DD300231A5

DD300231A5 - Eintopfprozeß zur Herstellung von Alpha-C-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid

Info

Publication number: DD300231A5
Application number: DD34315190A
Authority: DD
Original assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1990-07-30
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1992-05-27

Abstract

Beschrieben wird ein Eingefaeszverfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid (a-APM(HCl) * ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Aspartam.{Alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid; Zwischenprodukt fuer Aspartam}

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Eingefäßverfahren zur Herstellung von Alpha(a)-L-Aspartyl-L-pheynalaninmethylesterhydrochlorid (a-APM(HCI)), das zur Herstellung von a-L-Aspartyl-phenylalnninmethylester (α·ΑΡΜ) verwendet wird, einem Süßstoff mit der etwa 200fachen Süßkraft von Saccharose. Die Wirksamkeit dieser Verbindung, eines Dipeptide, ermöglicht es, Speisen und Getränke mit wesentlich qeringeren Mengen als den dafür erforderlichen Zuckermengen zu süßen. Infolgedessen konnten Millionen von Verbrauchern ihre Kalorienaufnahme verringern, ohne dabei auf Süßes im Leben verzichten zu müssen. Die Verbindung weist auch nicht den unangenehmen Nachgeschmack auf, der von anderen Süßstoffen, z. B. Saccharin und Cyclamat, bekannt ist. Überdies bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Methode zur Erhöhung des a/ß-Verhältnisses von APM(HCI) und auf Methoden zur Herstellung eines Endreaktionsgemisches von a/ß-APM(HCI) mit gießbarer Viskosität.

a-APM ist nicht neu und wurde im US-Patent 3,492,131 für Schlatter 1970 beschrieben. Seitdem sind zahlreich andere Patente, die andere Herstellungsverfahren und verwandte Verbindungen zum Gegenstand haben, erteilt worden, und es wurde viel über die Auswirkungen des Dipeptids auf die Erzeugung kaloriearmer Süßstoffe geschrieben. Bis jetzt jedoch erfordern die Herstellungsverfahren aufwendige Isolierungs- und Wiedergewinnungsprozesse, deren Kosten folglich vom Verbraucher zu tragen sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Herstellungsmethode, die dadurch gekennzeichnet ist, daß eine vergleichbare Ausbeute des gewünschten Endprodukts erzielt wird, ohne daß hierbei die bisher in diesem Fachgeh^' notwendige Isolierung von Zwischenprodukten notwendig ist.

Alpha-L-Aspartyl-L-phenylalariinmethylester ist ein Dipeptid, das im wesentlichen aus zwoi Aminosäuren, L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin, besteht. Es ist seit längerem bekannt, daß die Süßkraft des Dipeptids von der Stereochemie dieser einzelnen Aminosäuren abhängt. Jede dieser Aminosäuren kann entweder in Rechts- oder Linksform vorliegen, und es wurde festgestellt, daß die L-Aspartyl-L-phenylalaninester im Gegensatz zu den entsprechenden D-D-, D-L- und L-D-Isomeren süß sind. Kombinationen der Isomere, die das L-L-Dipeptid, DL-Aspartyl-phenylalanin, L-Aspartyl-DL-phenylalanin und DL-Aspartyl-DL-phenylalanin enthalten, sind süß, aber nur halb so süß, da das Racemat die Hälfte der L-L-Anteile enthält. Das Dipeptid wird durch eine Additionsreaktion hergestellt, bei der die Asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder seinem Methylester verknüpft wird. Diese Additionsreaktion erfordert eine an die Asparaginsäurekomponente angelagerte Aminoschutzgruppe, z. B. Formyl-, Acetyl, Acetoacetyl, Benzyl, substituiertes oder nichtsubstituiertes Carbobenzoxy, t-Butoxycarbonyl und Hydrohalogenidsalz. Die Aminoschutzgruppe, in der Fachwelt oft als N-Schutzgruppe bezeichnet, wird zum Zwecke dieser Darlegung N-Formyl genannt, da die Fomylkomponente in der vorliegenden Erfindung das Sperrmittel ist. Formyliertes Asparaginsäureanhydrid wird häufig als Ausgangsmaterial verwendet, dessen Herstellung ausführlich beschrieben wurde (s. US-Patent 4,173,562).

Die Additionsreaktion findet in einem Lösungsmittel statt und stellt einen der üblichen Schritte bei verschiedenen patentierten Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylaianinmethylester (a-APM) dar; s. US-Patent 3,962,207 für Uchiyama, US-Patent 4,173,562 für Bachrnan und EPO-Patent 127,411 für Yaichi u. a., auf oie alle hierin Bezug genommen wird. Während der Additionsreaktion der beiden Aminosäuren entstehen als Zwischenprodukte iwei Isomere, deren Stereochemia letztendlich die Süße des entsprechenden Moleküls bestimmt. Das Alpha(a)-Isomer ist das gewünschte Produkt, da isolierte Fraktionen von

reinem α-ΑΡΜ etwa die 200fache Süßkraft von Zucker besitzen. Die Beta(ß)-Isomer-Fraktlon besitzt nicht diese Süßkraft. Die Erfindung hat das Ziel, die Herstellung von α·ΑΡΜ zu verbessern, wodurch die Produktionskosten gesenkt und die Ausbeute an Alpha-Isomer, dem gewünschten Endprodukt, erhöht werden sollten

Die α- und ß-lsomere von APM sind nachstehend aufgeführt:

Alpha-Isomer Beta-Isomer

CO₂CH₃ CO₂H

I I

CCNH-C-H H₂N-C-H CO₂CH₃

Il Il

H₂N-C-H CH₂ 0 CH₂CONH-C-H

I I

CH₂ CH₂ 0

CO₂H

Es zeigte sich, daß die Bildung von Alpha- und Beta-Isomeren und ihre entsprechenden Verhältnisse aus der Additionsreaktion davon abhängen, welches Lösungsmittel für die Reaktion verwendet wird, bei welcher Temperatur die Reaktion stattfindet und welche Menge Lösungsmittel eingesetzt wird. Gemäß US-Patent 4,173,562 für Bachman ist ein Alpha/Beta-Isomeren-Verhältnis von 75:25 erreichbar, wenn als Lösungsmittel Ethansäure in der Additionsreaktion bei 50⁰C verwendet wird. Das Molverhältnis von Ethansäure zu Phenylalanin muß mindestens 10:1 betragen. Das Alpha/Beta-Isomeren-Verhältnis fällt deutlich auf 69/31 ab, wenn das Molverhältnis Ethansäure/L-Phenylalanin auf 6:1 zurückgeht. Die vorliegende Erdindung zeigt, daß das Alpha/Beta-Verhältnis auf etwa 80/20 erhöht werden kann, wenn die als Lösungsmittel in der Additionsreaktion verwendete Ethansäure partiell durch einen Alkylester, einen gehinderten Alkohol oder ein entsprechendes Gemisch ersetzt wird. In dieser Darlegung bedeutet der hier verwendete gehinderte Alkohol entweder einen sekundären oder einen tertiären Alkohol. Ein mit der Verwendung dieser Lösungsmittel bei diesem Verfahren in Zusammenhang stehendes Problem liegt darin, daß sich nach einer Reaktionszeit von 0,5-3 Stunden das Reaktionsgemisch verfestigt und praktisch nicht mehr zu rühren oder aus dem Reaktor zu entfernen ist. Aus mindestens zwei Gründen ist ein rührbares System notwendig. Erstens wird durch das Rühren gesichert, daß die Reaktanten vollständig umgesetzt werden. Zweitens muß Lösungsmittel später durch Destillation entfernt werden.

