DD301645A9

DD301645A9 - Mutantenenzym mit verminderter stabilitaet unter grosstechnischen bedingungen

Info

Publication number: DD301645A9
Application number: DD90342161A
Authority: DD
Inventors: Van Jan H Eijk; Wilhelmus J Quax; Johan P M Sanders
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1993-05-13
Also published as: CA2032518A1; FI910908A0; EP0409299A2; FI910908A7; HU906646D0; IE76723B1; ATE141103T1; IE902367L; NO910794L; HUT56396A; NO910794D0; KR920701448A; WO1991000343A2; EP0409299A3; DE69028010D1; EP0409299B1; NZ234297A; ZA905111B; AU5939790A; IE902367A1

Abstract

Es wird ein Mutantenenzym zur Verfügung gestellt, das unter großtechnischen Bedingungen verminderte Stabilität aufweist. Als Beispiel wird Mutanten-Bakterien-alpha-Amylase zur Verfügung gestellt, deren Thermostabilität während des Backens vermindert ist. Diese modifizierte alpha-Amylase kann zur Verbesserung des Laibvolumens und der Krumenweichheit von Broterzeugnissen verwendet werden, ohne daß die Gefahr übermäßiger Dextrinbildung besteht.

Description

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Mutantenenzym mit verminderter Stabilität und ein Verfahren zur Gewinnung desselben.

Hintergrund und einschlägige Literatur

Den meisten zur Brotherstellung verwendeten Mehlen wird in der Mühle oder in der Bäckerei a-Amylaie zugesetzt. Entsprechend dem Stand der Technik können Pilz- und Getreide-a-Amylasepräparate zur Verbesserung des Volumens der Brotlaibe sowie zur Krumenerweichung verwendet werden. Untersuchungen des Altbackenwerdens von Brot haben gezeigt, daß die Rekristallisierung der Stärkefraktion während der Brotlagerung die Krumenfestigkeit erhöht. Folglich kann eine krumenerweichende Wirkung dadurch erzielt werden, daß die Stärkefraktion während des Backprozesses teilweise abgebaut wird. Damit die a-Amylase ihre Wirkung gegen das Festwerden wirksam entfalten kann, ist es erforderlich, daß das Enzym im Backteig überlebt, bis ein ausreichender Teil der Stärkefraktion verkleistert ist, damit die Hydrolyse eintreten kann (Miller u. a., Food Technology, Januar 1953, S. 38). Aufgrund der geringen Thermostabilität der von Aspergillus oryzae gebildeten Pilz-a-Amylase ist dieses Enzym zu dem Zeitpunkt, da die Stärke im Gebäck verkleistert und von dem Enzym angegriffen und hydrolysiert werden kann, bereits weitgehend inaktiviert. Aus diesem Grund werden Pilz-a-Amylasen die Weichheit der Krume kaum verbessern, wenn sie auch zur Verbesserung des Laibvolumens genutzt werden können, ohne daß die Gefahr der übermäßigen Dextrinbildung besteht.

Andererseits sind Bakterien-a-Amylasen durch eine so hohe Thermostabilität gekennzeichnet, daß während des Backens zu viel Stärke in Dextrin umgewandelt wird. Wonn zu viel Enzym zugegeben wurde, ist die Brotkrume gummiartig und stark klebrig, und die Brotqualität ist für den Verbraucher nicht akzeptabel. Bakterienamylasen überleben teilweise den Backprozeß und wirk9n weiter nach dem Backen, besonders während der langsamen Abkühlung des Brotes. Um eine akzeptable krumenerweichende Wirkung zu erzielen, ist es notwendig, die Dosierung der Bakterien-a-Amylase und die Bedingungen der Brotherstellung sehr genau zu steuern. Aufgrund der bei der Verwendung dieser thermisch stabilen Enzyme auftretenden Probleme werden Bakterienamylasen im Bäckereigewerbe im allgemeinen nicht verwendet. a-Amylasen mit mittlerer Thermostabilität scheinen für die Verbesserung der Krumenweichheit am besten geeignet zu sein, weil in der Brotkrume eine zu starke Dextrinbildung nicht so leicht durch zu hohe Dosierung dieser Enzyme ausgelöst werden kann. Aus diesem Grund werden Malz-ct-Amylase, deren Thermostabilität zwischen der der Pilz- und der Bakterien-a-Amylase liegt, im Bäckereigewerbe noch weitgehend verwendet. In vielen Malzpräparaten wirkende proteolytische Nebenaktivitäten verursachen jedoch unerwünschte Nebenwirkungen. Darüber hinaus ist eine aus Malz hergestellte gereinigte a-Amylase für die Verwendung in der Bäckerei viel zu teuer.

Weitere Möglichkeiten werden in der US-PS 4320050, die ein Verfahren zi r Verbesserung der geringen Thermostabilität von Pilz-a-Amylase während des Backprozesses boschreibt, sowie in der EPA 0273268 dargelegt, die ein chemisches Modifikationsverfahren der hohen Thermostabilität der Bakterien-a-Amylase beschreibt. Um eine mittlere Thermostabilität zu erzielen, müssen di6 Enzyme in beiden Fällen vor der Verwendung im Brotteig modifiziert werden. Nach der US-PS kann die Pilz-a-Amylase gegen thermisch·) Denaturierung geschützt werden, indem das Enzym in einem Schutzmediurr, löslich gemacht oder dispergiert wird, während nach der Europäischen Patentanmeldung Bakterien-a-Amylase vor der Verwendung im Teig acyliert werden muß. Folglich besteht der Bedarf an neuen Enzymen mit optimaler Stabilität, die für die unmittelbare Verwendung in einem industriellen Prozeß wie dem Backprozeß geeignet sind, noch weiter.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Mutantenenzym zur Verfügung, das unter großtechnischen Bedingungen verminderte Stabilität aufweist. Dieses mutierte Enzym kann durch Substitution von mindestens einem Rest das Wildtyps oder nativen Enzyms gewonnen werden.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1: Struktur des Plasmids pl»JAm4

Ein 2,2 kb Bg 1 ll-BamH I-Fragment, ü.: das a-Amylssegen des Bacillus amyloliquefaciens trug, wurde in den BamH I-Ort

von pUC 18 inseriert. Das Ampicillinresiitenzgen ist mit AMP bezeichnet. Fig. 2: DNA-Sequenz des a-Amylasegens

Das Insert von pUCAm 4 zeigte ein einziges großes offenes Leseraster von 1542 Basen, die a-Amylase des Bacillus

amyloliquefaciens codieren. Die Aminosäuresequenz ist im Einbuchstaben-Code angegeben. Fig.3: Sequenz dep EcoRI-BamHI-Fragments von pMaTBac

Der EcoR I-Ort in Position 3753 entspricht dem EcoR I-Ort in pMa 5-8 in Position 3753. Der TAC-Promoter befindet sich

zwischen Position 3753 und 3858. Die Aminosäuresequenz im Einbuchstaben-Code zeigt das a-Amylasegen an. Fig. 4: Restaktivität des Wildtyps (WT) und Kombinationsrriutanten-a-Amylase nach 10minütiger Inkubation bei 75⁰C. Die

Mutanten sind in Tab. 7 ausgewiesen

Fig. 5: Restaktivität des Wildtyps (WT) und der Mutanten-a-Amylase nach lOminütiger Inkubation bei 75°C.

Bei den Mutanten handelt es sich um verschiedene Substitutionen in Rest 123, wie sie in Tab.8 dargestellt sind. Fig.6: Chromosomenkartierung der B.amyloliquefaciens H 2 DNA, 5'- und 3'-lntegranten und des a-Amylase-Minusstranges BAM112.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Enzyme mit geeigneter Stabilität können auf verschiedene Weise entwickelt oder gefunden werden, z. B. durch klassische Screening-Methoden oder mittels moderner gen- oder proteintechnischer Methoden.

Das Screening auf die gewünschte enzymatische Aktivität aufweisende Organismen oder Mikroorganismen kann z. B. durch Isolierung und Reinigung des Enzyms von einem Mikroorganismus oder einem Kulturüberstand solcher Mikroorganismen, Bestimmung seiner biochemischen Eigenschaften und Feststellung, ob diese biochemischen Eigenschaften die Anforderungen für einen bestimmten Verwendungszweck erfüllen, erfolgen. Wenn das identifizierte Enzym nicht aus seinem natürlichen produzierenden Organismus gewonnen werden kann, können DNA-Rekombinationsmethoden zur Isolierung des das Enzym codierenden Gens, zur Expression des Gens in einem anderen Organismus, zur Isolierung und Reinigung des exprimierten Enzyms und zur Beantwortung der Frage, ob es für den beabsichtigten Verwendungszweck geeignet ist, genutzt werden. Die Modifizierung existierender Enzyme ist ein anderer Weg zur Gewinnung neuer Enzyme für einen beabsichtigten Verwendungszweck. Das kann u. a. durch chemische Modifikationsmethoden erreicht werden (vgl. I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44 11976], S. 273-291). Allgemein kann festgestellt werden, daß diese Methoden zu unspezifisch sind, da sie alle zugänglichen Reste mit gemeinsamen Seitenketten modifizieren, von der Gegenwart geeigneter zu modifizierender Aminosäuren abhängig sind und oft nicht in der Lage sind, schwer erreichbare Aminosäuren zu modifizieren, wenn nicht das Enzymmolekül entfaltet wird.

