DD299439A5 - Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von chemischen Wirkstoffen undmedizinisch-pharmazeutischen Präparaten - Google Patents
Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von chemischen Wirkstoffen undmedizinisch-pharmazeutischen PräparatenInfo
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Abstract
Die Erfindung auf dem Gebiet der Wirkstoff-Forschung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von medizinisch-pharmazeutischen Praeparaten an in vitro kultivierten Zellverbaenden aus Saeugetieren, speziell der Maus, durch Beobachtung der Wirkung dieser Praeparate an pulsierenden differenzierten Herzmuskelzellen, insbesondere der durch ein solches Praeparat hervorgerufenen Veraenderungen der Pulsfrequenz. Dazu wird eine Zellinie solcher pluripotenter embryonaler Stammzellen verwendet, die in spontan pulsierende Herzmuskelzellen differenzieren kann; aus den embryonalen Stammzellen werden in geeigneter Weise "embryoid bodies" kultiviert, die dem zu untersuchenden Wirkstoff ausgesetzt werden. In-vivo -Untersuchungen sind nicht mehr erforderlich; stattdessen kann die Zellinie konstant kultiviert werden und steht so immer zur Verfuegung, ohne dasz fernerhin Versuchstiere verwendet werden mueszten.{Wirkstoff-Forschung; Saeugetier; Herzmuskelzellen; Pulsfrequenz; Zellinie; Stammzellen; embryoid body; Versuchstier}
Description
Hierzu 5 Seiten Zeichnungen
uie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von chemischen Wirkstoffen und medizinischpharmazeutischen Präparaten nach dem Oberbegriff des Patentanspruches.
Pharmazeutische Präparate oder entsprechende Wirkstoffe, die in irgendeiner Weise in Haupt- oder Nebenwirkung die Tätigkeit des Herzmuskels beeinflussen und hinsich'lich dieser Wirkung getestet werden sollen, werden zumeist an perfundierten Herzen bzw. an Papillarmuskelpräparaten der Ratte, des Meerschweinchens oder des Kaninchens untersucht. Eine weitere Möglichkeit bietet der Einsatz von isolierten adulten Herzmyozyten bzw. in vitro kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen. Solche Test reihen erfordern einen erheblichen Zeit- und Geldaufwand, bis genügend gesicherte Ergebnisse gewonnen werden, und es muß zu diesen Untersuchungen eine große Anzahl an Versuchstieren eingesetzt werden. Auch aus Gründen des Tierschutzes ist es erwünscht, daß die Züchtung und Tötung großer Mengen von Versuchstieren vermieden wird.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, ein Testverfahren der eingangs näher bezeichneten Art anzugeben, das wirtschaftlich und in vitro ausführbar is*, rso daß es vor allem zum Prä-screening herzaktiver Substanzen eingesetzt werden kann. '
Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, ein entsprechendes Verfahren so zu gestalten, daß wenige Versuchstiere genügen, um mit der gleichen Sicherheit und Genauigkeit wie bisher zu verwertbaren Ergebnissen zu gelangen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruches angegebenen Maßnahmen gelöst.
Bereits bei der Untersuchung des Nerven-Wachstumsfaktors (NGF) konnte gezeigt werden, daß die Verwendung pluripotenter ESC, die auch in vitro in alle Derivate der drei Keimblätter, nämlich in Entoderm, Ektoderm und Mesoderm, differenzieren können, für die Untersuchung spezifischer zellulärer Leistungen in vitro vorteilhaft ist (Wobus, A. M. et al., Biomed.Biochim.Acta 47 (1988) 12, S. 965-973).
Eine wesentliche Voraussetzung für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei, daß eine pluripotente embryonale Stammzellinie aus einem frühen Embryonalstadium isoliert und in vitro kultiviert wird, die in spontan pulsierende Herzmuskelzellen zu differenzieren imstande ist.
Nach den bisher vorliegenden Untersuchungen sind wie im adulten Herzen oder in kultivierten Herzmyozyten neonataler Ratten u.a. folgende Rezeptor-Effektor-Systeme ausgebildet:
a) beta-adrenerge rezeptor-vermittelte Reaktionskaskade,
b) alpha-adrenerge und cholinerg muskarinerg vermittelte Reaktion.