Ein weiteres Problem auf diesem Gebiet besteht bisher darin, daß bei einigen Technologien 25% des α-ΑΡΜ oder mehr verlorengeht, weil es in der ursprünglichen Reaktionslösung verbleibt (s. US-Patent 4,173,562). Ein anderes Problem bei dem erwähnten Patent besteht darin, daß Formyl-L-asparaginsäureanhydrid aus einem Reaktionsgemisch von Asparaginsäure, einem großen Überschuß an Methansäure und Ethansaureanhydrid hergestellt wird. Die überschüssige Methansäure muß später durch Destillation entfernt und von der Ethansäure separiert werden, was die Kosten für das Endprodukt erhöht. US-Patent 3,962,207 beschreibt ein ähnliches Verfahren, bei dem L-Asparaginsäureanhydridhydrochlorid mit L-Phenylalaninmethylester verknüpft wird. Bei dem erwähnten Verfahren besteht ein Problem darin, daß eine große Menge L-Phenylalaninmethylester notwendig ist, was die Kosten des Verfahrens erhöht. Weiterhin führt dies zur Bildung beträchtlicher Mengen von Tripeptiden, die entfernt werden müssen, wozu teure und aufwendige Trennverfahren notwendig sind. Bei der vorliegenden Erfindung besteht diese Notwendigkeit nicht.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung legt ein Verfahren zur Herstellung von a-APM(HCI) dar. Das wird mittels eines „Eingefäßverfahrens" erreicht, wobei die bei der Herstellung von formyliertem L-Asparaginsäureanhydrid anfallenden Nebenprodukte auch als Lösungsmittel für die Additionsreaktion dienen, was viele Trennungsprobleme umgeht und dadurch die Herstellungskosten senkt. Eine Verdünnung der Verknüpfungsreaktion mit einem Ester oder gehinderten Alkhol verbessert die Ausbeute an APM(HCI). Zunächst wird N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid erzeugt, indem in einem Reaktionsvorgang, der dem in der Fachwelt bekannten ähnlich ist, Asparaginsäure mit Ethansaureanhydrid und Methansäure eine Verbindung eingeht (s. US-Patente Nr. 3,933,781; 3,962,207 und 4,173,562). Erfindungsgemäß wird jedoch nur aine geringe Menge Methansäure verwendet (1,2-1,35 Moläquivalente pro Mol Asparaginsäure), wobei die überschüssige Menge in Isopropylformiat durch Zugabe von Ethansaureanhydrid und Isopropylalkohol umgewandelt wird. Das formylierte Asparaginsäureanhydrid kann dann in situ durch Zusatz von L-Phenylalanin (L-Phe) verknüpft werden. Wahlweise wird ein Alkylester oder ein gehinderter Alkohol tier Additionsreaktion zugesetzt, wodurch das a/ß-Verhältnis positiv beeinflußt wird. Während ein Ester normalerweise durch Reaktion eines Alkohols mit einem Anhydrid hergestellt wird, greift der gehinderte Alkohol das Formyl-Asparaginsäureanhydrid bei der Reaktion unerwarteterweise nicht an. Diese Additionsreaktion kann mit wenig oder ohne Rühren durchgeführt werden, um die Viskosität des Reaktionsgemisches geringzuhalten und zu einem gießbaren Endreaktionsgemisch zu kommen. Das entstehende Dipoptid wird dann mit HCI deformyliert und durch Angleichung der Konzentrationen von Methanol, Wasser und HCI an Mengen, die für eine hohe Ausbeute von a-APM(HCI) wirksam sind, verestert. Das a-APM(HCI) fällt aus dem Reaktionsgemisch aus und wird zur Bildung von α-ΑΡΜ isoliert und mit einer Base neutralisiert.

-5- 300 231 Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Bildung von a-APM(HCI). Das Eingefäßverfahren beginnt mit dem Vermischen von L-Asparaginsäure mit einer geringen Menge Methansäure (mindestens 1,2 Moläquivalente auf der Basis von Asparaginsäure) und Ethansäureanhydrid (mindestens etwa 2,0 Moläquivalente auf der Basis von Asparaginsäure) in Anwesenheit eines Katalysators, z. B. Magnesiumoxid, was zur Bildung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid führt. Als Katalysatoren eignen sich u.a. Oxide, Hydroxide und Salze von Metallen, die in den US-Patenten 4,508,912 und 4,550,180 aufgeführt sind und auf die hier verwiesen wird. Diese Reaktion läuft bei einer Temperatur bis etwa 52⁰C ab. Bei etwa 50°C sollte das Gemisch mindestens etwa 2,5 Stunden lang gerührt werden. Nach etwa 2,5 Stunden wird mehr Ethansäureanhydrid (etwa 0,2 mol) zugesetzt, um alle überschüssige, nicht verbrauchte Methansäure in Methan-Ethansäureanhydrid, d. h. ein Mischanhydrid, umzuwandeln. Nach weiteren 2,5 Stunden wird überschüssiger Isopropylalkohol (mindestens etwa 0,3 Moläquivalente auf der Basis der insgesamt zugesetzten Methansäure) zugegeben, um Methan-Ethansäureanhydrid in Isopropylformiat umzuwandeln. Die verwendete Menge Methansäure sollte 1,3-1,35 Moläquivalente auf der Basis von Asparaginsäure botragen.

Das Ethansäureanhydrid kann wahlweise auch dem Reaktionsgemisch zu Beginn der Reaktion auf einmal zugegeben werden (2,3-2,9 Mol pro Asparaginsäure) und der sekundäre Alkohol danach, um überschüssige Methansäure durch Reaktion mi» dem Mischanhydrid zu verbrauchen, was zur Bildung des entsprechenden Esters führt. Eine geringo Menge des Ethansäureanhydrids kann auch in einem einzigen Schritt zusammen mit dem sekundären Alkohol zugegeben werden. Vorzugsweise sollten jedoch die Methansäure, eine größere Menge Ethansäureanhydrid und ein Katalysator etwa 2-3 Stunden lang gemischt und dann mit einer geringen Menge Ethansäureanhydrid versetzt werden. Die Reaktion wird dann für weitere 2-3 Stunden durch Mischen aufrechterhalten, bevor ihr dann sekundärer Alkohol (Isopropanol) zugesetzt wird. Dieses Endreaktionsgemisch wird dann möglichst für weitere 2-3 Stunden bei etwa 5O⁰C fertiggemischt.