Die als Alternative mögliche Enzymmodifikation durch Mutagenese des codierenden Gens leidet nicht unter dem erwähnten Mangel an spezifischer Wirksamkeit und gilt folglich air überlegenes Verfahren. Die Mutagenese kann entweder durch Zufallsmutagenese oder durch ortsgerichtete Mutagenese erreicht werden.

Die Zufallsmutagenese durch die Behandlung ganzer Mikroorganismen mit chemischen Mutagenen oder mit mutagenisierender Strahlung kann natürlich zu modifizierten Enzymen führen. In diesem Fall müssen strenge Auswahlprotokolle für die Suche nach diesen bestimmten, seltenen Mutanten zur Verfügung stehen. Die Wahrscheinlichkeit d6r Isolierung von Mutantenenzymen durch Zufallsmutagenese kann erhöht werden, wenn das codierende Gen nach dem Klonieren in vitro oder in vivo der Mutagenese unterzogen und das codierte Enzym durch nochmaliges Klonieren des mutierten Gens in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird. Bakterien (E. coll, Bacillus) Hefen oder Pilze (Aspergillus) sind z. B. geeignete Wirte für die Produktion der modifizierten Enzyme. Auch in diesem Fall müssen geeignete biologische Auswahlprotokolle zur Verfügung stehen, damit die gewünschten Mutantenenzyme ausgelesen werden können. Diese biologischen Auswahlprotokolle lesen nicht unbedingt direkt diejenigen Enzyme aus, die für den großtechnischen Einsatz am besten geeignet sind.

Die Erfindung stellt nun neuartige Mutantenenzyme zur Verfügung, die durch Expression eines das Enzym codierenden Gens gewonnen werden können. Das Enzym hat eine Aminosäuresequenz, die sich in mindestens einer Aminosäure von dem entsprechenden Wildtyp-Enzym unterscheidet und die unter Bedingungen der großtechnischen Anwendung verminderte

Stabilität aufweist. Ob> ^ohl bekannt ist, daß einige Mutanten unter Laborbedingungen weniger stabil sind, wurde bei ihrer großtechnischen Anwendung wegen unterschiedlicher Test-und Einsatzbedingungen (Temperatur, pH, Substrat usw.) nur eine geringfügige Stabilitätsveränderung festgestellt. Es gelang uns zum ersten Mal, Mutanten zu erhalten, die unter großtechnischen Prozeßbedingungen eine verminderte Stabilität aufweisen. Ortsgerichtete Mutagenese, die die spezifische Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) durch eine andere gewünschte Aminosäure ermöglicht, kann zur Konstruktion und Auswahl eines Enzyms mit verbesserten Eigenschaften genutzt werden.

Nach einem Aspekt der Erfindung können identifizierte Mutationen kombiniert werden, um die gewünschten Stabilitätsmerkmale genau zu modulieren. Durch Kombinieren geeigneter Mutanten ist es möglich, eine „Feinabstimmung" der Stabilität der Mutantenenzyme zu erreichen. Alle möglichen Stabilitätsformen des Enzyms können geändert werden, beispielsweise die Temperaturstabilität, pH-Stabilität, Stabilität während des Knetens oder die Stabilität in Gegenwart solcher chemischer Verbindungen wie Substrate, Salze, Inhibitoren usw.

Die Mutagenese des codierenden Gens oder die Fusion codierender Gene wurde bereits als Methode zur Konstruktion von α-Amylasemutanten mit veränderton enzymatischen Eigenschaften genutzt. In einer neueren Patentanmeldung (EP 0208491) wird eine Methode zur Konstruktion von Bakterien-a-Amylase-Hybridenzymen durch Konstruktion der Fusions-a-Amylasegene aus B.licheniformis und B.stcarothermophllus beschrieben. N.A. Smirnova u.a. (Biological Abstracts, 87,7 [1989], Zusammenfassungen Nr.70127 und 70128) konstruierten B.amylollquefaciens-a-Amylasemutanten, die unter Labor-Testbedingungen verminderte Thermostabilität aufweisen. Diese Testbedingungen weichen stark von den BackL sdingungen ab, bei denen der pH ziemlich niedrig ist (pH = 5-5,5), während der Stärkegehalt und die Viskosität sehr hoch sind. Wie in dem Roferenzbeispiel gezeigt werden wird, haben nicht alle mutierten a-Amylasen, die unter Labor-Testbedingungen verminderte Thermostabilität aufweisen, auch bei der Verwendung beim Backen eine optimale Thermostabilität. Die Erfindung macht sin Verfahren zur Herstellung eines unter großtechnischen Bedingungen eine gewünschte Stabilität aufweisenden Mutantenenzyms verfügbar, das am Beispiel der Herstellung von Mutanten-Backenzymen durch ein Verfahren zur Auswahl der am besten zur Verwendung bei der Brotherstellung geeigneten Mutanten dargestellt wird. Unter Backenzymen verstehen wir Enzyme, die an der Teigbereitung beteiligt sind oder bei ihr verwendet werden. Unter einem Mutantenenzym verstehen wir ein Enzym, das sich durch eine oder mehrere Aminosäure(n) von dem Wildtyp-Enzym unterscheidet. Das das Mutantenenzym codierende Gen hat eine DNA-Sequenz, die sich mindestens in 1, vorzugsweise in 1-10 Rest(en) von dem Wildtyp-Gen unterscheidet. Das Mutantenenzym wird in einem mikrobiellen Fermentationsprozeß produziert, und danach kann das Enzym isoliert und gereinigt werden. Das erfindungsgemäße Mutantenenzym weist unter großtechnischen Bedingungen die gewünschte Stabilität auf und kann ohne weitere chemische Modifizierung verwendet werden.

So kann es sich bei dem Mutantenenzym z. B. um eine a-Amylase handeln, die beim Backen eine verminderte Thermostabilität aufweist. Andere Backenzyme mit amylolytischer, hemicellulolytischer, proteolytischer, lipolytischer oder Oxidoreduktase-Aktivität können ebenfalls zur Qualitätsverbesserung von Backwaren genutzt werden (vgl. Übersicht im AIT Technical Bulletin [1980), Bd. II, 10,11,12). Die Eigenschaften der vorhandenen Enzyme wie Thermostabilität, pH-Optimum, Substratspezifität, Aktivität usw. sind für ihre Verwendung als Backenzym nicht immer optimal. Die Erfindung macht ein Verfahren zur Optimierung der Eigenschaften dieser vorhandenen Enzyme verfügbar, wodurch sie besser für die Verwendung bei der Brotherstellung geeignet sind. Mittels proteintechnischer Methoden können Enzyme konstruiert werden, die ihre höchste Aktivität auf eine der Stufen des Brotherstellungsprozesses entfalten. In einem Aspekt der Erfindung wird a-Amylase mit optimaler Thermostabilität zur Verfügung gestellt, wobei die a-Amylase zum größten Teil während und nicht nach dem Backstadium des Brotherstellungsprozesses wirkt. Ein anderes Beispiel für die Verbesserung vorhandener Backenzyme ist die Herstellung eines proteolytischen Mutantenenzyms, das während des Knetens bei der Brotherstellung deaktiviert wird und folglich als Knetzeitverkürzer wirkt, der nur während des Knetens aktiv ist.

Die modifizierte a-Amylase wird eine Aminosäuresequenz haben, die sich durch mindestens eine ausgewählte Aminosäure von dem Wildtyp-Enzym unterscheidet. Die genannten Mutationen werden von der a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens gewonnen, wie nachstehend ausführlich beschrieben werden wird, z. B. Bakterien-a-Amylase mit einer Aminosäuresequenz, die sich bezüglich mindestens einer Aminosäurezahl von B.amyloliquefaciens oder einer homologen Position in einer homologen a-Amylase unterscheidet. Es ist vorteilhaft, a-Amylase, deren Aminosäure Nr. 123 mutiert ist, zu verwenden. Fachleute werden verstehen, daß durch die Mutation einer anderen Teilen dar Aminosäuresequenz entsprechenden Aminosäure ebenfalls geeignete Enzyme gewonnen werden können.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde die Aminosequenz der modifizierten a-Amylase in mindestens zwei Aminosäurezahlen (?) modifiziert. Das kann ein Enzym ergeben, das eine verminderte Stabilität aufweist, die höher ist, als der von den einzelnen Mutationen geleistete Beitrag. Auf diese Weise kann eine Mutanten-a-Amylase mit optimaler Stabilität hergestellt werden.