Durch die Erfindung sind die Schwierigkeiten beseitigt, die mit einem In-vivo-Test verbunden sind. Eine einmal erzeugte Zellinie läßt sich konstant vorrätig halten und kultivieren, so daß tatsächlich angesichts vieler weltweit erforderlicher Untersuchungen die Zahl der Versuchstiere verringert werden kann.
Ausführungsbeispiel
An einem Ausführungsbeisplel wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert; es wird für Insgesamt 5 pharmakologlsche Wirkstoffe durchgeführt, und die Ergebnisse werden In der Zeichnung zusammenfassend graphisch dargestellt.
1. MedlenansStze
a) Verwendetes Kulturmedium
Das eingesetzte Kulturmedium besteht aus
80ml nach DULBECCOmodifiziertem E(NEM) Vertrieb: Serva Felnbiochemica GmbH & Co., Heidelberg; 20ml fötalem Kälberserum-getestete Charge, Hersteller: Staatliches Insitut für Immunpräparate Berlin, 105 Internationalen
Einheiten (IE)/I Penicillin; 200 ml/l Streptomycin; 1 ml nicht-essentiellen Aminosäuren (100x); 1ml beta-Mercaptoäthanol einer Stammlösung von 0,007ml/10ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), Hersteller:
Serva Feinbiochemica GmbH & Co., Heidelberg (Zugabe nur bei ESC-Kultur, nicht bei Differenzierung), und 1ml L-GlutamineinerStammlösungvon146mg/10ml,Hersteller:Reanal,Budapest.
b) Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) nach DULBECCO 10g/l NaCI, 0,25g/l KCI, 1,44g/l Na2HPO4 und 0,25g/l KH2PO4; Trypsln-EDTA-Lösung (zur Dissoziation der ESC In einzelne Zellen)
200g/l Trypsin (1:250) und 20g/l EDTA in PBS werden vor dem Gebrauch im Volumen-Verhältnis 1:1 gemischt.
2. Kultur der „embryoid bodies"
Embryonale Stammzellen ESC einer Zellinle D3 (Doetschman, T. C. et al., J. Embryol. exp. Morph. 87 [1985], S. 27-45) werden auf „feeder-layer-Zellen en bryenaler Fibroblasten der Maus (Wobus, A. M. et al., Exp. Cell Res. 152 [1984], S. 212-219) kultiviert.
Nach Dissoziierung mitderTrvpsin-EDTA-Lösung werden die ESC in einer Zählkammer gezählt. Die ESCsind wesentlich kleiner als die „feeder-layer"-Zellen und deshalb von diesen leicht zu unterscheiden.
50 Einzeltropfen mit jeweils 100ESC in 0,02 ml Kulturmedium werden auf den Deckel einer mit PBS gefüllten bakteriologischen Petrischale von 10cm Durchmesser aufgetragen und im hängenden Tropfen kultiviert (Rudnicki, M. A./Burney, M. W., in:
EJ. Robertson [Edt.J: Teratocarcinomas and embryonic stem cells, IRL Press Oxford, Washington D. C. (1987), S. 19-49).
Drei Tage später werden die inzwischen gebildeten „embryoid bodies" vom Deckel der Petrischale abgespült und in 5 ml kulturmedium in einer bakteriologischen Petrischale von 6cm Durchmesser weitere vier Tage kultiviert. Nach insgesamt sieben bis acht Tagen Kultivierung werden die „embryoici bodies" in je eine Kavität von 24er Mikrotest-Platten in jeweils 1 ml darin befindliches Kulturmedium transferiert, nachdem alle Kavitäten zuvor 1 bis 2 Stunden mit 0,1%iger Gelatinelösung bei 40C vorbehandelt worden sind.
Bereits einen Tag nach der Plattierung sind in etwa 70% der plattierten Zellaggregate pulsierende Herzmuskelzellen vorhanden.
Es empfielt sich, die Untersuchungen am fünften Tag nach der Plattierung der „embryoid bodies" durchzuführen, da zu diesem Zeitpunkt die bisher untersuchten Rezeptoren und Signalübertragungssysteme ausgebildet sind.
3. Test
Nachdem das Kulturmedium abgesaugt wurde, wird 1 ml Kulturmedium erneut zugegeben; es wird die „Basalfrequenz", d.h.
die normale Pulsfrequenz, mittels Stopuhr ermittelt.