Das Produkt, N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid, reagiert dann in situ mit L-Phenylalanin, womit kosten- und zeitaufwendige Trennverfahren entfallen. Die Nebenprodukte der Reaktion dienen als Hilfslösungsmittel für den Additionsprozeß. L-Phenylalanin wird in äquimolaren Mengen mit N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid in Anwesenheit eines Alkylesters oder eines gehinderten Alkohols oder einer geeigneten Mischung aus beiden zur Reaktion gebracht. Es zeigie sich, daß der Alkylester und/oder der gehinderte Alkohol das a/ß-Verhältnis erhöhen, wenn bei den zugegebenen Mengen mindestens etwa 1,2 Mol einem Mol L-Phenylalanin entspricht. Das a/ß-Verhältnis erhöht sich mit wachsenden Mengen Ester oder Alkohol, bis die Molmenge von Ester, Alkohol oder Kombinationen aus beiden etwa das 4,7fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt. An diesem Punkt v/ird ein Sättigungswert erreicht, wobei das Isomerenverhältnis unabhängig von der weiteren Zugabt von Ester oder Alkohol konstant bleibt.

Der bei der Additionsreaktion verwendete Alkylester sollte aus der Gruppe Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat und Isorpropylformiat ausgewählt werden. Methylacetat (MeOAc) ist ein bevorzugter Alkylester. Zu den geeigneten gehinderten Alkoholen gehören Isopropylalkohol und sekundärer odcer tertiärer Butylalkohol. Dies sind die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wobei keinesfalls die Verwendung anderer Alkylester oder gehinderter Alkohole eingeschränkt oder der Anwendungsbereich der Erfindung begrenzt werden soll.

Die Additionsreaktion wird durchgeführt, indem das obenerwähnte Gemisch etwa 4-6 S'.unden bei einer Temperatur von etwa 5-60⁰C und vorzugsweise von 15-30°C, d. h. Zimmertemperatur, gerührt wird. Ein Problem bei der Additionsreaktion besteht darin, daß mit der Bildung von N-Foimyl-L-aspartyl-L-phenylalanin das Gemisch bzw. die Trübe sich allmählich verfestigt, d. h. hochviskos wird, bis das Rühren äußerst schwierig oder gar unmöglich wird. Eine derart hochgradige Viskosität macht die Filtration äußerst schwierig und hemmt den Wärmeaustausch, was die unten beschriebene Destillation von Ethansäure, Estern und/oder gehindertem Alkohol verhindert. Es zeigte sich, daß durch Zugabe von Ethansäure zur Additionsreaktion das Festwerden verhindert, d. h. die Viskosität gesenkt wird. Dies ist wichtig, da das Mischen das vollständige Umsetzen sichert. Säure und Ester müssen überdies durch Destillation vor der Deformylierung aus dem Gemisch entfernt werden. Das Reaktionsgemisch muß deshalb rührbar sein.

Die Menge der zugesetzten Ethansäure hängt von der Menge des synthetisierten N-Formyl-asparaginsäurearihydrids ab. Da die Additionsreaktion in situ in den Nebenprodukten der Reaktion abläuft, liegt bereits aus der Ausgangsreaktion von L-Asparaginsäure und Ethansäureanhydrid eine bestimmte Menge Ethansäure vor. Die Gesamtmenge der Ethansäure im System sollte- in Mol ausgedrückt- etwa das 7fache von L-Phenylalanin betragen. Es ist dabei nicht erforderlich, Ethansäure in einer Menge zuzusetzen, die das 7fache des zugesetzten L-Phenylalanins beträgt. Ausreichend ist eine geringere Menge, bei der die Gesamtmolmenge der im System vorhandenen Ethansäure etwa das 7fache von L-Phenylalanin beträgt. Obwohl die Additionsreaktion bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden kann, sollten höhere Temperaturen gewählt weiden, da diese die Viskosität des Reaktionsgemisches senken. Vorzugsweise sollten Temperaturen zwischen 25 und 4O⁰C gewählt werden, am günstigsten sind etwa 3O⁰C.

'Ein weiterer einmaliger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herabsetzung der Viskosität des Additionsgemisches durch gesteuertes Rühren d, ,selben. Es zeigte sich, daß die Viskosität des Additionsreaktionsgemisches drastisch abnimmt, wenn während der Additionsreaktion das Rühren angehalten oder seine Laufgeschwindigkeit verlangsamt wird. In einem großen Reaktor (Durchmesser 10 Fuß/3,04m/), der mit 5 Fuß (1,52m) langen Schaufeln versehon ist, reduziert sehr langsames Rühren (z. B. kurzzeitiges Laufen des Rührwerks alle 5-15 Minuten) im Vergleich zu Reaktionen bei einer Rührwerksgeschwindigkeit von etwa 60 oder mehr Umdrehungen pro Minute (U/min) drastisch die Viskosität dee Additionsreaktionsgemisches. In Laborgefäßen (Rundkolben 4 Zoll/101,6 mm/ Durchmesser mit 3 Zoll/76,2 mm/ langen Schaufeln) verursachen 200-300 U/m in ein sehr dickes Reaktionsgemisch, während Rühren bei 5-15 U/min ein sehr rührbares niedrigviskoses Reaktionsgemisch ergibt. Auch wenn der Rührapparat etwa 1 Stunde nach Zugabe von L-Phe zum Reaktionsgemisch abgeschaltet und nach der Reaktion, d. h. nach etwa 6 Stunden, wieder eingeschaltet wird, entsteht ein Reaktionsgemisch mit niedriger Viskosität. In einer großtechnischen Anlage jedoch dürfte es schwierig sein, nach Ruhepausen von einer Stunde den Rührapparat wieder in Gang zu setzen, weil sich ein Bodenkörper bildet und verfestigt. Desha'b sind langsames und periodisches Rühren vorzuziehen.

Die hier verwendeten Begriffe „gießbar" oder „niedrigviskos" bedeuten - bezogen auf die Additionsreaktionsgemische - eine Flüssigkeit, die aus einem Glas oder einem Reaktionsgefäß ausgegossen werden kann. Solche Flüssigkeiten haben im allgemeinen eine Viskosität unter etwa 15000 Centipoise (cp), zweckmäßigerweise zwischen 1000 und 10000cp, vorzugsweise jedoch zwischen 150 und 500cp.

Die Rührmittel sind für die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht entscheidend. Jedes Standardrührmittel ist einsetzbar, z. B. Edelgaseinspritzung, Schütteln, Schleudern des Reaktors, mechanische Rührwerke vorzuziehen. Die genaueXonstrukticn des Rührwerks ist ebenfalls nicht entscheidend. Sowohl bei Schaufel· als auch bei Blattrührern sollte die Rührgeschwindigkeit möglichst bei 5 bis 40 U/min, vorzugsweise aber bei etwa 20 U/min, liegen. Da sich die Geschwindigkeit der Schaufelspitze in Meter pro Sekunde (m/sec) bei einer bestimmten Anzahl von Umdrehungen pro Minute in Abhängigkeit von der Schaufellänge ändert, erwies sich, daß die Angabe „Umdrehungen pro Minute" bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung die Geschwindigkeit des Rührwerks genauer angibt. Jede Rührgeschwindigkeit unter etwa 40 U/min ist für die Reduzierung der Viskosität des Reaktionsgemisches zulässig. Es sollte jedoch erwähnt werden, daß bei Laborgeräten (4-Zoll/101,6mm/-Kolben) eine Rührgeschwindigkeit von 40 bis 150U/min ein gießbares Reaktionsgemisch ergibt.