Geeignete Wirtsorganismen für die Produktion modifizierter a-Amylase sind E. coll. Bacillus subtilis. Bacillus licheniformis und Bacillus amyloliquefaciens. Das Gen wird vorzugsweise in den Wirt eingebaut.

Die modifizierte a-Amylase zeigt während der großtechnischen Anwendung, z. B. im Prozeß der Brotherstellung, verbesserte Eigenschaften. Unter verbesserten Eigenschaften, wie hier in der Spezifikation im Zusammenhang mit einer Mutanten-a-Amylase verwendet, verstehen wir eine im Vergleich zum entsprechenden Wildiyp Enzym verminderte Thermostabilität während des Backens.

Gemäß dieser Erfindung kann ein Mutantenenzym auf der Grundlage einer sorgfältigen L'".;' ^rsuchun_ der Struktur des Wildtyp-Enzyms zusammen mit der sorgfältigen biochemischen Untersuchung der Stabilität c' jr ursprünglichen Enzyme, z. B. der Thermostabilität der Bakterien-a-Amylase unter Backbedingungen, gefolgt von einer rationellen Abwandlung der Gensequenzen des Wildtyps, durch Design geschaffen werde κ Eine umfangreiche Untersuchung der durch Design erhaltenen Mutanten unter großtechnischen Bedingungen führte zur Ermittlung von Mutanten mit optimalen Eigenschaften. In einem Aspekt der Erfindung kann die Mutanten-a-Amylase mit verminderter Thermostabilität während der Verwendung z. B. beim Backen in einem Verfahren zur Teig- oder Brotherstollung ioder ähnlicher Erzeugnisse) genutzt werden. Unter ähnlichen Produkten verstehen wir Produkte, die durch Backen eines flüssigen oder festen Teiges aus einem Gemisch von Wasser und gemahlenem Getreideschrot entstehen.

Methoden und Material

1. Allgemeine Klonlerungstechniken

Es wurden die in den Handbüchern von T.Maniatis u.a. (198?), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory; F. Ausübet u. a. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York; B. P6rbal (1988), A. Practical Guide to Molecular Cloning, 2. Aufl., John Wiley & Sons Inc., New York, beschriebenen Klonieungsverfahren angewendet. Diese Handbücher beschreiben ausführlich die Protokolle für die Konstruktion und Vermehrung rekombinierter DNA-Moleküle, die zur Erstellung von Gen-Banken erforderlichen Prozeduren, die Prozeduren zur DNA-Sequenzierung und -Mutation und die Protokolle für die enzymatische Behandlung der DNA-Moleküle.

2. Chemische Mutagenese

Um in der DNA Mutation auszulösen, kann Monierte DNA in vitro mit Chemikalien behandelt werden. Wenn diese Mutationen auf die die Aminosäure codierent^n Triplettcodons gerichtet sind, kann durch die mutierte klonierte DNA ein mutiertes Protein produziert werdoh.

Ei;:e Methode zur chemischen Mutagenese mit Hilfe von Natriumbisulfit wurde von Shortle und Botstein beschrieben (Methods Enzymol. 100 [1983), S.457). Eine gute Methode wurde von Folk und Hefstetter (Cell, 33 [1983), S.585) beschrieben. Andere Miiiagenecernethoden wurden von Smith, Ann. Rev. Gent., 19(1985), S.423 beschrieben Ein besonders nützliches Protokoll findet sich bei Ausubel, a.o.a.O. (vgl. Kapitel 8).

3. Mutagenese auf Duplex-DNA mit Einzelstrangbereich (gapped DNA)

Ein auf der Lücken aufweisenden Duplex-Mcthode beruhendes Verfahren (Kramer i;.a., Nucl. Acids Res. 12 (1984), S.9441) und ein Phasmid (Hybrid aus Plasmid und Phage) wurden verwendet. Im wesentlichen beruht die Methode auf einem Duplex-DNA-Zwischenstück mit Einzelstrangbcreich, das aus einem Lücken aufweisenden Strang (- Strang), der einen Antibiotikurnresistenzmarker vorn Wildtyp enthielt, und einem Matrizenstrang {+ Strang) besteht, der in dem die Antibiotic nfesistenz vermittelnden Gens eine Amber-Mutation trägt. Nach der Hybridisierung wird das mutagene Oligonucleotii während der in vitro erfolgenden Einzelstrangreparatur- und Verschlußreaktion in den Lücken aufweisenden Strang eingebaut. Die so erhaltenen Moleküle werden gonutzt, um einen Wirt mit Mismatch-Reparatur-Mangel (Mut S), in dem die Verbindung zwischen der beabsichtigten Mutation und dem Antibiotikumresistenzmarker erhalten ist, zu transformieren. Man läßt dann die aus diesem Stamm isr.lieite gemischte Phasmidpopulation sich in einen Suppressor-negativen Wirtestamm aufspalten. Die Transformanten weiden auf antibiotikumhaltigem Medium plattiert, wodurch eine Selektion auf die Nachkommen des Lücken aufweisenden Stranges durchgesetzt wird.

Das Zwillingsvektorsystem/pMa/c 5-8, das von P.Stanssen u.a. in Protein Engineering and Site-directed Mutagenesis, 1985, 24th Harden Conference, Programme and Abstracts, herausg. von A. R. Fersht und G.Winter), beschrieben wurde, besteht aus folgenden Elementen: Pos. 11-105: Bakteriophage fd, Terminator Pos. 121-215: Bakteriophage fd, Terminator Pos.221-307: Plasmid pBR322 (Pos.2069-2153)

Pos.313-768: Bakteriophage M, Replikationsstartpunkt (Pos.5482-5943) Pos.772-2571: Plasmid pBR322, Replikationsstartpunkt und ß-Lactamasegen Pos. 2572-2685: Transposon Tn903 Pos.2719-2772: Trypiophanterminator (doppelt) Pos.2773-3729: Transposon Tn9, Chloramphenicalacetyltransferasegen Pos.3730-3803: Vielfach-Klonierungsstelle.

Die Sequenz ist veröffentlicht (Stanssensu.a., EMBO-Lehrgang, Martinsried [1987]; Stanssens u.a., Nucleic Acid Res. 17 [19891, S.4441-4454).

Indem Vektor vom pMa-7 ,,) ist Nucleotid 3409 von G und A verändert, während in dem Vektor vom pMc-Typ Nupleotid 2238 von G zu C verändert ist. Dadurch werden amber-Stoppcodons im Acetyltransferase-Gen bzw. im ß-Lactamase-Gen geschaffen, wodurch diese Gene inaktiv werden.

Alle genannten Sequenzen wurden von Genbank TM, National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH USA, bezogen. Plasmid pMc 5-8 wurde eingelagert (DSM 4566). Zur Durchführung der Mutagenese wird das Ziel-DNA-Fragment in die Vielfach-Klonierungsstelle von pMa 5-8 kloniert. Danach wird ein Einzelstrangbereiche aufweisender Duplex zwischen pMa 5-8, der die Ziel-DNA enthält und pMc 5-8 konstruiert.

Die aus der Ziel-DNA bestehende einzelsträngige Lücke kann durch ein mutagenes Oligonucleotid, lange synthetische Oligonucleotide mit wenigen fehleingebauten Nucleotiden, Chemikalien oder enzymatischem Fehleinbau von Nucleotiden der Mutagenose unterworfen werden. Eine ausführliche Beschreibung findet sich bei Ausubel u.a., a. o.a. O. oder bei Perbai, a.o.a.O. Als Alternative zur In-vitro-Mutagenese ist die In-vivo-Mutagenese mittels UV-Licht oder Chemikalien oder durch Verwendung eines Mutator-Stammes von E.coli möglich (Fowler u.a., J. Bacteriol. 167 [1986], S. 130). Mutagene Nucleotide können mit Hilfe einer von Applied Bio Systems zu beziehenden Aparatur synthetisiert werden.

4. Zufallsmutagenese durch enzymatischen Fehleinbau von Nucleotiden

Wie erstmals von Shortle u. a. (Proc. Acad. of Science, 79 (1982], S. 1588-1592) und von Cunningham und Wells (Prot. Eng. 1 [1987], S.319) beschrieben wurde, ist es möglich, an einem Einzelstrangbereiche aufweisenden pMa/pMc Duplex Starter-Extension und Mutagenese durch Fehleinbau vorzunehmen. Vorzugsweise geschieht das durch Abwandlung des von Lehtovaara u.a. (Prot. Eng. 2 [1988), S.63) beschriebenen Verfahrens.

