsubstituierte Verbindungen, Tryptophan, Tyrosin, Valin und Alanin sowohl in der L- oder D-Konfiguration als auch als Pacemat ersetzt werden können, wobei Glycin vorhanden oder auch nicht vorhanden sein kann, und wenn es vorhanden ist, dann auch durch alle Aminosäuren in der L- oder D-Konfiguration oder auch als Racernat ausgetausc'ni werden kann und darüber hinaus die oben aufgeführte Grundstruktur auch auf Pro-Phe-Peptide, deren Salze und Derivate, bevorzugt die entsprechenden Dipeptidpyrrolidide und -piperidide, verkürzt werden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als wirksame Komponenten bevorzugt die Oligopeptide Pro-D-Phe-Pro-Gly, Pro-Phe-D-Pro-Gly, Pro-Phe-D-Pip-Gly, Pro-D-Phe-N und Pro-Phe-N zugesetzt werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die als wirksame Komponenten eingesetzten Oligopeptide vom Des-Tyrosin¹-ß-Casomorphin-5-Typ durch Segmentkondensation, vorzugsweise aber durch stufenweisen Aufbau vom C-terminalen Ende, hergestellt werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die als wirksame Komponenten eingesetzten Oligopeptide vom Des-Typrosin¹-ß-Casomorphin-5-Typ in Form oral wirksamer Präparate mit neuroleptischer und/oder antidepressiver und/oder antikonvulsiver Wirkung mit neuartigem Wirkungsmechanismus, breitem Wirkungsspektrum, hoher metabolischer Stabilität, ausgesprochener Langzeitwirkung, geringen Nebenwirkungen und guter Verträglichkeit zur klinischen Anwendung kommen.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Basis von bekannten Neuroleptika, Antidepressiva und Antikonvulsiva in Kombination mit Peptiden des Des-Ty^-ß-Casomorphin-5-Typs und seiner Derivate verbesserte Neuropsychopharmaka mit neuartigem Wirkprofü hergestellt werden können.