Die durch obige Erfindung hergestellten α- und ß-lsomere von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin (α/β F-AP) können mittels Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC) analysiert werden, und dabei zeigt sich, daß diese Verfahren eine ungewöhnlich hohe a/ß-Ausbeute von etwa 79,5:20,5 ergeben.

Wahlweise werden Ethansäure und alle Ester (Methylacetat, Isopropylformiat usw.) oder gehinderter Alkohol vor der unten beschriebenen Deformylierung aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Die Ethansäure und die Ester werden unter Vakuum bei etwa 381 bis 635mm Quecksilbersäule destilliert. Die vakuumdestillation wird vor der Zugabe von HCI zur Deformylierung von α/β F-AP durchgeführt. Ethansäure, Ester und/oder Alkohol werden zurückgewonnen und zur Verwendung für die nachfolgenden Additionsreaktionen in der» Kreislauf zurückgeführt.

Die α- und ß-ls imere von N-Formyl-L-aspartyl-L-phunyl-alanin werden dann deformyliert. Chlorwasserstoffsäure und eventuell Methanol werden dem Isomerengemisch zugesetzt, um α/β F-AP zu deformylieren, was zur Bildung von α/β·ΑΡ führt. Überschüssiges Methanol reagiert auch mit übriggebliebener Ethansäure und Methansäure im Reaktionsgemisch und bildet Methylacetat und Methylformiat, die wesentlich niedrige Siedepunkte als Ethansäure od r Methansäure haben und deshalb durch Destillation bei niedrigeren Temperaturen aus dem System entfernt werden können. '

Das entstandene Gemisch aus a/ß-AP und verschiedenen Methylestern wird dann durch Einstellung der Konzentration von HCI, Methanol und Wasser auf Mengen, die für eine hohe Ausbeute an a-APM(HCI) ausreichen, verestert. Die Methanolkonzontration sollte 1 bis 10Ma.-%, möglichst jedoch 3 bis 5Ma.-% betragen. Die HCI-Konzentration sollte 9 bis etwa 18Ma.-%, möglichst etwa 12,5 bis etwa 1<),5 Ma.-% betragen. Die Wassei konzentration sollte etwa 32 bis etwa 50Ma.-%, möglichst jedoch etwa 37 bis etwa 42 Ma.-% betragen. Nach entsprechender Einstellung der Konzentrationen von Wasser, HCI und Methanol wird das Reaktionsgemisch vorsichtig bei einer Temperatur unter 35⁰C und möglichst bei Umgebungstemperatur (20-30⁰C) gerührt. Dio Veresterung ist nach etwa 4 bis 10 Tagen, meist nach 6 Tagen, abgeschlossen.

Das entstandene Hydrochloridsalz von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (a-APM(HCI)) ist dann leicht vom ß-lsomer zu trennen, da a-APM · HC! · 2 H₂O in wäßrigen Lösungen eine geringere Löslichkeit als ß-APM(HCI) aufweist (s. Ariyoshi weiter oben). Das α-Isomer fällt aus der Lösung aus und wird durch Filtrieren. Zentrifugieren, Dekantieren oder ein anderes herkömmliches Verfahren separiert.

a-APM(HCI) wird dann mit einer Base neutralisiert und bildet APM, das dann durch die auf diesem Gebiet bekannten Kristallisationsverfahren wiedergewonnen wird. Die folgenden Be'spiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Sie haben lediglich erklärenden Charakter und sollen in keiner Weise durch die aufgeführten Einzelheiten den Grundgedanken und den Anwendungsbereich der Erfindung einengen. Fachleuten auf diesem Gebiet erschließen sich durch diese Darlegung die Materialien und Methoden.

Beispiel 1

0,12g (0,003mol) des Katalysators Magnesiumoxid wurden in 16ml (0,405mol) 95%iger Methansäure gelöst. Diese Lösung wurde d3nn mit 60,2 ml Ethansäureanhydrid versetzt und 10-15 Minuten lang auf 35-40⁰C erwärmt. Anschließend wurden 39,93g (0,3 mol) L-Asparaginsäure zugegeben und das Gemisch 2,5 Stunden bei 50 ± 2⁰C gerührt. Dann wurden weitere 8,6ml Ethansäureanhydrid zugesetzt und die Reaktion ncoh einmal 2,5 Stunden bei 50 ± 2⁰C fortgesetzt. Dem Reaktionsgemisch wurden 9,2ml (0,120mol) Isopropylalkohol zugegeben und die Erwärmung weitere 2 Stunden fortgesetzt. Mittels Hochflüssigkeitschromatografie (HPLC) konnte dann die Bildung von N-Formyl-asparaginsäureanhydrid nachgewiesen werden. Anschließend wurde das N-Formyl-asparaginsäureanhydrid-Gemisch auf Zimmertemperatur abgekühlt (20-25°C) und zunächst mit 150ml (1,89 mol) Methylacetat und danach mit 44,6g (0,27 mol) L-Phenylalanin versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang be; Zimmertemperatur (?0-30°C) gerührt. Mach dreistündigem Rühren blieb das Gemisch über Nacht (18-24 Stunden) bei Zimmertemperatur stehen und verfestigte sich.

Das erstarrte Produkt wurde in einei Lösung von Methanol und Wasser (9:1) gelöst. Das entstandene Gemisch aus Alpha- und Beta-Isomeren von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin wurde mittels HPLC analysiert, wobei ein a/ß-lsomeren-Verhältnis von 79,2:20,8 festgestellt wurde.

Beispiel 2

Das a/ß-Verhältnia von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin, das sich aus der In-situ-Additionsreaktion ergeben hatte, wurde unter Verwendung verschiedener Ester/Alkohol als Hilfslösungs.niittel verglichen. Magnesiumoxid (0,121g; 0,003 mol) wurde in 16,4 ml (0.406mol)93,4%igerMeihansäure unter Stickstoff gelöst Dann wurden dem gerührten Gemisch 62,5ml (0,655mol) Ethansäureanhydrid zugesetzt, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Die Temperatur des Gemisches stieg innerhalb von 30 Minuten auf 37-33⁰C. L-Asp?raginsäure (39,93g; 0,30 mol) wurde zugegeben und 2,5 Stunden lang eine Temperatur von 48-5O⁰C aufrechterhalten. Nach Zugabe von weiterem Ethansäureanhydrid (8,6ml; 0,09 mol) wurde noch einmal für 2,5 Stunden erhitzt. Dann wurden dem Reaktionsgemisch 9,2 ml (0,120 mol) Isopropylalkohol zugegeben und weitere 2,0 Stunden eine Temperatur von 50 ± 2°C aufrechterhalten. Das Reaktionsgemisch wurde danach auf Zimmertemperatur (22-27°C) abgekühlt.