Diese Methode beruht auf der kontrollierten Verwendung von Polymerasen. Zuerst werden vier Populationen von DNA-Molekülen durch Starterelongation eines Lücken aufweisenden Duplex aus pMa/pMc so generiert, daß sie zufällig in der Lücke, jedoch stets vor einem bekannten Basentyp (vor A, C, G bzw. T) enden. In jeder der vier Populationen wird dann in einer getrennten Fehleinbaureaktion eine Mutation ausgelöst, in der die richtige Base nun weggelassen werden kann. Auf diese Weise

-6- 301 t'45

können Substit'Jtionsmutationen für alle Basentypen an jeder Position der Lücke generiert werden. In Abwandlung des von Lethovaara genutzten Verfahrens verwendeten wir Sequenase™ (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OQ) anstatt der Klenow-DNA-Polymerase und MoMuLV-Revertase (BRL) anstatt AMV-Revertase. Wir haben ferner beobachtet, daß höhere fievertasekonzsntrationen häufig zu vielfachen konsekutiven Mutationen führten. Das kann bei der Gewinnung labiler Enzyme als Vorteil gewertet warden.

Andererseits haban wir das von Lehtovaara u.a., a.o.a.O. beschriebene Protokoll folgendermaßen abgewandelt, um Substitutionen an einer einzigen Stelle zu garantieren. In dem Revertasepuffer ist statt drei nur ein Fehleinbaunucleotid enthalten. So wird z.B. das Α-spezifische limitierte Basenelongationsgemisch in drei getrennten Reaktionen mit 250μΜ dCTP, 250μΜ dGTP bzw. 250μΜ dTTP inkubiert. Für einen kompletten Satz des 4 basenspezifischen Elongationsgemischs wird eine Gesamtmenge von 12 getrennten Fehleinbaureaktionen durchgeführt. Nach 1,5stündiger Inkubation bei 42⁰C wird ein alle vier Desoxynucleotide enthaltender „Chase" in einer Konzentration von 0,5 mM zugegeben, und die Reaktionen werden mindestens weitere 20 min lang bei 37°C inkubiert. Danach werden die Proben wie von Lehtovaara u.a. (a o.a.O.) beschrieben, verarbeitet, jedoch mit der Abweichung, daß keine Gegenselektion auf einen Uracil enthaltenden DNA-Strang vorgenommen wurde, sondern eine auf dem pMa/c-Vektor basierende Gegenselektion.

5. Isolierung der Mutanten-a-Amylase

E.coll WK 6 Zellen, die das Plasmid pMaTBac enthalten, werden in BHI-Medium, das das geeignete Selektionsmedium enthält, gezüchtet. 10ml einer über Nacht gezüchteten Kultur wirden zentrifugiert und in 1 ml 2C%iger Sucrose, 1mM EDTAgelöst. Nach 15minütiger Inkubation bei 20°C werden die Zellen nochmals zentrifugiert. Der Zellrückstand A;rd danach erneut in 1 ml MiIIiQ H₂O suspendiert und 10min lang bei O⁰C gehalten. Nachdem Zentrifugieren der Sphä.oblasten wird der die a-Amylase enthaltende Überstand auf 2 mM CaCI₂,0,7 mM MgCI₂ und 2,5mM NaHCO₃ adaptiert. Gegebenenfalls kann die a-Amylase mit herkömmlichen biochemischen Methoden gereinigt vverdon.

6. a-Amylaseaktivitet

Mit Hilfe von Phadebas™-Tabletten von der Fa Pharmacie wurden die a-Amylase-Aktivitäten routinemäßig bestimmt. Bei dieser Methode wird die Lösung der Farbstoff-markierten Stärke durch a-Amylaso in einem Puffer von pH 5,5 während 15min bei 30°C spektrophotornetrisch gemessen. Die a-Arnylaso-Aktivilät wird in Phadebas-Einheiten (PU) ausgedrückt. Als innerer Standard wird ein Pilz-a-Amylase-Präparat von Aspergillus oryzae mit 10000PU/g verwendet. Eine auf diese Weise bestimmte Phadebas-Einheit entspricht etwa 10SKB-Einheiten, die im Bäckereigewerbe angewendet werden.

Die a-Amylase-Restaktivität in der Brotkrume wurde mit einem etwas abgewandelten Verfahren bestimmt. Aus 10g Brotkrume und 40 ml Puffer, pH 5,5, wurde mit Hilfe eines 1 min bei voller Geschwindigkeit laufenden Waring-Mischers eine Brotkrumensuspension hergestellt. 0,1-1,0ml dieser Suspension wurde über Nacht (18 h lang) bei 3O⁰C in einem Phadebas-Test inkubiert. Berechnet wurde die Restaktivität in der Brotkrume durch Vergleich Hör Aktivität der wärmebehandelten Amylase in der Brotkrumensuspension mit der Aktivität des unbehandelten Enzyms, das zu der Suspension der Krume eines Kontrollbrotes, das ohne Bakterien-a-Amylase hergestellt worden war, zugegeben wurde.

7. Prüfung der Thermolabilität der a-Amylase Im Einsatz 'Backtest)

Die Thermolabilität ausgewählter a-Amylasemutanten wurde in einem Minibrot-Backversuch getestet. Minibrote wurden aus 150g schweren Teigstücken gebacken. Der Teig wurde aus 200g Mehl (100%), 110ml Wasser (55%), 3mg Askorbinsäure (15ppm), 1,4g Trockenhefe (0,7%, Fermipan™), 4g Salz (2%), 3g Zucker (1,5%), 1 g Fett (0,5%), 400mg CaCI₂ · 2H₂O (0,2%), 10mg Pilz-a-AmylaseP₂oo(225OSKB/kg Mehl) und unterschiedlichen Mengen Wildtyp-und Mutanten-Bakterien-a-Amylase hergestellt. Nach einer Knetzeit von 6min, 15s in einer Intensivknetmaschine, die bei 52Upm arbeitete, wurde der Teig geteilt. Man ließ ihn 45 min bei 3O⁰C gehen. Nach dem Zusammenstoßen ließ man ihn nochmals 25 min gehen, danach wurde er geformt und in die Backform gegeben. Nach dem letzten Gehen (70min 3O⁰C) wurde der Teig 20min in einem 24O⁰C heißen Ofen gebacken, und das Laibvolumen wurde durch die Rapssaat-Verdrängungsmethode bestimmt. Ein Stevens Texture Analyzer wurde zur Ermittlung der Krumenweichheit von 2 Scheiben aus der Mitte der Minibrote, die 72h lang bei Raumtemperatur in Plastiktüten gelagert worden waren, verwendet. Die Krumenfestigkeit wird ausgedrückt als Kraft (g), die zum Zusammendrücken einer 2 cm dicken Scheibe Brot um 5 mm (25%) bei Verwendung einer Probe von 1,0 Zoll (25,4 mm) Durchmesserund einer Zusammendrückgeschwindigkeit von 0,5mm/s erforderlich ist. Die Thermolabilität der verschiedenen Bakterien-, Amylaseproben wurde als Anzahl der a-Amylaseeinheiten (PU) ausgedrückt, die erforderlich sind, um eine optimale Krumenweichheit ohne übermäßige Dextrinbildung zu erzielen (20-30% Verringerung der Festigkeitswerte).

8. Bewertung des Backverhaltens der Bakterlen-a-Amylasemutanten

1. Das Laibvolumen verbessernde Wirkung

Die das Laibvolumen verbessernde Wirkung der (Mutanten)-Bakterien-a-Amylase wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Minibroten bestimmt, jedoch wurden CaCI₂, Pilz-a-Amylase und Fett aus der Rezeptur weggelassen.

2. Krumenerweichonde Wirkung

Aus 3500g Mehl (100%), 1960ml Wasser (55%), 87,5g Preßhefe (2,5%), 52,5g Zucker (1,5%), 70g Salz (2%), 210mg Pilz-a-Amylase P₂₀₀ (2700SKB/kg Mehl), 17,5g Fett (0,5%), 105mg Askorbinsäure (30ppm), 94,5mg Cystein (27,5ppm) und unterschiedlichen Mengen Wildtyp- oder Mutanten-Bakterien-a-Amylase wurde ein Teig bereitet. Nach dem Kneten in einer Kemper-Spiral-Knetmaschine, dis bei 6350Upm auf Stufe 1, danach bei 1 200 auf Stufe 2 arbeitet, wurden 900g schwere Rundstücke geformt, die man 35min bei 30°C gehen ließ. Danach wurden sie zusammengestoßen, geformt, in die Backform gegebon und nach nochmaligem Gehen (65min, 34°C) in einem 22O⁰C heißen Ofen 30min lang gebacken. Das I aibvolumen wurde durch die Rapssaat-Verdrängungsmethode bestimmt, und eine Verbraucherjury stufte die Klebrigkeit in 4 Stufen ein. (0: Krume nicht klebrig, keine Dextrinbildung; 0/+: Krume nicht klebrig, geringfügige Dextrinbildung, (optimal); +: Krume etwas klebrig, mäßige Dextrinbildung; + + +: Krume sehr klebrig, übermäßige Dextrinbildung). Zur Messung der Krumenfestigkeit

wurden zwei 2cm dicke Scheiben aus der Brotmitte in einem Stevens Texture Analyzer untersucht. Man verwendete dazu eine Prob6 von 1,6 Zoll (38,1 mm) Durchmesser, eine Kompiessionstiöfe von 5mm (25%) und eine Kompressionsgoschwindigkeit vonO,5mm/s.