Anschließend wird der zu testende Wirkstoff in der gewünschten Konzentration zugegeben. Nach erneuter Messung der Pulsfrequenz kann die Differenz zur Basalfrequenz festgestellt werden, die ein Maß für die Wirksamkeit der Testsubstanz ist. Zur Erstellung von Dosiswirkungs-Kurven werden die Wirkstoffe dem System kumulativ zugesetzt.
Diese Untersuchungen können über einen langen Zeitraum nach der Plattierung der „embryoid bodies" mit Erfolg durchgeführt werden.
4. Testergebnisse
In der Zeichnung sind einige getestete Substanzen dargestellt. Die Diagramme spezifischer zellulärer Leistungen der Fig. 1 bis 5 sind nach Einwirkung von 5 pharmakologischen Präparaten ermittelt worden. Es bedeuten im einzelnen:
a) Fig. 1 den Effekt von (-! Isoprenalin (im folgenden nur Isoprenalin genannt) auf die Schlagfrequenz aus ESC differenzierter, spontan pulsierender Herzmyozyten; die Basal-Pulsationsrate der Zellen beträgt hier (106,3 ± 10,2) Schläge/min. Ein beta2-adrenerger Antagonist IC1118.551 (10'7M) hat an den frühdifferenzierten Herzmyozyten keine Hemmwirkung; der beta,-adrenerge Antagonist ßisoprolol (10"6M) hemmt den positiv chronotropen Effekt des Isoprenalins;
b) Fig. 2 den Einfluß des Aktivetors der katalytischer) Untereinheit der Adenylatzyklase auf die Pulsationsrate der Herzmyozyten; Forskolin erhöht dosisabhängig die Schlagfrequenz; die Basal-Pulsationsrate beträgt hier (107,3 ± 9,2) Schläge/min;
c) Fig. 3 die Wirkung des Phosphodiesterase-Hemmers Isobutylmethylxanthin IBMX auf die Schlagfrequenz der Herzmyozyten; die Basal-Pulsationsrate liegt bei (104,0 ± 8,7) Schläge/min;
d) Fig.4 den Einfluß des alphai-adrenergen Agonisten Fhenylephrin auf die kultivierten herzspezifisch differenzierten Myozyten; die AusgangS'Pulsationsrate betrug (101,9 ± 7,6) Schläge/min;
e) Fig. 5 den Nachweis des cholinerg muskarinerg induzierten, negativ chronotropen Effekts. Die Zugabe von Carbachol führt zu einer dosisabhängigen, signifikanten Abnahme der Schlagfrequenz. Dieser negativ chronotrope Effekt des Carbachols wird durch Atropin (10'4M) aufgehoben; Basal-Pulsationsrate: (128,0 ± 11,0) Schläge/min.
Isoprenalin (Hersteller: Sigma St. Louis, Fig. 1), ein beta-adrenerger Agonist, erhöht in den aus ESC differenzierten Herzmyozyten in Abhängigkeit von der zugesetzten Menge der Substanz die Schlagfrequenz. Dieser positiv chronotrope Effekt des Isoprenalins wird im Versuchsansatz (1 bis 2 Tage nach der Plattierung 7 Tage alter „embryoid bodies") durch einen spezifischen beta2-adrenergen Antagonisten IC1118.551 (10"'M) - Hersteller: Imperial Chemical Industries plc - nicht beeinflußt. Ein betar adrenerger Blocker Bisopropol (E. Merck Darmstadt) in einer Konzentration von 10~6 M hemmt den positiven chronotropen Effekt von 1O-5M isoprenalin nahezu vollständig. Ein solcher Befund deutet darauf hin, daß in einer frühen Phase der Differenzierung Isoprenalin seine Wirkung über den betai-adrenergen Rezeptor-Subtyp realisiert. Des weiteren sind solche Befunde eine Hinweis dafür, daß in einem frühen Differenzierungsstadium die beta-Rezeptor-Adenylatzyklase-Kaskade bereits funktioniert. · Letzteres wird durcn die Untersuchungen gestützt, in denen gezeigt wird, daß Forskolin - ein Aktivator der katalytischer! Untereinhoit der Adenylatzyklase, Hersteller: Serva Feinbiochemica GmbH & Co. Heidelberg - die Schlagfrequenz der Herzmyozyten erhöht (Fig. 2). Auch das zyklisches AMP (cAMP) hydrolysierende System ist in den Herzmyozyten bereits entwickelt. Eine Hemmung dercAMP/ hydrolysierenden Phosphodiesterasen führt zu einer Akkumulation des cAMP; aus einer Akkumulation des cAMP wiederum folgt eine Steigerung der Pulsationsrate der Herzmyozyten (Fig. 3). Auch der alphat-adrenerge Rezeptor ist in früh differenzierten Herzmyozyten bereits vorhanden. Der alphai-adrenerge Agonist Phenylephrin (Hersteller: Serva Feinbiochemica GmbH & Co. Heidelberg, Fig. 4). erhöht dosisabhängig die Schlagfrequenz der Herzmyozyten. Dieser positiv chronotrope Effekt de s Phenylephrins wird durch den alphai-adrenergen Antagonisten Prazosin (10~4 M) - Hersteller: VEB Arzneimittelwerk Dresden - geblockt,