Die Herstellung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrld wurde mehrmals wiederholt, um multiple Erstreaktionsgemische zu erhalten. Jedem dieser Erstreaktionsgemische wurden dann 100 ml eines der in Tabelle 1 aufgeführten Lösungsmittel (Alkylester oder gehinderte Alkohole) sowie danach 44,6g (0,27 mol) L-Phenylalanin zugegeben. Die entstandenen Trüben wurden zum Abschluß des In-situ-Additionsverfahrens 5 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten. Im Verlauf der Reaktion verfestigten sich die Trüben immer mehr. Um alle Feststoffe zu lösen, wurde eine Lösung aus Methanol und Wasser (10:1) zugegeben. Mittels HPLC wurden in jedem Reaktionsgemisch 2,0g aliquote Teile analysiert. Bei jeder Reaktion entstanden folgende a/ß-Verhältnisse von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin:

Tabelle 1

Lösungsmittel	a/ß-Verhältnis
Methylacetat	79:21
Ethylacetat	79:21
Isopropylacetat	80:20
n-Butylacetat	78:22
Methylformiat	75,5:24,5
Isopropylformiat	78:22
Isopropylalkohol	78:22
soc-Butylalkohol	76:24
tert-Butylalkohol	78:22
ohne Lösungsmittel	71:29

Beispiel 3

Nach dem in Beispiel 1 dargelegten Verfahren wurde N-Formyl-asparaginsäureanhydrid hergestellt, pas Asparaginsäureanhydrid verblieb im ursprünglichen Reaktionsgemisch, um in situ mit L-Phenylalanih verknüpft zu werden. Dem In-situ-Reaktionsgemisch wurden 100ml Methylacetat, 44,6g (0,27mol) L-Phenylalanin und 84ml (1,47mol) Ethansäure --zugesetzt. Die im Reaktionsgemisch vorliegende Gesamtmenge an Ethansäure betrug 166,4ml (2,912mol), da etwas bereits als Nebenprodukt aus der Reaktion von Ethansäureanhydrid mit L-Asparaginsäure zur Bildung von Anhydrid vorlag. Das Additionsreaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur (20-25⁰C) etwa 6 Stunden lang gerührt. Dieses Gemisch verfestigte sich nach Abschluß der Additionsreaktion nicht. Das durch HPLC ermittelte a/ß-lsomeren-Verhältnis betrug 79,5:20,5.

Beispiel 4

Nach dem in Beispiel 1 dargelegten Verfahren wurde N-Formylasparaginsäurelanhydrid hergestellt und im ursprünglichen Reaktionsgemisch belassen. Die Additionsreaktion wurde dann in situ durchgeführt, wobei 44,6g (0,27 mol) L-Phenylalanin, 106,89g (1,26mol) Methylacetat und ausreichend Ethansäure zum Erreichen einer Gesamtmenge von 2,91 mol zugesetzt wurden (s.Beispiel 3).

Die Additionsreaktion wurde ausgeführt, indem das Gemisch etwa 6 Stunden lang bei Zimmertenpers jr (20-25⁰C) gerührt wurde. Dieses Gemisch verfestigte sich auch nach Abschluß der Additionsreaktion nicht. Erzielt wurde ein a/ß-lsomeren-Verhältnis von 79,5:20,5.

Die folgende Tabelle (Tabelle 3) faßt die Ergebnisse bezüglich der bei Einsatz von verschiedenen Konzentrationen von Methylacetat und Ethansäure (HOAc) in der Additionsreaktion err lchten a/ß-Verhältnisse zusammen. Es wurden konstante Mengen von N-Formylasparaginsäureanhydrid und L-Phenylalr ,n - jeweils 0,27 mol - eingesetzt. Temperatur und Reaktionszeiten wurden ebenfalls konstant gehalten. Die entspi jhenden Konzentrationen von Methylacetat und Ethansäure bei jeder Reaktion werden in Mol Lösungsmittel pro Mol L-Phenyidianin angegeben. Die entsprechenden aus jedem Gemisch gewonnenen α/ß-Vorhältnisse werden rechts angegeben, um zu belegen, daß bei Anwendung vorliegender Erfindung kontinuierlich günstige Relationen zu erreichen sind.

Tabelle 3

α/ß-Verhältnis in Abhängigkeit von den Konzentrationen von HOAc und MeOAc bei der Verknüpfung von L-Phe und F-Asp=O

Experiment	Konzentration	mol/mol L-Phe	a/ß-Verhältnis
	MeOAc	HOAc
1	4,65	0,00	80,0/20,0
2	4,65	5,34	78,6/21,4
3	7,00	5,34	79,2/20,8
4	4,60	10,79	79,5/20,5
5	3,49	10,79	79,2/20,8
6	2,33	10,79	77,9/22,1
7	1,17	10,7	77,1/22,S
8	2,94	9,00	77,4/22,6
Q	3,50	9,00	78,0/22,0
10	2,28	7,00	77,15/22,85
11	1,17	8,58	76,3/23,7
12	2,61	7.67	77,8/22,2
13	0,00	5,34	69,0/31,0
14	0,00	10,50	74,0/26,0

Beispiels

Obwohl ratsam ist, daß bei der Additionsreaktion im allgemeinen die eingesetzte Menge Ethansäure das 7fache der Menge von L-Phenylalanin beträgt, wurde nachgewiesen, daß selbst eine geringe Menge als Katalysator wirkt. N-Formylasparaginsäureanhydrid (31,0g; 0,217mol)- hergestellt nach dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren-wurde mit 150ml Methylacetat und 25,8ml (0,45 mcl) Ethansäure unter Stickstoff gemischt. 33,0g (0,20 mol) L-Phenylalanin wurden zugegeben und das Gemisch bei etwa 25⁰C gerührt. Nach 3,5 Stunden wurden weitere 100ml Methylacetat zugesetzt, um ein Festwerden zu verhindern. Das wurde nach 4,5 Stunden wiederholt. Nach insgesamt 6 Stunden wurde die Reaktionstrübe in genügend Methanol und Wasser (10:1) gelöst. Die Lösung wurde mittels HPLC analysiert und ein a/ß-lsomeren-Verhältnis von 80:20 festgestellt.

Beispiel 6

Magnesiumoxid (0,4g 0,01 mol) wurde in 53,3ml (1,35mol) 95%iger M nhansäure und 200ml (2,10mol) EthansäureanhydrirJ gelöst. Innerhalb von 15 Minuten erhöhte sich während der Reaktion die Temperatur von 20-22 ⁰C auf 4O⁰C. Dem Reaktionsgemisch wurde L-Asparaginsäure (133,1 g; 1,0mol) zugesetzt und die entstehende Trübe 2,5 Stunden lang bei einer Temperatur von 48-5O⁰C gohalten; danach wurden weiten 28,9ml (0,303mol) Ethansäureanhydrid zugegeben. Nach weiteren 2,5 Stunden Erwärmung wurden 30,7 ml (0,4mol) Isopropylalkohol eingerührt. Dieses Gemisch wurde bei 48-50⁰C 1,5 Stunden gerührt und dann auf Zimmertemperatur (25 ± 2⁰C) abgekühlt. Das entstandene Gemisch enthielt N-Formylasparaginsäureanhydrid.