Allein dieser Spezifikation erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen sind hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen, so als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung speziell und individuell erwähnt worden wäre.

Obwohl die vorstehende Erfindung zur Veranschaulichung, zur Erklärung und zur Erleichterung des Verstehens ziemlich ausführlich beschrieben wurde, rvii.i Fachleuten angesichts der Darlegung dieser Erfindung ohne weiteres klar sein, daß bestimmte Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werdsjii können, ohne vom Geist und Umfang cer beigefügten Patentansprüche abzuweichen. Die folgendem Beispiele sollen die Hrfindung noch weiter veranschaulichen.

Beispiel 1

Molekulares Klonieren des a-Amylase-Gons von Bacillus amyloliquefaciens

Aus Bacillus amyloliquefaciens H 2, einem Derivat des Baclllus-Stammes HIAM1521 (Hartley, 1968, Biochemistry 7,2401-2408), isolierte Chromosomen-DNA wurde mit Restriktionsenzym Bd I verdaut und in die Bc 11-Stelle des Plasmids pUM 121 ligiert (Nilsson u.a.. Nucleic Acids Res. 11 [1983], S.8019). Dieses Plasmid trägt ein Ampicillinresistenz-Gen, ein Tetracyclinresistenz-Gan und ein c 1-Repressor-Gen. Die Transkription des Tetracyclin-Gens wurde durch das Genprodukt des c 1-Repressor-Gens verhindert. Die Insertion der Fremd-DNA in die einzigartige Bc 11-Stelle des c 1 -Repressor-Gtns führt zur Aktivierung der Tetracyclinresistenz. Das ermöglicht die positive Selektion der Rekombinanten auf AgrarplaUen, dia Ampicillin und Tetracyclin enthalten. Das Ligationsgemisch wurde in E.coll HB101 (ATCC 33694/ transformiert. Ampicillin/Tetracyclin-resitente Kolonien wurden auf LB-Platten (Ausubel, a.o.a.O) auf a-Amylaseproduktion, die nach Ulkosky (Merck) mit 0,4g/l Stärke versetzt waren, geprüft. Nach der Züchtung und Inkubation mit I₂-Dampf wurde eine positive E.coli-Kolonie, die einen großen aufgehellten Hof bildete, zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Es wurde nachgewiesen, daß das passende Plasmid, pUNH2, ein 5,5kb Bc-Ll-Bc 11 -Insert, das aus Bacillus amyloliquefaciens H 2 stammte, aufwies. Ein 2,2 Bg 1 ll-BamH 1 Fragment wurde mittels Gene Clean (zu beziehen von B10101 La JoIIa, LA, USA) isoliert und in die BamH I-Stelie von pUC 18 (Pharmacia) ligiert. Das so erhaltene Plasmid pUCAm4 ist in Fig. 1 abgebildet. Das Insert von pUCAm4 wurde mit der Sanger-Methode (Proc. Natl. Acad. Sei USA, 74 [1977), S. 6463) sequenziert. Die DNA-Sequenz zeigte ein offenes Leseraster von 1 542 Basen (Fig. 2), die eine Signalsequenz von 31 Aminosäuren plus ein reifes Protein von 483 Aminosäuren codierten. Die Proteinsequenz war mit der α-Amy lasesequenz des Bacillus amyloliqu äfaciens, wie sie von Takkinen u.a. bestimmt wurde (J. Biol. Chem. 258 [1983], S. 1007), identisch.

Beispiel 2

Konstruktion des Mutagonese-/Expresslonsvektors pMiTBac

Ein 2,2 kb Sma l-BamH I-Fragment wurde von pUCAm4 doriviert und nach der Gene Clean Methode gereinigt. Dieses Fragment wurde in das mit Sma l-BamH I verdaute pMc 5-8 ligiert. Das resultierende Plasmid pMcAM wurde durch Transformation von E.coil WK6 (CBS 473.88) (R.Zel! und H. J. Fritz, EMBO J. 6 [1987], S. 1809) gewonnen. Nach der Infektion mit dem Phagen M 13KO7 wurde einzelsträngiges pMcAM nach der vom Lieferanten beschriebenen Methode (Pharmacia) Isoliert. Das doppelsträngige Plasmid pMa 5-8 wurde mit Sma I und BamHI verdaut und mit einzelsträngigem pMcAM hybridisiert, um einen Lücken aufweisenden Duplex zu erhalten (Kramer u.a., Nucleic Acids Res., 12 [1984], S. 9441). Dieser Lücken aufweisende Duplex wurde ortsgerichteter Mutagenese unterworfen (Kramer u.a., a. o.a. O.; R. Zeil und HJ. Fritz, a.o.a.O.). Zu diesem Zweck verwendete man ein Oligonucleotid, dessen Aufgabe darin bestand, eine Xba I-Stelle in Position -18 - bezogen auf das Startcodon - einzufügen.

Die Sequenz dieses Oligonucleotids lautet:

5'-TTC CTC TCC CTC TAG ATT TCT TAT AC.

Nach der erfolgreichen Mutf genese wurde das Plasmid durch einen DAM E.coll-Stamm (E.coliGM48, Phroagen, Utrecht) geleitet, und danach wurde das EcoR I-Xba I-Fragment durch partielle Verdauung entfernt und durch ein sy nthetisches EcoR I-Xba I-Fragment ersetzt, das eine Kopie eines tac-Promoters trug. Die Sequenz dieses Fragments ist in Fig.3 zusammen mit dem die a-Amylase codierenden Insert des so erhaltenen pMaTBac (CBS 287.89) abgebildet. Dieses Plasmid verurcacht die Synthese von a-Amylase in E. coil unter der „guidance" des durch IPTG induzierbaren tac-Promoters. Ferner kann das Insert dieses Vektors dadurch der Mutagenese unterzogen werden, daß zwischen DNA-Molekülen vom pMa- und pMc-Typ geeignete, Lücken aufweisende Duplexmoleküle gebildet werden. Einzelsträngige DNA für die jeweiligen Moleküle kann durch Infektion vonE.coli WK6 mit dem Phagen M13KO7 nach der vom Lieferanten vorgegebenen Methode (Pharmacia) gewonnen werden.

Beispiel 3

Bisulfit-Mutagenese von pMaTBac

Einzelsträngiges pMaTBac wurde mit Kpn I-Apa I verdautem pMcTBac hybridisiert, um einen Heteroduplex zu erhalten, bei dem die Lücke von Position 4915 bis 5146 reichte (s. Fig.3A-C). Dieser Heteroduplex wurde der Bisulfitmutageness unterworfen

(s. Experimentelles). Nach der Transformation in E. coll WK 6 MutS (CBS 472.88) (R. Zeil und H. J. Fritz, a. o. a. 0.) und der Selektion auf Chloramphenicol enthaltenden Agrarplatten (25 pg/ml) wurden Plasmidpools isoliert und in E. coil WK6 transformiert. Die so erhaltenen Transformanten wurden in BHI-Modium (DIFCO), das 2,OmM CaCI₂,25Mg/ml Chloramphenicol und 0,15mM IPTG (SIGMA) enthielt, 24h lang bei 37°C gezüchtet. Drei Proben des Überstandes wurden 0,7 bzw. 14 min bei 8O⁰C inkubiert und danach auf a-Amylaseaktivität untersucht. Das geschah durch Tüpfeln der Proben (5-1 )μΙ) auf 0,2% Stärke enthaltende BHI-Platten, 1 stündiges Inkubieren bei 55°C und Färben der Platten mit einer I₂-Lösung (3g ₂/1 und 7g Kl/1). Kolonien, die im Ergebnis der längeren Inkubation bei 80°C keine Abnahme der Hofgröße und der Intensität gegenüber den Kolonien des Wildtyps aufwiesen, wurden als thermolabile a-Amylasemutanten ausgewählt.

Tab. 1 zeigt die Sequenz der Mutationen, die in einem typischen Versuch erhalten wurden. DNA-Sequenzen wurden bestimmt, indem die Lückenregion nach Isolierung der einzelsträngigen DNA der pMcTBac-Mutanten sequenziert wurde. MutantenpMcTbac-Plasmide wurden in BH I-Medium in dem Stamm E. coli WK6 gezüchtet. Enzympräparate wurden durch das Verfahren

des osmotischen Schocks (Ausubel u.a., a.ο.a.Ο., Methoden und Material), durch den die periplasmatischea-Amylase freigesetzt wurde, hergestellt.

Tab.2 zeigt die optimale Dosierung der Mutanten-a-Amylasen und die Backergebnisse.