Neben dem alpha,-adrenergen Rezeptor ist auch der muakarinerg cholinerge Rezeptor in den Herzmyozyten ausgebildet. Der cholinerge Agonist Carbachol (Hersteller: E. Merck Darmstadt, Fig. 5) senkt in den differenzierten Herzzellen die Schlagfrequenz. Dieser negativ chronotrope Effekt des Carbachols wird durch den Antagonisten Atropin (10~4 M) - Hersteller: Serva Feinbiochemica GmbH & Co. Heidelberg-aufgehoben.
Die Befunde zeigen, daß bereits in den frühen Phasen der Differenzierung sowohl die adrenerg als auch die cholinerg rezeptorvermittelten Signalübertragungssysteme, aber auch die cAMP-generierenden und hydrolysierenden Systeme In den Herzmyozyten ausgebildet sind.
Die Erfindung ist nicht auf die in der Beschreibung vor allem betrachtete Zellinie beschränkt; ohne die Erfindung zu verlassen, ist die Anwendung des Verfahrens auch an anderen pluripotenten ESC-Linien, die in pulsierende Herzmuskelzellen differenzieren können, ohne weitere erfinderische Maßnahmen anwendbar. Beispielsweise sind solche Untersuchungen mit einer pluripotenten ESC-Linie Bl 17 des Zentralinstituts für Genetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben der Akademie der Wissenschaften der DDR erfolgreich durchgeführt worden.
Es ist darüber hinaus auch möglich, spontan pulsierende Herzmuskelzellen von pluripotenten embryonalen Karzinomzellen beispielsweise der Zellinie P19 (McBurney, M.W./Rogers, B. J., Developmental Biology 89 [1982], S.503) nach Differenzierungsinduktion mit 1 % Dimethylsulfoxid für ein screening herzaktiver Wirkstoffe einzusetzen. In diesem Fall kann sogar auf den Einsatz von „feeder-layer "-Zellen für die Kultur der undifferenzierten Zellen ganz verzichtet werden. Die Versuche werden analogg zur oben dargestellten Verwendung der Zellinie D3 durchgeführt mit dem Unterschied, daß anstelle von 10OESC nunmehr 400 Zellen der Zellinie P19 in der o. a. Menge des Kulturmediums zu „embryoid bodies" kultiviert werden.
Claims (1)
- Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von chemischen Wirkstoffen und medizinischpharmazeutischen Präparaten an in vitro kultivierten lebenden Zellverbänden aus Säugetieren, vorzugsweise der Maus, hinsichtlich ihres Einflusses auf spezifische zelluläre Leistungen vor allem in Bezug auf chronotrope Effekte an pulsierenden, differenzierten Herzmuskelzellen, dadurch gekennzeichnet, daß- der Untersuchung pluripotente embryonale Stammzellen (ESC) zugrunde gelegt werden, die so differenzieren können, daß sie die für den Test erforderlichen physiologischen Eigenschaften erwerben,- die embryonalen Stammzellen (ESC) so lange in vitro kultiviert werden, bis sich als „embryoid bodies" bezeichnete differenzierte Zellaggregate bilden,- danach die „embryoid bodies" auf einem geeigneten adhäsiven Substrat ausplattiert,- die dabei entstehenden Zellaggregate weiter kultiviert und dem zu untersuchenden Wirkstoff ausgesetzt und ·- die dabei eintretenden Haupt- und Nebenwirkungen an den differenzierten Herzmuskelzellen gemessen werden.
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