Diesem Roaktionsgemisch wurden 187 ml Methylacetat und 148,68g (0,9 mol) L-Phenylalanin zugesetzt. Die entstandene Trübe wurde 1,5 Stunden gerührt. Um das Rühren zu erleichtern, wurden 120ml Ethansäure zugegeben und weitere 4,5 Stunden eine Temperatur von 25-26⁰C aufrechterhalten. Danach wurde das Gemisch unter einem Vakuum von 22 Zoll (558,8mm) Quecksilbersäule destilliert, bis das Reaktionsgemisch eine Temperatur von 65⁰C erreicht hatte.

Methanol (220ml) und 100ml Chlorwasserstoffsäure (1,2mol) wurden in die Trübe eingerührt, derenTemperatur etwa 1 Stunde lang bei 6O⁰C gehalten wurde. Die entstandene klare Lösung wurde destilliert, bis der Überstau eine Temperatur von 63⁰C und das Roaktionsgemisch eine Temperatur von 73⁰C erreicht hatten. Zusätzlich wurde Methanol (400 ml) zugegeben und die Destillation bis zu einer Temperatur des Reaktionsgemisches von 85⁰C fortgesetzt. Der entstandene Rückstand wurde auf Zimmertemperatur (etwa 25⁰C) abgekühlt, indem das Reaktionsgemisch 45 Minuten lang unter Vakuum bei 26 Zoll (660,4 mm) Quecksilbersäule gehalten wurde. Dem abgekühlten Rückstand wurden dann 120 ml 37%ige Chlorwasserstoffsäure, 19ml Methanol und 94,8 ml Wasser zugesetzt. Dieses Gemisch wurde dann bei Zimmertemperatur 6 Tage lang gerührt.

Die entstandene Trübe wurde filtriert und ausgewaschen und lieferte nach lOstündiger Trocknung bei 50°C einen weißen Feststoff (197,54g). Die HPLC-Analyse ergab, daß das Produkt 61,5% G-APM enthielt.

Beispiel 7

Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 angewendet, jedoch wurden die 400ml Methanol nur so weit zugegeben, wie es zur Aufrechterhaltung eines kostanten Volumens notwendig war. Der entstandene Feststoff (197,85g) wurde mit HPLC analysiert und wies einen a-APM-Gehalt von 67,18% auf.

Beispiele

Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 7 angewendet, jedoch wurde die abschließende Destillation vollständig unter Vakuum bei einer Maximaltemperatur des Gefäßes von 55-56⁰C durchgeführt. Die Ausbeute von L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester als Hydrochloridsalz betrug 51 % des theoretischen Wertes.

Beispiel 9

Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 7 angewendet, jedoch wurde die Destillation nach der Zugabe von Methanol 2 Stunden lang bei 55-67⁰C unter Vakuum (20 Zoll/508 mm/Quecksilbersäule) durchgeführt. Die Ausbeute von 186,15g a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochloriddihydrat wurde isoliert und analysiert, was 64,88% a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester ergab.

Beispiel 10

Methansäure (95,7%; 16 ml; 0,405 mol) wurde innerhalb von 5 Minuten tropfenweise in 60,2 ml (0,631 mol) Ethansäureanhydrid gegeben. Vvähranddessen stieg die Temperatur auf 40⁰C. Das Gemisch wurde 55 Minuten lang gerührt und mit 0,43g (0,003 mol) Magnesiumacetat und 39,93g (0,3mol) L-Asparaginsäure versetzt. Die entstehende Trübe wurae 2,5 Stunden lang bei 47-48⁰C gehalten. Ethansäureanhydrid (7,1 ml; 0.0744 mol) wurde zugegeben und die Wärmezufuhr weitere 2,5 Stunden fortgesetzt. Isopropylalkohol (7,21g; 0,120mol) wurde zugegeben und die Wärmezufuhr wiederum 1,5 Stunden fortgesetzt. Dann wurde die Erwärmung beendet und 130ml Ethansäure und 44,6g (0,270mol) L-Phenylalanin zugegeben. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die entstandene Trübe wurde in 750 ml Wasser und 1,051 Methanol gelöst und gewogen. Ein aliquoter Teil wurde entnommen und auf α/β-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin durch HPLC analysiert. Die AusDeute an α-Isomer betrug 71,5%.

Beispiel 11

Mathansäure (16,0ml; 0,405 mol) wurde unter Stickstoff 0,121 g (0,003 mol) Magnesiumoxid zugesetzt und bis zur Lösung aller Feststoffe gerührt. Ethansäure (60,2 ml; 0,631 mol) wurde zugegeben, was sofort zur Ausfällung eines Niederschlags führte und die Temperatur innerhalb von 15 Minuten auf 4O⁰C erhöhte. L-Asparaginsäure (39,93g; 0,3mol) wurde zugesetzt und die Trübe 2,5 Stunden lang büi 48-5O⁰C gehalten. Unter Zugabe von weiterem Ethansäureanhydrid (9,3 ml; 0,0974 mol) wurde die Wärmezufuhr 2,5 Stunden lang fortgesetzt. Dann wurde Isopropylalkohol (11,9ml; 0,155mol) zugegeben und das Gemisch 1,5 Stunden urhitzt. Die Temperatur wurde auf 53°C erhöht, und innerhalb von 15 Minuten wurden 44,Sg (ö,27 mol) L-Phenylalanin in vier Graben zugefügt. Innerhalb von 10 Minuten stieg die Temperatur auf 58⁰C; das Rühren wurde noch 60 Minuten fortgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch kühlte dann auf Umgebungstemperatur ab. 30,1 ml 37%ige Chlorwasserstoffsäure und 70 ml Wasser wurden zugegeben. Die Trübe wurde auf 60⁰C erhitzt und 1 Stunde lang bei dieser

Temperatur gehalten, wobei sich dann der Feststoff gelöst hatte. Das Lösungsmittel wurde durch Vakuumdestillation bei einer Gefäßtemperatur von 55 ± 2⁰C entfernt. Der Rückstand wog 119g. Dem Rückstand wurden 100g Wasser zugegeben und die Destillation bis zum Erreichen einer Rückstandsmasse von 107g wiederholt. 50,5ml Chlorwasserstoffsäure, 41,2ml Wasser und 31,SmI Methanol wurden zugesetzt und die Trübe 4 Tage bei 20-30 ⁰C gerührt. Der Feststoff wurde filtriert und mit 50ml gesättigter Salzlösung gewaschen. Das weiße, kristalline a-L-Aspartyl-L-phenylalanlnmethylesterhydrochloriddihydrat wog, nachdem es über Nacht getrocknet war, 43,95g.