Da das Laibvolumen der einzelnen Backversuche differieren kann, werden die entsprechenden Ergebnisse mit einem Kontrollenzympräparat verglichen (WT), das Bestandteil jedes einzelnen Versuches ist. Dieses WT-Enzym wird durch Fermentierung des nichtmutagenisierten Plasmids pMaTBac in E.coli WK6 gewonnen.

Tabelle I

Nach Bisulfit-Mutagenese erhalten wärmeempfindliche a-Ar.tylasemutanten

Mutant	Aminosäure	von —>	zu	AA -	* AA
	(AA)Nr.
A8	394	CCG	TCG	Pro	Ser
	386	TAC	TAT	Tyr	Tyr
B10	34Ö	CCG	TCG	Pro	Ser
E12	398	CCC	TCC	Pro	Ser
G2	386	CCG	CTG	Pro	Leu
3	349	GCC	GCT	AIa	AIa
	322	ACA	ATA	Thr	He
4	345	CCG	TCG	Pro	Sei
6	322	ACA	ATA	Thr	He
	316	CAT	TAT	His	Tyr
7	356	TCC	TTC	Ser	Phe

Tabelle 2

Backversuche mit Bisulfit-mutierten a-Amylasen

Mutant	optimale Dosierung	Laibvolumen
	(PU/200gMehl)	(ml)
WT	4,25	563
(Elternstamm)
A8	14	574
B10	9	596
E12	14	577
G2	8,5	591
3	7,8	526
4	9,6	557
6	6,4	543
7	11,1	550

Beispiel 4

Mutagenose von pMaTBac durch enzymatischem Fehleinbau

Zur Gewinnung eines Heteroduplex mit einer Lücke von Position 4018 bis 4915 (s. Fig. 3) wurde ein einzelsträngiger pMaTBac

(s. Beispiel 2) mit EcoRV-Kpn I verdautem pMcTBac hybridisiert. Dereinen Einzelstrangbereich aufweisende Duplex wurde der im Abschnitt über Versuche beschriebenen Mutagenese durch enzymatischen Fehleinbau unterzogen. Eine durch A-Iimitierte Starterelongation erhaltene Probe wurde gedrittelt und in Gegenwait von Revertase mit dCTP, dGTP bzw. dTTP inkubiert. Nach lOminütiger Inkubation bei 37°C wurde ein „Chase" mit allen vier dNTPs vorgenommen und Klenow-Polymerase und T4-DNA-Ligase wurde genutzt, um die Elongation zu vollkommen doppelsträngigen Molekülen abzuschließen. Diese Moleküle wurden in

E. coll WK6 Muts transformiert, und Plasmidpools wurden zurückgewonnen. Diese Plasmidpools wurden in E.coli WK6 transformiert, und die Kolonien wurden auf Chloramphenicol enthaltenden (25pg/ml) Agrarplatten ausgewählt. Die daraus resultierenden Mutanten wurden nach dor in Beispiel 3 beschriebenen Methode aufwärmeempfindliche a-Amylase gescreent.

Tab. 3 zeigt die Sequenz verschiedener thermolabiler a-Amylasen, die in einem typischen Experiment gewonnen wurde. Die DNA-Sequenzen wurden durch Sequenzierung der Lücke nach der Isolierung der einzelsträngigen DNA der pMcTBac-Mutanten bestimmt.

Tab.4 zeigt die optimale Dosierung der Mutanten-a-Amylasen und die Backergebnisse.

-9- 301 Tabelle 3 Nach limitierter Elongation erhaltene wärmeempfindlich^ Amylasemutanten

A-Iimitierter	AA-Nr.	von ->	zu	von -	> zu
Mutant
12	116	GTC	GAC	VAL	ASP
13	113	GTA	GGA	VAL	GLY
	114	ACT	ACC	THR	THR
	116	GTC	GCC	VAL	ALA
14	163	TGG	CGG	TRP	ARG
	164	GAT	GAG	ASP	GLU
	166	TCC	CCC	SER	PRO
17	238	TTT	CTT	PHE	LEU
25	116	GTC	GCC	VAL	ALA
26	116	GTC	GGC	VAL	GLY
29	113	GTA	GCA	VAL	ALA
	114	ACT	ACG	THR	THR
	116	GTC	GCC	VAL	ALA
T-Iimitiert
15	123	AGA	TGT	ARG	CYS

Tabelle 4 Backversuch mit a-Amylase, die mit A- oder T-Iimitierter Elongation gewonnen wurde

Mutant	optimale Dosierung	Laibvolumen
	(PU/200gMehl)	(ml)
W.	4,4	566
(Ei'ernstamm)
12	13,4	525
13	19,5	564
14	11	542
15	>100	560
17	4,25	545
25	5,4	558
26	12,5	561
29	14,6	558

b'eispiel 5

Vergleich der Wildtyp- und Mutinten-a-Amylase von B.amyloliquefaciens bei der Brotherstellung

In Tab. 5 wird die das Laibvolumen von Minibroten verbessernde Wirkung von Pilz-a-Amylase sowie der Bakterien-α- Amylase aus B. amyloliquefaciens vom Wildtyp und der Mutante Nr. 15 verglichen. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die für ein maximales Laibvolumen erforderliche Anzahl von a-Amylaseeinheiten (~ 50 PU/200g Mehl) für die Pilz-a-Amylase, die Wildtyp- und die Mutanten-a-Amylase von B.amylollquofacions sehr ähnlich ist. Bei der Verwendung der Pilz-a-Amylase oder der a-Amylase der Baktorienmutante Nr. 15 wird eine maximale Erhöhung des Laibvolumens um etwa 10% erzielt, ohne daß es zu einer übermäßigen Dextrinbildung in der Brotkrume kommt. Bei der Verwendung von Wildtyp-a-Amylase von

B. amyloliquefaciens zur Verbesserung des Laibvolumens kann das maximale Laibvolumen jedoch nicht erzielt werden, ohne daß eine starke übermäßige Dextrinbildung ausgelöst wird.

in Tab. 6 wird die krumenerweichende Wirkung der a-Amylase vom Wildtyp und der Bakterienmutante Nr. 15 (Arg 123 —> Cys 123) in einer Standardbrotrezeptur verglichen, die pro kg Mehl 2 700SKB Pilz-Amylase enthält.

Aus Tab. 6 ist ersichtlich, daß die Bakterien-a-Amylase vom Wildtyp die Krume sehr wirksam erweicht. Eine optimale krumenerweichende Wirkung wird bereits in Dosierungen zwischen 3,9 und 12 PU/kg Mehl erzielt. Bereits in einsr etwas höheren Dosierung von 39 PU/kg Mehl wird jedoch eine starke übermäßige Dextrinbildung in der Brotkrume beobachtet. Bei Mutantenenzym ist eine viel höhere Dosierung von etwa 74 PU/kg Mehl erforderlich, um eine optimale krumenerweichende Wirkung zu erhalten, und eine Dosis von 740 PU/kg kann zugegeben werden, ehe eine geringfügige übermäßige Dextrinbildung in der Brotkrume beobachtet wird. Folglich ist das Risiko dor übermäßigen Dextrinbildung beträchtlich verringert, wenn anstatt der Wildtyp-a-Amylase Mutanten-a-Amylase Nr. 15 aus B. amyloliquefaciens als krumenerweichendes Mittel verwendet wird.

Die verminderte Thermostabilität der Mutante Nr. 15 der Bakterien-a-Amylase wird auch aus der Amylase-Restaktivität in der Brotkrume deutlich. Während die Bakterien-a-Amylase vom Wildtyp den Backprozeß weitgehend überlebt (50-75% Restaktivität), konnte in Brot aus Teigen, die a-Amylase der Mutante Nr. 15 enthielten, keine Restaktivität nachgewiesen werden.

-10- 301 645 Tabolle 5 Vergleich verschiedener α-Amyfasetypen bei der Brotherstellung

Enzym	Dosierung	Laibvolumen	übermäßige
	(PU/200gMehl)	(ml)	Dfixtrinbildung*
(keine Pilzamylase)	0	446	0
Pilzamylaso	22,5	487	0
Pilzamylase	45	510	0
Pilzamylase	90	510	0
Pilzamylase	180	510	0
WilJ.yp, β. amyloliquefaciens	4	476	0/+
Wildtyp, B. amylollquefaclons	10	480	+
Wildtyp, B. amyloliquafaciens	40	510	+ + +
Wi'j'.yp, B. amyloliquefaciens	100	510	+ + +
Mutante Nr. 1!^:,.R, nmyloliquofaclens	5,2	450	0
Mutante Nr. 15, U. umylollquof aclens	13	460	0
Mutants Nr. 15, B. amyloliquefaciens	52	510	0
Mutante Nr. 15, B. amyloliquefaciens	130	510	0/+

* Krumenmerkmale wurden von einer Gruppe ausgebildeter Verbraucher beurteilt: O— nicht klebrig, keine übermäßige Dextrinbildung; 0/+- nicht klebrig, geringe Dextrinbildung (optimales Ergebnis); +-etwas klebrig, mäßige Dextrinbildung; + + + - sehr klebrig, sehr starke Dextrinbildung.