Beispiel 12

Nach Beispiel 1 wurde eine Suspension von N-Formylasparaginsäureanhydrid hergestellt. Vor der Zugabe von L-Phenylalanin (44,6g) wurden Methylacetat (75ml) und 84ml Ethansäure hinzugegeben und die entstandene Trübe β Stunden bei 20-30⁰C gerührt. Lösungsmittel (350g) wurde durch Vakuumdestillation bei 50mm Quecksilbersäule entfernt. Chlorwasserstoffsäure (37%; 30ml) und 66,7ml Methanol wurden zugesetzt und 1 Stunde lang bei 60-62⁰C gehalten. Unter Zugabe von weiteren 528ml Methanol wurde bis zu einer Gefäßtemperatur von 85°C destilliert. Unter Vakuum (26 Zoll/660,4 mm/Quecksilbersäule) wurde das Lösungsmittel bis zu einer Gefäßtemperatur von 30 ⁰C destilliert. Dann wurden 36,4 ml Chlorwasserstoffsäure, 24,4 ml Wasser und 5,5ml Methanol zugesetzt und das entstandene Gemisch 4 Tage gerührt. Der sich bildende Niederschlag wurde filtriert, gewaschen und getrocknet, was eine Ausbeute von 63,1 g woißem Feststoff ergab. Die HPLC-Analysen wiesen einen a-APM-Gohalt von 63% nach.

Beispiel 13

Wie in Beispiel 1 wurden verschiedene Suspensionen von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (F-A-P=O) hergestellt und in einen mit einem mechanischen Rührwerk von Talboys, Modell 134-2, versehenen 500-ml-Rundkolben gegeben. Methylacetat (MeOAc), Ethansäure (HOAc) und L-Phenylalanin (Phe) wurden diesem Reaktionsgemisch zugegeben, wobei das Molverhältnis von MeOAc/HOAc (gesamt)/Phe/F-Asp=O 2,73/10,64/1,0/1,0 betrug. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang mit einer Rührgeschwindigkeit von 200-300U/min gerührt. Nach genau einer Stunde wurde die Temperatur auf 4O⁰C erhöht und die Rührgeschwindigkeit auf 5-15 U/min gesenkt. Innerhalb von 3 Stunden kam es zu einer im wesentlichen vollständigen Umsetzung von l'he. Mit einem Brookfield-LV-Viskometer wurde die Viskosität bei Zimmertemperatur nach einer Reaktionszeit von 6 Stunden, einschließlich 1,5-2 Stunden Abschlußreakticn bei 50-55⁰C, gemessen/Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Rührwerksgeschwindigkeit	Temperatur	Viskosität in cp (U/min)- Spindel 2)	12»	937	30»	60»
nachi Stunde	nach 1 Stunde		1 587 cp	485 _	819cp	483 cp
		6·	/
200-300 U/min	Zimmer-Temp.	2860cp	490	301
(Kontrolle)			287	170
5-15 U/min	25⁰C	1225
5-15 U/min	40⁰C	690

* U/min der Spindel

Beispiel 14

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Beispiel 13 angewendet, mit dem Unterschied, daß das Reaktionsgemisch nach einer Stunde Reaktiqnszeit nicht gerührt wurde. Nach insgesamt 6 Stunden konnte das Reaktionsgemisch gerührt werden, jedoch nicht ohne Hilfe beim Ingangsetzen des Rührwerks. Danach erwies sich das Reaktionsgemisch als sehr fließfähig und gießbar und war wesentlich weniger viskos als ein bei 200-300U/min 6 Stunder, lang gerührtes Reaktionsgemisch. Die Analyse des Reaktionsgomisches ergab die vollständige Umsetzung von Phe.

Beispiel 15

Es wurde im wesentichen das gleiche Verfahren wie in Beispiel 13 angewendet, mit dem Unterschied, daß das Reaktionsgemisch kurzzeitig gerührt wurde, d. h. 12 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit alle 5-15 Minuten nach 45 Minuten Reaktionszeit. In der ersten Stunde betrug die Rührgeschwindigkeit 20O-300U/min. Bei Beendigung der Reaktion stellte das Reaktionsgemisch eine gießbare Flüssigkeit dar. Die Analyse des Reaktionsgemisches ergab die vollständige Umsetzung von Phe.

Beispiel 16

Wie in Beispiel 1 wurde eine Suspension von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (F-Asp=O) hergestellt und in einen mit einem mechanischen Rührwerk von Talboys, Modell 134-2, versehenen 500-ml-Rundkolben gegeben. Dem Reaktionsgemisch wurden MeOAc, HOAc und Phe zugesetzt, wobei das Molverhältnis von MeOAc/HOAc (gesamt)/Phe/F-Asp=O 2,73/7,84/1,0/1,0 betrug. Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang mit einer Rührgeschwindigkeit von 200-3000 U/min gerührt. Nach oiner Stunde wurde die Rührgeschwindigkeit auf 5-15U/min reduziert. In etwa 5 Stunden wurde Phe vollständig umgesetzt. Bei zwei Kontrollproben betrug die Rührgeschwindigkeit 6 Stunden lang 200-300U/min. Mit einem Brookfield-LV-Viskometer wurde die Viskosität bei Zimmertemperatur nach einer Reaktionszeit von 6 Stunden, einschließlich 1,5-2 Stunden Abschlußreaktion bei 50-53⁰C, gemesson. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Rührwerksgeschwindigkeit Viskosität in cp (U/min- Spir HeI 4)

nach 1 Stunde 12* 30» 60»

200-300 U/min (Kontrolle) 9100cp 6740cp 5110cp

200-300 U/min (Kontrolle) 12 000 8000 6000

5-15U/min 6850 3740 2410

' U/min der Spindel

Beispiel 17

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wi in Beispiel 16 angewendet, mit dem Unterschied, daß die Temperatur des Reaktionsgemisches auf 40"C erhöht wurde, als die fahrgeschwindigkeit auf 5-15U/min sank. Das entstandene Reaktionsgemisch war leicht gießbar und wesentlich weniger viskos als die Kontrollproben, die mit einer Geschwindigkeit von 200-300 U/min gerührt worden waren. Die Analyse ergab die vollständige Umsetzung von Phe.

Ähnlich wurde eine gute Ausbeute von a-APM(HCI) erzielt, wobei die hier beschriebenen unterschiudlichen Alkylester, gehinderten Alkohole, Rührparameter und Destillationsverfahren zur Anwendung kamen.

Claims

1. Eingefäßmethode zur Herstellung von a-APM-Hydrochlorid, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte erfolgen:

(a) Formylierung von L-Asparaginsäure in einem ersten aus Methansäure, Ethansäureanhydrid und einem sekundären Alkohol bestehenden Reaktionsgemisch zu N-Formyl-L-asparaginsäurereanhydrid;

(b) Verknüpfung des N-Formyl-asparaginsäureanhydrids in situ mit L-Phenylalanin bei einer effektiven Temperatur zu α,β-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-isomeren;

(c) Deformylierung der Isomere durch Zugabe einer effektiven Menge Chlorwasserstoffsäure;

(d) Entfernung der restlichen Ethansäure und Methansäure aus dem Reaktionsgemisch;

(e) Veresterung der deformylierten Isomere zuq-und ß-APM-Hydrochlorid durch Zugabe effektiver Mengen Methanol, Wasser und HCI in das Reaktionsgemisch, wobei das a-APM-Hydrochlorid ausfällt; und

(f) Isolierung des a-APM-Hydrochlorids.

2. Die Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der sekundäre Alkohol in Schritt (a) Isopropylalkohol ist und der Additionsschritt in Anwesenheit einer ausreichenden Menge zugasetzter Ethansäure durchgeführt wird.

3. Die Methode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Additionsschritt in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder eines entsprechenden Gemisches erfolgt.

4. Die Methode nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Addition (Schritt b) außerdem die Vakuumdestillation von im Reaktionsgemisch vorliegender Ethansäure, gehindertem Alkohol und Estern vor der Deformylierung (Schritt c) umfaßt; daß die Deformylierung (Schritt c) weiterhin die Zugabe einer für die Veresterung von im Reaktionsgemisch vorliegender Methansäure und Ethansäure effektiven Menge Methanol umfaßt; und Schritt (d) die Entfernung des entstandenen Methylacetat und Methylformiat umfaßt.

5. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung (Schritt d) durch atmosphärischer Destillation erfolgt.

6. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung (Schritt d) durch Vakuumdestillation erfolgt.

7. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß auch die Neutralisierung des isolierten a-APM-Hydrochlorids mit einer Base zur Bildung von APM darin enthalten ist.

8. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtmolmenge der vorliegenden Ethansäure mindestens das 7fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

9. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Molmenge des bei Schritt (b) zugegebenen Alkylesters mindestens das 1,2fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

10. Die Methode nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat, Isopropylformiat oder entsprechende Gemische darstellt.

11. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Molmenge des bei Schritt (b) zugegebenen gehinderten Alkohols mindestens das 1,2fachedervon L-Phenylalanin beträgt.

12. Die Methode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der gehinderte Alkohol Isopropylalkohol, sekundären Butylalkohol, tertiären Butylalkohol oder entsprechende Gemische darstellt.

13. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Molmenge des bei Schritt (b) zugesetzten Gemisches aus Alkylester und gehindertem Alkohol mindestens das 1,2fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

14. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Addition (Schritt b) ohne Rühren erfolgt.

15. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Addition (Schritt b) unter solchen Rührbedingungen erfolgt, daß ein gießbares Endreaktionsgemisch entsteht.

16. Die Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Rühren mit einem mechanischen Rührwerk erfolgt.

17. Die Methode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Rührwerk mit höchstens etwa 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) betrieben wird.

18. Die Methode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Rührwerk während der Reaktion periodisch betrieben wird.

19. Die Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Rühren folgendermaßen abläuft:

(a) starkes Rühren etwa 30 Minuten lang nach der Zugabe von L-Phenylalanin und

(b) anschließend langsames oder diskontinuierliches Rühren.

20. Die Methode nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem mechanischen Rührwerk gerührt wird, wobei:

(a) starkes Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 60U/min,

(b) langsames Rühren mit einer Rührwerksgeschwindigkeit von etwa 20U/min und

(c) diskontinuierliches Rühren mindestens einmal alle 15 Minuten für mindestens 1 Minute durchgeführt wird.

21. Ein Eingefäßverfahren zur Herstellung von a-APM-Hydrochlorid, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte erfolgen:

(a) Formylierung von L-Asparaginsäure in einem ersten Reaktionsgemisch aus Methansäure, Ethansäureanhydrid und Isopropylalkoho! zu N-Formyl-asparaginsäiireanhydrid;

(b) Verknüpfung des Asparaginsäureanhydrids in situ mit L-Phenylalanin in Anwesenheit von (i) Ethansäure und (ii) einer geeigneten Menge eines Alkylesters, einea gehinderten Alkohols oder eines entsprechenden Gemisches bei einer Temperatur von etwa 5⁰C bis etwa 4O⁰C zu α,β-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-lsomeren;

(c) Deformylierung der Isomere durch Zugabe effektiver Mengen HCI und Methanol;

(d) Vakuumdestillation von überschüssiger Ethansäure, Methansäure, Methylacetat und Methylformiat aus dem Reaktionsgemisch;

(e) Veresterung deformylierter Isomere zu α,β-APM-Hydrochlofid durch Zugabe effektiver Mengen Methanol und HCI zum Reaktionsgemisch, wobei das a-APM-Hydrochlorid ausfällt, und

(f) Isolierung des a-APM-Hydrochlorids.

22. Die Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß (1) das Molverhältnis Ethansäure/ L-Phonylalanin mindestens 7:1 beträgt und (2) Methanol der Reaktion bei der Vakuumdestillation (Schritt d) in solchen Mengen zugesetzt wird, daß diese effektiv die Entfernung von Ethansäure und Methansäure durch Bildung entsprechender Methyiester begünstigen.

23. Die Methode nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von gehindertem Alkohol, Alkylester oder entsprechenden Gemischen zu L-Phenylalanin mindestens etwa 1,2:1 beträgt.

24. Die Methode nach Anspruch 2J, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat, Isopropylformiat oder entsprechende Gemische darstellt.

25. Die Methode nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der behinderte Alkohol Isopropylalkohol, sekundären Butylalkohol, tertiären Butylalkohol oder entsprechende Gemische darstellt.

26. Die Methode nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Addition (Schritt b) unter solchen Rührbedingungen erfolgt, daß ein gießbares Endreaktionsgemisch entsteht.

27. Die Methode nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem mechanischen Rührwerk mit einer Geschwindigkeit unter etwa 30 U/min gerührt wird.

28. Die Verbesserung einer Methode zur Verknüpfung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin zur Herstellung eines Gemisches von α,β-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß die Additionsreaktion in Anwesenheit eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder eines entsprechenden Gemisches zur Erhöhung des α,β-Verhältnisses erfolgt.

29. Die verbesserte Methode nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat oder entsprechende Gemische darstellt und es sich bei dem ge'· äderten Alkohol um Isopropanol handelt.

30. Die verbesserte Methode nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Additionsreaktion in Anwesenheit von Methylacetat erfolgt.

31. Die verbesserte Methode nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß im Reaktionsmedium Methylacetat in einer Menge von etwa 1,2 bis etwa 4,7 Moläquivalenten pro Mol L-Phenylalanin vorliegt.

32. Eine Methode zur Herstellung von a/ß-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-lsomeren, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes umfaßt: (a) Umsetzung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin, (b) in Abwesenheit von Ethansäure und (c) ohne Rühren, wobei letzteres ein gießbares Endreaktionsgemisch ergibt.

33. Die Methode nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch weiterhin enthält:

(a) eine Menge eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder entsprechende Gemische, die effektiv das oVß-Verhältnis der Isomere erhöht.

34. Die Methode nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß (d) Methylacetat ist.

35. Die Methode nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid und L-Phenylalanin lediglich in der ersten Stunde der Reaktionszeit gerührt werden und danach kein Rühren mehr erfolgt.

36. Eine Methode zur Herstellung von a/ß-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-lsomeren, dadurch gekennzeichnet, daß dazu gehören:

(a) Umsetzung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin,

(b) die Anwesenheit von Ethansäure und

(c) Rührbedingungen, unter denen eingießbares Endreektionsgemisch entsteht.

37. Die Methode nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem mechanischen Rührwerk mit einer Geschwindigkeit von unter etwa 40 U/min gerührt wird.

38. Die Methode nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Laufgeschwindigkeit des Rührwerks etwa 20 U/min beträgt.

39. Die Methode nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch während der Reaktion periodisch gerührt wird.

40. Die Methode nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur unter etwa 60⁰C erfolgt.

41. Die Methode nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 30⁰C beträgt.