Tabelle 6 Vergleich der Wildtyp- und Mutanten-ßakterlen-a-Amylase bei der B.otherstellung

Enzym	Dosierung	Laibvolumen	Krumenfestigkeit	übermäßige
	(PU/kgMehl)	(ml)	nach72h(g!	Dextrinbildur.g*
(keineAmylase)	0	3870	510	0
Bakterienwildtyp	1,3	3860	5OC	0
Bakterienwildtyp	3,9	3910	460	0/+
Bakterienwildtyp	13,0	3920	440	+
Bakterienwildtyp	39	4 000	280	+ + +
Bakterienmutantc Nr. 15	7,4	3 890	500	0
Bakterieninutante Nr. 15	22,3	3860	470	0/+
Bakterienrr utante Nr. 15	74	3920	440	0/+
Bakterienmutante Nr. 15	223	3900	420	0/+
BakterienmutantoNr. 15	742	3900	400	+

• Krumenmerkmale werden von β., ^r Gruppe ausgebildeter Verbraucher beurteile 0-nicht klebrig, keine übermäßige Dextrinbildung; 0/+-nicht klebrig, goringe Dextrinbildung; + + + -sohr klebrig, sehr starke Dextrinbildung.

Beispiel 6

Regulierung der Thermolabilität von a-Amylasen durch Kombination verschiedener Mutationen

Es wurde festgestellt, daß mehrere tier in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Mutanten eine für den optimalen Nutzen bei der

Brothersiellung zu hohe Stabilität aufwiesen. Da üie einzelnen Aminosäuresubstitutionen jeder Mutantcn-a-Amylase bekannt sind, kann durch Kombination einzelner Aminosäuresubstitutionen ein Design einer Mutante mit optimaler Stabilität/Labilität für die Verwendung in Brot entwickelt werden.

Das Kombinieren kann durch Austausch geeigneter Restriktionsfragmente von mutierter pMaTBac oder durch Einbau der in

Erwägung gezogenen Aminosäuresubstitution durch ortsgerichtete Mutagenese (Methode und Material, Abschnitt 3) erfolgen.

Tab. 7 zeigt eine Reihe von realisierten Kombinationen. Diese Kombinationsmutanten wurden durch lOminütiges Inkubieren von

Probender Überstände bei 75⁰C und Prüfung der verbliebenen a-Amylaseaktivität mit Hilfe von BHI-Stärkeplattenund

1 stündigem Inkubieren bei 55⁰C (vgl. Beispiel 3) auf ihre Stabilität geprüft.

Durch Vergleich mit entsprechenden Vei dünnungen nicht erhitzter WT- und Mutanton-a-Amylase wurde der prozentuale Anteil der verbliebenen Aktivität bestimmt (Fig.4). Es zeigt sich, daß alle Kombinationsmutanten eine höhere Thermolabilität aufweisen als die entsprechenden Elternmutanten. Folglich ist die Foinregulierung der Thermolabilität durch Kom'iination entsprechender einzelner ortsspezifischer Mutanten möglich.

Beispiel 7 Regulierung der Thermalabilität durch Substituierung verschiedener Aminosäuren in ausgewählten Positionen

Mit Hilfe der in Beispiel 3 und 4 angewendeten Methoden wurden Restpositionen ermittelt, die für die Stabilität/Labilität der

ci-Amylase von Bedeutung sind. Wegen des spezifischen Mutageneseverfahrens kann in einer bestimmten Position jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Substitutionen etwartet werden. Um den Mutationsbereich und das entsprechende Stabilitäts-/

Labiliiätsverhalten zu erweitern, kann ein Rest, dessen Bedeutung für die Stabilität/Labilität ermittelt wurdo, für alle möglichen natürlichen Aminosäuren substituiert werden. Dar kann durch ortsgerichtete Mutagenese mittels eines Oligonucleotids mit

einem Gemisch aller vier möglichen Nucleotide in dem in Betracht gtzogonon Codon erfolgon (vgl. Methoden um¹ Material, Abschnitt 3). Zu diesem Zweck wurde ein gemischtes Oligonucleo id mit folgender Sequenz

CGAAGTTTCCTGATT^NNATTGGCCGGATTGAC G

genutzt, um etliche verschiedene α-Amylasen zu gewinnen, deren Rest 1Γ3 mutiert war. ',* stoht für jodos dor Λ möglichen Nucleotide (Tab. 8).

Der prozentuale Anteil der verbliebenen Aktivität wurdo nach der gleichen Methode wie in Beispiel β bestimmt (Fig. 5). Es zeigt sich, daß alle in Position 123 untersuchten Mutanten weniger stabil als das Enzym vom Wildtyp waren (R 123). For nor ist klar Haß verschiedene Aminosäuren in Position 123 hinsichtlich der Thorniolabilita! i.ntersehiedlichos Verhalten aulweison. Aus diesom Grunde kann die Zufallemutagenose in Positionen, die nach der Methode von F!eis|..' jl 3 und 4 ausgewählt wurden, zur Auswahl oder zum Design einer Mutanten-a-Amylase mit gewünschtem Stebilitätv/Labilitütsvorhalten genutzt werdon.

Ta'ielle 7 Komblnatlonsii.utanten

Mutants

Kombination der Mutanten Aminosäuren

34 35 36 37 38 39 40 41

E12 + 12

E12+ 13

E 1? + 14

E 12 + 26

7 + 12

7 + 13

7 + 14

7 + 26

P 398 S

V116D

P398S

V113G/V116A

P393S

T163R/D161E/SI66P

P 398 S

V113G

S 356 F

V116D

S3Ü6F

V113G/V116A

S 356 F

T163 R/D 164 E/S 166 P

S 356 F

V116G

' Die Expression dieser a-Amylasemutant' η war möglicherweise wegen Instabilität oder Proteatoempfindlichkeit stark verniimieit.

Tabelle 8 Z'ifellsmutagenese en einer einzigen Restposition

Mutante	Aminusäurosubstitution
15	R123C
42	R123H
43	R123V
44	R123L
45	R123A
46	R 123 P
47	R 123 D

Beispiel 8 Ersetzung de· chromosomalen Wüdtyp-O'Amylasegent durch oln Mutantongon Zur Gewinnung einer Mutanten-n.A.-nylnse kann die Reklonierung In oinem Exprossionswirt vorgonommon wnrdon. Ein

bevorzugter Wirt kann der Elternorganismus der in Erwägung gezogonen a-Amylaso sein. Das ondogono a-Amylasegon mußjedoch vor der Verwendung inaktiviert odor deletiert werden. In diesem Baispin! wird die Deletion dos α-Amylasogons von

B.amylollquefaclens beschriot en. Danach kann dosMutanton-a-Amylasogen von oinom das Gen tragendon Plasmid (z.H. PUB 110) oder von oiner chromosomal integrierten Kopio dos Gons oxprimiort wordon. Lotzloro Mothodo wird für Produktionszwocke bevorzugt, woil in d'am Wirt koino hotorologo DNA onthalton int. Die chromosomale a-Amylaso von B.amylollquofaclens wurde durch Einbau eines oinon tompornturompfindlichon Replikationsstartpunkt onthallondon Plasmids (dus auf pE 134 basierende pE 194 noo, vgl. EP 0283075) in das Gen inakliviort. Die Selektion auf Chromosom Io lntogranton erfolgto durch Erhöhung dor Temperatur auf Wmto, dio dio Plasmidroplikntion in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums nicht gostattot. Ons Plasmid onthiolt oino Kopio dos a-Amyliisogo.is, <!<-«.».nn Mittelteil dolotiort war (vgl. Fig.6). An don boidon flonkiorendon Soquonzon kann dio Rokomblnation elntroton. Nur wonn

Integration it nd Ex/ision durch Rekombination an zwei unterschiedlichen flankierenden Sequenzen erfolgen, wird das schließlich zum Verlust des a-Amylasegens führen. Diese potentiellen Integranten wurden bei 37⁰C in Abwesenheit von Neomycin zwecks Stimulierung der „nulrßcombination" (Ausschluß eines genet. Elements durch Rekombination, d. Cl) und Plasmidcuring gezüchtet. Orei a-Amylase-negative Klono wurden gewonnen, von donen einer durch Chromosomenkartierung ausführlich untersucht wurde. Ferner wurde der Eltorn-fntegrant des a-Amylaso negativen Klons durch Chromosomenkartierung untorsucht. Die Rastriktioriskarten dor Chromosomenintegration und der Exzision sind in Fig.6 abgebildet. Ein a-Amylasenegativer B.amyloliquefaclens Stumm wurde gewonnen und BAM112 genannt. Dieser Stamm wies auf dem inneren Amylaf egen von EcRV ->is Hindill ein» Deletion von 735bp auf.

Der a-Amylase-negativo Stamm DAM 112 wurde dann zur Gewinnung der Mutanten-a-Amylase genutzt. Zuerst wurde die codierende DNA der Mutanto 15(R 123C) in pE 194 neo Moniert und mittels Protoplastentransformation (Chang und Cohen, Molecular and Genera! Genetics, 168 (1979), S. 115-115) in den Stamm BAM112 transformiert. Nach der Selektion bei 5O⁰C und 20pg/ml Neomycin war das mutierte a-Amylasegon (R 123C) in Chromosomen eingebaut. Einigo Integranten wurden isoliert und nach der Rekombination an beiden flankierenden Sequenzen konnte die Seioktion auf Integration des 123C-a-Amylasegens durchgeführt wurden. Auf die gleiche in Fig.6 dargestellte Weise wurde die Exzision des Plasmids vom Chromosom vorgenommen. Ein a-Arnylase-positiver, Neomycin-empfindlicher Klon - BAM115 -wurde selektiert und durch Chromosomenkartiurung untersucht.

Beispiel 9 (Bezugsbeispiel)

Die von N. A. Smirno ι. a. (Biological Abstracts, 87 (1989) Nr. 7, Zusammenfassung 70127 und 70128) beschriebene α-Amylasomutamen von B. amyloliquefaclens TS141 und TS191 wurden sowohl unter Labor- als auch Praxisbedingungen getestet. Die verminderte Thormostabilität dieser Mutanton wurde mit Hilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Platten-Prüfmotliode bestätigt. Beim Vergleich der Aktivität der Mutante TS141 und des Wildtyp-Enzyms sowohl bei pH5,5 als auch bei 6,5 nach der Phadebas-Mothode wurdo deutlich, daß die a-Amylaseder MutanteTS 141 bei pH 6,5 normal aktiv war, jddoch bei pH 5,5 fast ihre gesamte Aktivität verloren hatte. Aus diesem Grund ist die a-Amylase der Mutanten TS141 (Asp"⁴ —> Asn"⁴) für die Verwendung beim Backen nicht geeignet. Die Thermostabilität der a-Amylase der Mutante TS191 (GIu'⁹' -> Lys¹⁶¹) bei der Brotherstellung wurde anhand der für eine optimale krumenerweichende Wirkung erforderlichen Dosierung beurteilt. Eb zeigte sich, daß die Thermostabilität dieses Mutantenenzyms unter großtechnischen Bedingungen der Thermostabilität des Wildtypenzyms weitgehend glich. Folglich stellt diese Mutante keinen nützlichen Phänotyp dar.

-2Z- 304

Text zu Figuren

Fig. 4: Kombinationsmutairlen - h Aktivität Fig. 5: Mutanten von R123 - H Aktivität Fig. 6: 5'-Integration - Chromosoms¹ .b DNA H2 5¹Integrant

3¹ ".ntegration - 3'Integrant "Outrecombination": chromosomale ÜNA BAM 112 o£-Amylase negativ

1. chromosomale DNA von B. amyloliquefaciana

2. chromosamalea ot-Amylaaegen

3. Plasmid-getragene 5' und 3'o6-Amylaae flankierende Sequenz

4. Neomycinresistenz-Gen

5. ts-ori

6. Plasmidaequenzen

Claims

1. Mutantenenzym, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Produkt eines biologischen Fermentationsprozesses ist und unter großtechnischen Einsatzbedingungen im Vergleich zürn entsprechenden Wildtyp-Enzym verminderte Stabilität aufweist.

2. Mutantenenzym, das durch eine oder mehrere ausgewählte Mutationen des Wildtyp-Enzyms gewonnen wurde, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte Enzym unter großtechnischen Einsatzbodingungen eine gewünschte vermindert Stabilität aufweist.

3. Mutantenenzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es unter Backbedingungen die Brotquaiität verbessernde Eigenschaften aufweist.

4. Mutantenenzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Backenzym, vorzugsweise Bakterien-a-Amylase ist.

5. Mutantenenzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Bakterien-a-Amylase ist, die unter Backbedingungen im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Enzym verminderte Thermostabilität aufweist.

6. Modifiziertes Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Expression eines das modifizierte Gen codierenden Gens gewonnen wird, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die sich hinsichtlich 1 bis 10 Aminosäure(n) von dem Wildtyp-Enzym unterscheidet.

7. Modifizierte Bakterien-a-Amylase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz besitzt, durch die Arg 123 des Wildtyp-Enzyms durch Cys 123 ersetzt wird.

8. Modifizierte Bökterien-a-Amylase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosequenz aufweist, durch die die Aminosäuresequenz sich hinsichtlich mindestens einer Aminosäure von dem Wildtyp-Enzym auf der Aminosäure Nr. 113,114,116,123,163,164,166,238, 316,322,345,349,356,386,394 oder 398 von B. amyloliquefaciens oder einer homologen Position in einer homologen α-Amylase unterscheidet.

9. Modifizierte Bakterien-a-Amylase nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien-a-Amylase eine Bacillus-a-Amyiase, vorzugsweise eine B. amyloliquefaciens-a-Amylaso ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Teiges oder ähnlichen Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verwendung eines Mutantenenzyms mit die Brotqualität verbessernden Eigenschaften nach einem der Ansprüche 3 bis 9 umfaßt.

11. Teig oder ähnliches Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutantenenzym mit die Brotqualität verbessernden Eigenschaften nach einem der Ansprüche 3 bis 9 umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung von Brot oder verwandten Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zugabe eines Mutantenenzyms mit die Brotqualität verbessernden Eigenschaften nach einem der Ansprüche 3 bis 9 zum Teig umfaßt.

13. Brot oder verwandte Produkte, wenn sie nach Anspruch 12 hergestellt sind.

14. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Produktion eines Mutantenenzyms nach Ansprüchen 1 bis 9 geeignet gemacht wurde.

15. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Produktion der Mutanten-Bakterien-a-Amylase durch Ausschaltung der Expression endogener a-Amylase geeignet gemacht wurde.

16. Mikroorganismus, vorzugsweise Bakterium, Hefe oder Pilz, am besten E. coli, ein Bacillus oder ein Aspergillus wie Bacillus stubtilis, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus licheniformis, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Gen codierendes Mutantenenzym nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.

17. Gen, das das Mutantenenzym der Ansprüche 1 bis9codiert, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz besitzt, die sich hinsichtlich 1 bis 10 Rest(en) vom Wildtyp-Enzym unterscheidet.

18. Gen nach Anspruch 14, das Bakterien-a-Amylase codiert, dadurch gekennzeichnet, daß es sich hinsichtlich 1 bis 10 Rest(en) von dem Wildtyp-Gen unterscheidet, das die in Fig. 2 abgebildete DNA-Sequenz besitzt.

19. Vektor oder Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß er/es ein Gen nach Anspruch 17 oder 18 umfaßt.

20. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Vektor oder Plasmid nach Anspruch 19 transformiert wurde.

21. Verfahren zur Produktion eines Mutantenenzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Fermentation eines Mikroorganismus nach Anspruch 14 bis 16 oder 20 und gegebenenfalls die Trennung oder Reinigung des gebildeten Mutantenenzyms umfaßt.

22. Verfahren zur Herstellung eines Mutantenenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß es unter großtechnischen Einsatzbedingungen eine gewünschte Stabilität aufweist, bestehend aus

a) Auflösung der Mutation in einem das Wildtyp-Enzym codierenden Gen;

b) Auswahl der Mutanten mit veränderten Stabilitätseigen^c,chatten;

c) Bestimmung der entsprechenden im Vergleich zu den Wildtyp-Enzymen ausgewechselten Aminosäuren und

d) Kombination ausgewählter einzelner Aminosäuresubstitutionen zur Bildung eines mutierten, das Mutantenenzym codierenden Gens.

23. Verfahren zur Präparation eines Mikroorganismus, der mit einem ein Mutantanenzym codierenden Enzym kloniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß es unter großtechnischen Einsatzbedingungen eine gewünschte Stabilität aufweist, bestehend aus

a) Klonierung eines das Wildtyp-Enzym codierenden Gens;

b) Auslösung der Mutation in dem das Wildtyp-Enzym codierenden Gen;

c) Auswahl der Mutanten mit veränderten Stabilitätseigenschaften;

d) Bestimmung der entsprechenden im Vergleich zum Wildtyp-Enzym ausgewechselten Aminosäuren;

e) Kombination ausgewählter einzelner Aminosäuresubstitutionen zur Bildung eines mutierten, das Mutantenenzym codierenden Gens und

f) erneutes Klonieren des mutierten Wirts in einem geeigneten Wirt.

24. Verfahren zur Produktion von Mutantenenzym, das unter großtechnischen Einsatzbedingungen eine gewünschte Stabilität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es die Fermentation eines nach Anspruch 23 präparierten Mikroorganismus umfaßt.

25. Die Brotqualität verbessernde Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Substanz ein Mutantenenzym mit die Brotqualität verbessernden Eigenschaften nach einem der Ansprüche 3 bis 9 umfaßt.